CN100522241C - 在低氧气浓度下用骨诱导蛋白包被的金属植入物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生产装置的方法，包括以下步骤(a)提供包括溶解的骨诱导蛋白的溶液，(b)让上述步骤的溶液与包括金属或金属合金表面的载体接触，(c)允许所述溶解的蛋白对所述载体的表面进行包被，和(d)对在步骤(c)中获得的包被的载体进行干燥，其中，步骤(b)-(d)是在降低浓度的氧气条件下进行的。本发明还涉及可以通过本发明方法获得的装置。另外，本发明涉及包括所述装置的药用组合物，并且涉及所述装置用于制备用来加速骨整合和新骨形成的药用组合物的用途。最后，本发明涉及包括本发明装置的试剂盒。

Description

在低氧气浓度下用骨诱导蛋白包被的金属植入物
本发明涉及用于生产装置的方法，包括以下步骤(a)提供包括溶解的骨诱导蛋白(osteoinductive protein)的溶液，(b)让上述步骤的溶液与包括金属或金属合金表面的载体接触，(c)用所述溶解的蛋白对所述载体的表面进行包被，和(d)对在步骤(c)中获得的包被的载体进行干燥，其中，步骤(b)-(d)是在降低浓度的氧气条件下进行的。本发明还涉及可以通过本发明方法获得的装置。另外，本发明涉及包括所述装置的药用组合物，并且涉及将所述装置用于制备用来加速骨整合和新骨形成的药用组合物的用途。最后，本发明涉及包括本发明装置的试剂盒。
在过去几十年中，披露了改善植入物质量的多种方法，所述质量涉及骨植入物接触和它们的生物兼容性。对植入物的要求是非常严格的，因为这些装置必须牢固地固定在骨骼上，并且对诸如高压的条件(例如牙齿，关节)来说是稳定的。植入之后最初的组织反应取决于从周围组织中释放的特殊生长因子的存在，这些因子能刺激细胞生长和分化。
尽管业已完善了牙齿植入物的固定方法，但仍然存在植入物经长时间使用之后松动的倾向。业已披露了多种方法，以便改善相应的植入物的整合(骨整合)。所述方法包括用生物可降解的材料(例如，磷酸三钙，羟磷灰石)对不同来源的植入物(例如，陶瓷，金属，或其它材料，参见EP-B1 0 657 146)的植入物进行包被，以及各种用于对金属表面进行蚀刻的各种方法。提供纳米和微米范围的表面不规则性，以便改善胶原和细胞向内生长(T.Albrektsson in：Handbook ofBiomaterials(Black，J and Hastings，G(eds.)，Chapman & Hall，London，1998，pp500-512)。
披露了用陶瓷表面对金属植入物进行包被，例如，两种粉末的混合物：一种金属粉末和一种含有磷酸钙的粉末(EP 0467948)，在烧结工艺中将其加工成植入物材料。
业已披露了多种生产复合陶瓷材料的其它烧结方法(Offenlegungsschrift DE 2928007，美国专利4,882,196)。主要关注点在于用诸如磷酸三钙或羟磷灰石等磷酸钙对金属表面进行包被(Y.Tsui，1998)，它能够改善所述植入物的整合(美国专利6,312,472；美国申请A-20020038149)。所披露的磷酸钙和多种其它无机医用材料具有成孔的特征。据说，这些孔有助于植入物整合到天然骨骼中(WO 00/72776；美国专利4,051,598；EP 0806211，H.Jennissen，2001)，因为天然骨骼会生长到所述孔中，与此同时，降解所述植入物的无机磷酸钙层(WO 96/10370；WO 01/97679)。除了所述组合材料之外，还披露了包括多层的植入物，其中，所述植入物的下层通常包括金属或合金，如钛或钛合金(WO 98/43550；WO00/72777)，用一层磷酸钙进行包被(EP 0478532)。通常，用磷酸钙包被是通过以下方法实现的：水热处理(EP 0548365)，或浸泡和沉淀(美国专利6,129,928，WO 97/41273)或等离子喷涂(美国专利5,697,997，美国专利6,113,993，EP 0548365，EP 0739191，Lichtinger，2001)。
位于所述植入物主体上的磷酸钙层可以是一层内的材料混合物的一部分(WO 98/48862，美国专利5,934,287；美国申请A-20020033548)或是多层形式(WO 02/09788，美国专利6,322,728)的一部分。
除了所述表面的改进之外，披露了若干种方法，其中，将蛋白或蛋白混合物(主要是生长因子)涂在整形外科或牙齿植入物上。据说，所述蛋白能显著加快植入物的整合(Lichtinger，2001；Shah，1999)。披露了若干种用于将蛋白直接涂敷在金属表面上的若干种方法。不过，这些方法具有若干缺陷，特别是蛋白从所述金属表面上的迅速释放，这不能够将所述蛋白保持诱导骨形成所需要的时间(Lichtinger，2001)。
为了避免所述蛋白的迅速释放(自发分解)，K.Endo(1995)和Voggenreiter等(2001)披露了通过与所述金属表面共价结合固定所述蛋白。保持了相应蛋白的活性。不过，所述共价结合可能诱导结构变化，这种变化会影响蛋白的免疫原性。
很多研究者业已指出，用于软骨内骨形成的生骨因子的成功的植入，需要所述蛋白与合适的载体材料或基质结合，所述材料能够将所述蛋白保持在使用部位上(美国专利5,344,654)。为了克服以上困难，美国专利5,258,029披露了“本发明的生骨蛋白通常以生骨有效量与可以药用的固体或液体载体一起配制。所述制剂优选包括能够提供用于形成骨骼和软骨的结构的基质。潜在的基质可以是生物可降解的或生物不可降解的，并且可以是化学或生物学定义的”。干燥TGF-β-蛋白和所述载体的悬浮液，然后涂敷在所述带负荷的假体上。所述方法的缺陷是，来自动物的胶原或无机成分的使用，有可能在植入期间磨损。
Lichtinger等(2001)披露了克服所述蛋白被迅速清洗掉的其它方法，该作者用chromosulfuric acid处理所述钛合金表面，以便获得超强亲水性生物粘性表面。不过，在生产医学制品或医疗装置期间，应当避免使用chromosulfuric acid，因为保留在所述表面上的残留量的这种酸，能导致所述蛋白的氧化，造成随后的结构和功能改变，并且还可能造成对患者的损伤。
在WO 00/72777和WO 00/72778中披露了其它方法，这些方法使用了depot，所述depot是通过在所述钛表面的厚的氧化层的孔的排列或通过内部空间，通道或凹槽形成的。不过，众所周知的是，蛋白倾向于在存在金属和金属离子的情况下被氧化(Li等(1997)，Ann.Occup.Hyg.41，suppl.1，379-383)。因此，上述装置的缺陷可能是，所述蛋白在所述植入物的表面上被氧化。这种氧化可能导致结构变化，结构变化可能导致免疫原性反应的形成。
因此，本发明所要解决的技术问题是提供改进骨骼扩充的工具。
所述技术问题通过权利要求书中所限定的实施方案得到了解决。
因此，本发明涉及用于生产装置的方法，包括以下步骤：
(a)提供包括溶解的骨诱导蛋白的溶液；
(b)让步骤(a)的溶液与包括金属或金属合金表面的载体接触；
(c)允许所述溶解的蛋白对所述载体的表面进行包被；和
(d)对在步骤(c)中获得的包被的载体进行干燥，
其中，步骤(b)-(d)是在降低浓度的氧气条件下进行的。
术语＂制造＂除了包括明确所述提到的步骤之外，还包括诸如包装等的其它制造步骤。本发明的方法优选是作为借助于合适的自动仪器的自动化制造方法进行的。术语“生产”和“制造”在本发明的含义范围内是可以交换使用的。
本发明所使用的术语＂装置＂表示包括至少两个部分的实体。其中的一个部分是载体。
可以在本发明含义范围内使用的载体包括固体载体，如全金属或合金载体，以及金属或合金基质。另外，本发明涵盖包括空腔和间隙的固体载体。另外，优选地，由于大型和小型孔的形成，所述载体具有大的表面。所述大孔或小孔优选局限于所述载体的表面层。本发明还涉及包括至少两个不同部分的载体，其中，将金属或合金部分用作核心或核心层，并且，例如陶瓷材料用作表面层。所述载体表面对骨诱导蛋白具有高亲和力，不过，仍然允许在体内释放所述蛋白。根据本发明，所述载体优选是下文所披露的金属或合金。本发明装置所包括的载体可以制成合适的形式，以便在体内使用所述装置。其中包括植入物或完整的外科用假体的形成。正如下文将要更详细地说明的，所述假体优选是用金属表面制成的或用金属表面包被。假体是用钛或钛合金诸如钛合金或不锈钢制成的。
