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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
im allgemeinen verbesserte Verfahren zum Herstellen von bioabbaubaren
polymeren Mikropartikeln, enthaltend einen aktiven Inhaltsstoff.
Zusätzlich
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der besagten Mikropartikel,
um Zusammensetzungen für
die verzögerte
Freisetzung von Therapeutika herzustellen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Aufgrund jüngerer Fortschritte in der
Gen- und Zelltechnik ist man in der Lage, Proteine, die bekanntermaßen verschiedene
pharmakologische Wirkungen in vivo aufweisen, in großen Mengen
für pharmazeutische
Anwendungen herzustellen. Solche Proteine schließen Erythropoietin (EPO), Granulocyten-Kolonie-stimulierenden
Faktor (G-CSF), Interferone (alpha, beta, gamma, Consensus), Tumornekrosefaktor-bindendes Protein
(TNFbp), Interleukin-1-Rezeptor-Antagonist
(IL-1ra), aus dem Hirn stammender neurotropher Faktor (BDNF), Keratinocyten-Wachstumsfaktor
(KGF), Stammzellenfaktor (SCF), Megakaryocytenwachstums-Differenzierungsfaktor
(MGDF), Osteoprotegerin (OPG), Glial-Zellinien-abgeleiteter neurotropher
Faktor (GDNF) und Fettleibigkeitsprotein („obesity protein") (OB-Protein) ein.
OB-Protein kann
hierin auch als Leptin bezeichnet werden.
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Da diese Proteine im allgemeinen
kurze in-vivo-Halbwertszeiten und eine venachlässigbare orale Bioverfügbarkeit
haben, werden sie typischerweise mittels häufiger Injektion verabreicht,
wodurch sie eine signifikante physische Belastung für den Patienten
und damit verbundene Verwaltungskosten bedeuten. Als solches gibt
es gegenwärtig
ein großes
Maß an
Interesse hinsichtlich der Entwicklung und Bewertung von Formulierungen
mit verzögerter
Freisetzung. Effektive Formulierungen mit verzögerter Freisetzung können ein Mittel
bereitstellen, um die Blutkonzentrationen des aktiven Inhaltsstoffes
zu kontrollieren, und ebenso für
eine größere Wirksamkeit,
Sicherheit, Bequemlichkeit für
den Patienten und Patientenverträglichkeit
sorgen. Leider hat die Instabilität der meisten Proteine (z.
B. Denaturierung und Verlust an biologischer Aktivität bei Aussetzen gegenüber Wärme, organischen
Lösungsmit teln
etc.) die Entwicklung und Bewertung von Formulierungen mit verzögerter Freisetzung
in starker Weise beschränkt.
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Versuche, Formulierungen mit anhaltender
Freisetzung zu entwickeln, haben die Verwendung einer Vielzahl von
bioabbaubaren und nicht-bioabbaubaren Polymer- z. B. Poly(lactid-coglycolid))
Mikropartikeln, enthaltend den aktiven Inhaltsstoff, eingeschlossen
(siehe z. B. Wise et al., Contraception, 8: 227–234 (1973); und Hutchinson
et al., Biochem. Soc. Trans., 13: 520–523 (1985)), und eine Vielzahl
von Techniken sind bekannt, mit denen aktive Mittel, z. B. Proteine,
in polymere Mikrosphären
eingebaut werden können
(siehe z. B. US-Patent Nr. 4,675,189 und die darin zitierten Literaturangaben).
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Eine solche Technik ist Sprühtrocknen,
wobei das Polymer und der aktive Inhaltsstoff in einem Lösungsmittel
für das
Polymer zusammengemischt werden, und dann wird das Lösungsmittel
verdampft, indem man die Lösung
sprüht,
was polymere Tröpfchen,
die den aktiven Inhaltsstoff enthalten, zurückläßt. Für eine detaillierte Übersicht über das
Sprühtrocknen
siehe z. B. Masters, K., „Spray
Drying Handbook" (John
Wiley & Sons,
eds., New York 1984). Obwohl sich die Sprühtrocknungstechnik in bestimmten
Fällen
als nützlich
erwiesen hat, leidet sie immer noch unter der Tatsache, daß biologisch
aktive Proteine oft aufgrund des Kontaktes mit dem organischen Polymer
und Lösungsmittel
oder aufgrund der während
der Sprühtrocknungsprozesse entwickelten
Wärme denaturieren.
