DE69831223T2

DE69831223T2 - Gefriergetrocknete zusammensetzung des menschlichen,morphogenen knochenproteins mp52

Info

Publication number: DE69831223T2
Application number: DE69831223T
Authority: DE
Inventors: Mitsuko Iruma-shi INAGAKI; Hideki Kawagoe-shi ICHIKAWA
Original assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Current assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Priority date: 1997-01-30
Filing date: 1998-01-29
Publication date: 2006-02-16
Also published as: WO1998033514A1; HU226554B1; JP4209948B2; ATE302021T1; EP0972520A1; IL130967A0; AU5679198A; DK0972520T3; AP983A; HUP0002386A3; KR20000070586A; DE69831223T9; RS49691B; CN1244127A; NO993702L; NO993702D0; EA199900694A1; YU34999A; HUP0002386A2; NO322334B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine lyophilisierte Zusammensetzung des humanen knochenmorphogenen Faktors MP52 und ein Herstellungsverfahren dafür. Insbesondere betrifft diese Erfindung eine lyophilisierte Zusammensetzung, welche den humanen knochenmorphogenen Faktor MP52 und Mannitol enthält, sowie ein Herstellungsverfahren dafür.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die cDNA des humanen knochenmorphogenen Faktors MP52 wurde zum ersten Mal 1994 als Osteogenese-assoziierter Faktor isoliert, der in die TGF-β-Superfamilie einklassifiziert wurde (Biochem. Biophy. Res. Comm., Band 204, Nr. 2, 1994). Dann ermöglichte es ein hochentwickeltes gentechnologisches Verfahren, den humanen knochenmorphogenen Faktor MP52 zu erhalten, ohne dessen knochenmorphogene Aktivität zu zerstören (WO 95/33215). Der humane knochenmorphogene Faktor MP52 wird unter lyophilisierten Bedingungen gelagert. Dies ist jedoch mit dem Nachteil verbunden, dass während der Lagerung eine Volumenverringerung (Schrumpfung) erfolgt, und dass zum Zeitpunkt der Rekonstitution eine Kohäsion des Pulvers auftritt.
Mit dem Ziel der Überwindung der oben beschriebenen Probleme werden Aminosäure, Saccharide oder Polyole für BMP-2 verwendet, welches ein in dieselbe TGF-β-Superfamilie einklassifiziertes Protein ist und Eigenschaften aufweist, die dem humanen knochenmorphogenen Faktor MP52 am ähnlichsten sind (JP-A Nr. HEI 6-508777 = US 5,597,897 ). EP 0 567 391 offenbart ein biologisch abbaubares Abgabesystem für TGF-β zur Knochenregenerierung. Ein solches System enthält TGF-β stabilisiert in einer Zusammensetzung durch einen Puffer aus organischer Säure, zu welchem zusätzliche Komponenten hinzugefügt wurden. EP-A-0 597 101 beschreibt eine stabilisierte humane monoklonale Antikörperzubereitung. US 5,464,614 beschreibt eine stabilisierte Superoxid-Dismutase-(SOD)-Zusammensetzung, enthaltend als Zusatzmittel Cyclodextrin und entweder einen Zucker oder einen Zuckeralkohol.
