TWI605819B - Active substance for treating dementia, preparation method thereof, pharmaceutical composition containing the same, and preparation method of the pharmaceutical composition - Google Patents

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Description

治療失智症之活性物質、其製備方法、含其之醫藥組合物、及該醫藥組合物的製備方法
本發明關於一種治療失智症的活性物質、其製備方法、含其之醫藥組合物、及該醫藥組合物的製備方法，尤指一種包含猴頭菇菌絲體活性物質的醫藥組合物及其製備方法。
阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease,AD)
隨著社會的人口老化比例增高，罹患失智症的人口也跟著增加。失智症並非特指一種疾病，但約半數以上的比例為阿茲海默氏症。阿茲默氏症的患者會喪失辨識能力，喪失記憶、失去方向感、改變行為習性、妄想症、失去自制等等病狀。此疾病最為廣泛被接受的致病原因為類澱粉蛋白質在腦部積累造成神經退化。此疾病主要分為兩大類，一為家族性阿茲海默氏症，另一則為偶發性阿茲海默氏症。詳述如下：
家族性阿茲海默氏症為遺傳性疾病，其病患在21號染色體amyloid precursor protein(APP)、14號染色體Presenilin 1(PS1)、以及1號染色體Presenilin 2(PS2)上有突變。上述的基因突變會造成類澱粉蛋白質Aβ42的合成量增加，進而提高擁有該等基因突變者罹患阿茲海默氏症的機率。
偶發性阿茲海默氏症較為常見，通常好發於65歲以上的老年人，但有少數患者其發病是在65歲以前就屬於早發性阿茲海默氏 症。
類澱粉蛋白質(Amyloid beta,Aβ)
類澱粉蛋白質主要是由穿膜蛋白類澱粉蛋白質前驅物(amyloid precursor protein,APP)經由β-分泌酵素(β-secretase)及γ-分泌酵素(γ-secretase)連續切割後，所產生的代謝產物。該代謝產物常見有Aβ40及Aβ42。其中，Aβ42結構為疏水性容易相互聚集，因此當降低對於Aβ42的清除量或是增加Aβ42的生成量，皆會導致有毒性寡聚物(oligomer)的生成，進而增加神經細胞的氧化壓力，造成神經細胞產生發炎反應、神經訊息傳遞異常及鈣離子調節失去平衡等等情況。最終會導致神經細胞啟動凋亡機制，造成認知記憶等功能受損。
腦部類澱粉蛋白質降解路徑
在正常的生理狀態下，Aβ在一旦生成後會立即被酵素分解，以避免造成Aβ的過度積累，造成腦部神經元的受損。降解Aβ的酵素有胰島素降解酶(insulin-degrading enzyme,IDE)以及腦啡肽酶(Neprilysin又稱為neutral endopeptidase(NEP)或是membrane metallo-endopeptidase(MME))。
胰島素降解酶於1994年被學者發現若在高胰島素的生理環境下，胰島素會與Aβ競爭IDE，造成Aβ的降解路徑受阻，使Aβ過度堆積而產生神經毒性，說明胰島素降解酶除了有降解胰島素的能力外，亦能降解Aβ(Kurochkin&Goto,1994)。
腦啡肽酶係編碼於MME基因的酵素(因此又稱為membrane metallo-endopeptidase,MME)，其可透過水解胜肽鏈的氨基酸疏水端，使特定的胜肽賀爾蒙去活化。先前研究指出，若減少年老者大腦中生長激素抑制素(somatostatin)的產生，則會造成Neprilysin的活性被抑制，進而促成未經處理的Aβ的積累。Neprilysin在大腦中的表現量並不高，但其相關於突觸可塑性及記憶等功能，因 此對大腦的生理功能與作用物質有一定的影響。