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Eine andere Technik, die verwendet
werden kann, um Mikrosphären
zu bilden, ist die Lösungsmittelverdampfung.
Lösungsmittelverdampfung
beinhaltet das Auflösen
des Polymers in einem organischen Lösungsmittel, das entweder aufgelösten oder
dispergierten aktiven Inhaltsstoff enthält. Die Mischung aus Polymer/aktivem
Inhaltsstoff wird dann zu einer gerührten kontinuierlichen Phase
zugegeben, die typischerweise wäßrig ist.
Emulgatoren werden in der wäßrigen Phase
eingeschlossen, um die Öl-in-Wasser-Emulsion
zu stabilisieren. Das organische Lösungsmittel wird dann über eine
Periode von mehreren Stunden oder mehr verdampft, wodurch das Polymer
um das Kernmaterial abgelagert wird. Für eine vollständige Übersicht
der Lösungsmittelverdampfungsprozedur
siehe z. B. US-Patent Nr. 4,389,330 (und darin zitierte Literaturangaben). Ebenso
wie die Sprühtrocknungstechnik
haben sich Lösungsmittelverdampfungstechniken
in bestimmten Fällen
als nützlich
herausgestellt. Jedoch wird die Technik oft nicht bevorzugt, da
oft während
des Lösungsmittelextraktionsprozesses
aktiver Inhaltsstoff verloren wird. Dies geschieht, weil der Prozeß eine Emulgierung
in eine wäßrige Phase
beinhaltet, und eine wasserlösliche
Arznei wird sich oft von der mehr hydrophoben Polymer-Lösungsphase
in die wäßrige Umgebung
partitionieren.
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Noch eine weitere Technik, die dafür verwendet
werden kann, um Mikrosphären
zu bilden, ist die Phasentrennung, die die Bildung einer Wasser-in-Öl-Emulsion
oder Öl-in-Wasser-Emulsion beinhaltet.
Das Polymer wird aus der kontinuierlichen Phase auf dem aktiven
Mittel durch eine Veränderung
hinsichtlich der Temperatur, pH, Ionenstärke oder durch die Zugabe von
Fällungsmitteln
ausgefällt.
Für eine Übersicht über Phasentrennungstechniken
siehe z. B. US-Patent Nr. 4,675,800 (und darin zitierte Literaturangaben).
Wiederum leidet dieses Verfahren hauptsächlich an einem Verlust von
aktivem Inhaltsstoff aufgrund von Denaturierung.
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Die Freisetzungseigenschaften für den aktiven
Inhaltsstoff aus Mikropartikeln, die mittels Verfahren, wie denjenigen,
die oben beschrieben worden sind, hergestellt worden sind, können kontinuierlich
oder diskontinuierlich sein, und in einigen Fällen ist das anfängliche
Niveau der Freisetzung an aktivem Inhaltsstoff zu hoch oder zu niedrig.
Daher werden verschiedene Zusatzstoffe häufig verwendet, um zu versuchen,
die Freisetzung an aktivem Inhaltsstoff zu kontrollieren (siehe
z. B.
EP 0 761 211
A1 , veröffentlicht
am 12. März
1997).
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EP 0 442 671 A2 offenbart Mikrokapseln mit
verlängerter
Freisetzung, hergestellt durch Zubereiten einer Wasser-in-Öl-Emulsion.
Die Emulsion umfaßt
eine innere wäßrige Schicht,
enthaltend ein physiologisch aktives Polypeptid, und eine Ölschicht,
enthaltend ein Co-Polymer
oder Homo-Polymer. Die Wasser-in-Öl-Emulsion wird einer Mikroverkapselung
unterzogen, um die Mikrokapseln herzustellen.
