WO2020138244A1

WO2020138244A1 - 認知機能改善用の組成物

Info

Publication number: WO2020138244A1
Application number: PCT/JP2019/051030
Authority: WO
Inventors: 俊二名取; 宏人駒野; 鈴木　利治; 沙緒里伴
Original assignee: 学校法人岩手医科大学; 株式会社デメンケア研究所
Priority date: 2018-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2020-07-02
Also published as: US20220096415A1; EP3903776A4; JPWO2020138244A1; EP3903776A1; AU2019415299A1

Abstract

本発明は、動物における認知機能を改善するための共役リノール酸を含む組成物を提供することを目的として、ｃ９、ｔ１１－共役リノール酸（ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡ）を含む共役リノール酸（ＣＬＡ）、又はそのグリセリドを有効成分として含む、認知機能改善用の組成物を提供する。

Description

認知機能改善用の組成物

　本発明は、認知機能改善用の組成物に関する。

　共役リノール酸（Conjugated Linoleic Acid；ＣＬＡ）は、リノール酸の異性体のうち、炭素－炭素間の二重結合が２個共役した形（－Ｃ＝Ｃ－Ｃ＝Ｃ－のように連続している。）部分構造を有するものである。ヒトは、例えば反芻動物由来の食品を介して、その食品に含まれるＣＬＡを極微量摂取している。

　ここで、ＣＬＡには体脂肪低減作用等のヒトに対して有益な作用があることが知られており、ＣＬＡを含む製品として、反芻動物由来の食品以外にも、反芻動物以外の生物由来の食品（例えば、鶏肉や鶏卵等）や人工的なサプリメントが開発されている。

国際公開第２０１８／１８６３２７号

Hunt W.T. et al. Protection of cortical neurons from excitotoxicity by conjugated linoleic acid. J. Neurochem. 115, 123-130 (2010) Lee E. et al. Effect of conjugated linoleic acid, μ- calpain inhibitor, on pathogenesis of Alzheimer's disease. Biochim. Biophys. Acta 1831, 709-718 (2003)

　また例えば、先般、本発明者のうちの一人は、センチニクバエの幼虫又は蛹に由来する脂質に、ＣＬＡの異性体の１つであるｃ９、ｔ１１－ＣＬＡが多量に含まれていることを見出した。その脂質中のｃ９、ｔ１１－ＣＬＡの純度は、従前に純度が最も高いと考えられていた反芻動物に由来する脂質中のｃ９、ｔ１１－ＣＬＡの純度よりも何倍も高かったことを見出した（特許文献１参照）。

　ここで、ＣＬＡをマウス或いはラットに投与すると、様々な生理機能を示すことが、分子レベル、細胞レベル、或いは個体レベルで検証されている。それらの生理機能として主要なものは、例えば、発ガン抑制作用、体脂肪低減作用、抗糖尿病作用、抗動脈硬化作用、免疫増強作用、骨代謝改善作用、血圧低下作用、抗リウマチ作用、抗炎症作用が挙げられる。また、それらの生理機能が発現する作用メカニズムについて、様々な説が提唱されている。ただし、アルツハイマー病に対する作用やその他の認知機能に対する作用については、分子レベル又は細胞レベルでの検証に留まり、未だに生体内に投与した際の作用を直接的に示した論文はなく、個体レベルで検証されていない。

　ＣＬＡについて、分子レベル又は細胞レベルで、一般的に神経細胞に対する作用を検証した結果を報告する論文としては、例えば非特許文献１が挙げられる。非特許文献１では、従来のＣＬＡには、その主な異性体として、ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡとｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡとがおよそ１：１の割合で含まれているところ、ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡのみが、グルタミン酸により誘導される神経細胞の過興奮状態と細胞死を阻害する作用を示し、神経保護作用があることを教示している。一方、ｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡはかかる作用を示さず、神経保護作用がないことを教示している。
　アルツハイマー病のような特定の神経疾患を念頭においた上で、ＣＬＡが神経細胞に与える作用を研究した結果を報告する論文もあるが、その検証に用いたＣＬＡは、ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡの純度が低く、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸等やＣＬＡの異性体を多量に含んだものである（非特許文献２参照）。