阿茲海默治療藥物
目前的阿茲海默氏症的治療，針對病因、認知功能、或情緒症狀的控制有不同的藥物治療，然皆僅能暫時改善阿茲海默氏症的病狀，但該些藥物無法有效治癒阿茲海默症。詳述如下： 病因性治療目的在於防止或減少神經纖維糾結及類澱粉蛋白質的形成，但目前仍無有效控制藥物或方法。
認知功能藥物係抗乙醯膽鹼水解酵素，針對中重度的患者，目前衛生署核可的藥物有愛憶欣(aricept)，憶思能(exelon)、利憶靈(reminyl)、憶必佳(ebixa)。
由於大多數的失智症患者在病程中會伴隨行為或情緒等症況，例如失眠、易怒、幻覺、妄想等，因此有行為及情緒症狀的治療，該等治療藥物係安眠藥、抗鬱劑、情緒安定劑及抗精神藥物、抗癲癇藥物等。但其效益並不高，且有增加死亡率的風險，因此並不建議施用。
猴頭菇
根據『中國藥用真菌』的記載：「猴頭菇味甘、性平、能利五臟、助消化、滋補、對消化不良、神經衰退與十二指腸潰瘍及胃潰瘍有良好的功效。」，由此可知在古代醫學上已知猴頭菇具有治療疾病的效果，為藥膳兩用菌。猴頭菇學名Hericium erinaceus，其分類於真菌界(Fungi)、真菌門(Eumycota)、擔子菌亞門(Basidiomycotina)、擔子菌綱(Basidiomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、齒菌科(Hydnaceae)、猴頭菌亞科(Hericioideae)中之猴頭菌屬(Hericium)。猴頭菇在外型上，其子實體外形由長條粗糙之突起組成，而成軟圓形狀，新鮮時成白色，乾燥過後則變為黃褐色。猴頭菇子實體或菌絲體中抽出物中含有醣類(Wang et al.,2001；Yang et al.,2003)、猴頭素(Erinacines) (Saito et al.,1998；Kenmoku et al.,2002；Kenmoku et al.,2004；Watanabe et al.,2007；Watanabe and Nakada,2008；Lee et al.,2014；Li et al.,2014)、雙亞麻油酸磷酯乙烯胺(dilinoleoyl-phosphatidylethanolamine；DLPE)(Nagai et al.,2006)、胺基酸、蛋白質及微量元素(Jia et al.,2004)。在過去文獻記載中，不乏是猴頭菇多醣體具有免疫調解、降血脂、降血糖或是抑制胃部發炎及胃癌的產生的效果。猴頭菇是藥膳兩用菌。研究證實猴頭菇多醣(hericium erinaceus polysaccharide)具有抑制腫瘤細胞生長，以RAW264.7巨噬細胞為免疫調解探討，發現猴頭菇水萃取物10g/ml可誘導NO(nitric oxide)、IL1(interleukin-1)表現，且證實是透過增加NF-Kb(nuclear factor kB)結合活性，以達到免疫調解作用(Son,C.G.,et al.Int.Immunol.,1363-1369 2006)，且猴頭菇水萃取物濃度為10及100g/ml，亦可增進脾臟細胞的活性，誘導INF-γ(interferon-gamma)、IL-12(interleukin-12)的表現，進而活化自然殺手細胞(Yim,M.H et al.,Acta Pharmacol 901-907 2007)。猴頭菇含多胜肽類、酚類及其衍生物，除了可增加體內免疫功能，提高淋巴細胞活性，可誘導細胞因子及產生抗體。臨床試驗中，給予猴頭菇藥片於慢性胃炎，消化性潰瘍病人每天三次，一次3片持續60天，慢性胃炎病人痊癒率為88.89%，消化性潰瘍病人痊癒率為84.62%，總療效可達87.5%。(潘超雄等人海南醫學院學報第27卷，第六期，260-261 2004)。目前未有文獻指出猴頭菇多醣或其二級代謝物可以治療阿茲海默症的相關機制探討。