Die in den beiden zuletzt genannten Anmeldungen beschriebenen Proteine unterscheiden sich beträchtlich von MP52, welches ein knochenmorphogener Faktor ist. Für solche knochenmorphogene Faktoren existierten die oben genannten Nachteile des Schrumpfens während der Lagerung und Kohäsion für im Stand der Technik bekannte Zusammensetzungen. Die Erfinder versuchten daher, aus verwandtem Stand der Technik bekannte Zusätze für den humanen knochenmorphogenen Faktor MP52 anzuwenden, konnten jedoch die obigen Probleme nicht überwinden. Insbesondere wurde beschrieben, dass zum Zeitpunkt der Rekonstitution eine Kohäsion beobachtet wurde, selbst wenn neutrale oder basische Aminosäuren, wie etwa Alanin, Valin oder Lysin, zu dem humanen knochenmorphogenen Faktor MP52 in einer Menge von 0,5 bis 2,5% vor der Lyophilisierung hinzugegeben wurden. Wenn ein Saccharid, wie etwa Saccharose oder Dextran, in einer Menge von 0,5 bis 1% hinzugefügt wurde, gefolgt von der Lyophilisierung, beobachtete man eine Farbentwicklung bis hin zu schwach gelblichem Grün sowie Schrumpfung des lyophilisierten Produkts. Wenn ein Polyalkohol, wie etwa Sorbitol, in einer Menge von 0,5 bis 1% hinzugegeben wurde, gefolgt von der Lyophilisierung, löste sich der humane knochenmorphogene Faktor MP52 während der Zeitdauer der Lyophilisierung, was es unmöglich machte, ein lyophilisiertes Produkt herzustellen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben eine ausgedehnte Untersuchung vorgenommen mit dem Ziel, die oben beschriebenen Probleme zu überwinden. Als Ergebnis wurde gefunden, dass, wenn Mannitol zum humanen knochenmorphogenen Faktor MP52 hinzugegeben wird, gefolgt von der Lyophilisierung, weder eine Verfärbung noch eine Schrumpfung während der Lagerung des lyophilisierten Produkts beobachtet wird, und zum Zeitpunkt der Rekonstitution keine Kohäsion auftritt, was zum Erhalt der vorliegenden Erfindung führte.
Die vorliegende Erfindung stellt daher eine lyophilisierte Zusammensetzung des humanen knochenmorphogenen Faktors MP52 bereit, die den humanen knochenmorphogenen Faktor MP52 und Mannitol enthält. Vorzugsweise wird als humaner knochenmorphogener Faktor MP52 in der vorliegenden Erfindung ein durch gentechnologische Verfahren, die in WO 96/33215 offenbart sind, hergestellter humaner knochenmorphogener Faktor MP52 (der nachfolgend hierin "rhMP52" genannt wird) verwendet. Als Mannitol wird vorzugsweise das im japanischen Arzneibuch als D-Mannitol bezeichnete Mannitol verwendet. Der humane knochenmorphogene Faktor MP52 und Mannitol werden vorzugsweise in einem Gewichtsverhältnis von 1 : 5–50 gemischt.
Die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch Lyophilisieren einer wässrigen Mischlösung aus humanem knochenmorphogenen Faktor MP52 und Mannitol durch ein herkömmliches Verfahren hergestellt werden. Insbesondere ist die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung erhältlich durch Hinzufügen einer vorbestimmten Menge von Mannitol zu einer wässrigen Lösung des aufgereinigten humanen knochenmorphogenen Faktors MP52, Vermischen und Filtern der resultierenden wässrigen Mischlösung, Abfüllen des Filtrats in ein steriles Gefäß und Durchführen der Lyophilisierung.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird einem Patienten in einer für eine therapeutische Behandlung wirksamen Menge verabreicht, nachdem sie zur Injektion in destilliertem Wasser oder einer schwachen Säure (etwa pH 3), beispielsweise einer Salzsäurelösung oder Zitronensäurepuffer, zur Verwendung gelöst wurde. Die bevorzugte Menge an in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung vorhandenem Mannitol wurde durch einen Stabilitätstest bestimmt. Der Stabilitätstest wurde gemäß einem Verfahren durchgeführt, welches in der Anleitung für das Standardbetriebsverfahren auf der Grundlage des japanischen Arzneibuchs XIII beschrieben ist, wo Eigenschaften, wie etwa Aussehen und Klarheit der Lösung, Elektrophorese und Wassergehalt, am Anfangszeitpunkt des Tests und 3 Monate später sowie ektopische Knochenbildung nach 6 Monaten beobachtet oder gemessen wurden.
