DE69826289T2

DE69826289T2 - Mikroverkapselte NGF Zusammensetzung mit geregelter Freigabe

Info

Publication number: DE69826289T2
Application number: DE69826289T
Authority: DE
Inventors: L. Jeffrey CLELAND; M. Xanthe Lam; T. Eileen DUENAS
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-06-13
Filing date: 1998-06-11
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2018-06-12
Also published as: AR012978A1; JP2002505671A; ZA985138B; WO1998056426A1; US6113947A; DE69826289D1; IL133112A; AU8059298A; JP4316682B2; CA2293575A1; EP1001814B1; IL133112A0; AU730612B2; EP1001814A1; ATE275975T1; CA2293575C; ES2227844T3

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Formulierungen. des Nervenwachstumsfaktors („NGF") und ihre Verwendung zur Induktion von Nervenwachstum, Differenzierung, Überleben, Reparatur, Reifung oder Funktion in vitro, in vivo oder ex vivo. Im Spezielleren betrifft diese Erfindung Mikroverkapselungszusammensetzungen, die kontrollierte Freisetzungseigenschaften, vorzugsweise mit erhöhter Stabilität für die NGF-Komponenten, insbesondere menschlichen rekombinanten NGF („rhNGF"), aufweisen. Es werden Verfahren zum Herstellen und Verwenden derartiger Zusammensetzungen bereitgestellt.
Beschreibung verwandter Offenbarungen
Nervenwachstumsfaktor (NGF) ist ein neurotropher Faktor, der für das Wachstum und Überleben sympathischer und sensorischer Neuronen während der Entwicklung und in vollentwickelten Tieren notwendig ist (Thoenen et al., Physiol. Rev. 60, 1284-1335 (1980)). Pro-NGF und NGF können als 75-Komplex auftreten, der Zinkionen enthalten kann (Journal of Molecular Biology 239(3), 385-400 (1994), und J. Histochem. Cytochem. 35(5), 579-583 (1987)). Klinische Indikationen für rekombinanten menschlichen NGF umfassen peripheres Sinnesnervenleiden und Alzheimer-Krankheit. Beispielsweise hat sich gezeigt, dass die systemische Verabreichung von NGF das durch die Verabreichung von Cisplatin und Taxol an Mäuse verursachte Sinnesnervenleiden verringert (Apfel et al., Ann. Neurol. 28, 87-90 (1991); Apfel et al., Ann. Neurol. 31, 76-80 (1992)). In neueren klinischen Versuchen ist NGF an Menschen verabreicht worden, um die Sinnesfunktion bei diabetischen Nervenleiden zu verbessern (Petty et al., Ann. Neurol. 36, 244-246 (1994)). Obgleich nicht-toxisch und wirksam, soll die Verabreichung von NGF in flüssigen parenteralen Formulierungen in gegenwärtigen Studien mit Injektionsstellen-Hyperalgesie und insbesondere Myalgesie in Zusammenhang stehen.
Intrazerebroventrikuläre (ICV) Verabreichung von rhNGF kann die Degeneration basaler cholinerger Vorderhirn-Neuronen in Ratten und Affen mit Fimbria-fornex-Läsionen verhindern (Koliatsos et al., Exp. Neurol. 112, 161-73 (1991); Koliatsos et al., Ann. Neurol. 30, 831-40 (1991); Tuszynski et al., Ann. Neurol. 30, 626-36 (1991)). Studien haben gezeigt, dass die ICV-Verabreichung von rhNGF die Cholinacetyltransferase-Aktivität steigern und das räumliche Gedächtnis in alternden Ratten verbessern kann (Williams, Neurobiol. Aging 12, 39-46 (1991); Fisher et al., J. Neurosci. 11(7), 1889-1906 (1991)). Die ICV-Zufuhr von rhNGF durch die Blut-Hirn-Barriere hindurch ist mittels Spritze, Ommaya^®-Reservoir oder Alzet-Pumpe zustandegebracht worden. Für die Behandlung der Alzheimer-Krankheit ist die Verwendung implantierbarer Infusionspumpen mit Kathetern zur kontinuierlichen Abgabe von rhNGF und direkt zur Hirnkammer erwogen worden. Jedoch ist beobachtet worden, dass rhNGF über Desamidierung und Isoaspartatbildung in einigen implantierbaren Pumpen bei 37 °C (physiologische Bedingung) abgebaut wird, wie mittels RP-HPLC ermittelt worden ist. Die Stabilität von NGF, insbesondere in Flüssigkeit, wird infolge der dimeren Struktur von NGF über die üblichen chemischen und physikalischen Abbauwege hinaus verkompliziert. Die Proteinstabilität kann weiter verkompliziert werden, wenn das rekombinante Protein ein Gemisch von C-terminal geschnittenen NGF-Varianten ist. Obgleich NGF normalerweise als Dimer vorliegt (die Kristallstruktur von Maus-NGF zeigt 3 antiparallele Paare von b-Strängen, die eine ebene Oberfläche bilden, über die die Monomere dimerisieren (McDonnald et al., Nature 354, 411-414 (1991)); die Dimer-Dissoziationskonstante beträgt = 10^-13 M (Bothwell et al., J. Biol. Chem. 252, 8532-8536 (1977); Timm et al., Biochem. 33, 4667-4676 (1994)), sind NGF-Aggregate höherer Ordnung beobachtet worden. WO 96/40072A erörtert die nachhaltige Freisetzung bioverträglicher Polymerzusammensetzungen mit Teilchen von Metall-Kation-stabilisiertem menschlichem Wachstumshormon.
Folglich besteht ein Bedarf an NGF enthaltenden Formulierungen, welche die NGF-Stabilität und Aktivität beibehalten und ein Mittel für die Behandlung einer Vielzahl von Leiden bereitstellen sowie für die therapeutische Verabreichung an Säugetiere, insbesondere an menschliche Patienten und insbesondere für die intrazerebrale Verabreichung wirksam sind.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung von Formulierungsbedingungen und Verfahren für die kontrollierte nachhaltige Freisetzung von NGF mit niedrigen anfänglichen Freisetzungsraten und erhöhter Stabilität von NGF während des Freisetzungszeitraums. Es wird eine NGF-Formulierung mit kontrollierter nachhaltiger Freisetzung bereitgestellt, die für eine niedrige anfängliche Freisetzungsrate sorgt und eine erhöhte Stabilität von NGF aufweist, um Wachstum, Differenzierung, Reifung, Reparatur oder Funktion von Nervenzellen in vitro, in vivo oder ex vivo zu induzieren. Es wird eine Formulierung mit kontrollierter Freisetzung bereitgestellt, die polymere Mikrokügelchen enthält, die NGF oder seine genetisch manipulierten Formen, insbesondere menschlichen NGF, vorzugsweise die 118-Form, enthält, die einen sehr geringen Verlust an Aktivität oder Aggregation während des Freisetzungszeitraumes zeigen. In bevorzugten Ausführungsformen enthalten die Formulierungen Zink-komplexierten NGF. In verschiedenen Ausführungsformen weisen die Formulierungen, die eine kontrollierte nachhaltige Freisetzungscharakteristik aufweisen, eine erhöhte Stabilität gegen Bewegung, Einfrieren, Auftauen, Licht oder Lagerung auf.
Es werden polymere NGF-Systeme mit kontrollierter Freisetzung beschrieben, worin NGF eine brauchbare biologische Aktivität beibehält und über einen erweiterten Zeitraum von zumindest einem Tag, typischer ein oder zwei Wochen, nach Verabreichung freigesetzt wird. In der bevorzugten Ausführungsform werden die polymeren NGF-Mikrokügelchen unter Anwendung sehr niedriger Temperaturen zum Gefrieren der Polymer-NGF-Gemische zu polymeren Mikrokügelchen mit sehr hoher Erhaltung von biologischer Aktivität und Material hergestellt. NGF wird zunächst vorzugsweise in Lösung mit einem Metall komplexiert und gegebenenfalls mit einem stabilisierenden (und die NGF-Beladung erhöhenden) Polyol, wie z.B. Trehalose oder Mannit, vermischt und getrocknet, vorzugsweise sprühgefriergetrocknet. Das getrocknete Pulver wird mit einem Polymer, vorzugsweise einem Poly(lactid) oder Co-Polymer, vermischt, in einem Lösungsmittel, wie z.B. Ethylacetat oder Methylenchlorid, gelöst. Das Polymer/NGF-Gemisch wird in ein Gefäß zerstäubt, das ein gefrorenes Nicht-Lösungsmittel, wie z.B. Ethanol, enthält, mit einem verflüssigten Gas, wie z.B. Stickstoff, überschichtet, und zwar bei einer Temperatur unter dem Gefrierpunkt der Lösung oder Suspension des Polymers/aktiven Mittels. Die zerstäubten Teilchen gefrieren bei Berührung des kalten verflüssigten Gases zu Mikrokügelchen und sinken dann auf die gefrorene Nicht-Lösungsmittel-Schicht. Das gefrorene Nicht-Lösungsmittel wird dann aufgetaut. Wenn das Nicht-Lösungsmittel auftaut, sind die Mikrokügelchen nach wie vor gefroren und sinken in das flüssige Nicht-Lösungsmittel. Das Lösungsmittel in den Mikrokügelchen taut ebenfalls auf und wird langsam in das Nicht-Lösungsmittel extrahiert, was in gehärteten, NGF-enthaltenden Mikrokügelchen resultiert.
Es werden Ausführungsformen bereitgestellt, bei denen sich die nachhaltige Freisetzung von biologisch aktivem NGF aus den Mikrokügelchen in vitro, ex vivo oder in vivo über einen Zeitraum von einer Woche bis zu drei Monaten erstreckt. Das Freisetzungsprofil kann durch Aufnahme von Polymer-Abbaumodifikatoren, porenbildenden Mitteln, Polymer-Co-Polymer-Verhältnissen und NGF-Stabilisatoren, insbesondere Zink, erzielt werden.
Außerdem wird ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen mit kontrollierter Freisetzung bereitgestellt, die NGF oder seine genetisch manipulierten Formen vorzugsweise mit Zink komplexiert enthalten, die einen sehr geringen Verlust an Aktivität oder Material während des Formulierungsvorgangs aufweisen. Es wird ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen bereitgestellt, die aus einer breiten Auswahl von Polymeren gebildet werden, die NGF enthalten, der auf eine kontrollierte Weise freisetzbar ist, sowie die durch ein derartiges Verfahren hergestellten Mikrokügelchen.
Hierin wird eine NGF-Formulierung mit verbesserter Beschaffenheit für die verbesserte Anwendung auf das Neuron oder Säugetier bereitgestellt. Es wird eine stabile NGF-Formulierung bereitgestellt, und zwar zur Verwendung bei der Behandlung eines Säugetiers, vorzugsweise des Menschen, das/der eine NGF-Behandlung benötigt, so dass eine therapeutisch wirksame NGF-Menge bereitgestellt wird. Die mikroverkapselten Vorrichtungen finden auch bei Zellkulturverfahren Verwendung, beispielsweise mit Primärneuronenkulturen oder Neuronenzelllinien. Diese und andere Aspekte werden dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung angesichts der vorliegenden Patentschrift und Figuren offensichtlich.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 ist ein Schema, das eine der Ausführungsformen für die Herstellung von NGF-Mikrokügelchen darstellt. 2 stellt ein Vorformulierungs-Screening der Stabilität von sprühgefriergetrockneten Proteinformulierungen dar (Trockenprotein I).
3 stellt weitere Vorformulierungs-Screenings der Stabilität von sprühgefriergetrockneten Proteinformulierungen dar (Trockenprotein II).
4 stellt den Zeitverlauf der Freisetzung von rhNGF aus PLGA-Mikrokügelchen dar, die verschiedene Mengen an Zinkcarbonat enthalten: 0 (offene Kreise), 3 (volle Kreise) oder 6 Gew.-% (volle Quadrate). Die Mikrokügelchen wurden bei pH 7,0 und 37 °C inkubiert. Der Freisetzungspuffer wurde zu jedem Zeitpunkt vollständig entfernt und ergänzt. Zink enthaltende Formulierungen sorgen für eine kontinuierliche Freisetzung von rhNGF für 2 bis 3 Wochen nach dem Tag 3.
5 stellt den Zeitverlauf der Freisetzung von rhNGF aus PLGA-Mikrokügelchen dar, die verschiedene Mengen an Tensid enthalten: 0 (offene Kreise), 0,01 Gew.-% PF68 (volle Kreise) oder 0,01 Gew.-% PEG (volle Quadrate). Die Mikrokügelchen wurden bei pH 7,0 und 37 °C inkubiert. Der Freisetzungspuffer wurde zu jedem Zeitpunkt vollständig entfernt und ergänzt. Tensid in der Proteinformulierung beeinflusst nicht die Rate der rhNGF-Freisetzung.
6 zeigt die Stabilität von rhNGF, der aus einer der Ausführungsformen von PLGA-Mikrokügelchen freigesetzt wurde, bei der Zink nach der Trocknung von NGF zugesetzt worden war.
7 zeigt die Stabilität von Zink enthaltenden NGF- (118/118 rhNGF) Formulierungen, gemessen als Prozent von nach vier Wochen erhaltenem Monomer (mittels SEC).
8 zeigt die Proteinkonzentration von Zink enthaltenden NGF-Formulierungen nach vier Wochen (Proteinkonzentration mittels UV-Absorption gemessen).
9 zeigt die In-vitro-Freisetzung von rhNGF aus PLGA-Mikrokügelchen, die mit (volle Kreise) und ohne (volle Quadrate) zur Proteinformulierung (mit Zink vorformuliert) zugegebenem Zinkacetat hergestellt wurden. Alle Mikrokügelchen wurden unter Verwendung von 12-Kd-, ungeblocktem 50:50-PLGA und 10 Gew.-% Proteinbeladung hergestellt. Der Freisetzungsmodifikator war 6 % Zinkcarbonat; Freisetzungspuffer für „NGF-PLGA" war Acetat, pH 5,5, und für „Zn-NGF-PLGA" war er PBS, pH 7,2.
10 stellt die Wirkung der Zink-Vorformulierung auf die Stabilität von aus PLGA-Mikrokügelchen freigesetztem rhNGF dar.
Ausführliche Beschreibung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass mit einem Metall, wie z.B. Zink, in Form eines mikroverkapselten Biopolymers formulierter NGF eine ausgesprochen niedrige anfängliche Freisetzungsrate aus den Mikrokügelchen aufweist, während eine kontrollierte nachhaltige Freisetzung über einen Zeitraum von mehr als einem Tag und typischerweise zumindest einer oder zwei Wochen ermöglicht wird. Darüber hinaus erhöhte die Formulierung von NGF in wässriger Lösung mit einem NGF bindenden Metall, wie z.B. Zink, vor der Verkapselung mit Biopolymer überraschenderweise die Stabilität von aus diesen mikroverkapselten Vorrichtungen freigesetztem NGF. Demgemäß wird in einer bevorzugten Ausführungsform der NGF mit einem Metall in Lösung vor dem Trocknen oder Beimischen von Mikroverkapselungspolymeren oder Freisetzungsmodifikatoren formuliert. Obgleich einige wenige Proteinmedikamente in einem Modus für kontrollierte Freisetzung formuliert worden sind, ist die kontrollierte Freisetzung mit einer bestimmten Rate und über einen gewünschten Zeitraum schwer zu erzielen. Beispielsweise ist beschrieben worden, dass rhNGF einen Komplex mit Zink bilden und durch Komplexierung des Proteins mit Zinkacetat während des Mikrokügelchen-Herstellungsprozesses und während der anschließenden Freisetzung stabilisiert werden kann (Johnson et al., Nature Medicine 2, 795-799 (1996)). Jedoch müssen weder die zur Verkapselung eines Medikaments verwendeten Bedingungen im Abbau des abzugebenden Medikaments resultieren, noch muss das Medikament mit der Polymermatrix reagieren, so dass das Medikament inaktiviert oder gebunden wird. Für eine klinische Situation muss das Mittel für die Abgabe kostengünstig herzustellen, stabil zur Lagerung und unter Anwendung von Standardverfahren verabreichbar sein. Diese Bedürfnisse sind von der folgenden Erfindung erfüllt worden.
„Polyol" bezeichnet bei Verwendung hierin einen Kohlenwasserstoff, der zumindest zwei an Kohlenstoffatome gebundene Hydroxylgruppen umfasst. Polyole haben vorzugsweise ein Molekulargewicht von weniger als ungefähr 70.000 D. Beispiele von Polyolen, die zur praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung zweckdienlich sind, umfassen Zuckeralkohole, wie z.B. Mannit und Trehalose, und Polyether, wie z.B. Polyethylenglykol. Siehe US-Patent Nr. 5.589.167, erteilt am 31. Dezember 1996, das hierin durch Verweis aufgenommen ist. NGF kann gegen Denaturierung bei Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel durch Beimischen eines Polyols, vorzugsweise eines Zuckeralkohols und bevorzugter Trehalose, Mannit oder Saccharose, und insbesondere Trehalose, zum Polypeptid stabilisiert werden.
„Polyether" bezeichnet bei Verwendung hierin einen Kohlenwasserstoff, der zumindest drei Etherbindungen enthält. Polyether können andere funktionelle Gruppen enthalten. Zur praktischen Umsetzung der Erfindung zweckdienliche Polyether umfassen Polyethylenglykol (PEG).
„Trocken-Polypeptid" bezeichnet bei Verwendung hierin ein Polypeptid, das einem Trocknungsverfahren unterzogen worden ist, so dass zumindest 50 % der Feuchte entfernt worden ist.
„Verkapselung" bezeichnet bei Verwendung hierin ein Verfahren zum Formulieren eines therapeutischen Mittels, wie z.B. eines Polypeptids, in eine Zusammensetzung (Mikrokügelchen-Vorrichtung), die zur kontrollierten Freisetzung des therapeutischen Mittels zweckdienlich ist. Beispiele von verkapselnden Materialien, die in der vorliegenden Erfindung zweckdienlich sind, umfassen Polymere oder Copolymere von Milch- und Glykolsäuren oder Gemische derartiger Polymere und/oder Copolymere, die üblicherweise als „Polylactide" bezeichnet werden.
„Beimengen" bezeichnet bei Verwendung hierin die Zugabe eines Exzipienten zu einem Polypeptid von Interesse, wie z.B. durch Vermischen trockener Reagenzien oder Vermischen eines trockenen Reagens mit einem Reagens in Lösung oder Suspension oder Vermischen von wässrigen Formulierungen von Reagenzien.
„Exzipient" bezeichnet bei Verwendung hierin ein nicht-therapeutisches Mittel, dass einer pharmazeutischen Zusammensetzung zugegeben wird, um für eine gewünschte Konsistenz oder Stabilisierungswirkung zu sorgen.
Unter „organisches Lösungsmittel" wird hierin jegliches auf Kohlenstoff basierende flüssige Lösungsmittel verstanden. Beispielhafte organische Lösungsmittel umfassen Methylenchlorid, Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid und Ethanol. Wie hierin verwendet werden „Alkohole" und „alkoholische Lösungsmittel" im Sinne der üblicherweise verwendeten Terminologie für Alkohol, vorzugsweise Alkohole mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, bevorzugter Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Propanol oder t-Butanol, sowie Glycerin, Propylenglykol, Ethylenglykol, Hexylenglykol, Polypropylenglykol und Polyethylenglykol, und insbesondere Ethanol oder Isopropanol, verstanden. Derartige Alkohole sind Lösungsmittel, die bei Zugabe zu einer wässrigen Lösung die Hydrophobizität der Lösung durch Verminderung der Polarität der Lösung erhöhen.