　しかしながら、アルツハイマー病のような特定の神経疾患を治療又は予防し得ることを念頭においた、動物における認知機能を改善するためのＣＬＡは、そもそも存在するのか、存在するとしても、どのようなものであるのかは全く明らかにされていない。また、動物中の脳神経細胞に対してＣＬＡがどのように送達することができるのかが不明であるため、個体レベルにおけるＣＬＡの挙動を分子レベル又は細胞レベルでの検証結果から推測することはできない。例えば、ＣＬＡを脳へ移行させるためには、血液脳関門（ＢＢＢ）の通過性を検討する必要があるところ、一般に脂肪酸はＭｆｓｄ２ａというトランスポーターを介してＢＢＢを透過して脳に移行するとされているが、ＣＬＡのようなトランス脂肪酸についてはその透過性は何ら明らかにされていない。なお、厳密には、脳神経細胞に対して作用する化学物質は、血液脳関門を透過したものだけではなく、脳に停留している血液中のものもあり得る。しかしながら、ＣＬＡのようなトランス脂肪酸について、認知機能を改善するための有効量を脳神経細胞に送達し得る方法は、何らの知見も存在しない。

　そこで、本発明は、上記従来技術の課題を解決するためになされたものであり、動物における認知機能を改善するためのＣＬＡを含む組成物を提供することを目的とする。

　本発明者らは、上述した従来技術の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを含むＣＬＡ又はそのトリグリセリドを有効成分として含む組成物を単に経口投与することによっても、アルツハイマー病モデルマウスにおいてその病理的特徴であるアミロイド斑の形成や、脳神経細胞のアポトーシスが顕著に抑制されることを見出し、本発明を完成させた。

　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］
　ｃ９、ｔ１１－共役リノール酸（ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡ）を含む共役リノール酸（ＣＬＡ）、又はそのグリセリドを有効成分として含む、
　認知機能改善用の組成物。
［２］
　全ＣＬＡの総量に対して、全ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを、８０質量％超含む、
　［１］に記載の組成物。
［３］
　前記組成物の総量に対して、ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを０．１質量％以上含む、
　［１］又は［２］に記載の組成物。
［４］
　全ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡに対する全ｔ１０、ｃ１２－共役リノール酸（ｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡ）の質量比が、０．２５未満である、
　［１］～［３］のいずれかに記載の組成物。
［５］
　全ｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡの含有量が、全ＣＬＡの総量に対して、２０質量％未満である、
　［１］～［４］のいずれかに記載の組成物。
［６］
　経口投与されるための、
　［１］～［５］のいずれかに記載の組成物。
［７］
　［１］～［６］のいずれかに記載の組成物を含む、ＢＡＣＥ１抑制剤。
［８］
　ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを含む共役リノール酸、又はそのグリセリドを有効成分として含む、
　認知機能改善用の食品組成物又は飼料組成物。
［９］
　認知機能改善がアミロイド斑の形成抑制又は脳神経細胞のアポトーシス抑制に関連する、［８］に記載の食品組成物又は飼料組成物。
［１０］
　認知機能改善がＢＡＣＥ１抑制に関連する、［８］又は［９］に記載の食品組成物又は飼料組成物。
［１１］
　ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを含むＣＬＡ、又はそのグリセリドを有効成分として含む、
　認知機能障害の治療又は予防に用いられる、医薬組成物。
［１２］
　認知機能障害がアミロイド斑の形成又は脳神経細胞のアポトーシスに関連する疾患である、［１１］に記載の医薬組成物。
［１３］
　認知機能改善がＢＡＣＥ１に関連する、［１１］又は［１２］に記載の医薬組成物。
［１４］
　認知機能障害がアルツハイマー型認知症である、［１１］～［１３］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１５］
　［１１］～［１４］のいずれかに記載の医薬組成物を含む、認知機能障害の治療剤又は予防剤。
［１６］
　［１１］～［１４］のいずれかに記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、
　認知機能障害の治療方法又は予防方法。

　本発明に係る認知機能改善用の組成物を用いれば、ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを含むＣＬＡ又はそのトリグリセリドを有効成分として含む組成物を単に動物に経口投与することによっても、その動物の認知機能を改善することが可能となる。

　具体的には、本発明に係る認知機能改善用の組成物は、海馬や皮質を含む脳全体の神経細胞の形成を促進する活性を有することに主に起因して、動物の認知機能を改善し、アルツハイマー病に代表される認知機能障害を治療及び予防することが可能となる。