正如下面将要详细说明的，所述装置的另一个部分是具有骨诱导特性的蛋白或多肽。将所述蛋白或多肽固定在所述载体的表面上。所述蛋白或多肽与所述载体的结合优选是可逆的。因此，设想具有骨诱导特性的蛋白或多肽不通过共价结合结合在所述载体的金属表面上的。结合优选是通过静电相互作用，疏水或非静电相互作用如范德华力实现的。由于所述骨诱导蛋白的可逆的结合，所述装置一旦与诸如骨腔等合适的体内环境接触，就能够溶解所述蛋白。所述蛋白的溶解优选是允许所述蛋白扩散到环绕所述装置的组织中的缓慢释放。因此，正如在所述实施例中证实的，所述装置允许骨诱导和天然蛋白的局部存在，这种存在能加快新骨的形成，和骨骼向所述基质表面的向内生长。本发明的装置可以是植入物，这意味着，本文所使用的术语“装置”和“植入物”是可以互换的。众所周知的是，术语＂植入物＂表示由本发明提供的每一种装置，它被设计成完全或部分位于上皮表面下面(Koeck，B.和Wagner，W.(Eds.)1996)。所述植入物可以是扁平的，致密的或具有复杂的形状，即可以使用任何常用的或可操作的装置。上述植入物可以包括从例如被用于取代长骨或作为人工牙齿的基础的简单的圆柱形状，到被用于取代头扁平骨和诸如臀部，膝盖或肘部等人工关节的扁平植入物。
正如下面所披露的，用所述骨诱导蛋白对本发明的装置进行包被，是为了启动和促进间充质干细胞转化成成骨细胞和软骨细胞。因此，希望仅仅对本发明装置的朝向相应的骨骼组织的部分进行包被。所述部分优选是整个表面或至少其与所述骨骼组织对合的部分。例如，被用于取代缺少的牙齿的牙齿植入物，包括要拧入颌骨的带螺纹的部分以及被用于锚定人工齿冠的延长部分(牙槽)。因此，只需要用所述骨诱导蛋白对所述带螺纹的部分进行包被。不过，没有用所述骨诱导蛋白包被的部分可以用其它制剂包被，如磷酸钙类，胶原或类似制剂。
术语＂骨诱导＂表示将间充质干细胞和前-成骨细胞转化成成骨细胞的能力。骨诱导的先决条件是由所述装置分配到周围组织中的信号，在这里，激活了上述造骨细胞前体和其它间充质细胞。本文所说的骨诱导包括间充质细胞分化成骨前体细胞-造骨细胞。另外，骨诱导还包括所述成骨细胞分化成骨细胞-骨骼的成熟的细胞。因此，骨诱导需要将未分化的或欠分化的细胞分化成能形成骨骼的骨细胞。如上文所述，在植入之后，本发明所使用的骨诱导蛋白从所述装置中缓慢地释放，并且有效地分配到周围组织中。另外，本发明所涵盖的蛋白和多肽具有体内骨诱导特性。例如，本领域众所周知的是，转化生长因子-β(TGF-β)超家族包括具有骨诱导特性的成员。在下文列举了具有特别好的骨诱导特性的所述TGF-β超家族的不同的成员。总之，本发明装置的骨诱导蛋白存在于它的表面上，并且在从所述载体上释放出来之后，可以发挥对于所述装置植入部位周围组织的骨细胞前体的骨诱导信号的作用。
术语＂骨诱导蛋白＂或如上文所述，表示具有骨诱导特性的转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员，如生长和分化因子-5；参见下文。令人吃惊的是，正如在所述实施例中证实的，所述骨诱导蛋白表现出对金属表面的高亲和力。对所述金属表面的这种吸附过程的重要的前提条件是，所述蛋白在所述包被溶液中具有足够的溶解度。
本发明的装置或植入物优选是如上文所披露的任何类型的金属表面。在所述含有溶解的骨诱导蛋白的溶液与含有本文所披露的金属或金属合金表面的载体接触之前，希望所述相应的金属表面优选是清洁过的或处理过的，以便除去任何表面污染物，并且促进所述涂层的良好的粘着强度。适用于这一目的的若干种方法为本领域所熟知，并且还在所述实施例中进行了说明。例如，本发明的装置的所述金属表面可以用，例如，丙酮，诸如乙醇等烷基醇漂洗，然后用无菌蒸馏水或去离子水充分漂洗。
本发明的装置优选由于进行了多孔的、珠状的或网状的表面修饰具有较大的表面。这种修饰可以通过本领域众所周知的方法导入，包括化学或机械方法。另外，业已证实了具有纳米和微米范围不规则性的增加的表面，有利于骨整合。
披露了多种用于将药用制品中的蛋白稳定化的方法。不过，支持本发明的实验证实了在液体或冷冻干燥蛋白制剂中进行蛋白稳定化的众所周知的技术，不能直接适用于吸附到金属表面上的蛋白。按照上面所提到的现有技术中所披露的方法将蛋白涂敷在诸如钛或钛合金等金属表面上，导致出现修饰类型的蛋白，这会导致所述蛋白氧化或聚集(详情参见实施例5)。另外，即使是添加还原性试剂，也不能减少氧化蛋白的量(详情参见实施例10)。由于本发明的方法，可以生产出这样的装置，在植入之后，能够有效地扩充骨骼。有利的是，可以避免由于氧化蛋白的增强了的免疫原性所导致的诸如炎症等不利的副作用。另外，本发明的方法在生产本发明的医疗装置时允许使用花费较少的时间，并且更节省成本的生产工艺，因为不需要用磷酸钙或胶原层对所述植入物的金属或合金主体进行包被。本发明的另一个优点是，所述生产工艺中排除了潜在的污染材料，如可能传播传染性病毒的胶原。
在本发明方法的优选实施方案中，步骤(b)-(d)是在低于10vol％氧气的氧气浓度下进行的，所述氧气浓度优选低于5％，最优选低于2％。
在本发明方法的另一种优选实施方案中，步骤(b)-(d)是在低于25℃的温度下进行的，优选低于15℃，最优选低于8℃。
在本发明方法的另一种优选实施方案中，所述金属或金属合金是钛或钛合金。
本发明的金属/金属合金优选是生物兼容性的。术语“生物兼容性的”表示对生物学系统没有毒性或损害作用的品质(Williams，D.F.1999)。特别是对于包括下文所提到的成分的钛或钛合金来说，所述特性是已知的。
更优选的是，所述钛合金是包括至少50％钛的钛合金。更优选的是，所述钛合金是Ti-Al-V-合金，Ti-Al-Fe合金，Ti-Al-Nb-合金或Ti-Mo-Zr-Al-合金，最优选Ti6Al4V。
在本发明方法的另一种优选实施方案中，所述包被是通过将所述金属表面浸泡在所述蛋白溶液中进行的。
在本发明方法的另一种优选实施方案中，所述包被是通过将所述蛋白溶液滴在所述金属表面上进行的。
作为优选实施方案，本发明还包括这样一种方法，其中，所述包被是通过将所述蛋白溶液喷洒在所述金属表面上进行的。
术语＂干燥＂包括除去在用所述骨诱导蛋白对所述载体进行包被之后仍然存在的液体，如多余的缓冲溶液。干燥优选是通过真空或冷冻干燥实现的。
在本发明方法的另一种优选实施方案中，所述干燥是通过在惰性气流中在室温下蒸发实现的。
在本发明方法的另一种优选实施方案中，所述骨诱导蛋白是TGF-β家族的成员。
术语＂TGF-β家族的成员＂包括所述蛋白的生物学活性，成熟的类型，以及相应的原形(proforms)，即原蛋白(proproteins)，其包括所述TGF-β家族的成员的相应的原结构域(prodomain)，正如在下面更详细地披露的。
业已证实生长和分化因子的TGF-β家族参与了多种生物学过程，包括骨形成。所述家族的所有成员都是分泌的多肽，包括特征性的结构域结构。在所述TGF-β家族成员的最N-末端包括信号肽或分泌前导序列。在该序列的C-末端是原结构域和所述成熟的多肽的序列。所述成熟的多肽的序列包括七个保守的半胱氨酸，其中的六个是形成分子内二硫键所必需的，其中的一个是两个多肽的二聚体化所需要的。所述生物学活性的TGF-β家族成员是二聚体，优选包括两个成熟的多肽。所述TGF-β家族成员通常是作为前蛋白原分泌的，除了所述成熟的序列之外，它还包括前(信号序列)-和原序列。所述信号序列和原结构域是在细胞外被切除的，并且不是所述信号传导分子的一部分。不过，业已报导过所述原结构域可能是所述成熟的多肽的细胞外稳定化所必须的。有关TGF-β超家族的成员的综述，披露于以下文献中：WozneyJM，Rosen V(1998)：在骨形成和修复中的骨形态发生蛋白和骨形态发生蛋白基因家族，Clin Orthop 346：26-37。所述TGF-β家族成员的氨基酸序列可以从众所周知的数据库获得，如通过互联网从一下网址(http://www.expasy.ch/sprot/sprot-top.html)获得。所述TGF-β家族的具有特别高的成骨潜力的成员BMP2，BMP7和GDF-5的前原形式的氨基酸序列，分别在SEQ ID No：1-3中示出。
在本发明范围内，术语＂TGF-β家族成员＂或下面所提到的所述家族的蛋白，包括所述蛋白或成员的所有生物学活性变体，以及所有变体和它们的无活性前体。因此，仅包括成熟序列蛋白以及包括成熟蛋白和原结构域或成熟蛋白，前结构域和前导序列的蛋白，以及它们的生物学活性片段，都属于本发明的范围。可以通过生物学测定方法方便地测定TGF-β成员的片段是否具有生物学活性，例如，参见KatagiriT，Yamaguchi A，Ikeda T，Yoshiki S，Wozney JM，Rosen V，WangEA，Tanka H，Omura S，Suda T，(1990)：通过重组人骨形态发生蛋白-2诱导非成骨小鼠多能细胞系C3H10T1/2分化成造骨细胞，Biochem.Biophys.Res.Commun.172：295-299或Nishitoh H，IchijoH，Kimura M，Matsumoto T，Makishima F，Yamaguchi A，YamashitaH，Enomoto S，Miyazono K(1996)：生长/分化因子-5的I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的鉴定，J.Biol.Chem.271：21345-21352。