„Behandeln" eines Polypeptids mit einem organischen Lösungsmittel bezieht sich bei Verwendung hierin auf das Vermischen eines Trocken-Polypeptids mit einem organischen Lösungsmittel oder das Herstellen einer Emulsion eines Polypeptids in einer wässrigen Formulierung mit einem organischen Lösungsmittel, wodurch eine Grenzfläche zwischen einem Polypeptid in einer wässrigen Formulierung und einem organischen Lösungsmittel erzeugt wird, oder das Extrahieren eines Polypeptids aus einer wässrigen Formulierung mit einem organischen Lösungsmittel.
Unter „Mikrokügelchen" werden feste, aus Polymer bestehende Kügelchen verstanden, die von dispergiertem NGF durchdrungen sind, sowie Mikroteilchen und Mikrokapseln, wenn nicht anders angegeben. Auf Mikroteilchen wird speziell Bezug genommen, wenn unregelmäßig geformtes) Polymer oder Polymer-Medikament-Teilchen beschrieben werden. Mikrokapseln sind kugelförmig geformte Polymervorrichtungen, die einen Nicht-Polymer-Kern oder einen Kern aufweisen, der aus einem anderen Polymer als die äußere Hülle besteht.
Eine „nachhaltige" oder „verlängerte" Freisetzung von NGF kann kontinuierlich oder diskontinuierlich, linear oder nicht-linear sein. Dies kann durch Verwendung einer oder mehrerer Arten von Polymerzusammensetzungen, Medikamentbeladungen, durch Auswählen von Exzipienten oder Abbauverstärkern oder durch andere Modifizierungen, Verabreichung alleine oder in Kombination oder aufeinander folgend zur Hervorbringung der gewünschten Wirkung erzielt werden.
„NGF" bezieht sich auf einen Nervenwachstumsfaktor aus jeglicher Spezies, einschließlich Maus, Rind, Schaf, Schwein, Pferd, Vogel und vorzugsweise Mensch, in Form der Nativsequenz oder einer genetisch manipulierten Variante und aus jeglicher Quelle, ob natürlich, synthetisch oder rekombinant hergestellt. Vorzugsweise wird NGF rekombinant hergestellt. In einem bevorzugten Verfahren wird NGF kloniert und seine DNA exprimiert, z.B. in Säugetierzellen, in Bakterienzellen.
Für die Verwendung am Menschen wird der reife menschliche Nativsequenz-NGF bevorzugt, bevorzugter eine Form einer Sequenz von 120 Aminosäuren und noch bevorzugter einer Sequenz von 118 Aminosäuren. Die bevorzugte Aminosäuresequenz für menschliches Prä-Pro-NGF und menschliches reifes NGF werden vom US-Patent Nr. 5.288.622 bereitgestellt, das hierin speziell durch Verweis aufgenommen ist. Die Form mit 120 Aminosäuren ohne zusätzliche posttranslationelle Modifizierungen ist eine bevorzugte Form in der Homodimer-Form (d.h. 120/120). Sogar noch bevorzugter ist die Form 118 ohne posttranslationelle Modifizierungen, insbesondere als Homodimer (d.h. 118/118). Die Primärstruktur eines Säugetier-NGF (Maus-NGF) wurde erstmals von Angeletti und Bradshaw, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 2417 (1971), aufgeklärt. Die Primärstruktur seines Vorläufers, Prä-Pro-NGF, ist von der Nucleotidsequenz der Maus-NGF-cDNA hergeleitet worden (Scott et al., Nature 302, 538 (1983); Ullrich et al., Nature 303, 821 (1983)). Das homologe menschliche NGF- (hNGF-) Gen ist ebenfalls identifiziert worden (Ullrich, Symp. on Quan. Biol., Cold Spring Harbor 48, 435 (1983); US- Patent Nr. 5.288.622, erteilt am 22. Februar 1994, das hierin durch Verweis aufgenommen ist). Seine Homologie mit dem Maus-NGF beträgt ungefähr 90 % und 87 % auf der Aminosäure- bzw. Nucleotidsequenzebene. NGF kann glykosyliert oder unglykosyliert sein.
In anderen Ausführungsformen umfassen die Mikrokügelchen-Formulierungen der vorliegenden Erfindung chimäre und pantrope NGF-Neutrophine, wie z.B. jene, die im US-Patent Nr. 5.488.099, erteilt am 30. Jänner 1996, in Urfer et al., EMBO J. 13(24), 5896-909 (1994), und in WO 95/33829, veröffentlicht am 14. Dezember 1995 (hierin durch Verweis aufgenommen), beschrieben sind, in denen NGF so modifiziert worden ist, dass er an mehr als einen Rezeptor bindet oder eine Rezeptorbindungsaktivität aufweist, die im nativen NGF normalerweise nicht in einem signifikanten Ausmaß auftritt. Von besonderem Interesse sind Chimären, die ein NGF-Aminosäuregerüst aufweisen, jedoch so modifiziert sind, dass sie andere Rezeptoren als trkA, wie z.B. trkB oder trkC, binden. Diese NGF-Formen weisen eine Aminosäuresequenz auf, die zur Aminosäuresequenz von NGF homolog ist (üblicherweise zu mehr als 80 %, vorzugsweise mehr als 90 % und bevorzugter mehr als 95 % und insbesondere bevorzugt mehr als 97 %) und Substitutionen aufweist, die andere neurotrophe Spezifitäten verleiht. In der bevorzugten Ausführungsform sind NGF-Reste durch die Domänen substituiert; d.h. dass eine gewisse Anzahl von Aminosäuren aus der NGF-Sequenz deletiert und durch eine identische oder ähnliche Anzahl von Aminosäuren substituiert ist, was eine zusätzliche Spezifität verleiht. Beispielsweise wird ein pantroper NGF mit einer D16A-Substitution hergestellt, die BDNF-Spezifität (trkB-Bindungsaktivität) verleiht, während die trkA-Bindungsaktivität beibehalten wird. Bevorzugt sind jene, bei denen im NGF Aminosäuresubstitutionen durch eine Aminosäure aus einer entsprechenden Position in NT-3 vorgenommen worden sind, die für die Bindung des trkC-Rezeptors für NT-3 verantwortlich ist. Derartige NGF-Mutanten weisen eine NT-3-artige trkC-Rezeptor-Bindungsaktivität auf, während die Konformation, Pharmakokinetik und das Reinigungsverhalten von NGF beibehalten wird (Urfer et al., Biochemistry 36(16), 4775-4781 (1997)). Beispielweise sind Substitutionen in der prä-variablen Region I (V18E+V20L+G23T) und in der variablen Region 4 (Y79Q+T81K+H84Q+F86Y+K88R) enthalten, die eine trkC-Bindungsaktivität ermöglichen. Die Substitutionen in der prä-variablen Region I können mit nur einzelnen Aminosäuresubstitutionen in der variablen Region 4 vorgenommen werden; beispielsweise kann V18E+V20L+G23T und eine oder mehrere von Y79Q, T81K, H84Q, F86Y oder K88R vorgenommen werden. Diese NGF-Mutanten können genetisch so manipuliert werden, dass ihnen die trkA-Bindungsaktivität fehlt, beispielsweise durch Entfernen oder Modifizieren der N-terminalen 1 bis 9 Aminosäuren des NGF. Die Spezies mit 109 Aminosäuren (10-118)hNGF, die aus dem Verlust der ersten 9 Reste des N-Terminus und der letzten beiden Reste aus dem C-Terminus des gereinigten rekombinanten menschlichen NGF resultiert, ist bei der Verdrängung von Maus[¹²⁵I]NGF aus dem menschlichen trkA-Rezeptor im Vergleich zum (1-118)hNGF 300-mal weniger wirksam (Shih et al., J. Biol. Chem. 269(44), 27679-86 (1994)). Derartige genetisch manipulierte NGF-Mutanten, die trkC, nicht jedoch trkA binden, sind zur Verwendung in der hierin beschriebenen Erfindung insbesondere bevorzugt.
Die Isolierung eines rekombinanten menschlichen NGF umfasst die Trennung des Proteins von einer Vielzahl verschiedener Wirtszell-Verunreinigungen. Jeder Schritt umfasst spezielle Puffer, die eine ausreichende Trennung ermöglichen. Der letzte oder vorletzte Verarbeitungsschritt für NGF wird durch die Anwesenheit mehrerer NGF-Varianten erschwert, die unter Verwendung herkömmlicher chromatographischer Medien mitgereinigt werden. Wenn ein Neufaltungsschritt im Gewinnungs- und Reinigungsverfahren enthalten ist, umfassen die Varianten fehlgefaltete NGF-Formen. Varianten können außerdem jene umfassen, die sich chemisch von NGF unterscheiden, wie z.B. carbamylierte, amidierte, desamidierte oder proteolytisch gespaltene Formen. Im Falle von NGF bestehen diese Spezies in erster Linie aus dimeren Formen – Homodimeren, z.B. 120/120 oder 117/117, wenn 118/118 erwünscht ist, oder Heterodimeren, z.B. 120/118, 117/118 – oder chemisch modifizierten Varianten – Isoaspartat-, mono-oxidierte, Glykosylierungsvarianten, N-terminale und C-terminale trunkierte Formen, und Dimere davon (Schmelzer et al., J. Neurochem. 59, 1675-1683 (1992); Canova-Davis et al., in: Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Escom Science Publishers, Leiden, Niederlande (1993) (Proceedings of the Thirteenth American Peptide Symposium, Edmonton, Alberta, Canada, 20.-25. Juni 1993)). Bevorzugte Formulierungen sind im Wesentlichen reines und homogenes 118/118-NGF ohne diese Modifizierungen.
Unter „im Wesentlichen rein" wird ein Reinheitsgrad von Gesamt-NGF zu Gesamtprotein verstanden, bei dem zumindest 70 % Neutrophin, bevorzugter zumindest 80 %, vorliegt und der sich noch bevorzugter auf zumindest 90 %, 95 oder 99 % steigert. Eine insbesondere bevorzugte Reinheit beträgt zumindest 95 %. Mit „im Wesentlichen rein" ist gemeint, dass die Zusammensetzung bezüglich des gewünschten Neutrophins eine Reinheit von zumindest 90 % aufweist.
Mit „im Wesentlichen frei von NGF-Varianten" ist eine Zusammensetzung gemeint, in der der prozentuelle Anteil der gewünschten NGF-Spezies zumindest 70 % der gewünschten NGF-Spezies, vorzugsweise zumindest 80 %, beträgt und noch bevorzugter auf zumindest 90 %, 93 %, 95 % oder 99 % ansteigt. Mit „im Wesentlichen frei" ist gemeint, dass die Zusammensetzung zumindest 90 % oder mehr gewünschtes NGF enthält. Ein insbesondere bevorzugtes Ausmaß ist zumindest 95 % gewünschtes Neutrophin, z.B. einer korrekt gefalteten, intakten 118/118rhNGF-Spezies. Die unerwünschten Spezies oder Formen können falsch prozessierte Formen oder chemische Varianten sein, z.B. Ladungsvarianten, die aus dem Fermentations- oder Reinigungsverfahren resultieren, oder alle der vorhergehenden hierin offenbarten. Zum Beispiel können NGF-„Spezies" oder „Varianten", wenn NGF nach der Synthese in Bakterien in vitro gefaltet wird, fehlgefaltete oder partiell gefaltete Formen umfassen.
Unter einer „fehlgefalteten" Variante wird eine Variante des NGF verstanden, die sich vom elterlichen NGF durch die Paarung seiner Cysteinreste oder durch die einzelnen Reste unterscheidet, die frei oder blockiert sind. Fehlgefaltete Varianten können auch dieselbe Cysteinpaarung wie das elterliche NGF, jedoch eine aus der Fehlfaltung resultierende andere dreidimensionale Konformation aufweisen.
Mit „chemischer" Variante ist eine Variante gemeint, die sich von wünschenswerten elterlichen NGF chemisch unterscheidet, zum Beispiel durch Carbamylierung, Amidierung oder proteolytische Spaltung.
Der NGF, vorzugsweise der hierin gelehrte metallstabilisierte NGF, wurde zur nachhaltigen Freisetzung formuliert, vorzugsweise durch Mikroverkapselung, vorzugsweise mit einem biologisch abbaubaren Polymer als Mikrokügelchen. Geeignete Beispiele von Präparaten mit nachhaltiger Freisetzung umfassen semipermeable Matrices fester hydrophober Polymere, die NGF enthalten, wobei die Matrices in Form von Formteilen, z.B. Filmen oder Mikrokapseln, vorliegen. Beispiele von Matrices mit nachhaltiger Freisetzung umfassen Polyester, Hydrogele (z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), wie beschrieben von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167-277 (1981), und Langer, Chem. Tech. 12, 98-105 (1982), oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919, EP 58.481), Copolymere von L-Glutaminsäure und Gamma-Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, 547-556 (1983)), nicht abbaubares Ethylenvinylacetat (Langer et al., s.o.), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie z.B. Lupron Depot^TM (injizierbare Mikrokügelchen, die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuproidacetat zusammengesetzt sind), und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure (EP 133.988). Während Polymere wie z.B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen für über 100 Tage ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Polypeptide für kürzere Zeiträume frei. Wenn verkapselte Polypeptide für lange Zeit im Körper verbleiben, können sie als Folge der Exposition mit Feuchtigkeit bei 37 °C denaturieren oder aggregieren, was in einem Verlust biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität resultiert. Wie hierin festgestellt worden ist, erhält die Vorformulierung von NGF mit einem Metall deutlich die Integrität von NGF während der nachhaltigen Freisetzung.
Alternative Modi der nachhaltigen Freisetzung, für die NGF oder NGF-Metall-Komplex einen Vorteil bietet, umfassen in Liposomen eingeschlossenen, metallstabilisierten NGF. Polypeptide enthaltende Liposomen werden mittels Verfahren hergestellt, die an sich bekannt sind: DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030-4034 (1980); EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; Japanische Patentanmeldung 83-118008; US-Patent Nr. 4.485.945 und US-Patent Nr. 4.544.545; und EP 102.324. Für gewöhnlich sind die Liposomen vom kleinen (ungefähr 200-800 Angström) unilamellaren Typ, in dem der Lipidgehalt mehr als ungefähr 30 Mol-% Cholesterin beträgt, wobei der gewählte Anteil für die optimale Ligandenanaloga-Therapie eingestellt wird. Liposomen mit erhöhter Zirkulationszeit sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
Die lyophilisierte Formen umfassenden Zusammensetzungen hiervon werden im Allgemeinen durch Mischen der Komponenten unter Verwendung allgemein verfügbarer pharmazeutischer Mischungstechniken hergestellt, die an sich bekannt sind. Desgleichen werden standardmäßige Lyophilisierungsverfahren und Apparaturen eingesetzt, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind.
Das biologisch abbaubare Polymer der vorliegenden Erfindung hat eine geringe Wasserlöslichkeit oder ist wasserunlöslich und umfasst aliphatische Polyester, z.B. Homopolymere oder Copolymere, die aus einer oder mehreren Arten von α-Hydroxycarbonsäuren (z.B. Glykolsäure, Milchsäure, 2-Hydroxybuttersäure, Valinsäure, Leucinsäure usw.), Hydroxydicarbonsäuren (z.B. Äpfelsäure usw.), Hydroxytricarbonsäuren (z.B. Zitronensäure usw.) oder ihren Gemischen; Poly-α-cyanoacrylester, z.B. Poly(methyl-α-cyanoacrylat), Polyethyl-α-cyanoacrylat), Poly(butyl-α-cyanoacrylat) usw.; und Aminosäurepolymeren, z.B. Poly(γ-benzyl-L-glutamat) usw. oder ihren Gemischen, synthetisiert werden. Die Art und Weise der Polymerisation für diese Polymere kann jegliche statistische, Block- oder Pfropf-Polymerisationstechnik sein.
Die bevorzugten biologisch abbaubaren Polymere sind aliphatische Polyester, z.B. Homopolymere oder Copolymere, die aus einer oder mehreren Arten von α-Hydroxycarbonsäuren (z.B. Glykolsäure, Milchsäure, 2-Hydroxybuttersäure usw.), Hydroxydicarbonsäuren (z.B. Äpfelsäure usw.) und Hydroxytricarbonsäuren (z.B. Zitronensäure usw.) oder ihren Gemischen und so weiter synthetisiert werden.
Unter den oben erwähnten aliphatischen Polyestern sind die aus einer oder mehreren Arten der α-Hydroxycarbonsäuren synthetisierten Homopolymere und Copolymere im Hinblick auf biologische Abbaubarkeit und Bioverträglichkeit bevorzugt. Insbesondere bevorzugte aliphatische Polyester sind aus zwei oder mehreren Arten der α-Hydroxycarbonsäuren synthetisierte Copolymere. Darüber hinaus können diese Copolymere als Gemische verwendet werden.
Wenn die α-Hydroxycarbonsäuren chirale Verbindungen sind, können sie jegliche der D-, L- und D-,L-Konfigurationen einnehmen. Es ist bevorzugt, dass das Verhältnis der D-/L-Konfiguration (Mol-%) im Bereich von 75/25 bis ungefähr 25/75 liegt. Bevorzugter ist ein Hydroxycarbonsäure, worin das Verhältnis der D-/L-Konfiguration (Mol-%) im Bereich von ungefähr 60/40 bis ungefähr 30/70 liegt.
Ein Beispiel des oben erwähnten α-Hydroxycarbonsäure-Polymers ist ein Milchsäurepolymer (hiernach manchmal als „Polymilchsäure" bezeichnet). Das α-Hydroxycarbonsäure-Copolymer umfasst Copolymere von Glykolsäure mit anderen α-Hydroxycarbonsäuren, wie z.B. Milchsäure und 2-Hydroxybuttersäure. Bevorzugte α-Hydroxycarbonsäure-Copolymere sind Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und 2-Hydroxybuttersäure-Glykolsäure-Copolymer. Ein insbesondere bevorzugtes α-Hydroxycarbonsäure-Copolymer ist ein Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer.
Die Polymilchsäure kann entweder eine D-Konfiguration oder eine L-Konfiguration oder ein Gemisch sein; eine mit dem D-/L-Konfigurationsverhältnis (Mol-%) von ungefähr 75/25 bis ungefähr 20/80 ist bevorzugt. Bevorzugter ist eine Polymilchsäure, worin das Verhältnis der D-/L-Konfiguration (Mol-%) im Bereich von ungefähr 60/40 bis ungefähr 25/75 liegt. Insbesondere bevorzugt ist eine Polymilchsäure, worin das Verhältnis der D-/L-Konfiguration im Bereich von ungefähr 55/45 bis ungefähr 25/75 liegt.