海馬におけるアミロイドβタンパク４２（Ａβ４２）沈着を抗Ａβ４２抗体によって染色した画像から、そのＡβ４２沈着が確認された面積を定量化したグラフを示す図である。海馬におけるアポトーシス神経細胞を染色した画像から、そのアポトーシス神経細胞が確認された面積によってアポトーシス神経細胞の割合を定量化したグラフを示す図である。図３(A)は、各培地に分泌された野生型マウスAβ40を定量化したグラフを示す図である。図３(B)は、マウス及びヒトのAβ1-40のそれぞれのアミノ酸配列である。各培地における野生型マウス神経細胞のBACE1活性を定量化したグラフを示す図である。図５(A)は、野生型神経細胞のAPP、BACE1、PS1 NTF、及び膜タンパク質Flotillin量をWestern blot法での解析結果を示す図である。図５(B)は、図５(A)の結果を定量化したグラフを示す図である。 rBACE1を用いたLA及びc9、t11-CLA存在下並びにそれらの無存在下でのBACE1活性を定量化したグラフを示す図である。各培地に分泌された野生型マウスAβ40を定量化したグラフを示す図である。 ADモデルマウスを用い、c9、t11-CLAを経口摂取した場合と、それを未摂取の場合とで、皮質及び海馬におけるIL-10発現細胞を観察した結果を示す図である。

　以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。以下の本実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明はその要旨の範囲内で、適宜に変形して実施できる。

　本実施形態の認知機能改善用の組成物（以下、「本実施形態の組成物」ともいう。）は、ｃ９、ｔ１１－共役リノール酸（以下、「ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡ」ともいう。）を含む共役リノール酸（以下、単に「ＣＬＡ」ともいう。）、又はそのグリセリドを有効成分として含む。

［ＣＬＡ］
　本実施形態のＣＬＡ（後述するそのグリセリド又はスフィンゴイドを併せたものも意味する。）は、ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを含む。また、ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡに対するｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡの質量比が、０．２５未満である。ここで、「ｃ」、「ｔ」、及びそれらに続く数値は、炭素－炭素間の二重結合がシス（cis）－トランス（trans）のいずれの異性であるかと、その二重結合がカルボン酸の炭素から数えて何番目の炭素から形成されているかを示す。例えば、「ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡ」では、炭素－炭素間の二重結合がシス及びトランスの異性であって、それぞれカルボン酸の炭素から数えて９位及び１１位の炭素から形成されていることを示す。

　本実施形態のＣＬＡは、主として動物に摂取させるために用いられる。つまり、本実施形態のＣＬＡを用いることにより、動物に対して認知機能を改善する作用を生じるＣＬＡの異性体であるｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを有効成分として含み、相対的にｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡを少なく含むＣＬＡを投与することが可能である。

　また、本実施形態のＣＬＡは、簡易に製造することが可能である。これは、ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡに対するｔ１０、ｃ１２－共役リノール酸（以下、「ｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡ」ともいう。）の質量比が、０．２５未満であるＣＬＡが、例えばハエ目に属する昆虫からの抽出により、容易に得られるからである（特許文献１参照）。また、特許文献１に記載される内容は全てここに参照として取り込まれ、このようなハエ目に属する昆虫からの抽出を含めたＣＬＡの製造方法を本実施形態において使用することできる。

　本実施形態のＣＬＡとは、リノール酸の異性体のうち、炭素－炭素間の二重結合が２個共役した形（－Ｃ＝Ｃ－Ｃ＝Ｃ－のように連続している。）の部分構造を有するものを意味し、それにその他の脂質等の不純物を含んだものも包含する。ＣＬＡは、Ｃ_１８Ｈ_３２Ｏ_２で表される化合物であり、理論的には２８種類の異性体が存在する。具体的なＣＬＡの異性体としては、例えば、ｃ９、ｃ１１－ＣＬＡ、ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡ、ｔ９、ｃ１１－ＣＬＡ、ｔ９、ｔ１１－ＣＬＡ、ｃ１０、ｃ１２－ＣＬＡ、ｃ１０、ｔ１２－ＣＬＡ、ｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡ、ｔ１０、ｔ１２－ＣＬＡ、ｔ１１、ｔ１３－ＣＬＡが挙げられる。

　ＣＬＡは、反芻動物の第一胃に存在する微生物の働きで牧草中のリノール酸（ｎ－６）から生成されるため、反芻動物由来の従来の食品を通じて摂取することができる。しかしながら、この種の食品中のＣＬＡの量は極めて少なく、多いものでも脂肪１ｇ当たり５ｍｇ程度である。