本發明的目的在於提供一種猴頭菇活性物質的製備方法，其可用於製成治療失智症的活性物質。
為達到前述目的，本發明提供之猴頭菇活性物質的製備方法包含以下的步驟： (a)取一猴頭菇菌絲體接種於一平板上，於溫度15-32℃下培養8-16天；(b)將步驟(a)培養的猴頭菇菌絲體接種於一燒瓶培養基，並於溫度20-30℃及pH值4.5-6.5下，培養3-5天；(c)將步驟(b)培養的猴頭菇菌絲體接種於一醱酵槽培養基，並於溫度24-32℃及pH值4.5-5.5下，培養8-16天，取得一猴頭菇菌絲體醱酵液；(d)將步驟(c)之該猴頭菇菌絲體醱酵液進行乾燥，獲得一猴頭菇菌絲體粉末。
較佳地，前述製備方法中的步驟(b)的培養為震盪培養，其震盪速率為100-250rpm。
較佳地，前述製備方法中的步驟(c)中醱酵槽的槽壓為0.8-1.2kg/cm2，攪拌速率為10-150rpm，且以通氣速率為0.5-1vvm通入一氣體至醱酵槽。
較佳地，前述製備方法中的該氣體為空氣、氧氣、二氧化碳、氮氣、或其組合。
較佳地，前述製備方法中的步驟(b)與步驟(c)中使用相同的培養基。
較佳地，前述製備方法中的該培養基包含綜合性碳氮源、動植物來源蛋白或其水解物、無機鹽類、醣類、酵母、麥芽抽出物、消泡劑或其組合。
較佳地，前述製備方法中的該綜合性碳氮源為穀類或豆類；該 無機鹽類為硫酸鹽類或磷酸鹽類。
較佳地，前述製備方法中的步驟(d)之該猴頭菇菌絲體粉末進一步利用一醇類溶劑萃取，獲得一猴頭菇菌絲體醇萃物。
較佳地，前述製備方法中的該醇類溶劑為30-100v/v%乙醇或30-100v/v%甲醇。
較佳地，前述製備方法中的該猴頭菇菌絲體醇萃物進一步利用水及乙酸乙酯萃取，再以管柱色層分析，獲得一猴頭素S、猴頭素A或其組合。
較佳地，前述製備方法中的該猴頭菇菌絲體活性物質為猴頭素S、猴頭素A或其組合。
本發明又提供一種治療失智症的猴頭菇菌絲體活性物質，係以如前述所述之方法製備而成。
較佳地，前述活性物質係以如部分前述方法製備時，其中該猴頭菇活性物質為粉末之型態。
較佳地，前述活性物質係以如部分前述方法製備時，其中該猴頭菇活性物質為醇萃物之型態。
較佳地，前述活性物質係以如部分前述方法製備時，其中該猴頭菇活性物質為猴頭素S、猴頭素A或其組合。
較佳地，前述活性物質係藉由增加酵素使蛋白質分解以治療該失智症。
較佳地，該酵素為胰島素降解酶(IDE)。
較佳地，該蛋白質為類澱粉蛋白質。
較佳地，該類澱粉蛋白質為Aβ40、Aβ42、Aβ36、Aβ37、Aβ38、Aβ39、Aβ41、或Aβ43。
較佳地，該失智症為阿茲海默氏症。
本發明另外提供一種治療失智症的醫藥組合物，其包含如前所述的猴頭菇菌絲體活性物質、以及生物可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑或輔劑。
本發明再提供一種製備用於治療失智症的醫藥組合物之方法，其包含有效量之猴頭菇菌絲體活性物質、以及生物可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑或輔劑。
較佳地，該猴頭菇菌絲體活性物質係以如前述部分方法製備而成。
較佳地，該猴頭菇菌絲體活性物質係包含猴頭素S、猴頭素A或其組合。
本發明另外提供一種製備用於治療失智症的醫藥組合物之方法，其包含猴頭素A、以及生物可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑或輔劑；其中該醫藥組合物係藉由增加酵素使蛋白質分解以治療該失智症。