优选的是，本发明的生物学活性可以通过在所述实施例中披露的体内模型确定。另外，本发明涉及所述TGF-β成员的变体，这些变体的氨基酸序列与本文所提到的TGF-β家族成员的氨基酸序列，特别是SEQ ID Nos.1-3中任意一项所示出的序列的相同性为至少75％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％。
更优选的是，所述TGF-β家族的成员是BMP亚家族的成员。
业已证实了所述骨形态发生蛋白(BMP)亚家族的成员特别参与了骨组织的诱导和重塑。BMPs最初是从骨基质中分离的。所述蛋白特征在于它们的在异位诱导新骨形成的能力。各种体内研究证实了通过BMPs能促进前体细胞的骨发生和软骨发生，并提出在骨骼发育期间每一种BMP分子具有不同作用的可能性。有关BMPs的分子和生物学特性的更多的细节，披露于以下文献中：Wozney JM，Rosen V(1998)：在骨形成和修复中骨形态发生蛋白和骨形态发生蛋白基因家族，ClinOrthop 346：26-27，Schmitt J，Hwang K，Winn，SR，Hollinger J(1999)：骨形态发生蛋白：对基础生物学和临床相关性的更新，JOrthop Res 17：269-278和Lind M(1996)：生长因子：可能的新的临床工具。综述。Acta Orthop Scan d67：407-17。
最优选的是，所述BMP家族的成员是BMP2或BMP7。BMP2的前原形式的氨基酸序列保藏在Swiss-Prot，保藏号为P12643，并且如下文所示。1-23号氨基酸相当于信号序列，24-282号氨基酸相当于前肽，而283-396号氨基酸相当于成熟蛋白。BMP7的前原形式的氨基酸序列保藏在Swiss-Prot，保藏号为P18075，或者如SEQ ID No：2所示。1-29号氨基酸相当于前导序列，30-292号氨基酸相当于原形，而293-431号氨基酸相当于成熟蛋白。优选的是，BMP-2或BMP7分别表示所述前原形式，所述原形，或表示成熟的BMP-2或BMP7肽。
另外，还包括具有基本上相同的生物学活性，优选骨诱导特性的所述蛋白的片段。下面提供了有关BMP2和BMP7的更多的序列信息。BMP2的原形的氨基酸序列被命名为proBMP-2，并且特别可以从SwissProt中检索到，编号为Pro BMP2_HUMAN；P12643，并且还在SEQID NO：4中示出。在SEQ ID NO：5中示出了rhproBMP2的氨基酸序列，包括位于N-末端的额外的His-标记。rhproBMP-2是人pro-BMP-2的重组形式。
在SEQ ID NO：4中示出的rhproBMP-2和在SEQ ID NO：5中示出的包括N-末端His-标记的rhproBMP-2，都特别可应用于所附实施例中。不过，所述实施例并不分别局限于SEQ ID NO：4或5。本文下面所提供的实施例还可以用本文所披露的任何其它氨基酸序列实施。
另外，更优选的是，所述TGF-β家族的成员是GDF亚家族的成员。
业已证实了，生长和分化因子(GDF)特别参与了骨组织的诱导和重塑。生长分化因子5(GDF-5)，又被称为软骨衍生的形态发生蛋白1(CDMP-1)，是BMP家族的亚类的成员，该家族还包括其它相关的蛋白，优选GDF-6和GDF-7。所述蛋白的成熟的形式是27kDa的同源二聚体。各种体内和体外研究证实了在哺乳动物骨骼的不同的形态学特征形成期间GDF-5的作用。GDF-5的突变导致了骨骼异常，包括肢体长骨长度的减少，在肢体和胸骨中异常的关节发育(Storm & Kingsley(1999)，Development Biology，209，11-27)。小鼠和人之间的氨基酸序列是高度保守的。
所述GDF亚家族的成员优选是GDF-5。在最优选的实施方案中，所述GDF-5是重组GDF-5(rhGDF-5)，正如在下面更详细地披露的。
GDF-5的前原形式的氨基酸序列保藏在Swiss-Prot，保藏号为P43 0 26，或者如SEQ ID No：3所示。1-27号氨基酸相当于前导序列，28-381号氨基酸相当于原形，而382-501号氨基酸相当于成熟蛋白。GDF-5优选表示所述前原形式、所述原形、或表示成熟的GDF-5肽。
另外，还涵盖具有大体上相同的生物学活性，优选骨诱导特性的GDF-5片段。在更优选的实施方案中，所述片段包括SEQ ID No：3所示出的序列的383-501号氨基酸。预计，上述TGF-β家族成员的任何组合，都可能用于在本发明方法中所使用的溶液中。以下表格示出了BMP-2，BMP-7和GDF-5的前原形式的氨基酸序列：
人BMP-2的前原形式(Swiss-ProtPrim.保藏号P12643)；SEQID No.1：
关键词  从   至   长度
信号    1    23   23
PROPEP  24   282  259
hBMP2   283  396  114
         |          |          |          |          |          |
FGLKQRPTPS RDAVVPPYML DLYRRHSGQP GSPAPDHRLE RAASRANTVR SFHHEESLEE
       130        140        150        160        170        180
         |          |          |          |          |         |
LFETSGKTTR RFFFNLSSIP TEEFITSAEL QVFREQMQDA LGNNSSFHHR INIYEIIKPA
       190       200        210         220        230        240
         |          |          |          |          |           |
TANSKFPVTR LLDTRLVNQN ASRWESFDVT PAVMRWTAQG HANHGFVVEV AHLEEKQGVS
       250       260        270        280         290       300
        |           |         |          |          |         |
KRHVRISRSL HQDEHSWSQI RPLLVTFGHD GKGHPLHKRE KRQAKHKQRK RLKSSCKRHP
      310        320        330        340          350      360
         |          |          |         |             |        |
LYVDFSDVGW NDWIVAPPGY HAFYCHGECP FPLADHLNST NHAIVQTLVN SVNSKIPKAC
     370          380       390
       |            |         |
CVPTELSAIS MLYLDENEKV VLKNYQDMVV EGCGCR
参考文献
[1]核酸序列。
MEDLINE＝89072730；PubMed＝3201241；
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[2]292-396的X-射线晶体学(2.7)。
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＂人骨形态发生蛋白-2在2.7分辨率下的晶体结构＂；
J.Mol.Biol.287：103-115(1999)。
人BMP-7的前原形式(Swiss-Prot Prim.保藏号：P18075)；
SEQ ID No.2：
关键词   从   至    长度
信号     1    29    29