　日本を含め諸外国で、ＣＬＡの体脂肪低減作用に注目した肥満解消用サプリメントとしてＣＬＡ製品が市販されている。市販されているＣＬＡ製品は、天然素材から抽出したものではなく、高リノール酸タイプの紅花油等をアルカリ異性化して人工的に合成したものである。つまり、このように人工的に合成した従来のＣＬＡ製品においては、例えばｃ９、ｔ１１－ＣＬＡが３７．０質量％であり、ｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡが３８．４質量％であり、他のＣＬＡ異性体やパルミチン酸、オレイン酸等の残分であるように構成されている。

　ＣＬＡを動物が摂取することにより示す生理作用は、主として動物実験で検証されており、その生理作用としては、例えば、発癌抑制作用、体脂肪低減作用、抗糖尿病作用、抗動脈硬化作用、免疫増強作用、骨代謝改善作用、血圧低下作用、及び抗リウマチ作用の有益な生理作用が挙げられる。これらの有益な生理作用は、主にｃ９、ｔ１１－ＣＬＡに起因し、一部の有益な生理作用（例えば、体脂肪低減作用）はｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡにも起因する。よって、従来の異性体を多量に含むＣＬＡを用いた検証では、ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを有効成分とした生理作用がどのようなものであるかは明らかにできない。

　ｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡには、上記の有益な生理作用と一部共通する生理作用（例えば、顕著な体脂肪低減作用）が認められるものの、動物に対して有益な作用以外にも、高インスリン血症や脂肪肝の誘発、ｅｒｂＢ－２遺伝子高発現型における乳癌の発癌作用、癌転移の促進、臓器の肥大化等の有害な生理作用が認められる。特に女性が肥満解消用サプリメント等で長期にわたってｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡを摂取する場合、乳癌発症の危険性増大の可能性が指摘されている。
　次に、ｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡの脳神経細胞に対する作用としては、ｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡが神経幹細胞の増殖を阻害することが挙げられる（非特許文献３：Ham Wang et al. Isomer-specific effects of conjugated linoleic acid on proliferative activity of cultured neural progenitor cells. Mol. Cell. Biochem. 358. 13-20 (2011)）。一方で、本実施形態の組成物に用いられるｃ９、ｔ１１－ＣＬＡは、ｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡの異性体でありながら、ｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡとは全く逆の活性として、神経幹細胞の増殖を促進する活性を有することを見出した。なお、神経幹細胞が増殖しなければ、神経細胞は形成されないため、神経細胞の形成に、ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡが関与している可能性がある。

　本実施形態のグリセリド又はスフィンゴイドは、グリセリンの有するヒドロキシ基に対してＣＬＡがエステル結合した化合物（例えば、トリグリセリド）、又は、スフィンゴシンの有するアミノ基若しくはヒドロキシ基に対してＣＬＡがアミド結合若しくはエステル結合した化合物である。このような化合物は、例えば、ＣＬＡが後述する昆虫に由来する場合に、遊離型のＣＬＡと共に抽出物として得られる。得られた抽出物から、公知の方法を用いて、遊離型のＣＬＡのみ、又は、そのグリセリド若しくはスフィンゴイドのみをさらに抽出することもできる。また、グリセリド又はスフィンゴイドは、上述したエステル結合やアミド結合を形成する骨格を有するものであれば特に限定されず、例えば、リン酸や糖がさらに結合した化合物であってもよく、塩を形成している化合物であってもよい。

　本実施形態のＣＬＡにおいて、全ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡに対する全ｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡの質量比（ｔ１０、ｃ１２／ｃ９、ｔ１１）は、０．２５未満であり、好ましくは０．２０以下であり、より好ましくは０．１５以下であり、さらに好ましくは０．１０以下であり、よりさらに好ましくは０．０５以下である。

　本実施形態のＣＬＡは、ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを含み、全ＣＬＡの総量（１００質量％）に対して、好ましくは全ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを８０質量％超含み、より好ましくはｃ９、全ｔ１１－ＣＬＡを８５質量％以上含み、さらに好ましくは全ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを９０質量％以上含み、よりさらに好ましくは全ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを９５質量％以上含み、さらにより好ましくは全ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを９８質量％以上含む。

　本実施形態のＣＬＡにおける全ｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡの含有量は、全ＣＬＡの総量（１００質量％）に対して、好ましくは２０質量％未満であり、より好ましくは１５質量％未満であり、さらに好ましくは１０質量％未満であり、よりさらに好ましくは５．０質量％未満である。

　本明細書において、「全ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡ」とは、遊離型のｃ９、ｔ１１－ＣＬＡ、並びにそのトリグリセリド及びスフィンゴイドを、全て遊離型のｃ９、ｔ１１－ＣＬＡに換算したものを意味する。また、「全ｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡ」及び「全ＣＬＡ」についても、それぞれ「全ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡ」と同様に、遊離型のもの、並びにそのトリグリセリド及びスフィンゴイドを、全て遊離型のものに換算したものを意味する。