較佳地，前述活性物質係藉由增加酵素使蛋白質分解以治療該失智症。
較佳地，該酵素為胰島素降解酶(IDE)。
較佳地，該蛋白質為類澱粉蛋白質。
較佳地，該類澱粉蛋白質為Aβ40、Aβ42、Aβ36、Aβ37、Aβ38、Aβ39、Aβ41、或Aβ43。
較佳地，該失智症為阿茲海默氏症。
第一圖顯示實施例三中，含猴頭素A樣品的HPLC分析結果。
第二圖顯示實施例四中，含猴頭素S樣品的HPLC分析結果。
第三圖顯示實施例六中，以免疫浸潤分析小鼠腦均質液中IDE和NEP的含量比例。
第四圖顯示實施例七中，以免疫組織化學分析小鼠腦組織中的類澱粉蛋白質斑塊截面積。
本發明的目的在於提供一種醫藥組合物及其製備方法，透過該製備方法得到的醫藥組合物可含有各種型態之猴頭菇菌絲體活性物質，且該醫藥組合物可藉由增加胰島素降解酶，以分解類澱 粉蛋白質，達到治療失智症的目的。
實驗方法
菌種來源：
本發明之實施例所用之猴頭菇(Hericium erinaceus)菌種，購自於食品工業研究(BCRC 35669)，但本發明所述之猴頭菇活性物質不限於由此菌種所得。
液體培養：
猴頭菇菌絲體的液體培養方式如下，其包括將菌絲體接種於平板上，於適當溫度如15-32℃，下培養約14天。接著，刮取菌絲並接種於燒瓶內，且使用下列培養基，在20-30℃、pH 4.5-6.5、振盪速率100-250rpm之下振盪培養到log期初期，3-5天。最後，將燒瓶培養物接種於醱酵槽培養基(同燒瓶培養基)內，在24-32℃，槽壓0.8-1.2公斤/平方公分，及pH約4.5-5.5，以0.5-1vvm通氣速率通入空氣，或空氣與氧氣，二氧化碳或氮氣的混合物，較佳者為空氣，在10-150rpm攪拌速率下培養8-16天，即得猴頭菇菌絲體醱酵液，其包括菌絲體與澄清液。
培養基配方如下：
其中該綜合性碳氮源可為穀類(如：麥粉、麩皮類)或豆類(如：黃豆粉、綠豆粉、大豆粉等)；其中該無機鹽類可為硫酸鎂、磷酸 氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鐵、硫酸鋅等；其中該醣類可為葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖等；其中，除上述成分外其餘為水。
於醱酵槽培養基中可額外添加消泡劑以抑制於培養過程中大量泡沫之生成，其中該消泡劑可為市售之習用消泡劑，如0.01%消泡劑如含矽油、矽樹脂之水性消泡劑。具體實施例的培養方法詳述如後。
活性物質的製備與分析
將上述所得的醱酵液進行乾燥，即可得到粉末狀的猴頭菇菌絲體活性物質，乾燥的方式可例舉如噴霧乾燥、熱風乾燥、滾筒乾燥、冷凍乾燥、或其他可適用於本發明之乾燥方法。較佳係採行冷凍乾操法，故所得之粉末狀的猴頭菇菌絲體活性物質即為菌絲體凍乾粉。進一步將該凍乾粉以醇類溶劑萃取，可得到猴頭菇菌絲體醇萃物。該等醇萃物透過水與乙酸乙酯以不同比例的方式進行萃取，將所得乙酸乙酯層再以管柱色層分析，得到含猴頭素A與猴頭素S的樣品。所得的將該含猴頭素A或猴頭素S的樣品，以HPLC與標準品比對進行定性分析。
動物實驗
購入具特定模式的基因轉殖小鼠，待飼養至特定月齡後，將該等小鼠分組，並在一固定期間內連續每天定量餵食猴頭菇活性物質。待餵食期間過後，將小鼠犧牲，並透過冷凍切片以取得腦切片，再藉由免疫組織化學偵測的方式，觀察類澱粉蛋白質在腦切片的分布情形。另一方面，取犧牲後小鼠的腦均質液進行西方墨點法，以電泳將均質液中的物質分離，再透過抗體與所欲偵測的特定蛋白質結合，即可定量均質液中所含的特定蛋白質。
實施例一：猴頭菇菌絲體的培養與其活性物質的製備
平板培養：
將菌絲體接種於平板培養基上，使用馬鈴薯糊精培養基(Potato Dextrose Agar,PDA)，於25℃下培養約7天。
燒瓶培養：