PROPEP   30   292   263
hBMP-7   293  431   139
         10         20         30         40        50         60
         |          |          |          |         |          |
MHVRSLRAAA PHSFVALWAP LFLLRSALAD FSLDNEVHSS FIHRRLRSQE RREMQREILS
        70         80          90        100        110        120
         |         |           |         |          |          |
ILGLPHRPRP HLQGKHNSAP MFMLDLYNAM AVEEGGGPGG QGFSYPYKAV FSTQGPPLAS
        130        140        150        160         170      180
         |         |           |         |           |        |
LQDSHFLTDA DMVMSFVNLV EHDKEFFHPR YHHREFRFDL SKIPEGEAVT AAEFRIYKDY
         190         200        210         220        230      240
         |           |           |          |          |        |
IRERFDNETF RISVYQVLQE HLGRESDLFL LDSRTLWASE EGWLVFDITA TSNHWVVNPR
         250        260        270        280         290      300
         |          |          |          |         |           |
HNLGLQLSVE TLDGQSINPK LAGLIGRHGP QNKQPFMVAF FKATEVHFRS IRSTGSKQRS
          310        320       330       340         350       360
          |          |         |          |           |         |
QNRSKTPKNQ EALRMANVAE NSSSDQRQAC KKHELYVSFR DLGWQDWI IA PEGYAAYYCE
         370         380        390      400          410       420
         |           |          |        |            |         |
GECAFPLHSY MNATNHAIVQ TLVHFTNPET VPKPCCAPTQ 
Figure C03821447D0018084935QIETU
 
Figure C03821447D0018084945QIETU
        430
        |
Figure C03821447D0018181702QIETU
参考文献
[1]核酸序列，以及部分序列。
组织＝胎盘；
MEDLINE＝90291971；PubMed＝2357959；
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[3]293-431的X-射线晶体学(2.8
Figure C03821447D0019181850QIETU
)。
MEDLINE＝96149402；PubMed＝8570652；
Griffith D.L.，Keck P.C.，Sampath T.K.，Rueger D.C.，Carlson W.D.；
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人GDF-5的前原形式(Swiss-Prot Prim.保藏号：P43026)；SEQ ID No.3：
关键词   从     至   长度
信号     1      27   27
PROPEP   28     381  354
hGDF-5   382    501  120
         10         20         30         40         50        60
         |          |          |          |          |         |
MRLPKLLTFL LWYLAWLDLE FICTVLGAPD LGQRPQGSRP GLAKAEAKER PPLARNVFRP
         70         80         90         100       110        120
         |          |          |          |         |          |
GGHSYGGGAT NANARAKGGT GQTGGLTQPK KDEPKKLPPR PGGPEPKPGH PPQTRQATAR
         130        140        150        160        170       180
         |          |          |          |          |         |
TVTPKGQLPG GKAPPKAGSV PSSFLLKKAR EPGPPREPKE PFRPPPITPH EYMLSLYRTL
          190      200        210        220        230        240
          |        |          |          |          |          |
SDADRKGGNS SVKLEAGLAN TITSFIDKGQ DDRGPVVRKQ RYVFDISALE KDGLLGAELR
          250       260       270        280         290       300
          |         |         |          |           |         |
ILRKKPSDTA KPAVPRSRRA AQLKLSSCPS GRQFAALLDV RSVPGLDGSG WEVFDIWKLF
          310       320        330       340         350       360
          |         |          |         |           |         |
RNFKNSAQLC LELEAWERGR TVDLRGLGFD RAARQVHEKA LFLVFGRTKK RDLFFNEIKA
          370       380        390        400        410        420
          |         |          |          |          |          |
RSGQDDKTVY EYLFSQRRKR RAPLATRQGK RPSKNLKARC SRKALHVNFK DMGWDDWI IA
          430       440        450        460        470       480
          |         |          |          |          |          |
PLFYEAFHCE GLCEFPLRSH LEPTNEAVIQ TLMNSMDPES TPPTCCVPTR LSPISILFID
        490        500
         |        |
Figure C03821447D0020182055QIETU
参考文献