　本実施形態の組成物は、当該組成物の総量に対して、好ましくはｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを０．０１質量％以上含み、より好ましくは０．１質量％以上含む。

［用途］
　本実施形態のＣＬＡ、並びにそのグリセリド及びスフィンゴイドを有効成分として含む組成物は、主として動物の認知機能を改善するために用いられる。そのことを実現するために、認知機能を改善するために用いられる食品（特に、機能性表示食品）若しくは飼料、又は認知機能障害の治療又は予防に用いられる医薬品として提供することができ、それぞれの場合に、本実施形態の組成物は食品組成物、飼料組成物、又は医薬組成物である。「動物」は、特に限定されないが、例えば哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ウマ、サル、ブタ等）であり、特にヒトである。ここで本願明細書における「医薬品」は、治療剤及び予防剤を含む概念である。

　本実施形態の食品組成物、飼料組成物、又は医薬組成物は、上記の本実施形態のＣＬＡを含み、食品、飼料、又は医薬品に許容できる担体や添加物をさらに含むことができる。

　担体及び添加物の例として、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等の薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられるがこれらに限定されない。

　本実施形態の食品組成物又は飼料組成物は、粉末剤、カプセル剤（ハードカプセル、ソフトカプセル）、マイクロカプセル剤、シロップ剤、丸剤、又は錠剤の形態で提供することができる。
　本実施形態の医薬組成物は、その投与経路によって様々な形態とすることができ、例えば粉末剤、カプセル剤（ハードカプセル、ソフトカプセル）、マイクロカプセル剤、シロップ剤、丸剤、錠剤、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、坐剤等とすることができる。

　本実施形態の食品組成物又は飼料組成物は、認知機能を改善するために用いられるが、より具体的には、アミロイド斑の形成抑制又は脳神経細胞のアポトーシス抑制に関連する認知機能、或いはＢＡＣＥ１抑制に関連する認知機能を改善するために用いられる。ここで、「ＢＡＣＥ１」は、β-site APP cleaving enzyme 1の略称であり、細胞内で主にエンドソームやゴルジ体等の小胞内でＡＰＰのβ切断サイトを切断するアスパラギン酸プロテアーゼである。また、ＡＰＰは、Amyloid Precursor Proteinの略称であり、アミロイド斑の形成に寄与するアミロイドβの前駆体であるアミロイド前駆体タンパク質である。
　本実施形態の医薬組成物は、認知機能障害を治療又は予防するために用いられるが、より具体的には、アミロイド斑の形成又は脳神経細胞のアポトーシスに関連する認知機能障害、或いはＢＡＣＥ１に関連する認知機能障害を治療又は予防するために用いられ、その中でも、アルツハイマー型認知症を治療又は予防するために用いられることが好ましい。ここで「認知機能障害」とは、脳神経細胞に関連する障害を意味する。

　本実施形態のＣＬＡ、並びにそのグリセリド及びスフィンゴイドを有効成分として含む組成物は、ＢＡＣＥ１抑制剤とすることも可能であり、特に脳神経細胞におけるＢＡＣＥ１抑制剤とすることが好ましい。

　ここで、従来のＣＬＡと動物における神経細胞との関係性については、上述した非特許文献２を参照することが可能であるが、本実施形態の組成物は、従来のＣＬＡと比較して、ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを有効成分として機能する程度に高い純度で含むことにより、認知機能の改善及び認知機能障害の治療又は予防を図ることが可能である。

［治療方法又は予防方法］
　本実施形態の認知機能障害の治療又は予防方法は、本実施形態の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む。ここで、「対象」とは、主として上述した動物のうち、認知機能障害に罹患したものであり、特にヒトの当該認知機能障害の患者である。

　本明細書において、「治療又は予防」とは、疾患の治癒や寛解に加え、発症の防止又は遅延、疾患の進行の防止又は遅延、及び疾患に関連する少なくとも１つの症状の緩和のうち、少なくとも１つを生じさせることを意味する。

　上述した治療方法又は予防方法を含めて、本実施形態の組成物を動物に投与する方法としては、動物の脳神経細胞に作用できる限り、どのような方法で投与してもよく、例えば、経口投与、経鼻投与、経粘膜投与、経膣投与、経眼投与、又は直腸内投与の投与方法が挙げられる。特に、本実施形態の組成物は、単に経口投与で投与することによっても動物の脳神経細胞に作用し得るため、簡易に対象に投与することができる点で優れる。