刮取平板上之菌絲接種於燒瓶內，用下列培養基，在約26℃、pH 5.0、於轉速120rpm震盪機上，震盪培養5天；
培養基配方：
醱酵槽培養：
醱酵槽培養所使用的培養基成分同燒瓶培養步驟，將燒瓶培養物接種於醱酵槽培養基內，在26℃、槽壓0.5-1.0公斤/平方公分、pH 5.0、10-150rpm攪拌速度或不攪拌(air lift)的情況下，以0.5-1.0vvm通氣速率通入空氣，培養12天。12天後，便取得醱酵液，該醱酵液中包括菌絲體與澄清液，並含有具治療失智症效果之猴頭菇活性物質。
實施例二：猴頭菇菌絲體凍乾粉的製備
該醱酵液進行冷凍乾燥後，即可得猴頭菇菌絲體凍乾粉(簡稱凍乾粉)，而20公噸之醱酵液在經冷凍乾燥處理後，可得約80公斤的凍乾粉。
實施例三：猴頭素A的萃取與分析
將猴頭菇菌絲體凍乾粉加入為凍乾粉10倍重量的甲醇進行第一次萃取，接著利用超音波震盪萃取一小時，取懸浮液進行離心，離心後取上清液。將該殘渣以甲醇進行第二次萃取，重複上述萃取步驟，取得一上清液。最後將該上清液經減壓濃縮，得膏狀的猴頭菇菌絲體醇萃物。
將猴頭菇菌絲體醇萃物經由水與乙酸乙酯以1：1的比例進行液液分配萃取，所得的乙酸乙酯層再以矽膠管柱色層分析，以正己烷/乙酸乙酯進行梯度沖提，得到12個分層，第9個分層再以矽膠管柱色層分析，以正己烷/丙酮進行梯度沖提，而得到含化合物猴頭素A(erinacine A)的樣品，再以HPLC做定性定量分析，其分析方式如下：以逆向層析管柱Cosmosil 5C18-AR-II在40℃下，用起始比例40：60之2%(v/v)醋酸及甲醇沖提，在20分鐘內逐漸提升甲醇至90體積%，流速1ml/min，UV偵測波長為340nm，猴頭素A滯留時間為17.7分鐘。該HPLC分析結果顯示於第一圖(標示為猴頭素A標準品)。第一圖中，上面的曲線為猴頭素A標準品(猴頭素A的標準品是申請人經由上述方式製備的標準品，以作為萃取物成分中，猴頭素A的定量依據)，第一圖下面的曲線則為含猴頭素A的樣品。由第一圖的結果可知，含猴頭素A的樣品於3及17.7分鐘有波峰出現，猴頭素A的標準品則在17.7分鐘出現波峰，兩相比較後可以確認17.7分鐘出現的波峰即屬猴頭素A，故猴頭菇菌絲體凍乾粉醇萃物確實具有猴頭素A之活性物質，而該含猴頭素A的樣品中的猴頭素A的定量結果為223ppm。
實施例四：猴頭素S的萃取與分析
將猴頭菇菌絲體凍乾粉加入為凍乾粉25倍重量的95v/v%乙醇進行第一次萃取，接著利用超音波震盪以震盪速率120rpm萃取一小時，取懸浮液進行離心，離心後取上清液。將該上清液以85v/v%乙醇進行第二次萃取，重複上述萃取步驟，取得一上清液。最後將該上清液經減壓濃縮，得膏狀的猴頭菇菌絲體醇萃物。
將猴頭菇菌絲體醇萃物經由水與乙酸乙酯以1：4的比例進行液液分配萃取，所得之乙酸乙酯層再以矽膠及LH-20矽膠管柱色層分析，以正己烷/乙酸乙酯進行梯度沖提，得到7個分層，第3個分層(正己烷/乙酸乙酯為3：2)再以LH-20矽膠管柱色層分析而得到含化合物猴頭素S(erinacine S)的樣品，再以HPLC做定性定量分析，其分析方式如下：以Cosmosil 5C18-AR-II管柱在40℃下，用乙腈起始60%沖提，在20分鐘內逐漸提升乙腈至65%，流速1ml/min，波長為290nm，猴頭素S約出現於14分鐘。該HPLC分析結果顯示於第二圖。第二圖中上面的曲線為猴頭素標準品(猴頭素S的標準品係申請人自行製備之標準品，以作為後續萃取物成分中，是否含有猴頭素S的判斷依據)，第二圖下面的曲線則為含猴頭素S的樣品。由第二圖的結果可知，含猴頭素S的樣品於14.827分鐘有波峰出現，其和猴頭素S的標準品在相同時間點出現波峰，故可以確認14.827分鐘出現的波峰即屬猴頭素S，故猴頭菇菌絲體凍乾粉醇萃物確實具有猴頭素S之活性物質，而該含猴頭素S的樣品中的猴頭素S的定量結果為32ppm。
