TWI516598B - A method for preventing the rapid degradation of Hericium erinaceus A during the fermentation of mycelium of Hericium erinaceus - Google Patents
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Description
本發明係關於一種猴頭菇(Hericium erinaceus)菌絲體之新穎培養方法。
猴頭菇之生物活性
猴頭菇(Hericium sp.)是一種珍貴的藥膳兼用真菌，除了利用太空包培養產生子實體亦可經由液態和固態發酵產生菌絲和具有生理活性的代謝產物包括多醣、猴頭素、猴頭酮和雙亞麻油酸磷脂乙烯胺(DLPE)等二級代謝物，其中猴頭素具有合成神經生長因子(NGF)可以增加神經突觸的生長。至今日人已由液態發酵產物中分離純化十種猴頭素，猴頭素可刺激老鼠星狀細胞分泌神經生長因子(NGF，而NGF可治療智力衰退、神經衰弱等疾病。維持神經細胞組織的調節因子稱為神經營養因子，包括NGF、BDNF、NT-4、NT-3，其中NGF是最早被發現，它們可和其專一性的受體結合，進一步誘導神經纖維以及神經軸突發育生長(Stariha and Kim,2001)。當NGF供應營養的神經細胞受損時，如添加Tunicamycin(TN)、Thapsigargin(TG)化學藥劑皆會造成為內質網壓力(endoplasmic reticulum stress；ER stress)因缺氧而導致神經細胞凋亡。Mori等人(2008)將猴頭菇萃取物以及NGF分別注入1321N1細胞培養後，在取其培養液注入老鼠鉻細胞(PC12)觀察其神經軸突生長情況，發現均有顯著成長，且餵小鼠5%猴頭菇萃取物，七天後可使海馬迴區塊合
成NGF的mRNA表現量比在大腦皮層高。Shimbo等人(2005)將猴頭素餵食大鼠，異發現在海馬迴合成NGF分泌量居高。
猴頭菇培養技術
目前台灣猴頭菇皆為人工栽培，但農民栽種猴頭菇子實體，不含猴頭素卻含猴頭酮，早期以為猴頭酮為功效成分，2008年東北大學證明猴頭酮不具功效，所以藉由液體發酵菌絲體量產猴頭素A(Erinacine A)。
因此有鑑於：
1. Erinacine A可以提高NGF分泌量，藉由NGF保護神經細胞避免因氧化壓力而導致神經細胞走向凋亡。
2.因人工栽培子實體不含猴頭素A，則採用液態發酵來量產。
是以，本案發明人鑑於上述習傳統猴頭菇菌絲體培養技術所衍生的各項缺點及困難，乃亟思加以改良創新，並經多年苦心孤詣潛心研究後，終於成功研發完成本件一猴頭菇菌絲體之新穎培養方法。
本發明之目的即在於提供一種猴頭菇菌絲體之新穎培養方法，藉由控制溫度來穩定其Erinacine A降解。
本發明之次一目的係在於提供一種猴頭菇菌絲之新穎培養方法，藉由通氣量控制，可收到較高產量Erinacine A。
可達成上述發明目的之一種猴頭菇菌絲體之新穎培養方法，包括有：猴頭菇(Hericium erinaceus)菌絲體，猴頭菇菌絲體培養，包括將菌絲體接種於平板上，進行平板培養後，再刮取菌絲接種於燒瓶內，進行燒瓶培養，最後，將燒瓶培養物接種於醱酵槽內，藉由控制溫度來穩定其Erinacine A降解。及通氣量控制，可收到較高產量Erinacine A。培養約10天後，猴頭菇發酵液經離心後，所得菌絲冷凍乾燥後Erinacine A產量最
高可達29.65 mg/g。
本發明之實施例所用之猴頭菇(Hericium erinaceus)菌種為於中華民國台灣省新竹市食品工業發展研究所菌種保存中心所購得(菌種編號：BCRC35669)。
猴頭菇菌絲體的液體培養包括下列步驟；(1)平板培養：將菌絲體接種於平板培養基上，於適當溫度如20-32℃，(較佳者週溫約30℃)下培養約2週；(2)燒瓶培養：刮取菌絲接種於燒瓶內，使用如表一所列之培養基，在約28℃，pH值4.5-7.0，較佳者pH值4-6.5，更佳者約pH值4.5，及振盪速率100-250 rpm之下振盪培養到log期初期，亦即，約5-7天；(3)發酵槽培養：最後，將燒瓶培養物接種於醱酵槽培養基(同燒瓶培養基)內，在20-32℃，(較佳者週溫約28℃)，槽壓0.1-1.5公斤/平方公分，及pH值約4.5-6.5，以0.5-1vvm(air volume/culture volume/min,每分鐘通氣量與培養基體積的比值)通氣速率通入空氣，或空氣與氧氣，二氧化碳或氮氣的混合物，較佳者空氣，在100-250 rpm攪拌速率下培養約8-16天。即得猴頭菇菌絲體醱酵液，包括菌絲體與澄清液。
*該綜合性碳氮源可為榖類(如：麥粉類)或豆類(如：黃豆粉、綠豆粉、大豆粉)；**該動植物來源蛋白及其水解物可為蛋白腖；***該無機鹽類可為硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸鐵等；****糖類可為葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖等；
於醱酵槽培養基中可額外添加消泡劑以抑制於培養過程中大量泡沫之生成，其中該消泡劑可為市售之習用消泡劑，如0.01%消泡劑(Antifoaming KM-72，為含矽油、矽樹脂之水性消泡產品)。