Die Polymilchsäure hat vorzugsweise ein wie unten definiertes gewichtsmittleres Molekulargewicht von ungefähr 1.500 bis ungefähr 10.000. Bevorzugter ist eine Polymilchsäure mit einem gewichtsmittleren Molekulargewicht von ungefähr 2.000 bis ungefähr 8.000. Insbesondere bevorzugt ist eine Milchsäure mit einem gewichtsmittleren Molekulargewicht von ungefähr 3.000 bis ungefähr 6.000. Die Dispersität (gewichtsmittleres Molekulargewicht/zahlenmittleres Molekulargewicht) von Polymilchsäure liegt vorzugsweise im Bereich von ungefähr 1,2 bis ungefähr 4,0 und bevorzugter im Bereich von ungefähr 1,5 bis ungefähr 3,5.
Die Polymilchsäure kann durch Verfahren nach dem Stand der Technik hergestellt werden, die in EP 172.636 beschrieben sind (z.B. durch dehydrierende Polykondensation in Abwesenheit eines Katalysators oder durch dehydrierende Polykondensation in Gegenwart eines anorganischen festen Säurekatalysators). Die bevorzugte Polymilchsäure wird durch dehydrierende Polykondensation in Abwesenheit eines Katalysators hergestellt.
Das Zusammensetzungsverhältnis (Milchsäure/Glykolsäure, Mol-%) im Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer beträgt ungefähr 100/0 (Homopolymer) bis ungefähr 40/60, vorzugsweise ungefähr 90/10 bis ungefähr 45/55, bevorzugter ungefähr 75/25 bis ungefähr 50/50 und insbesondere bevorzugt ungefähr 60/40 bis ungefähr 40/60. Das gewichtsmittlere Molekulargewicht des Milchsäure-Glykolsäure-Copolymers beträgt vorzugsweise ungefähr 3.000 bis ungefähr 20.000 und bevorzugter ungefähr 4.000 bis ungefähr 15.000. Die Dispersität (gewichtsmittleres Molekulargewicht/zahlenmittleres Molekulargewicht) des Milchsäure-Glykolsäure-Copolymers beträgt ungefähr 1,2 bis ungefähr 4,0 und bevorzugter ungefähr 1,5 bis ungefähr 3,5. In der vorliegenden Erfindung können zwei Arten von Milchsäure-Glykolsäure-Copolymeren, die sich hinsichtlich Zusammensetzungsverhältnis und des gewichtsmittleren Molekulargewichts unterscheiden, in einer Beimischung in einem beliebigen Verhältnis verwendet werden. Ein typisches Beispiel ist ein Gemisch eines Milchsäure-Glykolsäure-Copolymers, worin das Zusammensetzungsverhältnis der Milchsäure/Glykolsäure (Mol-%) ungefähr 75/25 und das gewichtsmittlere Molekulargewicht ungefähr 6.000 beträgt. Ein weiteres Beispiel ist ein Milchsäure/Glykolsäure-Copolymer, worin das Zusammensetzungsverhältnis von Milchsäure/Glykolsäure (Mol-%) ungefähr 50/50 und das gewichtsmittlere Molekulargewicht ungefähr 4.000 beträgt. Das bevorzugte Gewichtsverhältnis des Gemischs beträgt ungefähr 25/75 bis ungefähr 75/25.
Die Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere können mit den bekannten Verfahren hergestellt werden, die in EP 172.636 beschrieben sind (z.B. dehydrierende Polykondensation in Abwesenheit eines Katalysators oder dehydrierende Polykondensation in Gegenwart eines anorganischen festen Säurekatalysators). Das bevorzugte Copolymer ist eines, das durch dehydrierende Polykondensation in Abwesenheit eines Katalysators hergestellt wird.
Das Zusammensetzungsverhältnis des 2-Hydroxybuttersäure-Glykolsäure-Copolymers beträgt ungefähr 10 bis ungefähr 75 Mol-% Glykolsäure und die verbleibenden Mol-% 2-Hydroxybuttersäure, bevorzugter ungefähr 20 bis ungefähr 75 Mol-% Glykolsäure und bevorzugter ungefähr 30 bis ungefähr 70 Mol-% Glykolsäure. Das gewichtsmittlere Molekulargewicht des 2-Hydroxybuttersäure-Glykolsäure-Copolymers beträgt ungefähr 2.000 bis ungefähr 30.000 und bevorzugter ungefähr 3.000 bis ungefähr 20.000. Das insbesondere bevorzugte gewichtsmittlere Molekulargewicht des Copolymers beträgt ungefähr 4.000 bis ungefähr 15.000. Die Dispersität (gewichtsmittleres Molekulargewicht/zahlenmittleres Molekulargewicht) des 2-Hydroxybuttersäure-Glykolsäure-Copolymers beträgt vorzugsweise ungefähr 1,2 bis ungefähr 4,0, bevorzugter ungefähr 1,5 bis ungefähr 3,5.
2-Hydroxybuttersäure-Glykolsäure-Copolymere können mit den bekannten Verfahren hergestellt werden, die in EP 172.636 beschrieben sind (z.B. dehydrierende Polykondensation in Abwesenheit eines Katalysators oder dehydrierende Polykondensation in Gegenwart eines anorganischen festen Säurekatalysators). Das bevorzugte Copolymer ist eines, das durch dehydrierende Polykondensation in Abwesenheit eines Katalysators hergestellt wird.
Die Glykolsäure-Copolymere (z.B. Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer, 2-Hydroxybuttersäure-Glykolsäure-Copolymer usw.) können in einer Beimischung mit Polymilchsäure verwendet werden. Wenn Glykolsäure-Copolymer in Kombination mit Polymilchsäure verwendet wird, kann das Verhältnis von Glykolsäure-Copolymer/Polymilchsäure (Gew.-%) beispielsweise ungefähr 10/90 bis ungefähr 90/10 betragen. Das bevorzugte Verhältnis beträgt ungefähr 20/80 bis ungefähr 80/20, und das insbesondere bevorzugte Verhältnis beträgt ungefähr 30/70 bis ungefähr 70/30.
Unter den Ausdrücken „gewichtsmittleres Molekulargewicht" und „zahlenmittleres Molekulargewicht" wird bei Verwendung in dieser Patentschrift das Polystyroläquivalente mittlere Molekulargewicht und zahlenmittlere Molekulargewicht einer Probe verstanden, wie sie mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) unter Verwendung von 9 Polystyrol-Standards ermittelt wird, die ein gewichtsmittleres Molekulargewicht von 120.000, 52.000, 22.000, 9.200, 5.050, 2.950, 1.050, 580 und 162 aufweisen. Diese Bestimmungen können unter Verwendung der GPC-Säule KF804L × 2 (Showa Denko K.K.), des RI-Detektors L-3300 (Hitachi Ltd.) und Chloroform als mobile Phase vorgenommen werden.
In der vorliegenden Erfindung weisen die durch die dehydrierende Polykondensationsreaktion in Abwesenheit eines Katalysators synthetisierten biologisch abbaubaren Polymere freie Carboxylgruppen am Terminus auf. Derartige biologisch abbaubare Polymere mit freien Carboxylgruppen am Terminus besitzen eine hohe Übereinstimmung zwischen dem mittels Endgruppen-Titrationstest bestimmten zahlenmittleren Molekulargewicht und dem mittels vorher beschriebenen GPC-Test unter Verwendung von Polystyrol-Standards bekannter Molekulargewichte bestimmten zahlenmittleren Molekulargewicht.
Mit dem Endgruppen-Testverfahren kann das zahlenmittlere Molekulargewicht auf folgende Weise bestimmt werden. Ungefähr 1 g bis 3 g des biologisch abbaubaren Polymers werden in einem Lösungsmittelgemisch von Aceton (25 ml) und Methanol (5 ml) gelöst und die Carboxylgruppen in der Lösung rasch mit 0,05 N alkoholischer Kaliumhydroxidlösung unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator und Rühren bei Raumtemperatur (ungefähr 0 bis ungefähr 30 °C) titriert. Das zahlenmittlere Molekulargewicht wird mit der folgenden Gleichung berechnet: Zahlenmittleres Molekulargewicht mittels Endgruppen-Test = 20.000 (A/B), wobei A die Masse (g) des biologisch abbaubaren Polymers und B die Menge (ml) der bis zum Erreichen des Endpunkts zugegebenen 0,05 N alkoholischen KOH-Lösung ist.
Im Falle eines biologisch abbaubaren Polymers, das freie Carboxylgruppen am Terminus aufweist und aus einer oder mehreren Arten von α-Hydroxycarbonsäuren durch dehydrierende Polykondensation in Abwesenheit eines Katalysators synthetisiert wird, wird eine hohe Übereinstimmung zwischen dem mittels GPC-Test bestimmten zahlenmittleren Molekulargewicht und dem mittels Endgruppen-Test bestimmten zahlenmittleren Molekulargewicht gefunden. Im Gegensatz dazu ist im Falle eines aus dem zyklischen Dimer einer α-Hydroxycarbonsäure durch das Ringöffnungspolymerisationsverfahren unter Verwendung eines Katalysators hergestellten Polymers, das im Wesentlichen keine freien Carboxylgruppen am Terminus aufweist, das mittels Endgruppen-Test gefundene zahlenmittlere Molekulargewicht beträchtlich höher als das mittels GPC gefundene zahlenmittlere Molekulargewicht. Aufgrund dieses Unterschieds kann ein biologisch abbaubares Polymer mit freien Carboxylgruppen am Terminus leicht von einem biologisch abbaubaren Polymer unterschieden werden, das keine freien Carboxylgruppen am Terminus aufweist.
Während das mittels Endgruppen-Test gefundene zahlenmittlere Molekulargewicht ein absoluter Wert ist, ist das mittels GPC-Test gefundene zahlenmittlere Molekulargewicht ein relativer Wert, der von vielen Variablen, wie z.B. analytischen Verfahren und Bedingungen, abhängt (z.B. von der Art der mobilen Phase und Säule, des Referenzstandards, der Wahl der Fraktionenbreite, Wahl der Basislinie usw.) und daher schwer zu verallgemeinern ist. Jedoch besteht eine hohe Übereinstimmung zwischen dem mittels Endgruppen-Test gefundenen zahlenmittleren Molekulargewicht und dem mittels GPC-Test gefundenen zahlenmittleren Molekulargewicht, wenn der aus dem Endgruppen-Test erhaltene Wert im Bereich von ungefähr dem 0,5- bis ungefähr dem 2,0fachen des mittels GPC-Test gefundenen Werts liegt. Der bevorzugte Bereich ist der ungefähr 0,8- bis ungefähr 1,5fache Wert. Dass das mittels Endgruppen-Test gefundene zahlenmittlere Molekulargewicht „beträchtlich höher" als das mittels GPC gefunden zahlenmittlere Molekulargewicht ist, bedeutet, dass der mittels Endgruppen-Test gefundene Wert mehr als ungefähr das Doppelte des mittels GPC-Test gefundenen Werts beträgt.
In der vorliegenden Erfindung sind die bevorzugten Polymere jene, die eine hohe Übereinstimmung zwischen dem mittels Endgruppen-Test gefundenen zahlenmittleren Molekulargewicht und dem mittels GPC-Test gefundenen zahlenmittleren Molekulargewicht aufweisen.
Das Metallsalz, das zur Umsetzung eines biologisch abbaubaren Polymers zu seinem Metallsalz verwendet werden kann, ist nicht speziell eingeschränkt, solange es keine unerwünschten oder nachteiligen Einflüsse in vivo ausübt. Das Metallsalz umfasst ein Salz, das von einem einwertigen Metall, wie z.B. Alkalimetallen (z.B. Natrium, Kalium usw.), oder Erdalkalimetallen (z.B. Calcium, Magnesium usw.) oder einem mehrwertigen Metall, wie z.B. Zink (II), Eisen (II, III), Kupfer (II), Zinn (II, IV) und Aluminium (II, III), mit einer anorganischen Säure oder einer organischen Säure gebildet wird.
Das Metall ist vorzugsweise ein mehrwertiges Metall und bevorzugter ein Erdalkalimetall und Zink. Insbesondere bevorzugte Metalle sind Calcium und Zink.
Anorganische Säuren, die bei der Metallsalzbildung verwendet werden können, umfassen Halogenwasserstoff (z.B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, Fluorwasserstoffsäure), Schwefelsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure und so weiter.
Organische Säuren, die bei der Metallsalzbildung verwendet werden können, umfassen aliphatische Carbonsäuren und aromatische Säuren. Bevorzugte aliphatische Carbonsäuren sind aliphatische C_1-9-Carbonsäuren, z.B. aliphatische Monocarbonsäuren, aliphatische Dicarbonsäuren und aliphatische Tricarbonsäuren. Die aliphatischen Carbonsäuren können gesättigt oder ungesättigt sein.
Die aliphatischen Monocarbonsäuren umfassen gesättigte aliphatische C_1-9-Monocarbonsäuren (z.B. Kohlensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Capronsäure, Oenanthsäure, Caprylsäure, Pelargonsäure, Caprinsäure usw.) und ungesättigte aliphatische C_2-9-Monocarbonsäuren (z.B. Acrylsäure, Propiolsäure, Methacrylsäure, Crotonsäure, Isocrotonsäure usw.).
Die aliphatischen Dicarbonsäuren umfassen gesättigte aliphatische C_2-9-Carbonsäuren (z.B. Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure; Pimelinsäure usw.) und ungesättigte aliphatische C_2-9-Carbonsäuren (z.B. Maleinsäure, Fumarsäure, Citraconsäure, Mesaconsäure usw.).
Die aliphatischen Tricarbonsäuren umfassen gesättigte aliphatische C_2-9-Tricarbonsäuren (z.B. Tricarballylsäure, 1,2,3-Butantricarbonsäure usw.).
Die oben erwähnten aliphatischen Carbonsäuren können zusätzlich 1 bis 2 Hydroxylgruppen aufweisen. Illustrative Beispiele sind Glykolsäure, Milchsäure, Glycerinsäure, Hydroxymalonsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure usw.
Bevorzugte aliphatische Carbonsäuren sind aliphatische Monocarbonsäuren. Bevorzugtere aliphatische Carbonsäuren sind aliphatische C_2-9-Monocarbonsäuren. Insbesondere bevorzugt sind gesättigte aliphatische C_2-3-Monocarbonsäuren. Die insbesondere bevorzugte aliphatische Monocarbonsäure umfasst Essigsäure.
Aromatische Säuren, die bei der Metallsalzbindung verwendet werden können, umfassen Benzoesäure und Phenolsulfonsäure.
Das Metallsalz des biologisch abbaubaren Polymers kann auch unter Verwendung des Acetylacetonats oder Oxids der oben erwähnten mehrwertigen Metalle erlangt werden. Bevorzugte Metalldonoren dieses Typs sind Zink-Acetylacetonat und Zinkoxid.
Metallsalze, die zur Umsetzung eines biologisch abbaubaren Polymers zu seinem Metallsalz verwendet werden können, sind vorzugsweise Salze, die durch ein mehrwertiges Metall mit einer organischen oder anorganischen Säure gebildet werden (hiernach als mehrwertiges Metallsalz bezeichnet).
Mehrwertige Metallsalze, die verwendet werden können, umfassen Salze von Zink mit einer anorganischen Säure, z.B. Zinkhalogenide (z.B. Zinkchlorid, Zinkbromid, Zinkiodid, Zinkfluorid), Zinksulfat, Zinknitrat, Zinkthiocyanat usw.; Salze von Zink mit einer organischen Säure, z.B. Zinksalze aliphatischer Carbonsäuren (z.B. Zinkcarbonat, Zinkacetat, Zinkglykolat, Zinklactat, Zinktartrat usw.), aromatische Zinksalze (z.B. Zinkbenzoat, Zinksalicylat, Zinkphenolsulfonat usw.); Salze von Calcium mit einer anorganischen Säure, z.B. Calciumhalogenid (z.B. Calciumchlorid, Calciumbromid, Calciumiodid, Calciumfluorid usw.), Calciumsulfat, Calciumnitrat, Calciumthiocyanat usw.; Salze von Calcium mit einer organischen Säure, z.B. Calciumsalze aliphatischer Carbonsäuren (z.B. Calciumcarbonat, Calciumacetat, Calciumpropionat, Calciumoxalat, Calciumtartrat, Calciumlactat, Calciumcitrat, Calciumgluconat usw.) und aromatische Calciumsalze (z.B. Calciumbenzoat, Calciumsalicylat usw.). Bevorzugte Salze sind Zinkacetat, Zinkcarbonat, Calciumacetat und Calciumcarbonat. Das bevorzugtere mehrwertige Metallsalz umfasst Zinkacetat und Calciumacetat.
Falls zur Bildung eines homogenen NGF/Metall-Komplexes erforderlich können die im bioaktiven Polypeptid aus der Reinigung vorkommenden Metalle aus dem Polypeptid mit bekannten Verfahren entfernt und durch das stabilisierende Metall der Wahl ersetzt werden.
In der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt, dass Zusatzstoffe, die nicht das Metallsalz des biologisch abbaubaren Polymers im Präparat mit nachhaltiger Freisetzung sind, kein Metallsalz bilden.
Das Metallsalz des biologisch abbaubaren Polymers der vorliegenden Erfindung kann durch Emulgieren und Dispergieren einer wässrigen Lösung oder festen Form eines Metallsalzes in einer Lösung eines in einem organischen Lösungsmittel gelösten biologisch abbaubaren Polymers hergestellt werden, um eine Wasser/Öl-(W/O-) oder Öl/Wasser- (O/W-) Emulsion oder eine organische Lösung oder Suspension eines ein Metallsalz enthaltenden biologisch abbaubaren Polymers herzustellen. Die resultierenden Substanzen werden gewaschen und getrocknet oder einem Trocknungsverfahren in Wasser, Phasentrennungsverfahren, Sprühtrocknungsverfahren oder dergleichen mit Waschen und Trocknen unterzogen. Das Metallsalz, das nicht an der Bildung eines Salzes mit dem biologisch abbaubaren Polymer in diesem Verfahren teilnimmt, wird vorzugsweise entfernt.
Das oben erwähnte organische Lösungsmittel hat vorzugsweise einen Siedepunkt, der 120 °C nicht überschreitet. Ein derartiges organisches Lösungsmittel umfasst halogenierte Kohlenwasserstoffe (z.B. Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff usw.), Alkohole (z.B. Ethanol, Methanol usw.), Acetonitril und so weiter. Diese Lösungsmittel können auch als Gemisch verwendet werden. Insbesondere bevorzugt ist Dichlormethan.
Der Metallgehalt des biologisch abbaubaren Polymer-Metallsalzes beträgt ungefähr 0,01 bis ungefähr 10 Gew.-%, bevorzugter 0,05 bis ungefähr 7 Gew.-% und insbesondere bevorzugt ungefähr 0,1 bis ungefähr 5 Gew.-%. Der Metallgehalt eines biologisch abbaubaren Polymer-Metallsalzes kann durch Atomabsorptionsspektrometrie bestimmt werden.
Verfahren zum Herstellen eines biologisch abbaubaren Polymer-Metallsalzes (z.B. Trocknungsverfahren in Wasser, Phasentrennungsverfahren und Sprühtrocknungsverfahren) werden unten beschrieben.