前段落所述及之化合物猴頭素S為申請人所新發現的化合物，該化合物的化學結構與製備方法請參考專利文獻：台灣專利申請號：104121632。
藉由NMR得出猴頭素S氫譜與碳譜，如下表：
實施例五：實驗動物模式與猴頭菇菌絲體活性物質的餵食
從美國傑克森實驗室(Jackson Laboratory,No.005864)購入APP/PS1的基因轉殖小鼠，該小鼠具有瑞典型突變位點(Swedish KM594/595NL)的人鼠嵌合型APP基因(Mo/Hu APP695)和具有第9個外顯子(dE9)突變的人PS1基因。在上述兩種基因的共同作用下，會加速類澱粉蛋白質的產生和積累，而使得該小鼠在老年期會出現認知功能障礙等異常，而能模擬阿茲海默氏症的病理特徵與病程，是研究阿茲海默氏症常用的實驗小鼠模式。
該基因轉殖鼠的飼養與實驗程序皆依照衛生福利部國家中醫藥研究所實驗動物照護及使用委員會通過動物使用程序(IACUC No：100-A-04 and 102-417-3)來進行。將該小鼠飼養於長寬高30(W)×20(D)×10(H)公分之透明塑膠籠中，而該塑膠籠則在室溫 20-25℃和濕度60-70%的無塵自動控制室中。其中該自動控制室以自動定時器控制光照週期，07：00~19：00屬於黑暗期(dark period)，19：00~07：00屬於光照期(light period)。在此飼養期間皆正常供應飲食及飲水。
已知在上述環境下的6月齡APP/PS1基因轉殖鼠模式之腦部類澱粉蛋白質斑已明顯可見，因此在該小鼠飼養至5月齡後，隨機分組進行餵食猴頭菇活性物質的實驗。將實施例三及實施例四中取得的猴頭素A與猴頭素S以胃管的方式分別餵食該小鼠，每天餵食一次，每次餵食劑量以小鼠體重每公斤為30毫克，連續餵食30天。
實施例六：猴頭菇菌絲體活性物質對酵素的影響
以上述步驟餵食猴頭菇活性物質的5月齡小鼠，在30天餵食完成後，取出其腦組織，以Dounce Tissue Grinders將腦組織在均質緩衝液(320mM sucrose,2mM EDTA,20mM Tris-HCl(pH 7.4),1mM PMSF,5g/ml aprotinin)中。製備腦均質液。將該腦均質液(含30μg蛋白質)進行西方墨點法以得知餵食猴頭菇活性物質是否會影響小鼠腦部的酵素含量。首先，透過膠體電泳將該腦均質液中的蛋白質進行分離，接著將膠體上的蛋白質轉漬至聚偏二氟乙烯(poly vinylidene fluoride,PVDF)膜上。該轉漬有蛋白質的PVDF膜浸於阻斷緩衝液(PBS含3% normal donkey serum,1%BSA和0.3% Triton X-100)中，以阻斷非特異性結合。再將上述PVDF膜浸於作為一級抗體的兔子抗腦啡肽酶抗體(abbit anti-NEP antibody(Millipore))和兔子抗胰島素降解酶抗體(rabbit anti-IDE antibody(Millipore))中過夜。以PBS緩衝液沖洗PVDF膜，將一級抗體洗去，再浸泡於作為二級抗體的山葵過氧化酶共軛之抗兔子IgG抗體(anti-rabbit IgG antibody conjugated with horseradish peroxidase(HRP)(GE Healthcare))和山葵過氧化酶共軛之抗小鼠IgG抗體(anti-mouse IgG antibody conjugated with HRP(Jackson ImmunoResearch))中2小時。最後，以冷光反應劑(Enhanced chemiluminescence detection reagents(GE Healthcare))與螢光影像分析儀(Fujifilm LAS-3000 Luminescent Image Analyzer(Tokyo,Japan))，偵測蛋白質的訊號，並藉由事後檢定Bonferroni多重比較測定的標準差分析軟體(analysis of variance(ANOVA)with post-hoc Bonferroni multiple comparisons tests)以分析蛋白質訊號，並該等分析結果以平均值±標準差(mean±standard deviation(S.D.))表示。