[1]核酸序列
组织＝胎盘；
MEDLINE＝95071375；PubMed＝7980526；
Hoetten G.，Neidhardt H.，Jacobowsky B.，Pohl J.；
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Biochem.Biophys.Res.Commun.204：646-652(1994)。
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组织＝关节软骨；
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＂软骨衍生的形态发生蛋白。在人胚胎发育期间主要在长骨中表达的转化生长因子-β超家族的新成员。＂；
J.Biol.Chem.269：28227-28234(1994)。
可能的情况是，在从Swiss-Prot中提取上文所示出的公开序列时，可能包含有一个或多个错误，例如，由于测序期间的不精确性所导致的错误。这种测序错误的后果是，可能导致一个或多个沉默突变或改变一个或多个密码子，因此，它编码一种或多种以前所公开的其它氨基酸。不过，由于Swiss-Prot在业已证实出现了测序错误的情况下，要进行数据更新，因此能够以所述参考编号或上述多肽的相应的名称从Swiss-Prot中获取最新的序列。
例如，SEQ ID NO：3可能包括人GDF-5的前原形式的原形的以下氨基酸取代：38号位置上的氨基酸丝氨酸(S)被氨基酸苏氨酸(T)所取代，SEQ ID NO：3的254号位置上的氨基酸缬氨酸(V)被氨基酸丙氨酸(A)所取代，SEQ ID NO：3的256号位置上的氨基酸精氨酸(R)被氨基酸甘氨酸(G)所取代，SEQ ID NO：3的257号位置上的氨基酸丝氨酸(S)被氨基酸甘氨酸(G)所取代，SEQ ID NO：3的258号位置上的氨基酸精氨酸(R)被氨基酸甘氨酸(G)所取代，276号位置上的氨基酸丙氨酸(A)被氨基酸丝氨酸(S)所取代，SEQ ID NO：3的321号位置上的氨基酸苏氨酸(T)被氨基酸丙氨酸(A)所取代。在SEQ ID NO：6中示出了所得到的氨基酸序列，在该序列上发生了上面所提到的氨基酸取代。可以理解的是，在SEQ ID NO：3中所示出的GDF-5的前原形式的氨基酸序列的原形上的一个或多个氨基酸取代，不会改变，更改或破坏GDF-5的生理学功能。在本申请的范围内，设想SEQ ID NO：6也可以与本发明的装置和方法组合使用。
在本发明方法的另一种优选实施方案中，所述装置没有有毒物质的。
术语＂有毒物质＂，优选包括在本领域公开方法中所使用的有毒有机溶剂和添加剂，如乙腈或chromosulfuric acid。在将含有所述物质的装置植入之后，所述物质会导致炎症和其它反应。由于所述不理想的副作用，所述装置在治疗上不太被接受的，这种副作用不能够通过本领域所公知的包被方法和某些表面处理方法避免。另外，开发治疗蛋白的国际标准，要求在生产过程中应当避免使用有害和有毒物质(有关细节可以参见：International Conference on Harmonisation(ICH)，Topic Q3C；www.emea.eu.int/)。不过，本发明的装置或可以通过本发明方法获得的装置，有利地不含有所述有毒物质，因此在治疗上是完全可以接受的，并且满足了所述管理当局的要求。
在本发明方法的另一种优选实施方案中，所述溶液允许所述蛋白溶解足够的时间，以便对所述载体的金属表面进行均匀的包被。
术语＂允许所述蛋白溶解足够的时间，以便对所述载体的金属表面进行均匀的包被的溶液＂，表示这样一种溶液，其中，可以有效地溶解所述骨诱导蛋白。均匀的包被表示所述载体的表面在用所述溶液处理之后被所述骨诱导蛋白完整地包被。均匀的包被以在所述载体表面的每一个和所有区域存在大体上相同量的蛋白质为特征。均匀的包被是所述骨诱导蛋白向植入位点周围的组织中有效释放和均匀分布和活性的先决条件。另外，可以理解的是，所述骨诱导蛋白是不会聚集的，并且不会由于沉淀或微沉淀而部分或全部失活，相反，通过均匀的包被获得了具有生物学活性的，非聚集的蛋白的附着。所述均匀的包被可以通过本发明的方法实现，并且在所附实施例中披露。另外，在所附实施例中披露了用于控制均匀的包被，固定化蛋白的定量和表征的工具和方法。本领域技术可以根据所述骨诱导蛋白的溶解度配制所述溶液，所述溶解度取决于pH，离子强度，以及在所述载体与该溶液接触之后载体对所述参数的影响。根据本发明，业已发现了适用于本发明方法的溶液仅包括不影响所述骨诱导蛋白的氧化状态的成分。例如，常被用作蛋白制剂的赋形剂(稳定剂和填充剂)的糖类，如蔗糖或海藻糖(详情参见实施例9)，不能被用于包被方法，因为它们会减弱所述蛋白与金属表面的结合。在下面的附录的实施例中披露了应当避免使用的其它成分。
根据本发明的方法，所述溶液允许所述骨诱导蛋白的浓度超过0.5mg/ml，优选超过2mg/ml，最优选超过3mg/ml。
同样优选的是，所述溶液具有酸性pH的方法。
术语＂弱酸＂表示含有至少一个离子型结合的氢原子的有机或无机化合物。弱酸是本领域所熟知的，并且披露于标准教科书中，如
Figure C03821447D0023182606QIETU
，lexicon of chemistry。
所述弱酸优选具有低离解度，并且它的pK值为3-7，优选4-6。
最优选的是，所述酸性溶液包括HCl，乙酸，柠檬酸和/或琥珀酸。
在本发明方法的另一种最优选的实施方案中，所述酸的浓度低于100mmol/l，优选低于50mmol/l，更优选低于25mmol/l，最优选低于15mmol/l。
在本发明方法的另一种最优选的实施方案中，所述溶液是用惰性气体饱和的，最优选用氮，氩或氦饱和的。在它的最优选的实施方案中，本发明的方法是在受控制的气体，湿度，温度和特定的气体交换速度的腔室中实施的。
本发明还涉及可以通过本发明方法获得的装置。
上面结合本发明的方法对术语所作的定义和解释经过必要修正适用于下文所披露的装置。
所述装置以上述方法产生的特征为特征。具体地讲，所述装置包括被均匀地涂敷在该装置的金属或合金多孔或无孔表面上的骨诱导蛋白，由此，与没有涂敷到所述金属或合金表面上的骨诱导蛋白相比，所述骨诱导蛋白的氧化状态没有明显增强。在附录的实施例中详细披露了优选装置。
本发明涉及包括本发明装置或可以通过本发明方法获得的装置的药用组合物。上面结合本发明的方法和装置对术语所作的定义和解释，经过必要修正适用于这里所披露的药用组合物。
本发明还涉及包括本发明装置或可以通过本发明方法获得的装置用于制备用来加速骨整合和新骨形成的药用组合物的用途。上面所提到的术语的定义，经过必要修正适用于本发明的上述用途以及下面所披露的用途。
术语＂骨整合和新骨形成＂，表示骨骼具有在所述植入物周围形成新骨，并且与所述植入物整合的能力。
整合表示骨细胞与植入物表面的附着，导致了在功能性负荷下，所述假体再造的固定的和永久性的锚定，而没有疼痛，炎症或松脱。
更优选的是，所述加速的骨整合和新骨形成的实施，是为了治疗创伤，恶性或人工缺陷，用于治疗牙齿缺陷或用于治疗髋，肘，脊骨，膝，手指或踝关节。上面所提到的疾病和失调的症状详细披露于标准医学教科书中，如Pschyrembel and Stedman。
同样属于本发明范围的是用于治疗在本发明用途中所提到的一种或多种疾病的方法，其中，所述方法至少包括以下步骤：给对象使用可药用形式的本发明的装置或可以通过本发明方法获得的装置。所述对象优选是人类。
最后，本发明涉及包括本发明装置或可以通过本发明方法获得的装置的试剂盒。
上面针对本发明的所述方法，装置，药用组合物和用途对术语所作的定义和解释，经过必要修改适用于本文所披露的试剂盒。
根据相应的成分，可以将本发明试剂盒的各个部分独立地包装在小瓶或其它合适工具中或在合适的容器或多容器单元中组合包装。所述试剂盒的生产优选按照本领域技术人员所公知的标准方法进行。所述装置优选是在不含氧气的气体中包装在容器或小瓶中的，如惰性气体氛围，优选由氮气组成的氛围。
附图表示：
图1：在用10mmol/L HCl提取之后氧化rhGDF-5的百分比。
图2：用存在于10mM HCl中的rhGDF-5包被的金属片材的荧光染色。
图3：用存在于PBS中的rhGDF-5包被的金属片材的荧光染色。
图4：用10mmol/l HCl包被的金属片材的荧光染色。
图5：空白金属片材的荧光染色。
图6：rhGDF-5从预先处理过的钛表面上的释放。通过ELISA确定的结果的总结。
图7：用含和不含蔗糖的rhGDF-5溶液对钛表面进行包被。
图8：在室温下从预处理过的片材中提取后氧化rhGDF-5的百分比。