Im Ergebnis wurde keine Veränderung in den Eigenschaften, wie etwa Aussehen und Klarheit der Lösung, am Anfangszeitpunkt des Tests und 3 Monate später beobachtet. Nach den Ergebnissen der Messung bezüglich der Elektrophorese und des Wassergehalts war die Mannitol im oben genanten Gewichtsverhältnis enthaltende Zubereitung sowohl am Anfangszeitpunkt des Tests als auch 3 Monate später stabil. Man sagt, dass der bevorzugte Wassergehalt eines lyophilisierten Produkts im Allgemeinen 2% oder weniger beträgt. Aus den obigen Erkenntnissen leitete man ab, dass eine den humanen knochenmorphogenen Faktor MP52 enthaltende Zusammensetzung, die Mannitol in einer Menge von 5 bis 50 mg, vorzugsweise 10 mg pro 1 mg humanem knochenmorphogenen Faktor MP52 enthält, als pharmazeutisches Produkt bevorzugt ist.
Zusätzlich wurde die ektopische Knochenbildung jeder der lyophilisierten Zusammensetzungen aus dem humanen knochenmorphogenen Faktor MP52, enthaltend jeweils 10, 25 und 50 mg Mannitol, nach einer Lagerung für 6 Monate gemessen. Im Ergebnis wurde eine ektopische Knochenbildung mit jeder Zusammensetzung beobachtet, unabhängig von der Lagerungstemperatur und der Menge an Mannitol. Auf der Grundlage der oben beschriebenen Testergebnisse wurde bestätigt, dass die Zugabe von Mannitol zum humanen knochenmorphogenen Faktor MP52 vor der Lyophilisierung keine nachteiligen Auswirkungen auf den humanen knochenmorphogenen Faktor MP52 hat und dass die resultierende Zusammensetzung für eine lange Zeit stabil bleibt.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend durch die folgenden Beispiele genauer beschrieben.
Beispiel 1 Herstellung einer rhMP52-Zusammensetzung
Zu 1 mg/ml einer wässrigen Lösung aus aufgereinigtem rhMP52, welches durch den in WO 96/33215 offenbarten Herstellungsprozess erhalten wurde, wurde D-Mannitol des Japanischen Arzneibuches in einer Menge von jeweils 10, 25 und 50 mg hinzugegeben, und es wurde gemischt. Nachdem das resultierende Gemisch durch einen 0,22 μm Membranfilter gefiltert worden war, wurden 1 ml-Portionen des so erhaltenen Filtrats in Gefäße steril abgefüllt. Sie wurden lyophilisiert, wobei eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in Form eines pharmazeutischen Produkts erhalten wurde.
Beispiel 2 Stabilitätstest der rhMP52-Zusammensetzung
Die in Beispiel 1 erhaltene lyophilisierte rhMP52-Zusammensetzung wurde in ein Fläschchen (luftdicht, transparent) abgefüllt und jeweils bei 2–8°C, 25°C und 40°C gelagert. Die Stabilität wurde auf der Grundlage der folgenden Kriterien nach einer dreimonatigen Lagerung ausgewertet. Die Kriterien für die Auswertung waren wie folgt:
Eigenschaften:
(Aussehen): Die Zusammensetzung, die in Form eines weißen Kuchens verblieb und sich nicht verfärbte, wurde als "unverändert" eingestuft.
(Klarheit der Lösung): Eine Lösung aus der in 1 ml destilliertem Wasser zur Injektion gelösten Zusammensetzung wurde als "unverändert" eingestuft, wenn sie farblos, transparent und kohäsionsfrei war.
(Elektrophorese): Die Reinheit einer Hauptbande wurde aus einem Flächenprozentsatz berechnet, nachdem ein Bild durch einen Film-Scanner eingebracht wurde, welcher die Transmission unter Verwendung eines roten Films aufnimmt, und durch anschließendes Auffinden der integrationsoptischen Dichte (IOD) in % jeder Bande.