Um ein biologisch abbaubares Polymer-Metallsalz durch ein Trocknungs-Verfahren in Wasser (Wasser/Öl/Wasser- oder W/O/W-Verfahren) herzustellen, wird das biologisch abbaubare Polymer zuerst in einem organischen Lösungsmittel gelöst, um eine organische Lösungsmittellösung herzustellen (hiernach manchmal als die Ölphase bezeichnet). Die Konzentration des biologisch abbaubaren Polymers in dieser organischen Lösungsmittellösung wird in geeigneter Weise im Einklang mit dem Molekulargewicht des Polymers und der Art des verwendeten Lösungsmittels gewählt. Beispielsweise kann die Konzentration des biologisch abbaubaren Polymers im organischen Lösungsmittel ungefähr 0,01 bis ungefähr 90 Gew.-%, vorzugsweise ungefähr 0,1 bis ungefähr 80 Gew.-% und bevorzugter ungefähr 1 bis ungefähr 70 Gew.-%, betragen. Für die innere wässrige Phase wird eine wässrige Lösung von Metallsalzen verwendet. Die Metallsalzkonzentration kann ungefähr 10 bis ungefähr 90 % (Gew./Vol.) und vorzugsweise ungefähr 30 bis ungefähr 80 (Gew./Vol.) betragen. Jedoch hängt die Metallsalzkonzentration von der Löslichkeit des Metallsalzes in Wasser ab. Die obige wässrige Metallsalzlösung wird in der organischen Lösungsmittellösung des biologisch abbaubaren Polymers dispergiert und emulgiert, um eine W/O-Emulsion bereitzustellen. Das Volumenverhältnis der wässrigen Lösung von Metallsalzen in der organischen Lösungsmittellösung des biologisch abbaubaren Polymers beträgt ungefähr 1:1.000 bis ungefähr 1:1, vorzugsweise ungefähr 1:100 bis ungefähr 1:2, insbesondere bevorzugt ungefähr 1:50 bis ungefähr 1:3. Die Emulgation kann durch herkömmliche Emulgationsverfahren, wie z.B. durch Verwenden eines Turbinenmischers, eines Homogenisators oder dergleichen, erzielt werden.
Die so erlangte W/O-Emulsion wird dann einer wässrigen Phase (der äußeren wässrigen Phase) zugegeben, um eine W/O/W-Emulsion zu liefern. Danach wird das Ölphasen-Lösungsmittel abgedampft, um das gewünschte biologisch abbaubare Polymer-Metallsalz bereitzustellen. Das Volumen der äußeren wässrigen Phase kann aus dem Bereich von beispielsweise ungefähr 1- bis ungefähr 10.000-mal dem Volumen der Ölphase gewählt werden. Die Lösungsmittelabdampfung kann durch herkömmlich verwendete Verfahren erzielt werden, einschließlich mit dem Verfahren, bei dem das Lösungsmittel unter normalem oder allmählich vermindertem Druck während des Rührens mit einem Propellerrührer oder magnetischen Rührer usw. abgedampft wird, und mit dem Verfahren, bei dem das Lösungsmittel abgedampft wird, während die Stärke des Vakuums mit einem Rotationsverdampfer eingestellt wird, und so weiter.
Ein Emulgator kann der äußeren wässrigen Phase zugegeben werden. Der Emulgator kann jegliche Substanz sein, die für stabile W/O/W-Emulsionen sorgt. Beispiele derartiger Emulgatoren umfassen anionische Tenside, nicht-ionische Tenside, Polyoxyethylen-Rizinusöl-Derivate, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Carboxymethylcellulose, Lecithin, Gelatine, Hyaluronsäure und so weiter. Der bevorzugte Emulgator ist Polyvinylalkohol. Mehrere Emulgatoren in Kombination können zur Verwendung in der äußeren wässrigen Phase ebenfalls verwendet werden. Die Konzentration des Emulgators auf Basis der äußeren wässrigen Phase kann aus dem Bereich von ungefähr 0,001 bis ungefähr 20 Gew.-% gewählt werden. Der bevorzugte Bereich ist ungefähr 0,01 bis ungefähr 10 Gew.-%, und der noch bevorzugtere Bereich ist ungefähr 0,05 bis ungefähr 5 Gew.-%.
Ein Metallsalz, das dem in der inneren wässrigen Phase ähnlich oder davon verschieden ist, kann der äußeren wässrigen Phase ebenfalls zugegeben werden. In solchen Fällen wird vorzugsweise ein Fettsäuremetallsalz in einer Menge zugegeben, so dass die Konzentration des Metallsalzes in der äußeren wässrigen Phase ungefähr 0,01 bis 20 Gew.-% oder bevorzugter ungefähr 0,1 bis 10 Gew.-% beträgt. Durch sorgfältige Wahl der Konzentration des Metallsalzes in der äußeren wässrigen Phase kann der Übergang des in der inneren wässrigen Phase verwendeten Metallsalzes aus dem biologisch abbaubaren Polymer in die äußere wässrige Phase vermieden werden.
Das so bereitgestellte biologisch abbaubare Polymer-Metallsalz wird durch Zentrifugation oder Filtration gewonnen, mit destilliertem Wasser mehrmals gewaschen, um den Emulgator und andere Ablagerungen von der Salzoberfläche zu entfernen, danach wieder in destilliertem Wasser dispergiert und lyophilisiert.
Um ein biologisch abbaubares Polymer-Metallsalz mit einem Trocknungsverfahren in Wasser (Öl/Wasser-Verfahren) herzustellen, wird eine Lösung des biologisch abbaubaren Polymers in einem organischen Lösungsmittel zunächst wie im Verfahren (A) hergestellt. Danach wird Metallsalz zugegeben und in der organischen Lösungsmittellösung des biologisch abbaubaren Polymers dispergiert oder gelöst. Das Verhältnis von Metallsalz zu biologisch abbaubarem Polymer (gewichtsmäßig) beträgt ungefähr 5:1 bis ungefähr 1:100, vorzugsweise ungefähr 2:1 bis ungefähr 1:50 und bevorzugter ungefähr 1:1 bis ungefähr 1:10. Die so erlangte organische Lösungsmittellösung wird dann in eine wässrige Phase gegossen und eine O/W-Emulsion unter Verwendung eines Turbinenmischers oder dergleichen hergestellt. Danach wird das Ölphasen-Lösungsmittel wie im Verfahren (A) abgedampft, um das biologisch abbaubare Polymer-Metallsalz bereitzustellen. Das Volumen der wässrigen Phase basiert auf dem Volumen der Ölphase und wird aus dem Bereich von beispielsweise ungefähr 1- bis ungefähr 10.000-mal dem Volumen der Ölphase oder vorzugsweise ungefähr 2- bis ungefähr 5.000-mal gewählt. Der insbesondere bevorzugte Bereich ist 5- bis ungefähr 2.000-mal.
Wie im Verfahren (A) kann dieser wässrigen Phase ein Emulgator zugegeben werden.
Es kann ein Metallsalz in die wässrige Phase gegeben werden, das dem der Ölphase zugegebenen und dispergierten oder gelösten Metallssalz ähnlich oder davon verschieden ist.
Das so hergestellte biologisch abbaubare Polymer-Metallsalz wird wie im Verfahren (A) abgetrennt, gewaschen und lyophilisiert.
Um ein biologisch abbaubares Polymer-Metallsalz durch ein Phasentrennungsverfahren (Koazervationsverfahren) herzustellen, wird ein Koazervationsmittel allmählich in die wie im Verfahren (A) verwendete Wasser/Öl-Emulsion oder in die organische Lösungsmittellösung des biologisch abbaubaren Polymers gegeben, die wie im Verfahren (B) angewendet Metallsalz enthält, und zwar unter Rühren, um das biologisch abbaubare Polymer-Metallsalz zu präzipitieren und zu verfestigen. Die Menge des verwendeten Koazervationsmittels basiert auf dem Volumen der W/O-Emulsion oder organischen Lösungsmittellösung des biologisch abbaubaren Polymers. Das verwendete Volumen beträgt ungefähr 0,01- bis 1.000-mal, vorzugsweise ungefähr 0,05- bis ungefähr 500-mal und bevorzugter ungefähr 0,1- bis ungefähr 200-mal das Volumen der W/O-Emulsion oder organischen Lösung des biologisch abbaubaren Polymers.
Das Koazervationsmittel kann eine Substanz sein, die jeglicher Kategorie von Polymeren, Mineralölen oder Pflanzenölen angehört, die mit dem zur Lösung des biologisch abbaubaren Polymers verwendeten Lösungsmittel mischbar sind, in denen jedoch das biologisch abbaubare Polymer nicht nennenswert löslich ist. Typische Beispiele sind Silikonöl, Sesamöl, Sojabohnenöl, Maisöl, Baumwollsamenöl, Kokosöl, Leinöl, Mineralöl, n-Hexan, n-Heptan und so weiter. Die Koazervationsmittel können in einer Kombination von zwei oder mehreren Arten verwendet werden.
Das so hergestellte biologisch abbaubare Polymer-Metallsalz wird durch Filtration gewonnen und wiederholt mit Heptan oder dergleichen gewaschen, um das Koazervationsmittel zu entfernen. Das Salz wird dann wie im Verfahren (A) gewaschen und lyophilisiert.
Bei der Herstellung eines biologisch abbaubaren Polymer-Metallsalzes durch das Trocknungsverfahren in Wasser oder Koazervationsverfahren kann ein Antiflockungsmittel zugegeben werden, um die Agglomeration der Teilchen zu verhindern. Antiflockungsmittel, die verwendet werden können, umfassen wasserlösliche Polysaccharide, wie z.B. Mannit, Lactose, Glucose und Stärken (z.B. Maisstärke), Hyaluronsäure und seine Alkalimetallsalze, Glycin, ein Protein, wie z.B. Fibrin, Collagen und ein anorganisches Salz, wie z.B. Natriumchlorid, Natriumhydrogenphosphat, und so weiter.
Um ein biologisch abbaubares Polymer-Metallsalz durch ein Sprühtrocknungsverfahren herzustellen, wird entweder eine aus einer wässrigen Lösung des Metallsalzes und einer organischen Lösungsmittellösung des biologisch abbaubaren Polymers hergestellte Wasser/Öl-Emulsion oder eine das Metallsalz enthaltende organische Lösungsmittellösung oder -suspension des biologisch abbaubaren Polymers über eine Düse in die Trocknungskammer eines Sprühtrockners gesprüht, um das organische Lösungsmittel in feinen Tröpfchen in sehr kurzer Zeit zu verdampfen und ein feines biologisch abbaubares Polymer-Metallsalz zu produzieren. Beispiele der oben erwähnten Düse sind eine Zweiflüssigkeiten-Düse, eine Druckdüse und eine Rotationsscheibendüse. Eine wässrige Lösung des oben beschriebenen Antiflockungsmittels kann ebenfalls über eine weitere Düse eingesprüht werden, um die Agglomeration des biologisch abbaubaren Polymer-Metallsalzes mit der W/O-Emulsion oder der organischen Lösungsmittellösung oder der Suspension des das Metallsalz enthaltenden biologisch abbaubaren Polymers zu verhindern. Das so hergestellte biologisch abbaubare Polymer-Metallsalz wird wie im Verfahren (A) gewaschen und, falls erforderlich, wird Wasser und organisches Lösungsmittel unter Erwärmen und vermindertem Druck entfernt.
Das nachhaltig freisetzende Präparat der vorliegenden Erfindung kann gefertigt werden, indem NGF in einem das biologisch abbaubare Polymer-Metallsalz enthaltenden organischen Lösungsmittel dispergiert und die resultierende Dispersion der Formulierung unterzogen wird. Das Fertigungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann mit dem oben beschriebenen (A) Trocknungsverfahren in Wasser (W/O/W-Verfahren), (B) Trocknungsverfahren in Wasser (O/W-Verfahren), (C) Phasentrennungsverfahren (Koazervationsverfahren), (D) Sprühtrocknungsverfahren und jeglicher Modifizierung davon verwendet werden. Das organische Lösungsmittel der organischen Lösungsmittellösung ist vorzugsweise ein Lösungsmittel mit einem Siedepunkt von nicht mehr als 120 °C. Derartige organische Lösungsmittel umfassen unter anderem halogenierte Kohlenwasserstoffe (z.B. Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff usw.), Alkohole (z.B. Ethanol, Methanol, 1,4-Butandiol, 1,5-Pentandiol usw.) und Acetonitril. Alle der Lösungsmittel können gemeinsam als Gemisch verwendet werden. Wenn ein einzelnes organisches Lösungsmittel einzusetzen ist, wird Dichlormethan oder Acetonitril insbesondere bevorzugt. Wenn ein Gemisch organischer Lösungsmittel einzusetzen ist, wird eine Kombination eines halogenierten Kohlenwasserstoffs (z.B. Dichlormethan) mit Acetonitril oder einem Alkohol (z.B. Methanol, Ethanol usw.) bevorzugt. Insbesondere bevorzugt ist in vielen Fällen eine Kombination von Dichlormethan mit Acetonitril. Das (volumenmäßige) Verhältnis von halogeniertem Kohlenwasserstoff zu entweder Acetonitril oder Alkohol beträgt ungefähr 40:1 bis ungefähr 1:1 und vorzugsweise ungefähr 20:1 bis ungefähr 1:1.
Das Fertigungsverfahren für nachhaltig freisetzende Präparate wird nun unter Verwendung von Mikrokügelchen als Beispiel beschrieben.
Um ein nachhaltig oder kontrolliert freisetzendes Mikrokügelchen-Präparat unter Verwendung des Trocknungsverfahrens in Wasser (W/O/W-Verfahren) herzustellen, wird zunächst eine organische Lösungsmittellösung des biologisch abbaubaren Polymer-Metallsalzes in derselben Weise wie im oben beschriebenen Verfahren (A) hergestellt. Die Konzentration des biologisch abbaubaren Polymer-Metallsalzes in der organischen Lösungsmittellösung hängt vom Typ und Molekulargewicht des biologisch abbaubaren Polymer-Metallsalzes und der Art des organischen Lösungsmittels ab. Beispielsweise kann das Verhältnis von biologisch abbaubarem Polymer-Metallsalz zu organischem Lösungsmittel ungefähr 0,01 bis 80 Gew.-% betragen und beträgt vorzugsweise ungefähr 0,1 bis ungefähr 70 Gew.-% und insbesondere bevorzugt ungefähr 1 bis ungefähr 60 Gew.-%. Für die innere wässrige Phase wird eine wässrige Lösung von NGF verwendet. Die NGF-Konzentration in der wässrigen Lösung kann beispielsweise ungefähr 0,1 % (Gew./Vol.) bis ungefähr 500 % (Gew./Vol.), vorzugsweise ungefähr 1 % (Gew./Vol.) bis ungefähr 400 % (Gew./Vol.) und bevorzugter ungefähr 10 % (Gew./Vol.) bis ungefähr 300 % (Gew./Vol.) betragen. Dieser wässrigen Lösung kann/können ein pH-stellendes Mittel (z.B. Essigsäure, Salzsäure, Natriumhydroxid usw.), Stabilisatoren (z.B. Serumalbumin, Gelatine usw.) und/oder Konservierungsmittel (z.B. p-Hydroxybenzoesäureester usw.) zugegeben werden. Die so erlangte wässrige Lösung wird in der organischen Lösungsmittellösung des biologisch abbaubaren Polymer-Metallsalzes dispergiert, um eine W/O-Emulsion bereitzustellen.
Das Verhältnis (Vol./Vol.) der wässrigen NGF-Lösung (Dimerform) zur organischen Lösungsmittellösung des biologisch abbaubaren Polymer-Metallsalzes beträgt ungefähr 1:1.000 bis ungefähr 1:1, vorzugsweise ungefähr 1:100 bis ungefähr 1:5 und bevorzugter ungefähr 1:50 bis ungefähr 1:5, noch bevorzugter ungefähr 1:50 bis ungefähr 1:10 und insbesondere bevorzugt ungefähr 1:50 bis ungefähr 1:20. Bereiche von 1:4 bis 1:50, 1:6 bis 1:20 und 1:8 bis 1:4 sind zweckdienliche Ausführungsformen, wobei 1:50 bis 1:20 insbesondere bevorzugt ist. Einzelne zweckdienliche Verhältnis-Ausführungsformen sind 1:10, 1:15, 1:20 und 1:25. Die so erlangte W/O-Emulsion wird dann in eine wässrige Phase (äußere wässrige Phase) gegossen, um eine W/O/W-Emulsion zu liefern, und das Lösungsmittel in der Ölphase abgedampft, um Mikrokügelchen bereitzustellen. Ein Emulgator kann der äußeren wässrigen Phase zugegeben werden. Der Emulgator kann jegliche Substanz sein, die im Allgemeinen fähig ist, für eine stabile W/O/W-Emulsion zu sorgen. Im Speziellen können anionische Tenside, nicht-ionische Tenside, Polyoxyethylen-Rizinusöl-Derivate, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Carboxymethylcellulose, Lecithin, Gelatine, Hyaluronsäure usw. eingesetzt werden. Der bevorzugte Emulgator ist Polyvinylalkohol. Zwei oder mehrere Arten von Emulgatoren können in Kombination verwendet werden. Die Konzentration des Emulgators auf Basis der äußeren wässrigen Phase wird aus einem Bereich von ungefähr 0,001 Gew.-% bis ungefähr 20 Gew.-%, vorzugsweise ungefähr 0,01 Gew.-% bis ungefähr 10 Gew.-% und bevorzugter ungefähr 0,05 Gew.-% bis ungefähr 5 Gew.-%, gewählt. Ein Metallsalz, das dasselbe wie das der inneren wässrigen Phase zugegebene oder ein anderes Salz sein kann, kann der äußeren wässrigen Phase zugegeben werden. Bei diesem Verfahren wird vorzugsweise ein Fettsäuremetallsalz zugegeben, so dass die Metallsalzkonzentration der äußeren wässrigen Phase ungefähr 0,01 Gew.-% bis ungefähr 20 Gew.-% und vorzugsweise ungefähr 0,1 Gew.-% bis ungefähr 10 Gew.-% beträgt. Durch Ändern der Metallsalzkonzentration der äußeren wässrigen Phase kann die Migration des in der inneren wässrigen Phase verwendeten Metallsalzes aus dem biologisch abbaubaren Polymer in die äußere wässrige Phase verhindert werden.
Die so hergestellten Mikrokügelchen werden mittels Zentrifugation oder Filtration gewonnen, mit destilliertem Wasser wiederholt gewaschen, um Emulgator und andere Ablagerungen von der Kapseloberfläche zu entfernen, dann wieder in destilliertem Wasser oder dergleichen dispergiert und lyophilisiert. Danach wird, falls notwendig, restliches Wasser und organisches Lösungsmittel in den Mikrokügelchen durch Erwärmen unter vermindertem Druck weiter entfernt. Die Mikrokügelchen werden bei einer Temperatur erwärmt, die nicht unter der Glastemperatur des biologisch abbaubaren Polymers liegt, und nicht dermaßen hoch ist, dass die Mikrokügelchen aggregieren. Die Erwärmungstemperatur wird vorzugsweise im Bereich der Glastemperatur des biologisch abbaubaren Polymers bis ungefähr 30 °C über der Glastemperatur des biologisch abbaubaren Polymers gewählt. Hier ist die Glastemperatur als die unter Verwendung eines Differenzialkalorimeters während der Erwärmung bei einer Rate von 10 oder 20 °C pro Minute ermittelte Zwischenstufen-Glastemperatur definiert.