图9：在4℃下从预处理过的片材中提取后氧化rhGDF-5的百分比。
图10：与所述包被溶液相比，在包被/提取之后修饰的rhproBMP-2的增加。
现在将结合下面的生物学实施例对本发明进行说明，这些实施例仅仅是说明性的，而不被构成对本发明范围的限定。
实施例1：通过RP-HPLC方法对rhGDF-5进行定量
通过反向HPLC分析，测定rhGDF-5的量。将样品加样到业已用0.1％甲酸，21％乙腈平衡的Poros C8-18-柱(R2/10，21x30mm)上。在洗涤所述柱之后，用0.1％甲酸，和21-84％梯度的乙腈进行洗脱(流速：0.4ml/min)。通过在220nm波长下测定吸光度观察所述洗脱。通过洗脱峰和使用刚刚制作的标准曲线进行定量。
实施例2：结合蛋白的提取和定量
通过首先在室温下在PBS中孵育所述包被物体1小时，提取所述蛋白。然后将所述包被物体放在10mmol/l HCl中，在室温下孵育3小时。在将所述PBS样品调整到pH2之后，通过在实施例1中所披露的RP-HPLC分析所述含有提取的骨生长因子的PBS和HCl溶液。
实施例3：在含有提取蛋白的溶液中定量可溶性聚集物
通过大小排阻HPLC，测定含有提取蛋白的溶液中可溶性聚集物的量。所用柱(TSK 3000)是用50mmol/l乙酸，50mmol/l磷酸，NaOH，pH3.0平衡的。
通过在220nm波长下进行UV检测观察洗脱液。定量是通过聚集物峰面积与总峰面积的比例进行的。
实施例4：确定所述提取蛋白的化学修饰
通过RP-HPLC测定在含有提取蛋白的溶液中骨生长因子的化学修饰即氧化的量。将所述样品加样到Vydak C8-18柱(2 x 250mm)上，该柱业已用0.15％ TFA，20％乙腈平衡过。在洗涤所述柱之后，骨生长因子的洗脱用0.1％ TFA，和阶式梯度的20％-84％乙腈进行的(流速：0.3ml/min)。通过测定220nm波长下的吸光度，观察所述洗脱液。通过修饰形式的物质的峰面积与总峰面积的比例进行定量。
实施例5：用骨生长因子包被Ti6Al4V和释放
在用钛片材作为表面进行包被-释放循环之后，rhGDF-5可能氧化到显著程度。在这里我们披露了用于包被的避免在包被过程中发生蛋白氧化作用的方法和装置。
用于用骨生长因子对钛或钛合金进行包被的装置：
所述包被过程是在惰性气体环境中进行的，以便排除氧。为了保持这种条件，要使用腔室。所述腔室包括气体密封性的空间，具有连续的惰性气体流，例如氮气。在所述腔室内部，保持略高一些的压力。通过不透气的闭锁，将所述包被过程所需要的材料转移到所述腔室中。所述腔室可以执行手动的和自动的包被过程。为了将所述包被过程明确化和标准化，监测并且调整所述腔室的相对湿度。
包被：
清洁所述钛片材，用软化水洗涤，并且干燥。用60μg的rhGDF-5对所述钛片材进行包被。将每一个片材平放在培养皿中，并且用rhGDF-5溶液对所述金属片材的一侧进行包被。包被是在上述腔室中，在氮气气体环境下，并且在0-4℃下进行的。在包被之后，在相应的条件下，在真空中使所述片材干燥30分钟。
提取：
首先在PBS中孵育rhGDF-5，以便模拟接近生理学条件。为了保持样品几乎不含氧气，对于相应的样品来说，用氮气气体饱和所述PBS溶液。
在PBS孵育之后，将所述片材放在10mmol/l HCl中在相应的温度下孵育3小时。通过RP-HPLC对所述提取溶液中的rhGDF-5进行定量(参见实施例1)。还通过RP-HPLC测定氧化rh-GDF-5的量(参见实施例4)。
为了能够比较按上述方法包被和提取的样品，在室温下和在氧气气氛中进行相同的方法。
表1：
 
样品 气氛 温度 提取之后氧化蛋白％(平均) SD
植入物 空气 RT 10.0 1.6
植入物 N<sub>2</sub> 4℃ 5.6 0.6
本体(Bulk) 空气 RT 4.7 0.0
在本发明的实验中测试的参数对于在从钛片材上提取之后氧化rhGDF-5的量有影响：在存在空气氧气的条件下，在室温下包被的样品表现出的氧化rhGDF-5的量为10.0％±1.6％，正如在表1和图1中所示出的。
在4℃和氮气气体下处理的样品在提取之后表现出5.6％±0.6％的氧化rhGDF-5。与rhGDF-5本体溶液(bulk solution)相比，在4℃和氮气气体下处理的样品在氧化rhGDF-5的量(4.7％±0％)方面没有显著差别。
实施例6：通过荧光显微镜检法测定骨生长因子在钛表面上的包被的均匀性
我们使用蛋白的荧光标记研究了骨生长因子在钛物体上的包被密度。通过荧光显微镜检法进行该测定
包被：
将一块片材平放在培养皿中，并且用10μl的6.18mg/ml10mmol/l HCl rhGDF-5溶液对所述金属片材的一侧进行包被。用10μl的10mmol/l HCl对第二个片材进行了包被。在真空下干燥所述片材30分钟。第三个片材不进行包被，并且被用作空白对照。另外，用溶解在PBS中的6.0mg/ml的rhGDF-5溶液对片材进行包被。
蛋白的荧光染色：
将2.3μl的10mmol/l的Alexa FluorTM 488溶液添加到1ml的0.15M NaHCO3溶液中。将3个金属片材放在1ml的荧光染料混合物中，在室温下避光孵育4小时。蛋白：荧光体的比例为1:10。被用作空白对照的片材只进行了20分钟孵育。在经过所述孵育时间之后，用软化水对所述片材进行充分洗涤，并且在真空条件下避光干燥15分钟。通过荧光显微镜检法检测荧光信号，并且通过成像软件记录。
在图2中，通过荧光显微镜检法可以清楚确定用rhGDF-5包被的区域。表示与所述蛋白结合的荧光标记。相反，图3证实了rhGDF-5的溶剂的重要性，因为含有PBS的包被溶液导致所述蛋白的不均匀分布和蛋白斑点。
为了排除假象，在图4中示出了用10mmol/l HCl包被的片材。10mmol/l HCl是溶液中的rhGDF-5的溶剂。
为了排除溶剂的任何影响，我们还制备了没有用rhGDF-5或10mmol/l HCl包被的，但是同样在荧光标记Alexa FluorTM 488中孵育的空白片材(图5)。
图片清楚地表明，只有rhGDF-5被所述荧光标记染色。另外，当所使用的溶剂是10mmol/l HCl时，所述表面上的蛋白是均匀的。
实施例7：骨生长因子从预处理过的钛表面上的长期体外释放
我们开发了一种用于将骨生长因子涂敷在钛表面上的方法。在进行标准化提取之后，我们能够分析所述蛋白的聚集(实施例3)，氧化骨生长因子的量(实施例4)，并且能够对所述提取蛋白进行定量(实施例1)。在本文所披露的实验中，我们通过在细胞培养基中孵育包被的钛片材30天，确定了骨生长因子的释放动力学。为了模拟生理学条件和代谢活性，我们每48小时更换培养基，并且通过ELISA对释放的蛋白量进行定量。
包被.
按实施例5所述方法对样品进行包被。
30天的释放：
在4℃下，在6ml释放培养基中孵育所述片材30天，所述培养基包括：89％ αMEM，1％青霉素，链霉素，10％ FCS。样品在混合器中不停地滚动。每孵育48小时就采集上清液，并且在-70℃下冷冻保存。将6ml体积的新培养基添加到所述释放样品上。
通过骨生长因子ELISA对所述样品中的释放的蛋白进行定量。
用抗rhGDF-5的单克隆抗体对96孔平板的孔进行包被。用含有0.05％ Tween 20的PBS洗涤所述平板，并且用SuperBloc溶液(Pierce，cat-no.37515)封闭，然后添加含有rhGDF-5的样品，并且在室温下孵育所述平板60分钟。在洗涤所述样品之后(参见上文)，添加抗rhGDF-5的第二种生物素化的抗体，并且在室温下孵育所述样品60分钟。在洗涤步骤之后，添加链霉抗生物素蛋白过氧化物酶复合物，并且在室温下孵育所述样品60分钟。然后，用含有0.05％ Tween20的PBS洗涤所述孔，并且用BMBlue-POD底物(Roche Diagnostics，Cat-No.：1 484 28)对结合的过氧化物酶的量进行定量。检测波长为450nm，参考波长为630nm。利用rhGDF-5标准曲线计算rhGDF-5的量。
在表2和图6中归纳了通过ELISA测定的骨生长因子释放的结果。通过ELISA测定的在30天之后释放蛋白的量为100.4±0.8。
表2：
 
天数 ELISA：提取蛋白％
2 37.1
5 68.7
7 87.0
9 94.0
12 98.0
14 99.1
16 99.7
19 100.4
实施例8：用rhBMP-2对钛或钛合金进行的包被和提取
在本实施例中，我们研究了在包被-提取过程中rhBMP-2的表现：rhBMP2与rhGDF-5类似，是TGF-β蛋白家族的另一个成员。
包被：