(Wassergehalt): Der Wassergehalt der Zusammensetzung wurde durch einen Mikro-Feuchtigkeitsmesser gemessen.
Als Ergebnis betreffend die Eigenschaften verblieb die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung im Aussehen und Klarheit der Lösung unverändert, während in einem lyophilisierten Produkt aus rhMP52 allein eine Kohäsion beobachtet wurde. Als Ergebnis der Elektrophorese zeigte jede Zusammensetzung eine gute Stabilität (%). Die Messergebnisse des Wassergehalts (%) sind in Tabelle 1 dargestellt, welche zeigt, dass es unter den Zusammensetzungen keine große Änderung im Wassergehalt (%) gibt. Tabelle 1 zeigt, dass im Vergleich mit dem lediglich aus rhMP52 hergestellten Produkt der Wassergehalt jeder der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zum Zeitpunkt der Herstellung oder nach der Lagerung geringer ist, und dass daher eine Schrumpfung kaum auftritt.
Tabelle 1
Beispiel 3 Ektopische Knochenbildung von rhMP52
Ein Gefäß (1 mg/Gefäß), enthaltend die in Beispiel 1 erhaltene rhMP52-Zusammensetzung, wurde jeweils bei 4°C und 25°C für 6 Monate gelagert. Anschließend wurde 1 ml destilliertes Wasser für die Injektion zu dem Gefäß hinzugegeben, wobei eine Lösung für die Verabreichung hergestellt wurde. Die so hergestellte Lösung wurde intramuskulär an eine ICR-Maus verabreicht (erhalten von Nippon Crea Co., Ltd.), in einer Menge von 20 μg/20 μl. Zwei Wochen später wurde über sanfte Röntgenphotographie (n = 2) das Vorhandensein oder die Abwesenheit ektopischer Knochenbildung beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
Das lyophilisierte Produkt des humanen knochenmorphogenen Faktors MP52 zeigt Probleme dahingehend, dass es verfärbt ist oder es während der Lagerung schrumpft und dass es zum Zeitpunkt der Rekonstitution der Kohäsion unterliegt. Die erfindungsgemäße lyophilisierte Zusammensetzung ist jedoch frei von solchen Problemen. Der humane knochenmorphogene Faktor MP52 bleibt in der erfindungsgemäßen lyophilisierten Zusammensetzung stabil, und es wird bezüglich der Reinheit, des Wassergehaltes und der ektopischen Knochenbildung selbst nach einer Lagerung über längere Zeit keine wesentliche Veränderung beobachtet. Somit ist die vorliegende Erfindung im Bereich der pharmazeutischen Produkte anwendbar.

Claims

Rekonstituierte Zusammensetzung des humanen knochenmorphogenen Faktors MP52, abgeleitet von einer lyophilisierten Zusammensetzung, welche ein Gemisch aus dem humanen knochenmorphogenen Faktor MP52 und Mannitol in einem Mischungsverhältnis im Bereich von 1 : 5–50 (Verhältnis nach Gewicht) umfasst.
Rekonstituierte Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der humane knochenmorphogene Faktor MP52 durch gentechnologische Verfahren hergestellt wurde.
Verfahren zur Herstellung einer rekonstituierten Zusammensetzung des humanen knochenmorphogenen Faktors MP52, erhalten aus einer lyophilisierten Zusammensetzung, umfassend Hinzufügen von Mannitol zu einer wässrigen Lösung des aufgereinigten humanen knochenmorphogenen Faktors MP52 in einer Menge, um ein Mischungsverhältnis von humanem knochenmorphogenen Faktor MP52 zu Mannitol im Bereich von 1 : 5–50 (Verhältnis nach Gewicht) zu ergeben, und anschließendes Lyophilisieren der resultierenden vermischten Lösung, und Rekonstituieren der lyophilisierten Zusammensetzung.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der humane knochenmorphogene Faktor MP52 durch gentechnologische Verfahren hergestellt wurde.