上述實驗結果顯示於第三圖，其中第三圖A為以螢光影像分析儀所偵測到的螢光訊號，第三圖B及C為該訊號經軟體分析後分別為IDE及NEP的含量。第三圖A中，由左至右分別有三個組別，依序為控制組、餵食猴頭素A、以及餵食猴頭素S：這三個實驗小鼠的組別分別偵測三種蛋白質，圖中由上至下依序為腦啡肽酶(NEP)、胰島素降解酶(IDE)、以及肌動蛋白(actin)。從第三圖A可得知，餵食猴頭素A與S和控制組相比，其NEP的訊號強度類似，說明小鼠腦內的NEP含量並未因為實猴頭素A與S而有明顯改變；但餵食猴頭素A與S的小鼠的IDE的訊號強度，明顯強於控制組的訊號強度，說明餵食猴頭素A與S對小鼠腦中IDE的含量有正向的關係。第三圖B中，將控制組的IDE含量設定為百分之百，餵食猴頭素A與S的IDE含量與控制組相較皆有顯著的提升，在扣除以控制組為百分之百的IDE含量後，其提升比例分別為141.1±63.7%與130.5±68.9%。反觀第三圖C，其顯示的是小鼠腦中NEP的含量，同樣將控制組的含量設為百分之百，但餵食猴頭素A與S的組別其NEP含量與控制相組較，並未有顯著的差異。此實驗結果說明餵食猴頭素A與S對於腦中的NEP的含量並未有明顯的影響，而主是要係對於IDE含量有明顯提升的效果。
實施例七：類澱粉蛋白質在小鼠腦部的積累分析
以上述步驟餵食猴頭菇活性物質的5月齡小鼠，在30天餵食完成後，以酸鹼值7.4(pH 7.4)的生理食鹽水灌流心臟犧牲，並取出小鼠的腦部進行免疫組織的分析，以了解類澱粉蛋白在小鼠腦中的分布。首先，將取出的小鼠腦切塊浸於4℃的4%甲醛水溶液中18小時，再浸於蔗糖溶液中以保護經冷凍處理之組織，接著藉由自動浮動刀片切割腦部，得到厚度為30μm的腦切片。將該切片浸泡於阻斷緩衝液(PBS緩衝液含3%標準驢血清(normal donkey serum)、1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和0.3% Triton X-100)中6分鐘，以阻斷非特異性結合。再將上述切片浸於小鼠抗-Aβ1-16抗體(AB10,1：300,Millipore)浸泡16小時，並以螢光異硫氰酸鹽共軛之驢抗小鼠抗體(Fluorescein isothiocyanate-conjugated donkey anti-mouse IgG)於室溫下的暗室中反應2小時。最後以含0.01% Triton X-100的PBS緩衝液沖洗切片，再以封片膠Aqua Poly/Mount(Polyscience Inc.,Warrington,PA,USA)完成小鼠腦部組織貼片。將該組織貼片以Zeiss LSM 780共軛焦螢光顯微鏡(Jena,Germany)分析免疫組織化學之螢光影像，再以Image J software分析類澱粉蛋白質在腦部的沉積量。
上述實驗結果顯示於第四圖，其中第四圖A為以螢光顯微鏡所偵測到的小鼠腦中類澱粉蛋白斑塊負荷的螢光影像(綠色亮點)，可以觀察到小鼠餵以猴頭素A(HE-A)和猴頭素S(HE-S)後，其類澱粉蛋白斑塊明顯比餵食藥物載體(vehicle)的小鼠少。第四圖B為該影像的螢光訊號經軟體分析後的類澱粉蛋白斑塊面積佔腦切片面積的百分比。三個組別由左到右依序為控制組(vehicle)、餵食猴頭素A(HE-A)、以及餵食猴頭素S(HE-S)。餵食猴頭素A與猴頭素S的面積百分比明顯減少，分別為40.2±15.2%和38.1±19.7%，說明餵食猴頭素A與猴頭素S後，會 使得小鼠腦部的類澱粉蛋白質被分解，故能達到治療阿茲海默氏症的效果。