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Um die Denaturierung des Proteins
und anderer empfindlicher biologischer Moleküle zu vermeiden, die beim Sprühtrocknen,
Lösungsmittelverdampfung
oder Phasentrennung mittels klassischer Techniken stattfindet, kann
die Emulsion aus Polymeren und aktivem Inhaltsstoff in ein gefrorenes
Nicht-Lösungsmittel
atomisiert werden, das mit einem verflüssigten Gas, wie Stickstoff, überschichtet
ist, um Partikel zu bilden, und dann bei sehr niedrigen Temperaturen
extrahiert werden. Die extrem niedrigen Verarbeitungstemperaturen
können die
Aktivität
und Unversehrtheit der empfindlichen Biomoleküle, wie etwa Proteine, bewahren.
Jedoch führt
das Verfahren zu schlechten Beladungswirksamkeiten und Ausbeuten,
was zu dem Verlust an kostbarem biologischen Material führt, und
es ist aufwendig, schwierig und teuer, es in den großen Maßstäben zu implementieren,
die für
eine kommerzielle Herstellung erforderlich sind.
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Es ist klar, daß immer noch ein Bedarf existiert
für ein
verbessertes Verfahren zum Herstellen von polymeren Mikropartikeln,
enthaltend einen aktiven Inhaltsstoff, wobei das Verfahren einfach,
billig, vielseitig ist und, was am wichtigsten ist, das vor einem
Verlust an Proteinaktivität
schützt
und für
hohe Beladungswirksamkeiten und Ausbeuten sorgt, wodurch eine konsistentere
Freisetzung an aktivem Inhaltsstoff über eine ausgedehnte Zeitperiode
ermöglicht
wird.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Wie unten vollständig beschrieben, sorgt die
vorliegende Erfindung für
ein verbessertes Verfahren zum Herstellen von polymeren Mikropartikeln,
enthaltend einen aktiven Inhaltsstoff, durch die einzigartige Verwendung
einer direkten Lyophilisierung einer Emulsion oder Suspension. Dieses
verbesserte Verfahren liefert mehrere signifikante Vorteile gegenüber den
im Stand der Technik beschriebenen Prozessen, einschließlich z. B.
1) Leichtigkeit der Herstellung der mit aktivem Inhaltsstoff beladenen
Mikropartikeln (d. h. weniger und weniger aufwendige Schritte);
und 2) die Bereitstellung von Formulierungen mit verzögerter Freisetzung,
die die Aktivität
und Unversehrtheit des aktiven Inhaltsstoffes während der Freisetzung beibehalten,
wodurch sie für eine
kontrollierte Freisetzung an aktivem Inhaltsstoff über eine
ausgedehnte Zeitperiode sorgen. Zusätzlich sorgen die Verfahren
der vorliegenden Erfindung für
den Vorteil der Vielseitigkeit bezüglich der Klasse an Polymeren
und/oder aktiven Inhaltsstoff, die verwendet werden können, ebenso
wie für
das Erzielen von höheren Ausbeuten,
höherer
Beladung und höheren
Beladungseffizienzen.
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Entsprechend betrifft ein Aspekt
der vorliegenden Erfindung ein neues und verbessertes Verfahren zum
Herstellen einer Zusammensetzung, umfassend einen aktiven Inhaltsstoff,
der innerhalb von polymeren Mikropartikeln enthalten ist, wobei
eine Mischung des aktiven Inhaltstoffes und des Polymers innerhalb
einer kontinuierlichen Phase dispergiert werden, wobei die resultierende
Dispersion gefroren wird und das Wasser und die organischen Lösungsmittel
von der Dispersion mittel Lyophilisierung entfernt werden. Wichtig,
das vorliegende Verfahren ist verfeinerter und einfacher als diejenigen,
die im Stand der Technik beschrieben werden, und die Aktivität und Unversehrtheit
des aktiven Inhaltsstoffes wird während des gesamten Verfahrens
beibehalten.