本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。
實施例一
1.猴頭菇菌絲體之培養
菌絲體菌株：
由食品工業發展研究所所購得，菌種編號為BCRC 35669。
平板培養：
將菌絲體接種於平板上，使用馬鈴薯糊精培養基(Potato Dextrose Agar,PDA)，於30℃下培養約2週。
燒瓶培養：
刮取平板上的菌絲接種於燒瓶內，用表二所列之培養基，在約28℃，pH值5.0下，於搖動機上以振盪速率100-250 rpm振盪培養到log期初期，亦即培
養約5-7天。
醱酵槽培養：
所使用之培養基如表二所列，將燒瓶培養物接種於80公升醱酵槽培養基內(100公升醱酵槽)，在28℃，槽壓1.0公斤/平方公分，及pH值約5.0，以40升/分通氣速率通入空氣，在10 rpm攪拌速率下培養約6-15天，期間每日測定Erinacine A，當達測定值達30 ppm以上即可收槽，包括菌絲體與澄清液。醱酵液經離心後，菌絲部分再經冷凍乾燥，並進行乾重、Erinacine A含量測定。
上述醱酵槽培養基中，另外分別添加0.1%消泡劑(Antifoaming KM-72，為含矽油、矽樹脂之水性消泡產品)於醱酵槽培養基內。
實驗組別如下：
控制組：上述醱酵槽培養基中不調整溫度及通氣量
控制溫度組：上述醱酵槽培養過程中，於培養9天後調整溫度至25℃繼續培養
控制溫度及通氣量組：上述醱酵槽培養過程中，於培養9天後調整溫度至
25℃繼續培養並將通氣量調整至80升/分通氣速率。
2.猴頭菇菌絲體之乾重、Erinacine A測定
將上述實驗組別中各組所得之猴頭菇醱酵菌絲經冷凍乾燥，進行乾重、Erinacine A含量測定。
猴頭素A(Erinacine A)測定：
1.樣品處理：取1.0 g樣品，加人85%乙醇50 ml，以超音波震盪60分鐘進行萃取，過濾後再以85%乙醇定容至50 ml，取適量通過0.45 μm濾膜，作為分析樣品溶液。
2.分析方法：
a.標準品溶液配置
a.1.精確秤取10 mg之Erinacine A，添加甲醇溶解並定量至50 ml，配製成濃度為200 μg/ml，供作標準品儲備溶液，避光-20℃低溫保存。
a.2.線性標準品溶液配置：將Erinacine A標準品儲備溶液稀釋(如表三)並混合配置成20、60、100、140及200%濃度之Erinacine A線性標準品溶液。
a.3.將線性標準溶液由低至高分別進行檢測，得一標準曲線之線性方程式
b.高效能液相層析法(HITACHI L-2455)
b.1分離管柱，Cosmosil 5 C18-AR-Ⅱ，4.6ID*250
mm
b.2流速，1.0 ml/min。
b.3檢測波長，340 nm。
b.4溫控，40℃。
b.5注射量，20 μl。
b.6移動相條件
溶劑梯度程式設定
Y=aX+b
樣品中標準品的含量：Erinacine A 5 mg/g
C.計算
c.1依下列計算式求出檢品Erinacine A的含量。
c.2備註：a為線性方程式之斜率，b為線性方程式之截距
結果：
表四、五、六為上述實驗組別中各組所得之猴頭菇醱酵液經離心後，再經冷凍乾燥，並進行乾重和Erinacine A含量測定之結果。其中發酵過程中控制溫度組和控制組相較，其猴頭素A不易降解，且其猴頭素A之高點可維持三天，而控制溫度及通氣量組亦可大大增加猴頭素A產量。
結論：
本發明所提供之一種猴頭菇菌絲體之新穎培養方法，與傳統之習用技術相互比較，具有下列之優點：(1)於猴頭菇菌絲體培養的發酵過程中，藉由調整溫度可避免猴頭素A快速降解；(2)透過通氣量調整可使猴頭素A產量提高；(3)藉此方法所得之猴頭菇菌絲體，相較於習知之培養方法，更富功效價值。
綜上所述，本案不但在用途上確屬創新，並能較習知的培養方法增進上述多項功效，應已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。
Claims (3)
- 一種用以防止猴頭素A快速降解之猴頭菇菌絲體培養方法，該培養方法係包含下列步驟：：(1)平板培養：將菌絲體接種於馬鈴薯葡萄糖培養基(Potato Dextrose Agar)上，並於30-32℃培養14天；(2)燒瓶培養：將步驟(1)之菌絲體接種於燒瓶培養基中，並於26-30℃、pH4.3-4.7、震盪速率100-250rpm培養5-7天；(3)發酵槽培養：將步驟(2)之菌絲體接種於發酵槽培養基中，並於壓力0.1-1.5公斤/平方公分、26-30℃、pH4.85-5.15、通氣速率0.5-1vvm、槽壓0.8-1.2公斤/平方公分，培養8-16天；該燒瓶培養及發酵槽培養所使用之培養基包含豆類成分重量百分比0.5%；該豆類成分為黃豆粉、綠豆粉、大豆粉、或前述成分之混和物。
- 如申請專利範圍第1項之一種用以防止猴頭素A快速降解之猴頭菇菌絲體培養方法，其中該猴頭菇菌絲體係財團法人食品工業發展研究所寄存編號為BCRC35669之菌種。
- 如申請專利範圍第1項之一種用以防止猴頭素A快速降解之猴頭菇菌絲體培養方法，其中該猴頭素A的產量為29.65mg/g。
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