Um ein nachhaltig oder kontrolliert freisetzendes Mikrokügelchen-Präparat unter Verwendung des Trocknungsverfahrens in Wasser (O/W-Verfahren) herzustellen, wird eine organische Lösungsmittellösung des biologisch abbaubaren Polymer-Metallsalzes zunächst in derselben Weise wie im Verfahren (A) hergestellt. Die Konzentration des biologisch abbaubaren Polymer-Metallsalzes im organischen Lösungsmittel kann der beim Verfahren (i) beschriebenen ähnlich sein. In der organischen Lösungsmittellösung des so erlangten biologisch abbaubaren Polymer-Metallsalzes wird NGF aufgelöst oder dispergiert, um eine organische Lösungsmittellösung oder Suspension herzustellen, die das biologisch abbaubare Polymer-Metallsalz und NGF enthält. Das Gewichtsverhältnis von NGF zu biologisch abbaubarem Polymer-Metallsalz kann beispielsweise ungefähr 1:1.000 bis ungefähr 1:1, vorzugsweise ungefähr 1:200 bis ungefähr 1:5 und bevorzugter ungefähr 1:100 bis ungefähr 1:5, betragen, wobei ungefähr 1:50 bis ungefähr 1:5 bevorzugter ist, während ungefähr 1:50 bis ungefähr 1:10 noch bevorzugter und ungefähr 1:50 bis ungefähr 1:20 insbesondere bevorzugt ist. Bereiche von 1:4 bis 1:50, 1:6 bis 1:20 und 1:8 bis 1:14 sind zweckdienliche Ausführungsformen, wobei 1:50 bis 1:20 insbesondere bevorzugt ist. Einzelne zweckdienliche Verhältnis-Ausführungsformen sind 1:10, 1:15, 1:20 und 1:25.
Diese organische Lösungsmittellösung, die das biologisch abbaubare Polymer-Metallsalz und NGF enthält, wird in eine wässrige Phase gegossen, um eine Öl/Wasser-Emulsion herzustellen. Das Lösungsmittel in der Ölphase wird dann abgedampft, um Mikrokügelchen bereitzustellen.
Die so erlangten Mikrokügelchen werden wie im Verfahren (i) gewonnen, gewaschen und lyophilisiert. Danach können die Mikrokügelchen unter vermindertem Druck erwärmt werden, um restliches Wasser und organisches Lösungsmittel wie im Verfahren (i) zu entfernen.
Um ein nachhaltig oder kontrolliert freisetzendes Mikrokügelchen-Präparat unter Verwendung des Phasentrennungsverfahrens herzustellen, wird ein Koazervationsmittel derselben wie im Verfahren (i) verwendeten W/O-Emulsion oder derselben wie im Verfahren (ii) verwendeten organischen Lösungsmittellösung des biologisch abbaubaren Polymer-Metallsalzes und NGF allmählich unter Rühren in derselben Weise wie im Verfahren (C) zugegeben, um präzipitierte und verfestigte Mikrokügelchen hervorzubringen. Die so hergestellten Mikrokügelchen werden wie im Verfahren (C) gewonnen und gewaschen, um das Koazervationsmittel und freies NGF zu entfernen. Danach wird, falls notwendig, das restliche Wasser und organische Lösungsmittel im Inneren der Mikrokügelchen durch Erwärmen unter vermindertem Druck in derselben Weise wie im Verfahren (i) entfernt.
Bei der Herstellung von Mikrokügelchen mit dem Trocknungsverfahren in Wasser oder Phasentrennungsverfahren kann ein Antiflockungsmittel zur Verhinderung der Agglomeration von Teilchen wie im Verfahren (C) zugegeben werden.
Um ein nachhaltig oder kontrolliert freisetzendes Mikrokügelchen-Präparat unter Verwendung des Sprühtrocknungsverfahrens herzustellen, wird dieselbe wie im Verfahren (i) verwendete W/O-Emulsion oder dieselbe wie im Verfahren (ii) verwendete, das biologisch abbaubare Polymer-Metallsalz und NGF enthaltende organische Lösungsmittellösung über eine Düse in derselben Weise wie im Verfahren (D) gesprüht, um Mikrokügelchen bereitzustellen. Falls erforderlich werden die erlangten Mikrokügelchen unter vermindertem Druck erwärmt, um restliches Wasser und organisches Lösungsmittel wie im Verfahren (i) zu entfernen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird NGF in wässriger Lösung mit einem Metall (in Salzform) formuliert, das NGF bindet, wie z.B. Zink oder Zinkacetat oder Zinkcarbonat, und zwar vor der Formulierung mit anderen Freisetzungsmodifikatoren und anderen, das Mikrokügelchen bildenden abbaubaren Biopolymeren oder dergleichen. Der wässrige NGF-Metall-Lösungspuffer ist ausreichend nicht-sauer, um die Bindung des Metalls an NGF zu ermöglichen. Vorzugsweise beträgt der pH 6,5 bis 8,5, bevorzugter 7 bis 8 und noch bevorzugter 7,2 bis 7,6. Da das NGF-bindende Metall ein Mittel zur Stabilisierung von freigesetztem NGF sowie zur Verminderung der anfänglichen Freisetzungsraten aus den Mikrokügelchen bereitstellt, ist die Zugabe eines stabilisierenden Polyols, wie z.B. Trehalose, zur wässrigen NGF-Metall-Lösung vor der Gefriertrocknung optional.
Das gefriergetrocknete NGF-Zink-Pulver wird wie hierin gelehrt und vorzugsweise wie in Beispiel 1 erörtert zu einem kontrolliert freisetzenden Mikrokügelchen verarbeitet. Da ein Metall der wässrigen NGF-Lösung zugegeben wurde, ist die Zugabe eines Metalls als Freisetzungsmodifikator zum getrockneten Pulver vor oder mit der Beimengung eines biologisch abbaubaren Polymers optional. Falls vorhanden ist der Freisetzungsmodifikator vorzugsweise ein Metallionensalz, bei dem das Metall NGF bindet, wie z.B. ein hierin erörtertes Alkalimetall, Erdalkalimetall oder ein mehrwertiges Metall; bevorzugter ist der Freisetzungsmodifikator Zink und die Konzentration des Freisetzungsmodifikators 1 bis 10 Gew.-%, bevorzugter 3 bis 6 Gew.-%.
Die Metallsalze, die für die wässrige Formulierung mit NGF verwendet werden können, sind jene, die NGF binden und es bei Freisetzung aus dem Mikrokügelchen stabilisieren. Das Salz ist nicht speziell eingeschränkt, solange es keine unerwünschten oder nachteiligen Wirkungen in vivo ausübt. Das Metallsalz umfasst ein von einem einwertigen Metall gebildetes Salz, wie z.B. Alkalimetalle (z.B. Natrium, Kalium usw.), oder Erdalkalimetalle (z.B. Calcium, Magnesium usw.) oder ein mehrwertiges Metall, wie z.B. Zink (II), Eisen (II, III), Kupfer (II), Zinn (II, IV) und Aluminium (II, III), mit einer anorganischen oder organischen Säure. Das Metall ist vorzugsweise ein mehrwertiges Metall und bevorzugter ein Erdalkalimetall und Zink. Insbesondere bevorzugte Metalle sind Calcium und Zink. Anorganische Säuren, die bei der Metallsalzbildung verwendet werden können, umfassen Halogenwasserstoff (z.B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, Fluorwasserstoffsäure), Schwefelsäure und so weiter. Organische Säuren, die bei der Metallsalzbildung verwendet werden können, umfassen aliphatische Carbonsäuren und aromatische Säuren. Bevorzugte aliphatische Carbonsäuren sind aliphatische C_1-9-Carbonsäuren, z.B. aliphatische Monocarbonsäuren, aliphatische Dicarbonsäuren und aliphatische Tricarbonsäuren. Die aliphatischen Carbonsäuren können gesättigt oder ungesättigt sein. Die aliphatischen Monocarbonsäuren umfassen gesättigte aliphatische C_1-9-Monocarbonsäuren (z.B. Kohlensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Capronsäure, Oenanthsäure, Caprylsäure, Pelargonsäure, Caprinsäure usw.) und ungesättigte aliphatische C_2-9-Monocarbonsäuren (z.B. Acrylsäure, Propiolsäure, Methacrylsäure, Crotonsäure, Isocrotonsäure usw.). Die aliphatischen Dicarbonsäuren umfassen gesättigte aliphatische C_2-9-Dicarbonsäuren (z.B. Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure usw.) und ungesättigte aliphatische C_2-9-Dicarbonsäuren (z.B. Maleinsäure, Fumarsäure, Citraconsäure, Mesaconsäure usw.). Die aliphatischen Tricarbonsäuren umfassen gesättigte aliphatische C_2-9-Tricarbonsäuren (z.B. Tricarballylsäure, 1,2,3-Butantricarbonsäure usw.). Die oben erwähnten aliphatischen Carbonsäuren können zusätzlich 1 bis 2 Hydroxylgruppen aufweisen. Illustrative Beispiele sind Glykolsäure, Milchsäure, Glycerinsäure, Hydroxymalonsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure und so weiter. Bevorzugte aliphatische Carbonsäuren sind aliphatische Monocarbonsäuren. Bevorzugtere aliphatische Carbonsäuren sind aliphatische C_2-9-Monocarbonsäuren: Insbesondere bevorzugt sind gesättigte aliphatische C_2-3-Monocarbonsäuren. Die insbesondere bevorzugte aliphatische Monocarbonsäure umfasst Essigsäure. Aromatische Säuren, die bei der Metallsalzbindung verwendet werden können, umfassen Benzoesäure, Salicylsäure und Phenolsulfonsäure. Metallsalze zur Formulierung mit NGF in Lösung sind vorzugsweise die von einem mehrwertigen Metall mit einer organischen oder anorganischen Säure gebildeten Salze (hiernach als mehrwertiges Metallsalz bezeichnet).
Mehrwertige Metallsalze, die verwendet werden können, umfassen Salze von Zink mit einer anorganischen Säure, z.B. Zinkhalogenide (z.B. Zinkchlorid, Zinkbromid, Zinkiodid, Zinkfluorid), Zinksulfat, Zinknitrat, Zinkthiocyanat usw.; Salze von Zink mit einer organischen Säure, z.B. Zinksalze aliphatischer Carbonsäuren (z.B. Zinkcarbonat, Zinkacetat, Zinkglykolat, Zinklactat, Zinktartrat usw.), aromatische Zinksalze (z.B. Zinkbenzoat, Zinksalicylat, Zinkphenolsulfonat usw.); Salze von Calcium mit einer anorganischen Säure, z.B. Calciumhalogenid (z.B. Calciumchlorid, Calciumbromid, Calciumiodid, Calciumfluorid usw.), Calciumsulfat, Calciumnitrat, Calciumthiocyanat usw.; Salze von Calcium mit einer organischen Säure, z.B. Calciumsalze aliphatischer Carbonsäuren (z.B. Calciumcarbonat, Calciumacetat, Calciumpropionat, Calciumoxalat, Calciumtartrat, Calciumlactat, Calciumcitrat, Calciumgluconat usw.) und aromatische Calciumsalze (z.B. Calciumbenzoat, Calciumsalicylat usw.). Bevorzugte Salze sind Zinkacetat, Zinkcarbonat, Calciumacetat und Calciumcarbonat. Das bevorzugtere mehrwertige Metallsalz umfasst Zinkacetat und Calciumacetat.
Das Molverhältnis von NGF zu Metall ist jenes, das NGF bei Freisetzung aus den Mikrokügelchen stabilisiert, ohne unerwünschte Schäden oder Nebenwirkungen in einem Patienten oder in einer Zellkultur zu verursachen, an den/die die NGF-Mikrokügelchen verabreicht werden. Das Molverhältnis von NGF zu Metallion in Lösung kann im Bereich von 1 zu 4 bis 1 zu 50, bevorzugter 1 zu 6 bis 1 zu 20, noch bevorzugter 1 zu 8 bis 1 zu 14, liegen.
Falls erforderlich, können zur Bildung eines homogenen NGF/Metall-Komplexes jegliche Metalle, die im NGF aus der Reinigung vorkommen, mit bekannten Verfahren aus dem Polypeptid entfernt und durch das stabilisierende Metall der Wahl ersetzt werden.
Gegebenenfalls ist im NGF-Metallsalz-Gemisch ein Exzipient vorhanden, der zweckdienlich ist, um entweder NGF gegen Denaturierung durch im Mikroverkapselungsverfahren verwendetes organisches Lösungsmittel zu stabilisieren und/oder die NGF-Konzentration zu maximieren. Typischerweise ist der Exzipient ein Polyol eines Molekulargewichts von weniger als ungefähr 70.000 kD. Beispiel von Polyolen, die eingesetzt werden können, umfassen Trehalose, Mannit und Polyethylenglykol. Typischerweise beträgt das Massenverhältnis von Trehalose zu Polypeptid 100:1 bis 1:100, vorzugsweise 1:1 bis 1:10, bevorzugter 1:3 bis 1:4. Typische Massenverhältnisse von Mannit zu Polypeptid sind 100:1 bis 1:100, vorzugsweise 1:1 bis 1:10, bevorzugter 1:1 bis 1:2. Typische Massenverhältnisse von PEG zu Polypeptid sind 1:100 bis 100:1, vorzugsweise 1:1 bis 1:10. Optimale Verhältnisse werden auf Basis einer Exzipientenkonzentration gewählt, die eine maximale Löslichkeit des Polypeptids bei minimaler Denaturierung des Polypeptids ermöglichen.
In der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt, dass die Effizienz des Einschlusses von NGF in ein biologisch abbaubares Polymer mehr als oder gleich 50 % beträgt. Bevorzugter ist sie höher als oder gleich 80 %, und insbesondere bevorzugt ist sie höher als oder gleich 90 %.
Die Konzentration des im nachhaltig freisetzenden Präparat der vorliegenden Erfindung enthaltenen bioaktiven NGF kann im Bereich von 0,001 bis 50 Gew.-% des Mikrokügelchens betragen, wobei ungefähr 0,01 bis ungefähr 30 Gew.-% bevorzugt, 2 bis 20 Prozent bevorzugter und 5 bis 15 % noch bevorzugter sind. Eine Beladung von ungefähr 10 Gew.-% ist typisch. Die NGF-Beladung ist durch die Löslichkeit des NGF in Wasser und das Volumen von wässrigem NGF, das zum Polymer im organischen Lösungsmittel zugegeben werden kann, beschränkt. Volumina von mehr als 0,5 ml NGF pro Gramm Polymer resultieren typischerweise in einem hohen anfänglichen Medikamenten-Burst aus den Mikrokügelchen. Um diese Probleme zu vermeiden, kann eine feste Medikamentenformulierung anstelle der wässrigen Medikamentenlösung verwendet werden. Folglich sind Feststoff-in-Öl-in-Wasser-Verfahren bevorzugt, um Mikrokügelchen mit hoher Medikamentenbeladung (mehr als 10 %) mit niedrigen bis mäßigen anfänglichen Bursts herzustellen. Die zur Mikroverkapselung verwendete feste Medikamentenformulierung muss in organischen Lösungsmitteln stabil sein und muss eine geringe Größe (1-5 μm) im Vergleich zu den letztlich gewünschten Mikrokügelchen (10-100 μm) sein, um eine hohe Beladung und einen niedrigen Medikamenten-Burst zu ermöglichen. Für Proteinformulierungen ist eines der Verfahren zum Erlangen getrockneter Feststoffe geringer Größe die Sprühtrocknung. Mummenthaler et al., Pharm. Res. 11(1), 12-20 (1994), beschreiben die Sprühtrocknung von rhGH-Formulierungen. Da rhGH leicht durch Oberflächenwechselwirkungen, wie z.B. Luft-Flüssig-Grenzflächen, denaturiert wird, muss die Sprühtrocknung von rhGH mit Tensiden in der rhGH-Formulierung durchgeführt werden. Unerwarteterweise und wie hierin gelehrt erwies sich, dass die Gegenwart eines Metalls zur Stabilisierung von NGF während der Gefriertrocknung ohne Benötigung von Tensiden fähig ist.
Das nachhaltig freisetzende Präparat kann in Form des Mikrokügelchens oder in verschiedenen Dosisformen verabreicht werden, wie z.B. als nicht-orale Präparate (z.B. intramuskulär, subkutan oder viszeral injizierbares oder innenliegendes Präparat; nasal-, rektal- oder Uterus-transmucosales Präparat) oder orale Präparate (z.B. Kapseln, wie z.B. Hartkapsel oder Weichkapsel, feste Präparate, wie z.B. in Granulaten und Pulvern, flüssige Präparate, wie z.B. eine Suspension).
Das insbesondere bevorzugte nachhaltig freisetzende Präparat ist jenes einer Injektion. Um eine Injektion unter Verwendung der oben erlangten Mikrokügelchen herzustellen, können die Mikrokügelchen mit einer viskosen physiologisch annehmbaren Lösung formuliert werden: Ein Dispersionsmittel (z.B. Tenside, wie z.B. Tween 80, HCO-60; Polysaccharide, wie z.B. Carboxymethylcellulose, Natriumalginat, Natriumhyaluronat; Protaminsulfat; Polyethylenglykol 400 usw.), ein Konservierungsmittel (z.B. Methylparaben, Propylparaben usw.), ein Isotonie-Mittel (z.B. Natriumchlorid, Mannit, Sorbit, Glucose, Dextran usw.) und ein Lokalanästhetikum (z.B. Xylocain-Hydrochlorid, Chlorbutanol usw.), um eine wässrige Suspension bereitzustellen, oder dispergiert mit einem Pflanzenöl (z.B. Sesamöl, Maisöl usw.) oder ein Gemisch davon mit einem Phospholipid (z.B.
Lecithin) oder Fettsäuretriglyceriden mittlerer Kettenlänge (z.B. Migriol 812), um eine ölige Suspension bereitzustellen.
Wenn das nachhaltig freisetzende Präparat aus Mikrokügelchen besteht, sind die Mikrokügelchen vorzugsweise feine Teilchen. Die Größe von Mikrokügelchen für eine injizierbare Suspension kann aus dem Bereich gewählt werden, der die Erfordernisse für das Dispersionsausmaß und die Durchgängigkeit durch die zur Injektion verwendete Nadel erfüllt. Beispielweise kann die Mikrokapsel-Teilchengröße im Bereich von ungefähr 0,1 bis ungefähr 300 μm, vorzugsweise ungefähr 1 bis ungefähr 150 μm, bevorzugter ungefähr 2 bis ungefähr 100 μm und insbesondere bevorzugt ungefähr 20 bis 90 μm, liegen.
Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen als steriles Präparat umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, das Verfahren, bei dem der gesamte Produktionsprozess steril ist, das Verfahren, bei dem Gammastrahlen als Sterilisationsmittel verwendet werden, und das Verfahren, bei dem ein Antiseptikum während des Fertigungsprozesses zugegeben wird.