将所述片材平放在培养皿中，并且用10μl的6.0mg/ml骨生长因子或rhBMP2溶液对所述片材的一侧进行包被。所有片材都在真空条件下干燥30分钟。
提取：
所有片材都是在室温下用PBS提取1小时。然后，将用骨生长因子和rhBMP2包被的片材放在10mmol/l HCl中孵育3小时。
在下面的表3中归纳了上述实验的结果。
表3：
 
样品号 蛋白 在PBS中提取的蛋白％ 在10mmol/lHCl中提取的蛋白％ 蛋白总回收％
1 rhGDF-5 8.8 83.2 92.0
2 rhBMP2 0 111.3 111.3
3 rhBMP2 0 105.1 105.1
在用PBS孵育期间，没有rhBMP-2被提取。在PBS中，有8.8％的rhGDF-5被提取。
以上结果表明，来自TGFβ蛋白家族的蛋白结合在金属表面上，并且在PBS中孵育之后，能够(几乎)完全被10mmol/l HCl提取。
实施例9：在存在蔗糖的条件下用骨生长因子对钛或钛合金进行包被
在本实施例中，我们披露了用含有10％蔗糖的rhGDF-5溶液对钛表面进行包被。作为对照，我们用存在于10mmol/l HCl中的骨生长因子对钛表面进行了包被。
用软化水洗涤所述钛片材，干燥，并且分别用存在于10mmol/lHCl中的40μg骨生长因子或存在于10％蔗糖，10mmol/l HAc和5mmol/l HCl中的40μg骨生长因子进行包被。
然后，在室温下用PBS洗涤所述钛材料1小时。
然后，在室温下通过在100mmol/l HCl中孵育3小时提取所述蛋白。所有溶液的蛋白含量都是通过RP-HPLC定量测定的。在定量之前，将PBS溶液调整到pH2，以便提高骨生长因子的溶解度。
在本文所披露的实验中，制备了两种不同的包被金属片材：用含或不含10％蔗糖的骨生长因子溶液包被的钛片材。
在表4中归纳了包被和提取方法的结果：
表4：
 
样品号 不含蔗糖 含10％蔗糖
包被之后钛体上的蛋白质量(μg) 4.5 4.5
在PBS中提取的骨生长因子(％) 0 0
在100mmol/l HCl中提取的骨生长因子(％) 70.3 32.5
总回收蛋白(％) 70.3 32.5
在用含或不含10％蔗糖的骨生长因子溶液对钛片材进行包被时存在显著差别。从含有蔗糖的样品中回收到了32.5％的蛋白，从不含蔗糖的样品中回收到了70.3％的骨生长因子(参见图7)。
在上述实验中，我们希望评估蔗糖在包被溶液中的存在对骨生长因子在金属表面上的结合的影响。结果表明，与在不存在蔗糖的条件下进行包被后骨生长因子的回收率相比，总回收率显著降低。
实施例10：Ti6Al4V中骨生长因子的包被和释放-还原剂的影响
A)还原剂在所述包被溶液中的影响：
为了避免在包被和提取循环期间所述蛋白的氧化，我们在所述包被溶液中添加了还原剂：我们向所述骨生长因子包被溶液中添加了10mmol/l的以下化合物或它们的组合：
10μl样品1(空白)：存在于10mmol/l HCl中的5.04mg/ml骨生长因子。
12μl样品2：10mmol/l EDTA+3.94mg/ml骨生长因子
10μl样品3：10mmol/l Met+4.54mg/ml骨生长因子
10μl样品4：10mmol/l Na2SO3+4.54mg/ml骨生长因子
11μl样品5：10mmol/l Met+10mmol/l EDTA+3.84mg/ml骨生长因子
11μl样品6：10mmol/l EDTA+10mmol/l Na2SO3+3.84mg/ml骨生长因子；并且按实施例5所述方法进行包被。
提取：
首先，在室温下用PBS提取骨生长因子1小时(在PBS中孵育表示模拟体内的生理学情形)。然后，用10mmol/l HCl提取所述片材3小时。按实施例1所述方法，通过RP-HPLC对每一个样品的提取溶液中的骨生长因子进行定量。按实施例4所述方法测定氧化蛋白的量。在表5中归纳了上述实验的结果：
表5：
 
样品号 1 2 3 4 5 6 7
还原剂 无(空白) EDTA Met Na<sub>2</sub>SO<sub>3</sub> EDTA/Met EDTA/Na<sub>2</sub>SO<sub>3</sub> Bulk
在PBS中提取的骨生长因子(％) 13 78 41 -- 53 50 --
存在于10mmol/lHCl中的骨生长因子的提取(％) 69 32 76 -- -- --
总蛋白回收 82 78 73 76 53 50 --
在用PBS提取之后氧化形式的量(％) -- 13 8 -- 9 14
在用HCl提取之后，氧化形式的量 10 *) 12 23 *) *) 5存在于HCl中(未提取)
*)在HCl提取之后，通过HPLC定量没有检测到蛋白
所有样品的回收率在50％和82％之间。所有样品中用PBS提取到蛋白，只有含有Na2SO3的样品除外。在用PBS提取的样品和用HCl提取的样品中，测定氧化蛋白的量。氧化蛋白的量为8％至23％。
总之，在包被溶液中使用还原剂的方法不是用于避免骨生长因子氧化的优选方法。总回收率较低，或者所述蛋白已经用PBS进行了较大程度的提取，或者氧化骨生长因子的量明显较高。因此，需要其它方法来避免在包被和提取循环中骨生长因子的氧化作用。
B)在开始包被处理之前，用还原剂浸泡所述表面：
我们披露了还原剂在所述包被溶液中的影响。在这里，我们比较了在含有相应的还原剂的溶液中孵育预处理过的金属片材24小时之后，不同还原剂的作用。然后，包被和提取过程在两种不同温度下进行。
所有样品都是在具有以下还原剂的10mmol/l溶液之一中孵育的：硫脲，抗坏血酸，亚硫酸钠，半胱氨酸，甲硫氨酸，巯基乙醇。
在孵育24小时之后，用软化水洗涤所述片材，并且在室温下，在真空条件下干燥15分钟。
将所有片材平放在培养皿中，并且用10μl的6.95mg/ml rhGDF-5溶液对该金属片材的一侧进行包被。半数的片材在4℃下，在真空条件下干燥，另外一半片材在室温下，在真空条件下干燥。
包被和提取过程是在4℃和室温下进行的。首先，在室温下用PBS提取rhGDF-5 1小时。然后在10mmol/l HCl中孵育所述片材3小时。通过RP-HPLC对每一种样品的提取溶液中的rhGDF-5进行定量(实施例1)。然后，通过RP-HPLC测定氧化形式的量(实施例4)。
在表6中样品是按照它们的预处理模式排列的。
表6：
 
样品号 预处理II C/E温度 ％氧化rhGDF-5
1 硫脲 4℃ 12.2
2 抗坏血酸 4℃ 12.6
3 亚硫酸钠 4℃ 9
4 半胱氨酸 4℃ 9.7
5 甲硫氨酸 4℃ 11.1
6 巯基乙醇 4℃ 11.3
7 硫脲 RT 15.0
8 抗坏血酸 RT 15.1
9 亚硫酸钠 RT 17.3
10 半胱氨酸 RT 17.8
11 甲硫氨酸 RT 16.1
12 巯基乙醇 RT 14.7
Bulk 无 RT 5.0
所有样品中氧化rhGDF-5的量为9.0％至12.6％，而被用作原材料的蛋白溶液的氧化物质的含量为5％。
在4℃下孵育的样品中，氧化蛋白的量少于在室温下处理的相应样品中的氧化蛋白的量。根据以上结果可以得出这样的结论：所使用的赋形剂没有一种能够显著避免氧化作用。
在图8和9中示出了氧化蛋白的量。
本发所披露的实验的主要目的是，用不同的还原剂孵育预处理过的片材。我们的结论是，在含有还原剂的溶液中孵育金属片材24小时，不是可以避免蛋白氧化的优选方法。
实施例11：通过RP-HPLC对rhproBMP-2和rhBMP-2进行定量：
通过反相HPLC分析测定rhproBMP-2/rhBMP-2的量。将所述样品加样到业已用0.045％ TFA平衡过的PorosC4-柱(20 x 2mm)上。在洗涤所述柱之后，用0.025％ TFA，84％乙腈，和21-84％梯度浓度的乙腈进行洗脱(流速：0.4ml/分钟)。通过在220nm波长下测定吸光度，观察洗脱液。定量是通过所述峰，并且使用标准曲线完成的。
实施例12：测定提取的rhproBMP-2的化学修饰：
通过RP-HPLC测定含量提取蛋白的溶液中修饰形式的骨生长因子的量。将样品加样到业已用0.1％ TFA平衡过的YMC C4柱(4.6 x 250mm)上，在洗涤所述柱之后，用100％乙腈，0.1％ TFA，以及阶式梯度的25％-100％乙腈的混合物进行洗脱(流速：0.8ml/分钟)。通过在220nm波长下测定吸收值，观察洗脱液。根据相应的峰面积和总峰面积的比例，计算修饰形式的相对含量。
实施例13：测定在提取之后修饰rhproBMP-2的量：
在本实施例中，研究了在优化条件下进行包被-提取处理期间rhproBMP-2的表现：rhproBMP2是重组形式的pro-BMP-2。在SEQ IDNO：4中示出了所述rhproBMP2的氨基酸序列。在提取之后，测定修饰形式的量。
包被：