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Das vorliegende Verfahren kann im
allgemeinen dahingehend beschrieben werden, daß es die Schritte umfaßt: (a)
Herstellen einer polymeren Lösung;
(b) Zugeben eines aktiven Inhaltsstoffes, um eine Mischung zu produzieren;
(c) Dispergieren besagter Mischung innerhalb einer kontinuierlichen
Phase, d. h. Nicht-Lösungsmittel(n),
um eine Dispersion zu erzeugen; (d) Zugeben eines Bindemittels zu
besagter Dispersion; (e) Einfrieren besagter Dispersion, um eine
gefrorene Mischung zu erzeugen; und (f) Lyophilisieren der besagten gefrorenen
Mischung, um die erwünschten,
aktiven Inhaltsstoff enthaltenden Mikropartikel zu erzeugen. Alternativ
kann Schritt (b) ausgelassen und „blanke" Mikropartikel hergestellt werden, auf
die aktiver Inhaltsstoff dann geladen wird, indem man die blanken
Mikropartikeln in einer Lösung
aus aktivem Inhaltsstoff suspendiert.
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Ein zweiter Aspekt der vorliegenden
Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung für die verzögerte Freisetzung
eines aktiven Inhaltsstoffes, umfassend einen biologisch aktiven
Inhaltsstoff, der innerhalb von polymeren Mikropartikeln enthalten
ist, oder, alternativ, einen biologisch aktiven Inhaltsstoff, der
auf die polymeren Mikropartikel geladen ist. Wichtig, die Zusammensetzungen
mit verzögerter
Freisetzung gemäß der vorliegenden
Erfindung behalten die Aktivität
und Unversehrtheit des aktiven Inhaltsstoffes während einer Verkapselung und
Freisetzung, was dabei hilft, für
längere
Perioden mit einer einheitlichen Freisetzung zu sorgen.
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DARSTELLUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
wird ein Verfahren zum Herstellen einer Zusammensetzung bereitgestellt,
umfassend einen aktiven Inhaltsstoff, der innerhalb von polymeren
Mikropartikeln enthalten ist, wobei eine Mischung des aktiven Inhaltsstoffes
und das Polymer innerhalb einer kontinuierlichen Phase dispergiert werden,
die resultierende Dispersion gefroren wird und das Wasser und die
organischen Lösungsmittel
von der Dispersion mittels Lyophilisierung entfernt werden.
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Vorteilhafterweise ist besagte kontinuierliche
Phase wäßrig oder
organisch oder eine Mischung davon.
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Bevorzugt wird die aktive Inhaltsstoff-Polymer-Mischung
erhalten, indem man eine wäßrige Lösung des
aktiven Inhaltsstoffes in einer zweiten, nicht-wäßrigen Phase, enthaltend das
Polymer, vor Zugabe zu der kontinuierlichen Phase dispergiert.
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Bequemerweise wird die aktive Inhaltsstoff-Polymer-Mischung
erhalten, indem man beide Bestandteile in einem nicht-wäßrigen Lösungsmittel
vor Zugabe zu der kontinuierlichen Phase auflöst.
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Bevorzugt liegt der aktive Inhaltsstoff
als eine Dispersion von festen Partikeln in einer nicht-wäßrigen Lösung des Polymers vor, die
dann zu der kontinuierlichen Phase zugegeben wird.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
wird weiterhin ein Verfahren zum Herstellen einer Zusammensetzung
bereitgestellt, umfassend blanke polymere Mikropartikel, wobei das
Polymer innerhalb einer kontinuierlichen Phase dispergiert wird,
die resultierende Dispersion gefroren wird und das Wasser und die
organischen Lösungsmittel
von der Dispersion mittels Lyophilisierung entfernt werden.
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Bevorzugt umfaßt das Verfahren weiterhin,
daß aktiver
Inhaltsstoff auf besagte blanke polymere Mikropartikel geladen wird,
indem man besagte blanke polymere Mikropartikel in einer Lösung aus
aktivem Inhaltsstoff suspendiert.