Ein nachhaltig freisetzendes Präparat kann in Säugetieren (z.B. Menschen, Rind, Schwein, Hunden, Katzen, Mäusen, Ratten, Kaninchen usw.) gefahrlos mit niedriger Toxizität verwendet werden. Ein „Patient" zum Zwecke der vorliegenden Erfindung umfasst sowohl den Menschen als auch andere Säugetiere. Folglich sind die Verfahren sowohl auf die Therapie des Menschen als auch auf veterinäre Anwendungen anwendbar.
Das nachhaltig freisetzende Präparat der Erfindung ist zweckdienlich, um eine Neuronenschädigung zu behandeln oder zu verhindern. Nervenwachstumsfaktor hat markante Wirkungen auf Sinnesneuronen und sympathische Neuronen des peripheren Nervensystems. NGF wirkt über spezifische Zelloberflächenrezeptoren an reaktiven Neuronen, um Neuronenwachstum zu unterstützen, Neuriten-Auswuchs zu fördern und die neurochemische Differenzierung zu verstärken. NGF-Wirkungen werden von Veränderungen in Neuronenmembranen, des Zustands der Phosphorylierung neuronaler Proteine und der Häufigkeit bestimmter mRNAs und Proteine begleitet, die wahrscheinlich eine Rolle bei der Neuronendifferenzierung und Funktion spielen. (Connolly et al., J. Cell Biol. 90, 176-180 (1981); Skaper und Varon, Brain Res. 197, 379-389 (1980); Yu et al., J. Biol. Chem. 255, 10481-10492 (1980); Haleqoua und Patrick, Cell 22, 571-581 (1980); Tiercy und Shooter, J. Cell. Biol. 103, 2367-2378 (1986).) Cholinerge Vorderhirn-Neuronen reagieren ebenfalls auf NGF und könnten NGF für trophische Unterstützung erfordern (Hefti, J. Neurosci. 6, 2155 (1986)). In der Tat legt die Verteilung und Ontogenese von NGF und seines Rezeptors im Zentralnervensystem (CNS) nahe, dass NGF als ein Ziel-hergeleiteter neurotropher Faktor für basale cholinerge Vorderhirn-Neuronen wirkt (Korsching, TINS, S. 570-573 (Nov./Dez. 1986)).
Demgemäß wird von den NGF-Formulierungen der Erfindung angenommen, dass sie bei der Förderung der Entwicklung, Erhaltung oder Regeneration von Neuronen, einschließlich zentralen (Hirn und Rückenmark), peripheren (sympathischen, parasympathischen, sensorischen und enterischen Neuronen) und motorischen Neuronen, in vivo zweckdienlich sind. NGF-Formulierungen der Erfindung werden bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Vielzahl von neurologischen Krankheiten und Störungen eingesetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Formulierungen der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments verwendet, um neuronale Störungen zu behandeln. Mit „neuronalen Störungen" sind hierin Störungen des zentralen und/oder peripheren Nervenssystems gemeint, die mit Neuronen-Degeneration oder -Schädigung zusammenhängen. Spezielle Beispiele neuronaler Störungen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Chorea, Schlaganfall, ALS, periphere Nervenleiden und andere Leiden, die durch Nekrose oder Verlust von Neuronen, ob zentrale, periphere oder motorische Neuronen, gekennzeichnet sind, zusätzlich zur Behandlung geschädigter Nerven aufgrund von Traumen, Verbrennungen, Nierenversagen, Verletzung und aufgrund toxischer Wirkungen von zur Behandlung von Krebs und AIDS verwendeten Chemotherapeutika. Beispielsweise können periphere Nervenleiden, die mit bestimmten Leiden zusammenhängen, wie z.B. mit Diabetes, AIDS oder Chemotherapie zusammenhängende Nervenleiden, unter Verwendung der Formulierungen der vorliegenden Erfindung behandelt werden. Sie sind außerdem als Komponente von Kulturmedien zur Verwendung bei der Kultivierung von Nervenzellen in vitro oder ex vivo zweckdienlich.
In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung werden NGF-Formulierungen bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung des Nervensystems verwendet, das durch Trauma, chirurgischen Eingriff, Schlaganfall, Ischämie, Infektion, Stoffwechselkrankheit, Mangelernährung, Malignität oder toxische Mittel geschädigt worden ist, um das Überleben und Wachstum von Neuronen zu fördern, oder zur Behandlung beliebiger Leiden, deren Behandelbarkeit mit NGF sich erwiesen hat. Beispielsweise kann eine NGF-Formulierung der Erfindung verwendet werden, um das Überleben und Wachstum motorischer, durch Trauma oder chirurgischen Eingriff geschädigter Neuronen zu fördern. Außerdem können NGF-Formulierungen der Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Motoneuronen-Störungen, wie z.B. amylotropher Lateralsklerose (Lou Gehrigsche Krankheit), Bellscher Lähmung und verschiedener, spinale Muskelatrophie umfassender Leiden, oder Paralyse verwendet werden. NGF-Formulierungen der Erfindung können bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung neurodegenerativer Störungen des Menschen, wie z.B. Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Epilepsie, multipler Sklerose, Huntington-Krankheit, Down-Syndrom, sensorineuronaler Taubheit und Menierescher Krankheit, verwendet werden. NGF-Formulierungen der Erfindung können als kognitive Enhancer verwendet werden, um die Lernfähigkeit insbesondere bei Demenz oder Trauma zu verbessern. Alzheimer-Krankheit, die für mehr als 50 % der Demenzen bei älteren Menschen verantwortlich ist, wie von den National Institutes of Aging festgestellt worden ist, ist auch die fünfthäufigste Todesursache bei Amerikanern im Alter von mehr als 65 Jahren. Vier Millionen Amerikaner, 40 % der Amerikaner über 85 Jahre (das am schnellsten wachsende Segment der US-Population), weisen die Alzheimer- Krankheit auf. Fünfundzwanzig Prozent aller Patienten mit Parkinson-Krankheit leiden außerdem an Alzheimer-Krankheit-artiger Demenz. Und bei ungefähr 15 % der Patienten mit Demenz liegen Alzheimer-Krankheit und Multiinfarkt-Demenz gleichzeitig vor. Die dritthäufigste Ursache von Demenz nach Alzheimer-Krankheit und Gefäßdemenz ist die kognitive Beeinträchtigung aufgrund hirnorganischer Erkrankung, die direkt mit Alkoholismus zusammenhängt, die in ungefähr 10 % der Alkoholiker vorkommt. Jedoch ist die einheitlichste Abnormalität für die Alzheimer-Krankheit sowie für die Gefäßdemenz und kognitive Beeinträchtigung aufgrund der mit Alkoholismus in Zusammenhang stehenden hirnorganischen Erkrankung die Degeneration des cholinergen Systems, die aus dem basalen Vorderhirn (BF) in den Codex und Hippokampus entsteht (Bigl et al., in: Brain Cholinergic Systems, M. Steriade und D. Biesold (Hrsg.), Oxford University Press, S. 364-386 (1990)). Und es gibt eine Reihe anderer Neurotransmittersysteme, die von der Alzheimer-Krankheit beeinträchtigt werden (Davies, Med. Res. Rev. 3, 221 (1983)). Jedoch beschränkt sich die kognitive Beeinträchtigung, die beispielsweise mit der Degeneration des cholinergen Neurotransmittersystems zusammenhängt, nicht auf Individuen, die an Demenz leiden. Sie ist auch bei ansonsten gesunden älteren Erwachsenen und Ratten beobachtet worden. Untersuchungen, die das Ausmaß der Lernbeeinträchtigung mit dem Ausmaß an vermindertem Hirnrinden-Blutfluss in älteren Ratten vergleichen, zeigen eine gute Korrelation (Berman et al., Neurobiol. Aging 9, 691 (1988)). Beim chronischem Alkoholismus ist die resultierende hirnorganische Erkrankung wie bei Alzheimer-Krankheit und normaler Alterung durch diffuse Verminderungen des Hirnrinden-Blutflusses in jenen Hirnregionen gekennzeichnet, wo cholinerge Neuronen entstehen (basales Vorderhirn) und in die sie hineinragen (Hirnrinde) (Lofti et al., Cerebrovasc. and Brain Metab. Rev 1, 2 (1989)). Derartige Demenzen können durch Verabreichung von NGF-Formulierungen der Erfindung behandelt werden.
Außerdem werden NGF-Formulierungen vorzugsweise bei der Herstellung eines Medikaments verwendet, um Nervenleiden und insbesondere peripheres Nervenleiden zu behandeln. „Peripheres Nervenleiden" bezieht sich auf eine Störung, die das periphere Nervensystem beeinträchtigt, was sich am häufigsten als eine Dysfunktion oder eine Kombination von Dysfunktionen der motorischen, sensorischen, sensorimotorischen oder autonomen Neuronen manifestiert. Die breite Vielfalt an Morphologien, die periphere Nervenleiden aufweisen, können alle eindeutig einer gleich großen Anzahl von Ursachen zugeschrieben werden. Beispielsweise können periphere Nervenleiden genetisch erworben sein, können aus einer systemischen Krankheit resultieren oder können durch ein toxisches Mittel ausgelöst werden. Beispiele umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, diabetisches peripheres Nervenleiden, distales sensorimotorisches Nervenleiden, mit AIDS zusammenhängende Nervenleiden oder autonome Nervenleiden, wie z.B. verminderte Motilität des Magen-Darm-Trakts oder Atonie der Harnblase. Beispiele von Nervenleiden, die mit systemischer Krankheit zusammenhängen, umfassen Post-Polio-Syndrom; Beispiele von vererbbaren Nervenleiden umfassen Charcot-Mariesche Krankheit, Refsum-Syndrom, Abitalipoproteinämie, Tangier-Krankheit, Krabbe-Syndrom, metachromatische Leukodystrophie, Fabrysche Krankheit und Dejerine-Sottas-Syndrom; und Beispiele von Nervenleiden, die durch ein toxisches Mittel verursacht werden, umfassen jene, die durch Behandlung mit einem chemotherapeutischen Mittel, wie z.B. Vincristin, Cisplatin, Methotrexat oder 3'-Azido-3'-Desoxythymidin, verursacht werden.
Es wird eine therapeutisch wirksame Dosis einer NGF-Formulierung einem Patienten verabreicht. Mit „therapeutisch wirksam" ist hierin eine Dosis, die Wirkungen hervorruft, für die sie verabreicht wird, oder jene Menge gemeint, die für eine therapeutische Wirkung in einem bestimmten Verabreichungsregime sorgt. Die Dosierung des nachhaltig freisetzenden Präparats ist jene, die zur Erzielung einer wirksamen Konzentration von NGF in vivo für das speziell behandelte Leiden notwendig ist, obgleich die Dosis mit dem Typ der NGF-Variante, der gewünschten Freisetzungsdauer, der Zielkrankheit, der Versuchstierspezies und mit anderen Faktoren, wie z.B. dem Zustand des Patienten, variiert. Die exakte Dosis hängt üblicherweise von der zu behandelnden Störung ab und ist vom Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung unter Verwendung bekannter Techniken ermittelbar.
Gegenwärtig ist rhNGF subkutan an Patienten verabreicht worden, die ein diabetisches oder mit AIDS zusammenhängendes peripheres Nervenleiden aufweisen, wobei Phase-III-Tests im Gange sind. Die bei diesen klinischen Studien verwendeten wöchentlichen Dosismengen stellen einen guten Ausgangspunkt für den Kliniker bereit, Dosierungen für die Verabreichung von mikroverkapseltem NGF der Erfindung zu ermitteln. Im Allgemeinen werden die NGF-Formulierungen der vorliegenden Erfindung mit ungefähr 0,01 μg NGF/kg Körpergewicht bis ungefähr 100 mg/kg pro Tag, vorzugsweise von 0,02 bis 10 mg/kg, bevorzugter 0,03 bis 500 μg/kg und insbesondere bevorzugt 0,5 μg/kg bis 100 μg/kg, verabreicht. In manchen Ausführungsformen werden Dosen von 0,03 bis 1 μg/kg, vorzugsweise 0,1 bis 0,3 μg/kg, verabreicht. Außerdem können, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, Anpassungen hinsichtlich Alter sowie Körpergewicht, allgemeinem Gesundheitszustand, Geschlecht, Ernährung, Zeit der Verabreichung, Medikamentenwechselwirkung und Schwere der Krankheit notwendig sein und können vom Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung durch routinemäßiges Experimentieren ermittelt werden. Typischerweise wird der Kliniker NGF-Formulierungen der Erfindung verabreichen, bis eine Dosis erreicht ist, welche die Neuronenfunktion repariert, erhält und gegebenenfalls wiederherstellt. Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht durch herkömmliche Tests überwacht werden.
Ergebnisse aus klinischen Phase-II-Tests weisen darauf hin, dass Patienten mit peripherem Nervenleiden drei Dosierungen von rhNGF pro Woche mit entweder 0,3 oder 0,1 μg/kg benötigen. Dies bedeutet, dass nur 21 oder 7 μg pro rhNGF-Dosierung für einen durchschnittlichen Patienten mit 70 kg Körpergewicht benötigt werden. Die gegenwärtige flüssige rhNGF-Formulierung besteht aus 2 mg/ml in 10 mM Natriumacetat, pH 5,5, 142 mM NaCl. Diese Dosierungsinformation stellt einen Ausgangspunkt für die Dosierung mit der NGF-Mikrokügelchen-Vorrichtung bereit.
Wenn das nachhaltig freisetzende Präparat eine Formulierung ist, die eine Woche lang wirkt, kann die NGF-Dosis aus dem Bereich von ungefähr 0,0001 bis ungefähr 10 mg/kg Körpergewicht für einen Erwachsenen gewählt werden. Die bevorzugtere Dosierung kann in geeigneter Weise aus dem Bereich von ungefähr 0,0005 bis ungefähr 1 mg/kg Körpergewicht gewählt werden. Die bevorzugte Verabreichungshäufigkeit des nachhaltig freisetzenden Präparats kann in geeigneter Weise von einmal die Woche bis einmal alle zwei Wochen in Abhängigkeit von der Art des NGF-Polypeptids, der Dosisform, der Freisetzungsdauer, der Zielkrankheit, der Versuchstierspezies und anderen Faktoren gewählt werden.
Die Zusammensetzungen hierin werden hergestellt, so dass sie Mengen an NGF-Mikrokügelchen enthalten, die in resuspendierter Form NGF-Konzentrationen von 0,07 bis 20 mg/ml, vorzugsweise 0,08 bis 15 mg/ml, bevorzugter 0,09 bis 10 mg/ml und insbesondere bevorzugt 0,1 bis 2 mg/ml, liefern. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die NGF-Konzentration 0,1 mg/ml. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt die NGF-Konzentration 2 mg/ml. Zur Verwendung dieser Zusammensetzungen bei der Verabreichung an menschliche Patienten, die an peripherem Nervenleiden leiden, können diese Zusammensetzungen beispielsweise von ungefähr 0,1 mg/kg bis ungefähr 2 mg/kg NGF enthalten, was der gegenwärtig beabsichtigten Dosierungsrate für eine derartige Behandlung entspricht. NGF wird gut vertragen, und es können, falls notwendig, vom Arzt ermittelte höhere Dosen verabreicht werden.
Das nachhaltig freisetzende Präparat wird vorzugsweise trocken bei Raumtemperatur oder in der Kälte gelagert. Bevorzugter wird das nachhaltig freisetzende Präparat in der Kälte gelagert. Unter „Raumtemperatur" werden 15° bis 25 °C verstanden, und unter „in der Kälte" wird eine Temperatur unter 15 °C verstanden.
Therapeutische NGF-Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in einen Behälter gegeben, der eine sterile Füllöffnung aufweist, z.B. in einen intravenösen Infusionsbeutel oder in ein Fläschchen mit einem von einer Subkutaninjektionskanüle durchstechbaren Stopfen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Set zur NGF-Verabreichung bereitgestellt, das ein Fläschchen oder Gefäß umfasst, das eine nachhaltig freisetzende Vorrichtung der Erfindung enthält, die eine pharmazeutisch wirksame Menge Nervenwachstumsfaktor enthält, der vorzugsweise mit einem Metall, bevorzugter mit Zink, komplexiert ist. Gegebenenfalls wird eine sterile, viskose, physiologisch annehmbare Lösung zur Resuspension der Mikrokügelchen bereitgestellt. Beispielsweise ist ein Volumen von 1,5 ml zweckdienlich, wenn Dosierungen von 0,3 μg/kg oder 0,1 μg/kg verwendet werden.
NGF wird gegebenenfalls im Einklang mit anderen neurotrophen Faktoren, einschließlich NT-4/5, NT-3 und/oder BNDF, kombiniert oder verabreicht und wird mit anderen herkömmlichen Therapien für Nervenstörungen verwendet.
Eine wirksame Menge der NGF enthaltenden Mikrokügelchen wird an einen Patienten durch subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale und intradermale Injektion, durch Verabreichung an Mukosa-Membranen (wie z.B. intranasal oder mittels Suppositorium) oder durch In-situ-Abgabe verabreicht, um für die gewünschte NGF-Dosierung auf Basis der bekannten Parameter für die Behandlung der verschiedenen medizinischen Konditionen mit NGF zu sorgen. Demgemäß kann die Verabreichung der Formulierungen der vorliegenden Erfindung auf zahlreiche Weisen vorgenommen werden, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, oral, subkutan, intravenös, intrazerebral, intranasal, transdermal, intraperitoneal; intramuskulär, intrapulmonal, vaginal, rektal, intraventrikulär, intrathekal oder intraokulär. Die Formulierungen können kontinuierlich durch Infusion in die Flüssigkeitsreservoirs des CNS verabreicht werden, obgleich die Bolusinjektion annehmbar ist, und zwar durch Verwendung von Techniken, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind, wie z.B. durch Pumpen, Reservoirs oder Implantation. Insbesondere bevorzugt ist die intrazerebroventrikuläre (ICV) Verabreichung von rhNGF mittels Spritze, Ommaya^®-Reservoir, Alzet-Pumpe oder dergleichen. In manchen Fällen, beispielsweise bei der Behandlung von Wunden, können die Formulierungen direkt als Lösung oder Spray angewendet werden. Die Mikrokügelchen können auch zu einem Pellet der gewünschten Form zur Implantation verpresst werden.
Für eine Injektion werden die Mikrokügelchen vorzugsweise auf eine Größe von 20 bis 90 Mikrometern gesiebt. Die gesiebten Mikrokügelchen werden in einer Menge in Fläschchen abgefüllt, die für Resuspension und Injektion geeignet ist. Die Suspension der Mikrokügelchen wird mit einer sterilen Lösung mit geeigneter Viskosität durchgeführt, um die Injektion zu erleichtern, während eine gleichmäßige Suspension der Teilchen aufrechterhalten wird, um ein Absetzen während des Vermischens bei Resuspension, der Entnahme der Dosis und Injektion zu vermeiden. Eine geeignete Viskosität ist eine, die der einer 5%igen Dextran-70-Lösung ähnlich ist. Für die subkutane Injektion können die Mikrokügelchen in 5 % Dextran-70 in Salzlösung (9 % NaCl), gegebenenfalls mit 0,01 % Tween 20, resuspendiert werden.