按上文实施例5所述方法，用rhproBMP-2对钛片材进行包被。一组片材是在标准条件下进行包被的(空气，室温)(第1组)；另一组片材是在氮气气氛下进行包被的(第2组)。
将每一个片材平放在培养皿中，并且分别用10μl的1，9mg/mlrhproBMP-2溶液对所述金属片材的一侧进行包被。
提取：
提取是按照在上文的实施例5中所披露的方法进行的。修饰的rhproBMP-2的量同样是通过RP-HPLC测定的；参见上文实施例12。
提取蛋白的表征，是通过修饰蛋白的定量进行的。因此，将修饰rhproBMP-2的量的变化与rhproBMP-2本体溶液进行了比较。在表7中示出了数据，表示在提取之后化学修饰的rhproBMP-2的量：
表7：
Figure C03821447D00371
在本发明实验中测试的参数对在从钛片材上提取之后修饰的rhproBMP-2的量有影响：与上面表2中所示出的包被溶液相比，在空气中包被的样品表现出的修饰rhproBMP-2的量为4.9％±1.2％。
在室温和氮气气氛下处理的样品在提取之后表现出修饰的rhproBMP-2增加了1.5％±0.6％。
与蛋白本体溶液相比，在空气中处理的样品表现出+4，9％的增加(参见下面的图10)。图10表示与所述包被溶液相比，在包被/提取之后，修饰rhproBMP-2的增加。在下面的图10中，相应样品的误差棒是不重叠的。因此，可以得出的结论是，周围的气体气氛对在从所述钛片材上提取之后rhproBMP-2修饰的量具有显著影响。
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Figure C03821447D00431
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Figure C03821447D00462
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<400>6
Figure C03821447D00481
Figure C03821447D00491

Claims (55)

1.一种用于生产植入物的方法，包括以下步骤：
(a)提供包括溶解的骨诱导蛋白的溶液；
(b)让步骤(a)的溶液与包括金属或金属合金表面的载体接触；
(c)让所述溶解的蛋白对所述载体的表面进行包被；和
(d)对在步骤(c)中获得的包被的载体进行干燥，
其中，步骤(b)-(d)在低于10vol％氧气的氧气浓度下进行。
2.如权利要求1的方法，其中，步骤(b)-(d)是在低于25℃的温度下进行的。
3.如权利要求1的方法，其中，所述金属或金属合金是钛或钛合金。
4.如权利要求2的方法，其中，所述金属或金属合金是钛或钛合金。
5.如权利要求3的方法，其中，所述钛合金是包含至少50％钛的钛合金。
6.如权利要求4的方法，其中，所述钛合金是包含至少50％钛的钛合金。
7.如权利要求3的方法，其中，所述钛合金是Ti-Al-V-合金，Ti-Al-Fe合金，Ti-Al-Nb-合金或Ti-Mo-Zr-Al-合金。
8.如权利要求5的方法，其中，所述钛合金是Ti-Al-V-合金，Ti-Al-Fe合金，Ti-Al-Nb-合金或Ti-Mo-Zr-Al-合金。
9.如权利要求7的方法，其中，所述Ti-Al-V-合金是Ti6Al4V。
10.如权利要求8的方法，其中，所述Ti-Al-V-合金是Ti6Al4V。
11.如权利要求1的方法，其中，所述包被是通过将所述金属表面浸泡在所述蛋白溶液中进行的。
12.如权利要求2-10中任意一项的方法，其中，所述包被是通过将所述金属表面浸泡在所述蛋白溶液中进行的。
13.如权利要求1的方法，其中，所述包被是通过将所述蛋白溶液滴在所述金属表面上进行的。
14.如权利要求2-10中任意一项的方法，其中，所述包被是通过将所述蛋白溶液滴在所述金属表面上进行的。
15.如权利要求1的方法，其中，所述包被是通过将所述蛋白溶液喷洒在所述金属表面上进行的。
16.如权利要求2-10中任意一项的方法，其中，所述包被是通过将所述蛋白溶液喷洒在所述金属表面上进行的。
17.如权利要求1的方法，其中，所述干燥是通过真空干燥完成的。
18.如权利要求2-11、13、15中任意一项的方法，其中，所述干燥是通过真空干燥完成的。
19.如权利要求1的方法，其中，所述干燥是通过冷冻干燥完成的。
20.如权利要求2-11、13、15中任意一项的方法，其中，所述干燥是通过冷冻干燥完成的。
21.如权利要求1的方法，其中，所述干燥是通过在室温下，在惰性气体流中蒸发完成的。
22.如权利要求2-11、13、15中任意一项的方法，其中，所述干燥是通过在室温下，在惰性气体流中蒸发完成的。
23.如权利要求1的方法，其中，所述骨诱导蛋白是TGF-β家族的成员。
24.如权利要求2-11、13、15、17、19、21中任意一项的方法，其中，所述骨诱导蛋白是TGF-β家族的成员。
25.如权利要求23的方法，其中，所述TGF-β家族的成员是BMP亚家族的成员。
26.如权利要求24的方法，其中，所述TGF-β家族的成员是BMP亚家族的成员。
27.如权利要求25的方法，其中，所述BMP亚家族的成员是BMP2或BMP7。
28.如权利要求26的方法，其中，所述BMP亚家族的成员是BMP2或BMP7。
29.如权利要求23的方法，其中，所述TGF-β家族的成员是GDF亚家族的成员。
30.如权利要求24的方法，其中，所述TGF-β家族的成员是GDF亚家族的成员。
31.如权利要求29的方法，其中，所述GDF亚家族的成员是GDF-5。
32.如权利要求30的方法，其中，所述GDF亚家族的成员是GDF-5。
33.如权利要求1的方法，其中，所述植入物不含有毒物质。
34.如权利要求2-11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31中任意一项的方法，其中，所述植入物不含有毒物质。
35.如权利要求1的方法，其中，所述溶液允许所述蛋白溶解足够的时间，以便对所述载体的所述金属表面进行均匀的包被。
36.如权利要求2-11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33中任意一项的方法，其中，所述溶液允许所述蛋白溶解足够的时间，以便对所述载体的所述金属表面进行均匀的包被。
37.如权利要求1的方法，其中，所述溶液允许所述骨诱导蛋白的浓度超过0.5mg/ml。
38.如权利要求2-11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35中任意一项的方法，其中，所述溶液允许所述骨诱导蛋白的浓度超过0.5mg/ml。
39.如权利要求37的方法，其中，所述溶液具有酸性pH。
40.如权利要求38的方法，其中，所述溶液具有酸性pH。
41.如权利要求39的方法，其中，所述溶液包括HCl，乙酸，柠檬酸或琥珀酸。
42.如权利要求40的方法，其中，所述溶液包括HCl，乙酸，柠檬酸或琥珀酸。
43.如权利要求41的方法，其中，所述酸的浓度低于或等于100mmol/l。
44.如权利要求42的方法，其中，所述酸的浓度低于或等于100mmol/l。
45.如权利要求1的方法，其中，所述溶液是用惰性气体饱和的。
46.如权利要求2-11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43中任意一项的方法，其中，所述溶液是用惰性气体饱和的。
47.如权利要求45的方法，其中，所述惰性气体是氮，氩或氦。
48.如权利要求46的方法，其中，所述惰性气体是氮，氩或氦。
49.如权利要求1-11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47中任意一项的方法，该方法是在具有受控制的气体和湿度的腔室中进行的。
50.能够通过权利要求1-49中任意一项的方法获得的植入物。
51.一种药用组合物，包括能够通过权利要求1-49中任意一项的方法获得的植入物。
52.能够通过权利要求1-49中任意一项的方法获得的植入物用于制备用来加速骨整合和新骨形成的药用组合物的用途。
53.如权利要求52的用途，其中，所述加速的骨整合和新骨形成被用于治疗创伤，恶性或人工缺陷。
54.如权利要求52的用途，其中，所述加速的骨整合和新骨形成被用于治疗牙齿缺陷。
55.一种试剂盒，包括能够通过权利要求1-49中任意一项的方法获得的植入物。
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