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Vorteilhafterweise wird ein oder
mehrere Bindemittel mit der aktiven Inhaltsstoff-Polymer-Mischung vor dem
Einbau in die Dispersion kombiniert.
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Bequemerweise enthält besagte
kontinuierliche Phase ein oder mehrere Bindemittel.
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Vorteilhafterweise wird ein oder
mehrere Bindemittel mit dem aktiven Inhaltsstoff vermischt und dasselbe
oder ein unterschiedliches Bindemittel ist in der kontinuierlichen
Phase vorhanden.
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Bequemerweise ist besagtes Polymer
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus bioabbaubaren und/oder biokompatiblen
Polymeren.
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Bevorzugt sind besagte bioabbaubare
Polymere ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Polylactid(en), Polyglycolid(en),
Polymilchsäure(n),
Polyglycolsäure(n),
Polyanhydriden, Polyorthoestern, Polyetherestern, Polycaprolacton,
Polyesteramiden, Polycarbonat, Polcyanoacrylat, Polyurethanen, Polyacrylat,
Mischungen und Copolymeren davon.
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Vorteilhafterweise ist besagtes Polymer
Poly(Lactid-Co-Glycolid) (PLGA), und wobei besagtes Polymer in einem
organischen Lösungsmittel
aufgelöst
wird, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Chloroform, Ethylacetat, Dichlormethan,
Acetonitril, THF und Aceton.
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Bevorzugt ist der aktive Inhaltsstoff
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Peptiden, kleinen Molekülen, Zuckern,
Kohlenhydraten, Nucleinsäuren,
Lipiden und Proteinen.
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Vorteilhafterweise ist besagter aktiver
Inhaltsstoff ein Protein, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MGDF, den Interferonen
(alpha, beta, und gamma), Consensus-Interferon, den Interleukinen
(1–12),
Erythropoietin (EPO), Fibroblastenwachstumsfaktor, TNF, TNFbp, IL-1ra,
Stammzellenfaktor, Nervenwachstumsfaktor, GDNF, BDNF, NT3, Blutplättchen-abgeleiteter
Wachstumsfaktor, Tumorwachstumsfaktor (alpha, beta), OPG und Leptin;
oder Derivaten, Analogen, Fusionen, Konjugaten oder chemisch modifizierten
Formen davon.
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Vorteilhafterweise ist besagtes Protein
OB-Protein oder ein Derivat, Analog, Fusion, Konjugat oder chemisch
modifizierte Form davon.
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Vorteihafterweise ist besagte modifizierte
Form von OB-Protein ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Fc-Leptin-Fusion, succinyliertem Leptin
und Zink-derivatisiertem Leptin.
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Bevorzugt ist besagtes Protein G-CSF
oder ein Derivat, Analog, Fusion, Konjugat oder chemisch modifizierte
Form davon.
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Vorteilhafterweise ist besagtes Protein
BDNF oder ein Derivat, Analog, Fusion, Konjugat oder chemisch modifizierte
Form davon.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
wird ebenso eine pharmazeutische Zusammensetzung für die anhaltende
Freisetzung eines aktiven Inhaltsstoffes bereitgestellt, wobei besagte
Zusammensetzung durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhältlich ist.
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Bevorzugt umfaßt der aktive Inhaltsstoff
OB-Protein oder ein Derivat, Analog, Fusion, Konjugat oder chemisch
modifizierte Form davon.
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Vorteilhafterweise umfaßt der aktive
Inhaltsstoff G-CSF oder ein Derivat, Analog, Fusion, Konjugat oder
chemisch modifizierte Form davon.
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Vorteilhafterweise umfaßt der aktive
Inhaltsstoff BDNF oder ein Derivat, Analog, Fusion, Konjugat oder chemisch
modifizierte Form davon.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 ist
eine schematische Darstellung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung
zum Herstellen des aktiven Inhaltsstoffes, enthaltend Mikropartikel.