Im Allgemeinen können Formulierungen der gegenständlichen Erfindung andere Komponenten in Mengen enthalten, welche die Herstellung stabiler Formen nicht beeinträchtigt, und in Mengen, die für eine wirksame, sichere pharmazeutische Verabreichung geeignet sind. Beispielsweise können andere pharmazeutisch annehmbare Exzipienten, die dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind, einen Teil der gegenständlichen Zusammensetzung bilden. Diese umfassen beispielsweise verschiedene Füllstoffe, zusätzliche Puffersubstanzen, chelatierende Mittel, Antioxidantien, Co-Lösungsmittel und dergleichen; spezielle Beispiele dieser können Trihydroxymethylaminsalze („Tris-Puffer") und Dinatrium-EDTA umfassen. Gegebenenfalls können Formulierungen von NGF physiologisch annehmbare Träger, ein Konservierungsmittel, einen Puffer oder mehrere Puffer, einen Exzipienten oder mehrere Exzipienten, wie z.B. Polyethylenglykol (PEG) zusätzlich zu Trehalose oder Mannit, oder ein nicht-ionisches Tensid, wie z.B. Tween^®-Tensid, oder Stabilisatoren enthalten (Remington's Pharmaceutical Sciences). Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und rufen keine signifikante Verminderung der NGF-Stabilität in den hierin gelehrten Formulierungen hervor. Derartige Verbindungen umfassen Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare (weniger als ungefähr 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Histidin, Methionin, Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; chelatierende Mittel, wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; und/oder nicht-ionische Tenside, die ein Polysorbat enthalten, wie z.B. Polysorbat 20 oder 80 (Tween) usw., die Poloxamere, wie z.B. Poloxamer 184 oder 188, Pluronic^®-Polyole und andere Ethylen/Polypropylen-Blockpolymere, wie z.B. PEG usw. Jedoch verbesserten Tenside, wie hierin berichtet, im Allgemeinen nicht die Freisetzung von NGF aus den Mikrokügelchen oder die Stabilität von NGF bei 37 °C. Wenn gegebenenfalls vorhanden ist ein pharmazeutisch annehmbares Tensid vorzugsweise Tween 20 oder Pluronic-Säure (F68). Verwendete Mengen liegen für gewöhnlich im Bereich von ungefähr 0,001 % (Gew./Vol.) bis ungefähr 30 % (Gew./Vol.), bevorzugter von ungefähr 0,005 bis 0,02 %. Eine bevorzugte Tensidkonzentration ist 0,01 %. Puffer umfassen Carbonat-, Acetat-, Phosphat-, Tris-, Citrat-, Succinat- oder Histidinpuffer. Wenn vorhanden, liegt der Puffer am vorteilhaftesten im Bereich von ungefähr 2 mM bis 100 mM. Typischerweise erfordern die getrockneten Mikrokügelchen keine Pufferung. Gegebenenfalls ist das Salz, falls die Formulierung ein pharmazeutisch annehmbares Salz enthält, vorzugsweise Natriumchlorid und vorzugsweise in ungefähr physiologischen Konzentrationen zugegen.
Da die Formulierungen typischerweise in getrockneter Form bereitgestellt werden, wird ein Konservierungsmittel typischerweise nicht benötigt. Wenn jedoch eine Mikrokügelchen-Resuspension über einen verlängerten Zeitraum, wie z.B. mit einer Pumpe, verwendet wird, können Konservierungsmittel zweckdienlich sein. Gegebenenfalls können die resuspendierten Formulierungen der Erfindung ein pharmazeutisch annehmbares Konservierungsmittel enthalten. In manchen Ausführungsformen liegt die Konservierungsmittelkonzentration im Bereich von 0,1 bis 2,0 %, typischerweise Vol.-%. Geeignete Konservierungsmittel umfassen jene, die auf dem Gebiet der Pharmazie bekannt sind. Benzylalkohol, Phenol, m-Kresol, Methylparaben, Benzalkoniumchlorid, Benzethoniumchlorid und Propylparaben sind bevorzugte Konservierungsmittel. Bevorzugtere Konservierungsmittel sind 0,2-0,4 (Gew./Vol.) Phenol und 0,7-1,5 % (Gew./Vol.) Benzylalkohol. Obgleich die Art des Konservierungsmittels und der Konzentrationsbereich nicht entscheidend sind, ist die Erhöhung der NGF-Stabilität in Lösung durch Benzylalkohol beschrieben worden. Eine insbesondere bevorzugte Benzylalkohol-Konzentration ist 0,7 bis 1,2 (Gew./Vol.), bevorzugter 0,8 bis 1,0 %, wobei 0,9 % eine insbesondere bevorzugte Konzentration ist.
Die nachhaltig kontrolliert freisetzenden NGF-Mikrokügelchen bieten mehrere Vorteile zur Bolus-NGF-Injektion, insbesondere für die Behandlung von peripherem Nervenleiden. Im Speziellen vermindert diese Formulierung üblicherweise die Anzahl von Injektionen von 3 pro Woche auf einmal oder zweimal pro Monat. Außerdem resultiert der niedrige Burst und die langsame tägliche Freisetzung (d.h. niedrige anfängliche Freisetzung) üblicherweise in niedrigeren Cmax-Spiegeln und vermindert daher Nebenwirkungen, wie z.B. lokale Irritationen oder Hyperalgesie. Weiters könnte die Entwicklung anderer Indikationen, wie z.B. Nervenschädigung (z.B. Wirbelsäulen- oder Knochenfrakturen), von der lokalen NGF-Abgabe über die Mikrokügelchen profitieren. Es ist beobachtet worden, dass Nervenwachstumsfaktor das Neuronenüberleben verbessert und den Neuriten-Auswuchs erhöht, die vorteilhafte Wirkungen bei der Behandlung von peripherem Nervenleiden sind und einen Nutzen bei der Behandlung von Hirnstörungen, wie z.B. Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit, aufweisen. Während eine systemisch verabreichte NGF-Form die Blut-Hirn-Barriere nicht durchdringt und tägliche NGF-Injektionen notwendig sein können, um ein peripheres Nervenleiden zu behandeln, kann die lokale oder ziergerichtete Abgabe von NGF unter Verwendung der Mikrokügelchen-Fomulierungen der Erfindung eine wirksamere. Behandlung dieser Störungen ermöglichen. Die lokalisierte Abgabe von NGF an periphere oder zerebrale Neuronen kann mit biologisch abbaubaren Mikrokügelchen der Erfindung erzielt werden, die NGF am gewünschten Wirkungsort kontinuierlich freisetzen. Die Poly-(Milch-co-Glykolsäure)- (PLGA-) Mikrokügelchen verwendenden Ausführungsformen sind unbedenklich und werden sich an der Injektionsstelle im subkutanen Raum oder im Gehirn wirksam lokalisieren oder darauf begrenzt sein, was eine kontinuierliche lokale Versorgung mit an die Neuronen abzugebendem NGF ermöglicht.
Die folgenden Beispiele werden zur Illustration bereitgestellt und schränken die Erfindung nicht ein. Die Offenbarungen aller Zitate in der Patentschrift sind hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen.
Beispiele
Beispiel 1
Bei der Entwicklung einer für lange Zeit wirkenden Formulierung für rekombinantes menschliches NGF wurde die Verwendung einer biologisch abbaubaren Polymermatrix für die nachhaltige Freisetzung von NGF untersucht. Das für diese Anmeldung verwendete Polymer war ein Copolymer aus Milch- und Glykolsäure, das als Poly(Milch/Glykolsäure) oder PLGA bezeichnet wird. Um NGF in dieses Polymer zu inkorporieren, muss PLGA in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel gelöst werden. Ein herkömmlich verwendetes Lösungsmittel für die Auflösung von PLGA ist Methylenchlorid gewesen, das sowohl Wasserunlöslichkeit als auch PLGA-Löslichkeit bereitstellt. Jedoch wird Ethylacetat bevorzugt. Im Allgemeinen wurde zur Herstellung der NGF-PLGA-Mikrokügelchen das NGF in wässriger, gepufferter Lösung mit gegebenenfalls vorhandenen Polyol-Stabilisatoren und/oder einem Tensid vermischt und gefriergetrocknet. Dem gefriergetrockneten NGF-Pulver wurde gegebenenfalls ein Freisetzungsmodifikator, wie z.B. Zinkcarbonat, zugegeben. Das NGF-Pulver wurde dann einer Lösung von PLGA enthaltendem Ethylacetat zugegeben. In anfänglichen Untersuchungen wurde das Polypeptid in Form eines gemahlenen lyophilisierten Pulvers zugegeben. Nach der Polypeptid-Zugabe wurde die Ethylacetatlösung kurz homogenisiert. In einem der Verfahren wurde die Lösung einem Emulgationsbad zugegeben, was in der Extraktion von Methylenchlorid mit gleichzeitiger Bildung von NGF enthaltenden PLGA-Mikrokügelchen resultierte. In einem bevorzugten Verfahren wurde die Lösung zerstäubt und die zerstäubten Tropfen eingefroren. Das Ethylacetat wird aus den Mikrokügelchen extrahiert und die Mikrokügelchen dann getrocknet, um Spuren des Extraktionslösungsmittels zu entfernen. Es kann eine Siebung durchgeführt werden, um die Mikrokügelchen nach Größe zu klassieren. Das aus diesen Mikrokügelchen freigesetzte Polypeptid würde dann untersucht, um die Integrität des aus den Mikrokügelchen freigesetzten NGF zu ermitteln. Die Beurteilung des freigesetzten NGF wurde mittels analytischer Größenausschlusschromatographie (SEC-HPLC) sowie anderer Techniken durchgeführt.
Materialien
Rekombinanter menschlicher Nervenwachstumsfaktor (NGF) wurde in Chinahamster-Eierstockzellen produziert und mittels Umkehrphasen- (RP-HPLC) und Ionenaustauschchromatographie (IEC) wie früher beschrieben gereinigt (Schmelzer et al., J. Neurochem. 59, 1675-1683 (1992)). Acetonitril mit HPLC-Qualität und TFA wurden für die RP-HPLC verwendet. Alle anderen Chemikalien waren von USB-Qualität. Sterile 2-ml-Fläschchen Typ I aus Klarglas wurden von Wheaton bezogen und mit silikonisierten, Teflon-beschichteten Butyl-Gummistopfen verwendet.
Analytische Verfahren
UV-Analyse. rhNGH-Konzentrationen wurden durch Scannen von 240 bis 360 nm unter Verwendung eines HP-8452A-UV-Vis-Spektralphotometers bestimmt. Formulierungspuffer wurde als Referenz-Leerwert verwendet, und die Proteinkonzentration in mg/ml wurde aus (A278-320)/1,5 berechnet, wobei 1,5 der Extinktionskoeffizient von rhNGF in ml/(mg.cm) war.
BCA (Bicinchonin-Test) unter Verwendung von rhNGF-Standards wurde durchgeführt, um die NGF-Proteinkonzentration von aus den Mikrokügelchen freigesetztem NGF in vitro zu messen.
HPLC-Analyse:
Größenausschlusschromatographie. Größenausschluss-HPLC wurde eingesetzt, um die Aggregatbildung in den rhNGF-Formulierungen nachzuweisen und zu quantifizieren. Unter Verwendung dieser Technik eluiert rhNGF als Dimer (Hauptpeak) bei einer Retentionszeit von 8,6 Minuten. Das Auftreten einer vorausgehenden Schulter am Dimer-Hauptpeak zeigt die Gegenwart von Aggregaten höheren Molekulargewichts an. Die Größenausschluss-HPLC („SEC-HPLC") wurde unter Verwendung einer Perkin Elmer Series 410 Bio LC-Pumpe mit einem spektralphotometrischen UV-Detektor (Perkin Elmer LC 90) und einer Tosohas-Säule (TSK 2000 SWXL, 5 μm (7,8 × 300 mm)) durchgeführt. Diese SEC-Säule wurde bei 0,5 ml/min unter Verwendung einer mobilen Phase aus 0,2 M Kaliumphosphat und 0,45 M Kaliumchlorid bei pH 7,0 betrieben. Für die SEC erfolgte die UV-Detektion bei 280 nm; für die RP-HPLC und IEC bei 214 nm.
ELISA. Dieser Test hat einen Bereich von 0,39 – 6,25 ng/ml. Jede rhNGF-Probe wurde in Testverdünner auf zwei Zielkonzentrationen von 5 und 1,5 ng/ml verdünnt und jede Verdünnung in dreifacher Ausführung getestet. Die Proteinkonzentration in mg/ml wurde gegen einen internen -70-°C-Referenzstandard normalisiert, der demselben Test unterzogen wurde.
Radiorezeptortest (RRA). Dieser Test misst die Fähigkeit von unmarkiertem rhNGF, mit 125l-rhNGF um die Rezeptorbindung an PC-12-Zellen zu konkurrieren. Dieser Test hat einen Bereich von 3-80 ng/ml. Jede rhNGF-Probe wurde in Testverdünner auf zwei Zielkonzentrationen von 25 und 12,5 ng/ml verdünnt und jede Verdünnung in zweifacher Ausführung analysiert. Die Proteinkonzentration in mg/ml wurde gegen einen internen -70-°C-Referenzstandard normalisiert, der demselben Test unterzogen wurde.
P-12-Zellüberlebensbiotest. Dieser Test ermittelt die Fähigkeit von rhNGF, an seine Rezeptoren zu binden und intrazelluläre Signale zu erzeugen, die im Überleben von PC-12-Zellen unter serumfreien Kulturbedingungen resultieren, und hat einen Bereich von 0,24 – 30 ng/ml. Die Konzentration des aktiven Proteins in mg/ml wurde gegen einen internen -70-°C-Referenzstandard normalisiert, der demselben Test unterzogen wurde.
Neuriten-Auswuchs-Test. Die biologische Aktivität von NGF wurde unter Verwendung des von Greene (A quantitative bioassay for nerve growth factor activity employing a clonal pheochromocytoma cell line, Brain Res. 133, 350-353 (1977)) entwickelten und wie von Schmelzer et al., J. Neurochem. 59, 1675-1683 (1992), beschrieben modifizierten PC12-Tests bestimmt.
SDS-PAGE. Proben wurden in Tricin-SDS-Probenpuffer von Novex verdünnt und 1 Stunde lang bei 50 °C inkubiert. Nicht-reduzierte SDS-PAGE wurde an 10 % Acrylamid enthaltenden Novex-Tricingelen, gefolgt von Coomassie-Blau-Färbung durchgeführt. Molekulargewichte wurden unter Verwendung der Low-molecular-weight-Marker von Bio-Rad abgeschätzt. Unter Verwendung nicht-reduzierender SDS-PAGE läuft das Monomer bei 13,5 kDa und die Dimerbande bei ungefähr 26 kD.
Die Stabilität von NGF bei 37 °C wurde zum Teil durch das Ausmaß der NGF-Aggregation beurteilt. Die Dimer/Monomer-Gleichgewichtskonstante für Maus-NGF ist kleiner als 10-13 M bei pH 4-7 (Bothwell et al., J. Biol. Chem. 252, 8532-8536 (1977); Timm et al., Biochem. 33, 4667-4676 (1994); Moore et al., Neurobiol. 5, 369-381 (1975); Timm et al., Prot. Sci. 1, 236-244 (1992)). Die kleine Menge an aggregiertem NGF kann als Tetramer auf Basis von Molekulargewichtsstandards identifiziert werden. Eine vorausgehende Schulter an diesem Peak zeigt größere Aggregate an.
Die In-vitro-Freisetzung von NGF aus den Mikrokügelchen wurde durch Inkubation in Freisetzungspuffer gemessen: 10 mM Natriumacetat, 136 mM NaCl, 0,02 Polysorbat 20, 0,02 % Natriumazid, pH 5,5. Die Zeitdauer der „anfänglichen Freisetzung" wurde mit einer Stunde definiert.
Verfahren
Es wurde festgestellt, dass das NGF-Protein die größte physikalisch chemische Stabilität bei pH 5,5 aufweist. Daher wurde es in 5 mM Histidin, pH 5,5, formuliert (De Young et al., Biophys. J. 66, A401 (1994)). Verschiedene Exzipienten wurden diesem Formulierungspuffer zugegeben und die Formulierungen dann mit Ethylacetat wie früher beschrieben behandelt (J.L. Cleland und A.J. Jones, Pharm. Res. 13, 1464-1475 (1996)). Die stabilste der getesteten Formulierungen wurde durch Pumpen der Lösung durch eine Ultraschalldüse in flüssigen Stickstoff und Lyophilisieren der gefrorenen Tröpfchen sprühgefriergetrocknet. Siehe 1.
Das endgültige Proteinpulver wurde in einer Lösung von 50:50 Lactid/Glykolid-PLGA (0,2 dL/g Viskosität, hydrophile Gruppen aufweisend, Boehringer Ingelheim, RG502H) in Ethylacetat homogenisiert. Die Wirkung von Zink auf die Freisetzung von rhNGF wurde durch Zugeben verschiedener Mengen von festem Zinkcarbonat (< 5-μm-Teilchen) zur Polymerlösung in organischem Lösungsmittel analysiert. Die Suspension wurde durch eine Ultraschalldüse in ein Flüssigstickstoff und gefrorenes Ethanol enthaltendes Gefäß gepumpt (Johnson et al., Nature Medicine 2, 795-799 (1996)). Nach dem Erwärmen auf -70 °C extrahierte das Ethanol das Ethylacetat für 2-3 Tage aus den Mikrokügelchen. Die Mikrokügelchen wurden dann zur Entfernung des Ethanols filtriert und getrocknet.
Die Analyse der Mikrokügelchen wurde in vitro durch Inkubation in 10 mM Natriumacetat, 136 mM Natriumchlorid, pH 5,5, oder 10 mM HEPES, 100 mM Natriumchlorid, pH 7,4, mit 0,02 % Polysorbat 20 und 0,02 % Natriumazid in beiden Puffern durchgeführt. Freisetzungsuntersuchungen wurde wie früher beschrieben durchgeführt (Cleland et al., Pharm. Res. 13, 1464-1475 (1996)). Die Beladung von rhNGF in den PLGA-Mikrokügelchen wurde durch Auflösen in 1 N NaOH und Messung der Absorption bei 284 nm (E=1,545 (mg/ml)-1cm-1) bestimmt.
Ergebnisse
Um die Freisetzung von intaktem nativem rhNGF sicherzustellen, wurden Trehalose, Saccharose, Mannit, Polyethylenglykol (PEG, 3.350 Da) und Pluronic F68 (PF68) hinsichtlich ihrer Fähigkeit gescreent, rhNGF in Ethylacetat zu stabilisieren. Die Ergebnisse der Stabilitätstests sind in 2 und 3 dargestellt. Die stabilste Formulierung bestand aus 5 mg/ml rhNGF und 5 mg/ml Trehalose. Diese Formulierung wurde mit und ohne Tensid verwendet, das erforderlich sein kann, um die Aggregation des rhNGF während der Inkubation bei physiologischen Bedingungen zu verhindern. PLGA-Mikrokügelchen wurden mit den stabilen rhNGF-Formulierungen und verschiedenen Mengen an Zinkcarbonat wie in Tabelle 1 dargestellt hergestellt.