綜上所述，本發明提供之各類型態的猴頭菇之活性物質，包含猴頭菇菌絲體凍乾粉、猴頭菇菌絲體醇萃物、猴頭素S、或猴頭素A，經實驗證明具有增加IDE之功效，使得積累的類澱粉蛋白質得以被降解，而能達到治療阿茲海默氏症的效果。依照本發明的方法可製備含有猴頭菇活性物質的醫藥組合物，以廣泛應用於治療失智症之各項用途。

Claims (16)

  1. 一種治療失智症的至少包含有猴頭素S的猴頭菇菌絲體活性物質，係以如包含下列步驟的方法製備而成：(a)取一猴頭菇菌絲體接種於一平板上，於溫度15-32℃下培養8-16天；(b)將步驟(a)培養的猴頭菇菌絲體接種於一燒瓶培養基，並於溫度20-30℃及pH值4.5-6.5下，培養3-5天；(c)將步驟(b)培養的猴頭菇菌絲體接種於一醱酵槽培養基，並於溫度24-32℃及pH值4.5-5.5下，培養8-16天，取得一猴頭菇菌絲體醱酵液；(d)將步驟(c)之該猴頭菇菌絲體醱酵液進行乾燥，獲得一猴頭菇菌絲體粉末；(e)將步驟(d)之該猴頭菇菌絲體粉末進一步利用一醇類溶劑萃取，獲得一猴頭菇菌絲體醇萃物；(f)將步驟(e)之該猴頭菇菌絲體醇萃物進一步利用水及乙酸乙酯萃取。
  2. 如申請專利範圍第1項之活性物質，其中步驟(b)的培養為震盪培養，其震盪速率為100-250rpm。
  3. 如申請專利範圍第1項之活性物質，其中步驟(c)中醱酵槽的槽壓為0.8-1.2kg/cm2，攪拌速率為10-150rpm，且以通氣速率為0.5-1vvm通入一氣體至醱酵槽。
  4. 如申請專利範圍第3項之活性物質，其中該氣體為空氣、氧氣、 二氧化碳、氮氣、或其組合。
  5. 如申請專利範圍第1項之活性物質，其中步驟(b)與步驟(c)中使用相同的培養基。
  6. 如申請專利範圍第5項之活性物質，其中該培養基包含綜合性碳氮源、動植物來源蛋白或其水解物、無機鹽類、醣類、酵母、麥芽抽出物、消泡劑或其組合。
  7. 如申請專利範圍第6項之活性物質，其中該綜合性碳氮源為穀類或豆類；該無機鹽類為硫酸鹽類或磷酸鹽類。
  8. 如申請專利範圍第1項之活性物質，其中該醇類溶劑為30-100v/v%乙醇或30-100v/v%甲醇。
  9. 如申請專利範圍第1項之活性物質，進一步將步驟(f)所得之產物以管柱色層分析，獲得一猴頭素S。
  10. 如申請專利範圍第1項之活性物質，其係藉由增加酵素使蛋白質分解以治療該失智症。
  11. 如申請專利範圍第10項之活性物質，其中該酵素為胰島素降解酶(IDE)。
  12. 如申請專利範圍第10項之活性物質，其中該蛋白質為類澱粉蛋白質。
  13. 如申請專利範圍第12項之活性物質，其中該類澱粉蛋白質為Aβ40、Aβ42、Aβ36、Aβ37、Aβ38、Aβ39、Aβ41、或Aβ43。
  14. 如申請專利範圍第10項之活性物質，其中該失智症為阿茲海默氏症。
  15. 一種治療失智症的醫藥組合物，其包含如請求項第1至14項中任一項的至少包含有猴頭素S的猴頭菇菌絲體活性物質、以及生物可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑或輔劑。
  16. 一種製備用於治療失智症的醫藥組合物之方法，其包含有效量之如請求項第1至14項中任一項的至少包含有猴頭素S的猴頭菇菌絲體活性物質、以及生物可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑或輔劑。
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