　以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下で特に断りのない限り、「％」は、質量％を意味する。

実施例１
〔飼料の調製〕
　通常のマウス飼料に、2.0%(w/w)のヒマワリ油及び0.4%(w/w)のc9、t11-CLAを混ぜたものを実験飼料、2.4%(w/w)のヒマワリ油のみを混ぜたものを対照飼料とした。
・ヒマワリ油（商品名「NIKKOL　ヒマワリ油」、脂肪酸組成としてパルミチン酸：6.7%、オレイン酸：17.9%、ステアリン酸：4.0%、リノール酸（CLAは含まれていない）：69.8%、リノレン酸：0.9%、和光純薬社）
・c9、t11-CLA（純度98%、ABCAM社）
・通常のマウス飼料（CLAは含まれていない）

〔ADモデルマウスの飼育〕
　Swedish変異とIndiana変異を持つヒトAPP過剰発現マウスのオス７匹とメス９匹（Jacksonlaboratory社）を、誕生から生後６ヶ月齢までは通常のマウス飼料で飼育し、アルツハイマー病（AD）モデルマウスとして用いた。これらのADモデルマウスを、上記実験飼料でオス３匹及びメス４匹、上記対照飼料でオス４匹及びメス５匹を、それぞれ８ヶ月間飼育した。その後、ADモデルマウスを剖検し、脳のアミロイド斑、神経細胞アポトーシスの状況を定量的に判定した。この結果を図１及び２に示す。

　図１は、それぞれの検体について、海馬におけるアミロイドβタンパク42（Aβ42）沈着を抗Aβ42抗体によって染色した画像から、そのAβ42沈着が確認された面積を定量化したグラフを示す図である。
　図２は、それぞれの検体について、海馬における、アポトーシス神経細胞を染色した画像から、そのアポトーシス神経細胞が確認された面積によってアポトーシス神経細胞の割合を定量化したグラフを示す図である。

　図１及び図２に示すように、実験飼料を与えたADモデルマウスでは、脳の海馬領域のアミロイド斑の面積、及びアポトーシスを起こした神経細胞の割合は顕著に減少しており、対照飼料を与えたADモデルマウスのそれの50%以下になっていたことが確認できた。

　以上のように、c9、t11-CLAを含むCLAを有効成分として含む組成物には、経口的に投与することによって、ADモデルマウスのアミロイド斑形成を減少せしめ、さらに海馬又は皮質における神経細胞アポトーシスを抑制するという、未知の属性があることを初めて明らかにした。なお、このような作用効果を発現するためには、多様な分子メカニズムの積み重ねによることが推察される。

実施例２－１（CLAによるAβ産生抑制、BACE1活性低下）
　野生型マウス（C57BL6/J）胎仔脳から大脳皮質及び海馬の神経細胞を単離し、2％ B-27 Supplement (Invitrogen), 4mM Glutamax I, 5% heat-inactivated horse serum を含むNeurobasal Medium中で培養した（その他の詳細な条件は非特許文献４：Chiba et al., [2014] Mol. Biol. Cell 25, 3569-3580中に記載される方法と同様におこなった。）。

　上記の方法で9－12日間培養（DIV9-12）した初代培養神経（5 x 10⁵ cells）を、Linoleic Acid（LA　Sigma-Aldrich社「L1376」）10uMを添加した培地及びc9、t11-CLA（純度98％、ABCAM社）10uMを添加した培地のそれぞれで24時間培養し、それぞれの検体を得た（n=3~6の実験を3回行った）。その後、LA及びc9、t11-CLAを用いた検体のそれぞれについて、培地中に分泌されたマウスアミロイドβタンパク40（Aβ40）をサンドイッチエライザ法（sELISA）で定量した。マウスAβ40は、Aβ40のC末断端特異抗体4D1（非特許文献５：Tomita et al., [1988] J, Biol. Chem. 273, 6277-6284に記載されるもの）で捕捉(capture)した後、HRP（Horseradish peroxidase）標識したマウス/ラットAβ(1-16)配列特異抗体(ウサギ)のIgG Fab'フラグメント(IBL社：免疫生物研究所) を反応させ、TMB（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン）を発色基質として定量した結果を図３(A)に示す。図3(A)では、LA添加時のAβ40分泌量を1.0とし、c9、t11-CLA添加時のAβ40分泌量を定量化した。c9、t11-CLA添加神経細胞ではLA添加神経細胞と比較してAβの生成・分泌量が有意に低下した。