Tabelle 1: rhNGF-PLGA-Mikrokügelchen^a
Die Zugabe von festem Zinkcarbonat verminderte in hohem Ausmaß die anfängliche Freisetzung (1 Stunde Inkubation) aus den Mikrokügelchen. Dieses Ergebnis könnte durch die Bindung von rhNGF an Zink bedingt sein (eine Zink-Bindungsstelle pro Monomer), um ein reversibles nicht-kovalentes Aggregat zu bilden (Holland et al., J. Mol. Biol. 239, 385-400 (1994)). Ähnliche Ergebnisse wurden für die Verwendung von Zinkcarbonat zur Modulation der Freisetzung eines anderen Zink-bindenden Proteins, nämlich des menschlichen Wachstumshormons, beschrieben. Die Zink enthaltenden rhNGF-PLGA-Formulierungen wiesen außerdem eine langsamere Gesamt-Freisetzungsrate auf, wie in 4 dargestellt ist. Diese Mikrokügelchen setzten den gesamten verkapselten rhNGF innerhalb von 14 Tagen frei, während Mikrokügelchen ohne Zink den Großteil des rhNGF innerhalb von 7 Tagen freisetzten. Die Freisetzungsrate wurde durch die Zugabe von Tensid zur Proteinformulierung nicht beeinflusst (5).
Eine weitere wichtige Überlegung war die Stabilität des rhNGF während der Freisetzung aus den Mikrokügelchen bei 37 °C. Anfänglich aus den Mikrokügelchen freigesetzter rhNGF war leicht aggregiert (94 % natives Dimer), und die Zugabe von. Tensid zur Proteinformulierung bewirkte keine signifikante Erhöhung der Menge an nativem Dimer (siehe 6). Die Fähigkeit von rhNGF, an seinen Rezeptor zu binden, war ebenfalls vermindert. Eine weitere Verminderung des Anteils des aus den Mikrokügelchen freigesetzten rhNGF wurde nach Inkubation für 7-10 Tage bei 37 °C beobachtet, was nahe legt, dass der rhNGF unter diesen Bedingungen sogar in einem Freisetzungspuffer mit niedrigem pH-Wert (pH 5,5) nicht stabil war.
Die PLGA-Mikrokügelchen-Formulierungen in diesem Beispiel sorgten für eine kontinuierliche Freisetzung von rhNGF über 7 bis 14 Tage. Die Freisetzungsrate wurde durch die Zugabe von festem Zink zur Polymerphase moduliert. Zink und rhNGF bilden wahrscheinlich einen stabilen Komplex, der langsam aus den PLGA-Mikrokügelchen dissoziiert. Obgleich die Trehalose-Formulierung mit und ohne Tensid in Screening-Untersuchungen offenbar für eine gute Stabilität sorgte, resultierte sie nicht in der Freisetzung von nativem rhNGF für den Zeitraum der Freisetzung. Obgleich diese Ergebnisse eine kontrollierte Freisetzung von NGF in Mikrokügelchen anzeigen, werden hierin Verbesserungen der Formulierung dargelegt, um die NGF-Stabilität zu erhalten und die Freisetzung von nativem Dimer über den gesamten Freisetzungszeitraum hinweg zu gewährleisten.
Beispiel 2
Da die in Beispiel 1 dargestellten In-vitro-Freisetzungsuntersuchungen zeigten, dass verkapselter rhNGF über Aggregation abgebaut wurde (bei 37 °C war aus den Mikrokügelchen freigesetzter rhNGF, wie mittels SEC ermittelt wurde, nach Inkubation für 10 Tage aggregiert – 85 % natives Dimer), wurde eine neue Vorformulierung eingesetzt. Bei dieser neuen Vorformulierung wurde ein Metallion vor der Beimischung zum biologisch abbaubaren Polymer an rhNGF komplexiert. Überraschenderweise wurde eine signifikante Verbesserung der Stabilität (Integrität) des aus den Mikrokügelchen freigesetzten NGF beobachtet.
Zinkacetat wurde einer in 4 mM NaHCO₃ bei pH 7,4 formulierten rhNGF-Lösung zugegeben. Eine Erhöhung der Zinkacetat-Konzentration verringerte das Ausmaß der Aggregatbildung, wie mittels SEC ermittelt wurde (7). 7 stellt die Integrität als Prozent Monomer der Zink enthaltenden NGF-Lösungen vor und nach Gefriertrocknung vor der Verkapselung dar. Zink enthaltende rhNGF-Lösungen, die als Flüssigkeit bei 5 und 37 °C inkubiert worden sind, waren nach 4 Wochen Lagerung opaleszierend. Im Gegensatz dazu bildeten die lyophilisierten Proben unter denselben Lagerungsbedingungen nach Rekonstitution ein Präzipitat. Um die minimal erforderliche Zinkmenge für die Bildung des rhNGF-Zn-Komplexes zu ermitteln, wurde das Präzipitat der lyophilisierten rhNGF-Proben mit verschiedenen Molverhältnissen von Protein zu Zink mittels Zentrifugation entfernt und die im Überstand verbliebene Proteinkonzentration (ohne Zink-Komplexierung) mittels UV bestimmt. Wie in 8 dargestellt ist, bildeten mehr als 80 % des lyophilisierten rhNGF einen Komplex mit Zinkacetat bei Molverhältnissen von 1:6 und 1:8 (rhNGF:Zinkacetat) bei 5 °C. Folglich ist die Menge an mit Zink komplexiertem und vor und nach Gefriertrocknung vor der Verkapselung in Lösung verbleibendem NGF ein weiterer Hinweis der Integrität, wie in 8 dargestellt ist. Wie zu erkennen ist, trägt nach vier Wochen bei 37 °C das vor der Verkapselung zur NGF-Lösung zugegebene Metallion zur Erhaltung der Integrität des NGF-Dimers bei. Diese Befunde bestätigen, dass die Vorformulierung von NGF mit einem NGF-bindenden Metallion in wässriger Lösung vor der Trocknung der Lösung und Beimischung von zusätzlichen Freisetzungsmodifikatoren oder Biopolymer ein Mittel bereitstellt, die Stabilität von verkapseltem rhNGF während des Fertigungsprozesses und während der anschließenden Freisetzung in vitro zu verbessern und zu gewährleisten. Folglich zeigt das vorliegende Beispiel, dass rhNGF durch Komplexieren des Proteins mit Zinkacetat in Lösung vor der Verkapselung stabilisiert werden kann.
Diese Vorformulierung wurde weiter charakterisiert. In CHO-Zellen produzierter, gereinigter rhNGF wurde als Flüssigkeit mit 5,5 mg/ml in 4 mM Natriumbicarbonat, pH 7,4, formuliert. Zinkacetat wurde der rhNGF-Lösung in einem Molverhältnis von 1:10 (rhNGF:Zinkacetat) zugegeben. In allen Beispielen wird unter einem Mol rhNGF ein Mol der aktiven Dimerform verstanden. Die Zink enthaltende rhNGF-Lösung wurde in Flüssigstickstoff gefriergetrocknet und lyophilisiert, um festen rhNGF zur Mikroverkapselung herzustellen. Dieses feste Protein (10 Gew.-%) wurde dann mit PLGA (RG502H, 50:50, nicht blockiert, 12 kDa) homogenisiert, das in Ethylacetat gelöst war, um eine Suspension zu bilden. Zinkcarbonat (6 Gew.-%) wurde ebenfalls zur Polymerlösung zugegeben und vor der Zugabe des festen rhNGF homogenisiert. Nach der Homogenisierung wurde die Protein-Polymer-Suspension in Flüssigstickstoff und kaltem Ethanol gefriergetrocknet, um rhNGF/PLGA-Mikrokügelchen herzustellen.
In-vitro-Freisetzungsuntersuchungen wurden unter Verwendung einer ZentrifugenUltrafiltrationsvorrichtung durchgeführt. Zehn mg Mikrokügelchen wurden dem entfernbaren Reservoir der Vorrichtung zugegeben und mit 300 FL Freisetzungspuffer (phosphatgepufferte Salzlösung, pH 7,4) vermischt. Die Vorrichtung wurde bei 37 °C inkubiert. Nach der Gewinnung von Proben des freigesetztes Proteins mittels Zentrifugation wurde die Vorrichtung mit Freisetzungspuffer aufgefüllt. Die Proteinkonzentration des freigesetzten rhNGF wurde unter Verwendung der Bicinchoninsäure- (BCA-) Messmethode bestimmt. Native Größenausschlusschromatographie (SEC) wurde eingesetzt, um die Integrität (Prozent nicht aggregiert) des rekonstitutierten Feststoffs und freigesetzten rhNGF zu bestimmen.
Die Wirkung von Zink auf die Stabilisierung von rhNGF wurde durch Vergleichen des Freisetzungsprofils und der Integrität von freigesetztem rhNGF mit den ohne Zugabe von Zinkacetat zur Proteinformulierung hergestellten Mikrokügelchen (5 mM Histidinpuffer, pH 5,0) wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht. In diesem speziellen Beispiel wurde ein bevorzugtes Molverhältnis von 1:10 (rhNGF:Zinkacetat) gewählt, von dem festgestellt wurde, dass es die Proteinaggregation bei diesem Minimalverhältnis bei Lagerung der Suspension bei 37 °C signifikant vermindert. Die Zugaben von Zinkacetat zur Proteinformulierung beeinflusste insgesamt das In-vitro-Freisetzungsprofil nicht, wie in 9 dargestellt ist. Beide rhNGF/PLGA-Formulierungen mit und ohne Zink in der Proteinphase wiesen einen niedrigen anfänglichen Burst von ungefähr 1 % auf. Die aus beiden Formulierungen hergestellten Mikrokügelchen setzten das gesamte verkapselte rhNGF innerhalb von 14 Tagen frei.
Die Wirkung von Zinkacetat auf die Stabilität des rhNGF während der Freisetzung aus den Mikrokügelchen bei 37 °C wurde ebenfalls untersucht. Wie in 10 dargestellt ist, wies das freigesetzte Protein der Zink enthaltenden rhNGF/PLGA-Formulierung 93 % natives Dimer nach Inkubation bei 37 °C für 10 Tage auf, während die Formulierung ohne Zinkacetat Protein mit 85 % nativem Dimer freisetzte. In der Tat war der anfänglich aus der PLGA-Formulierung ohne Zink freigesetzte rhNGF leicht aggregiert (94 % natives Dimer).
Die Ergebnisse dieses Beispiels zeigen an, dass die Zugabe von Zinkacetat zur Proteinformulierung die Aggregation des rhNGF außerordentlich verminderte und das Protein daher während der Verkapselung und anschließenden Freisetzung aus den Mikrokügelchen stabilisierte. Die Stabilisierung wird wahrscheinlich durch die Komplexierung von rhNGF mit Zink unter Ausbildung stabiler Aggregate verursacht. Obgleich festes Zink (6 Gew.-% Zinkcarbonat) der Polymerphase während der Verkapselung ebenfalls zugegeben wurde, um den anfänglichen Burst des verkapselten rhNGF zu vermindern, förderte es nicht die Stabilisierung des Proteins. Außerdem bildet sich der Zn:rhNGF-Komplex nur bei einem hohen pH-Wert (pH 7,4) und dissoziiert bei niedrigem pH (pH 5,5). Bei 37 °C war rhNGF in der Zink enthaltenden Bicarbonat-Formulierung (pH 7,4) genauso stabil wie das Protein in der flüssigen Kontrollformulierung ohne Zinkacetat (5 mM Histidin, pH 5,5), wie in 10 dargestellt ist. Frühere Untersuchungen (Daten nicht dargestellt) zeigten, dass rhNGF bei pH 7,4 ohne Zink nicht stabil war. Dies legt nahe, dass rhNGF durch Bildung eines Zink- (Metallionen-) Komplexes stabilisiert und in dessen Abwesenheit bei einem derartig hohen pH rasch abgebaut werden könnte. Infolgedessen verbesserte in 4 mM Natriumbicarbonat bei pH 7,4 mit der Zugabe von Zinkacetat formulierter rhNGF wie hierin gelehrt die Stabilität des Proteins während der Mikroverkapselung und Freisetzung bei 37 °C (physiologische Temperatur). Der rhNGF in dieser Formulierung wurde durch die Bildung eines Zink-Komplexes stabilisiert.
Typischerweise wird die NGF-Metall-Lösung sprühgefriergetrocknet, vorzugsweise durch Zerstäubung der Lösung in flüssigen Stickstoff, wodurch die gefrorenen Tröpfchen einer Temperatur von weniger als oder gleich -70 °C ausgesetzt werden, gefolgt von der Entfernung des Stickstoffs und der Lyophilisierung der gefrorenen Tröpfchen oder Kristalle, um ein NGF-Metallsalz-Pulver einer sehr feinen Teilchengröße zu erlangen, die typischerweise weniger als ungefähr 5 Mikrometer beträgt. Das NGF-Zink-Pulver wird wie hierin gelehrt vorzugsweise wie in Beispiel 1 erörtert zu einem kontrolliert freisetzenden Mikrokügelchen verarbeitet. Die in die Mikrokügelchen eingebrachte NGF-Beladung beträgt typischerweise 10 Gew.-%.
Für eine Injektion werden die Mikrokügelchen gesiebt, vorzugsweise auf eine Größe von 20 bis 90 Mikrometern. Die gesiebten Mikrokügelchen werden in Fläschchen in einer Menge abgefüllt, die zur Resuspension und Injektion geeignet ist. Für subkutane Injektion werden die Mikrokügelchen in 5 % Dextran-70 in Salzlösung (9 % NaCl), gegebenenfalls mit 0,01 % Tween 30, resuspendiert. Alternativ dazu werden die rhNGF/Zink/PLGA-Mikrokügelchen resuspendiert und für die kontinuierliche Freisetzung von rhNGF für 3-4 Wochen in ein im Gehirn implantiertes Ommaya-Reservoir (oder dergleichen) injiziert.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Mikrokügelchen-Vorrichtung zur kontrollierten nachhaltigen Freisetzung von NGF mit verringerter NGF-Aggregationscharakteristik, umfassend das Vermischen von NGF in Lösung mit einem NGF-stabilisierenden Metallsalz eines NGF-bindenden Metalls, worin das Molverhältnis von NGF zu Metall 1 zu 4 bis 1 zu 50 beträgt, sowie das Mikroverkapseln des NGF-Metall-Gemischs zur Bildung eines NGF und Metall enthaltenden Mikrokügelchens, das zur kontrollierten nachhaltigen Freisetzung von NGF fähig ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das von Molverhältnis NGF zu Metall in der Lösung 1 zu 6 bis 1 zu 20 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Molverhältnis von NGF zu Metall in der Lösung 1 zu 8 bis 1 zu 14 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Metall ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder ein mehrwertiges Metall ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das Metall Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium, Eisen(II), Eisen(III), Kupfer(II), Zinn(II), Zinn(IV), Aluminium(II), Aluminium(III) oder Zink ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das Metall Zink ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Metall in Form eines aliphatischen Carbonsäuresalzes vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 7, worin das Salz ein Carbonat- oder Acetatsalz ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Metall Zinkchlorid, Zinkbromid, Zinkiodid, Zinkfluorid, Zinksulfat, Zinknitrat, Zinkthiocyanat, Zinkcarbonat, Zinkacetat, Zinkglykolat, Zinklactat, Zinktartrat, Zinkbenzoat, Zinksalicylat, Zinkphenolsulfonat, Calciumchlorid, Calciumbromid, Calciumiodid, Calciumfluorid, Calciumsulfat, Calciumnitrat, Calciumthiocyanat; Calciumcarbonat, Calciumacetat, Calciumpropionat, Calciumoxalat, Calciumtartrat, Calciumlactat, Calciumcitrat, Calciumgluconat, Calciumbenzoat oder Calciumsalicylat ist.
Verfahren nach Anspruch 9, worin das Metallsalz Zinkacetat, Zinkcarbonat, Calciumacetat oder Calciumcarbonat ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der NGF menschlicher 118-NGF ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der NGF von China-Hamster-Eierstockzellen sekretiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der pH-Wert des Gemischs 6 bis 8 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, weiters umfassend das Beimischen eines Polyol-stabilisators mit einem Molekulargewicht von unter ca. 70.000 kD.
Verfahren nach Anspruch 14, worin das Polyol ein Zuckeralkohol ist.
Verfahren nach Anspruch 15, worin der Zucker Trehalose, Mannit oder Saccharose ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Mikroverkapseln das Beimischen eines biologisch abbaubaren Polymers zum NGF-Metall-Gemisch und das Formulieren des Gemischs zu Polymer-Mikrokügelchen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, weiters umfassend das Trocknen der NGF-Metall-Lösung vor dem Beimischen des biologisch abbaubaren Polymers.
Verfahren nach Anspruch 17, weiters umfassend das Beimischen eines Freisetzungsmodifikators zum getrockneten NGF-Metall-Gemisch oder zum Gemisch aus NGF und dem biologisch abbaubaren Polymer.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Mikroverkapseln das Trocknen der NGF-Metall-Lösung, das Dispergieren eines biologisch abbaubaren Polymers in einem organischen Lösungsmittel, das Beimischen des getrockneten NGF-Gemischs zum Gemisch aus dem biologisch abbaubaren Polymer und dem organischen Lösungsmittel, das Spritzen des Gemischs aus NGF und dem biologisch abbaubaren Polymer zur Bildung von Tröpfchen und das Entfernen des organischen Lösungsmittels aus den Tröpfchen zur Bildung von NGF-hältigen Mikrokügelchen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 20, weiters umfassend das Beimischen eines Freisetzungsmodifikators zum getrockneten NGF-Metall-Gemisch.
Verfahren nach Anspruch 20, worin das organische Lösungsmittel Ethylacetat oder Methylenchlorid ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Mikrokügelchen 1 bis 1000 μn groß sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der NGF im Mikrokügelchen 5 bis 20 Gew.-% ausmacht.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das biologisch abbaubare Polymer Polylactid oder Poly(lactid-co-glykolid) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, weiters umfassend das Komprimieren der Mikrokügelchen zur Bildung eines Pellets.
Verwendung von NGF zur Herstellung eines Arzneimittels aus bioverträglichen Polymer-Mikrokügelchen zur Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge an NGF durch Freisetzung über einen Zeitraum von mehr als einem Tag, wobei die bioverträglichen Polymer-Mikrokügelchen einen Durchmesser von unter 300 μm aufweisen sowie 0,1 bis 50 Gew.-% NGF und ein an NGF komplexiertes Metall enthalten.
Verwendung nach Anspruch 27, worin das Metall Zink, Calcium oder Magnesium ist.
Verwendung nach Anspruch 27, worin der Patient an peripherem Nervenleiden leidet.
Polymer-Mikrokügelchen-Vorrichtung mit einem Durchmesser von unter 1000 μm zur kontrollierten nachhaltigen Freisetzung von NGF, umfassend ein bioverträgliches Polymer-Mikrokügelchen, das 0,1 bis 50 Gew.-% NGF, komplexiert mit einem NGF-stabilisierenden Metall, das NGF bindet, enthält, wobei die Vorrichtung zur Freisetzung von NGF über einen Zeitraum von mehr als einem Tag fähig ist.
Verfahren zur Erhöhung der Stabilität von NGF in einer mikroverkapselten, NGF als Wirkstoff enthaltenden Zusammensetzung, umfassend das Inkorporieren eines NGF-stabilisierenden und -bindenden Metalls in eine wässrige NGF-Lösung, gefolgt vom Trocknen der Lösung zum Mikroverkapseln.