　内在性のAβ前駆体タンパク質APP（Amyloid-β precursor protein）から生成するAβ42量は通常極めて少量であるため、マウス野生型神経細胞から分泌したAβ42の正確な定量は難しい。そこで、マウスのAβ配列をヒト型に変え(図3(B)にマウス及びヒトのアミノ酸)、Aβ42の産生量を増やす家族性アルツハイマー病遺伝子変異を導入したノックインマウス(App^tm3.1Tcs/App^tm3.1Tcs)（以下、APP-KIマウスと呼ぶ非特許文献６：Saito et al [2014] Nature Neuroscience 17, 661-663に記載されるマウスと同様である。）の神経細胞を上記と同様に培養し、図3(A)と同じ実験を行い分泌したヒト型Aβ42を定量した(非特許文献７：Kimura, Hata, Suzuki [2016] J. Biol. Chem. 291, 24041-24053)。野生系マウス神経と同様に、ヒト型Aβ42の分泌量はLA処理神経と比較してc9、t11-CLA処理神経で有意(p<0.05)に低下した（図示はしない。）。

　上記、図3に示す実験で用いた野生型マウス神経細胞のBACE1活性を、β-Secretase (BACE1) Activity Assay Kit (Abcam社「ab65357」)を用いて、そのマニュアルに従って測定した。その結果を図４に示す。LA添加神経細胞と比較してc9、t11-CLA添加神経細胞では、BACE1活性が有意に低下していた。上記APP-KIマウスの神経細胞でもBACE1活性について同様の結果を得た。

　LA及びc9、t11-CLAを添加した野生型神経細胞のAPP(Aβの前駆体でBACE1の基質になる)、BACE1、PS1 NTF (BACE1が切断したAβ配列を含むAPPのC末側断片である CTFβを切断してAβを生成する酵素γセクレターゼの触媒ユニット)、及び膜タンパク質Flotillin （対照タンパク）量をWestern blot法で解析した。細胞全体をRIPA buffer (組成　: 50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 150 mM NaCl, 0.5%SDS, 0.5% sodium deoxycholate, 1% Nonidet P-40)で溶解し、抽出液(15 μg protein)タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動後、抗体を用いたウエスタンブロット法でAPP (抗体名　G369, 非特許文献８：Oishi et al. [1997] Mol. Med. 3, 111-123に記載されるものと同様である。), BACE1 ( 抗体名 D10E5. Cell Signaling Technology社 ), PS1 NTF( 抗体名　Ab14,非特許文献９：Thinakaran et al. [1996] Neuron, 17, 181-190に記載されるものと同様である )及びFlotillin-1 (抗体名　610821,BD Bioscience社)を解析した。抗体と反応したタンパクは、Clarity Western ECL substrate (Cat #170-5061; Bio-Rad)で検出し、LAS-4000 (Fujifilm)で定量した。その結果を図5に示す。APP, BACE1, PS1 NTF　量は、Flotillin量と共に、LAを用いた場合及びc9、t11-CLAを用いた場合で有意差は認められない。

実施例２－２（c9、t11-CLAが直接BACE1に作用しないこと）
　c9、t11-CLAが直接BACE1に作用し活性を変化させるかどうか、組み換え体BACE1(rBACE1, catalog number 931-AS; R&D Systems, Mineapolis, MN, USA)を用いて、LA及びc9、t11-CLA存在下並びにそれらの無存在下でBACE1活性を測定した（図６）。rBACE1にDMSO（ジメチルスルホキシド）に溶解した100 μMのLA及びc9、t11-CLAを加え37oCで１５分間インキュベート後、発色基質を加え37℃で1時間インキュベートを行って、BACE1活性を測定した。その結果、溶媒であるDMSOだけに比べてLA及びc9、t11-CLAで活性が上昇したが、LAとc9、t11-CLAの間で活性に有為な差は認められなかった。この結果、c9、t11-CLAはBACE1に直接作用しないことが明らかになった。LA及びc9、t11-CLA添加による活性の上昇は、膜タンパク質であるBACE1が脂質の添加により安定化するためであると考えられる。

　図3は、c9、t11-CLAが神経細胞に作用してAβの分泌を抑制する結果である。ADマウスモデルにおいてc9、t11-CLA投与マウスでアミロイドプラークが減少する原因の1つとして、c9、t11-CLAによるAβの産生低下機能が考えられる。さらに図4は、c9、t11-CLA添付した神経細胞におけるBACE1活性の低下を示す結果である。Aβの減少はc9、t11-CLAがBACE1の活性を低下させ留事に起因すると考えられる。

　図5から得られた結果によれば、c9、t11-CLAは、基質であるAPP, APP切断酵素であるＢＡＣＥ１及びPS1 NTFの神経細胞内量に影響を与えない。また図6からLA及びc9、t11-CLAは、BACE1活性に直接作用しない。これは、c9、t11-CLAが神経細胞に作用して、間接的にBACE1によるAPP切断を低下させ、Aβの生成を抑制している事を示す新規な発見である。BACE1活性を直接阻害する化合物は、他の基質の切断も抑制するため、副作用が生じるために実用化されていない。c9、t11-CLAはBACE1に直接作用することなく、BACE1活性を低下させることでAβの産生を抑え、結果的にADの病理を抑制する新規なAD抑制効果を持つ物質であると理解出来る。

実施例２－３
　t10、c12-CLA 10uMを添加した培地を加えて、それぞれで48時間培養し、それぞれの検体を得た以外は、実施例２－１と同様の方法で行った。その結果を図３(A)と同様に、図７に示す。

実施例３
　実施例１と同様のADモデルマウスを用い、c9、t11-CLAを経口摂取した場合と、それを未摂取の場合とで、皮質及び海馬におけるIL-10発現細胞を観察した。その結果を図８に示す。
　図８の結果から、海馬でIL-10産生細胞の数が増加していることから、抗炎症性サイトカインIL-10が増加していると考えられる。
・リン酸化タウ蛋白の染色　：有意差は認められなかったが、
　　　　　　　　　　　　　　海馬で減少傾向があった。
・アストロサイトの染色　　：有意差が認められなかったが、
　　　　　　　　　　　　　　海馬で減少傾向があった。
・ミクログリア（Iba1染色）：海馬、皮質ともに
　　　　　　　　　　　　　　有意にCLA摂取群では増加した。
・抗炎症性サイトカインIL-10：有意にCLA摂取群の海馬でIL-10発現細胞が増加した。
　以上より、c9、t11-CLA摂取で活性化ミクログリアが上昇し、海馬でIL-10産生細胞の数が増加することから、抗炎症性サイトカインIL-10が増加していると考えられる。

　本発明に係る組成物は、食品（例えば、ヒト用食品及び愛玩動物用食品、特に、機能性表示食品）、飼料（例えば、飼養動物用飼料）、医薬品（例えば、ヒト用医薬品及び愛玩動物用医薬品）等の分野で有用である。

Claims

　ｃ９、ｔ１１－共役リノール酸（ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡ）を含む共役リノール酸（ＣＬＡ）、又はそのグリセリドを有効成分として含む、
　認知機能改善用の組成物。
　全ＣＬＡの総量に対して、全ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを、８０質量％超含む、
　請求項１に記載の組成物。
　前記組成物の総量に対して、ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを０．１質量％以上含む、
　請求項１又は２に記載の組成物。
　全ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡに対する全ｔ１０、ｃ１２－共役リノール酸（ｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡ）の質量比が、０．２５未満である、
　請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
　全ｔ１０、ｃ１２－ＣＬＡの含有量が、全ＣＬＡの総量に対して、２０質量％未満である、
　請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
　経口投与されるための、
　請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
　請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物を含む、ＢＡＣＥ１抑制剤。
　ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを含む共役リノール酸、又はそのグリセリドを有効成分として含む、
　認知機能改善用の食品組成物又は飼料組成物。
　認知機能改善がアミロイド斑の形成抑制又は脳神経細胞のアポトーシス抑制に関連する、請求項８に記載の食品組成物又は飼料組成物。
　認知機能改善がＢＡＣＥ１抑制に関連する、請求項８又は９に記載の食品組成物又は飼料組成物。
　ｃ９、ｔ１１－ＣＬＡを含むＣＬＡ、又はそのグリセリドを有効成分として含む、
　認知機能障害の治療又は予防に用いられる、医薬組成物。
　認知機能障害がアミロイド斑の形成又は脳神経細胞のアポトーシスに関連する疾患である、請求項１１に記載の医薬組成物。
　認知機能改善がＢＡＣＥ１に関連する、請求項１１又は１２に記載の食品組成物又は飼料組成物。
　認知機能障害がアルツハイマー型認知症である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　請求項１１～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、認知機能障害の治療剤又は予防剤。
　請求項１１～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、
　認知機能障害の治療方法又は予防方法。