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2 ist
ein Graph, der die in-vitro-Freisetzung verschiedener Protein-beladener
Mikropartikel dargestellt. Mikropartikel, enthaltend Leptin (eingebaut
in flüssiger
Form), werden mit der „-
-„-Kurve
dargestellt; Mikropartikel, enthaltend Zn : Leptin (eingebaut in
Suspensionsform), werden durch die „-•-„-Kurve dargestellt; und Mikropartikel,
enthaltend Zn : Leptin (eingebaut in Pulverform), werden durch die „-∎"-Kurve dargestellt. Es
wird der prozentuale Anteil an freigesetztem Leptin gegen die Zeit
(Tage) aufgetragen, (wobei die Leptinkonzentration mit einem UV-Spektrophotometer
bei 280 nm bestimmt worden ist).
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3 zeigt
die Cirkular-Dichroismus-Daten (CD), die freigesetztes Leptin von
Leptinbeladenen Mikropartikeln (in vitro) am Tag 7 (durchgezogene
Linie) gegen eine Kontrollprobe von Leptin in einem Formulierungspuffer
(gestrichelte Kurve) vergleichen. Die CD-Spektren wurden mit einem Jasco J-720-Spektrapolarimeter
(Japan Spectroscopic Co., Tokyo, Japan) erhalten. Die Proben (3,5 μM, bestimmt
mittels A280) wurden bei 22°C mit einer
Zellen-Weglänge
von 0,1 cm analysiert.
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4 zeigt
die Hochleistungs-Flüssigchromatographiedaten
(HPLC) für
Leptin, freigesetzt aus Leptin-beladenen Mikropartikeln (in vitro)
zu verschiedenen Zeitpunkten (0 bis 168 Stunden). Analytische Größenausschlußchromatographie
(SEC) wurde mit einer TosoHaas G2000 SW-Säule (Montgomery, PA) durchgeführt unter
Verwendung einer Waters-HPLC (Milford, MA) mit 20 mM Natriumphosphat,
125 mM NaCl, pH 7,4 bei 0,8 ml/min. Extinktion bei 280 nm wird gegen
Laufzeit (Minuten) aufgetragen.
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5 ist
ein Bild eines SDS-PAGE-Gels (2-20% Tris-Glycin-Gel (Novex, San
Diego, CA)), enthaltend die folgenden Proben: Spur 1: Leptin-Standard;
Spur 2: Molekulargewicht-Standards;
Spuren 3–9:
Leptin, freigesetzt aus Leptin-beladenen Mikropartikeln (in vitro)
nach 2 Stunden, 24 Stunden, 68 Stunden, 92 Stunden, 116 Stunden,
140 Stunden bzw. 168 Stunden; Spur 10, Molekulargewicht-Standards.
Die Proben wurden mit nicht-reduzierendem SDS-Puffer verdünnt, bei
100°C für fünf Minuten
erhitzt, und es wurden 1 μg
Protein in jede Vertiefung geladen. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau
R-250 gefärbt.
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6 zeigt
die in-vivo-Bioaktivität
von Leptin-beladenen Mikropartikeln in normalen Mäusen, hinsichtlich
des prozentualen Körpergewichtsverlusts
relativ zu einer Pufferkontrolle für eine siebentägige Periode.
Die Pufferkontrolle (-*-) wird gegen injiziertes Leptin mit 10 mg/kg
täglich
(-•-),
gegen injiziertes Leptin mit 50 mg/kg nur am Tag 0 (-x-), gegen
Leptinbeladene Mikropartikel, die mit 50 mg/kg nur am Tag 0 injiziert
worden waren (-∎-), gegen Kontrollmikropartikel, die nur
am Tag 0 injiziert worden waren (-o-), aufgetragen.
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7 ist
ein Graph, der die in-vitro-Freisetzung von BDNF aus Mikropartikeln
darstellt, auf die BDNF absorbiert worden war. Der prozentuale Anteil
an freigesetztem BDNF (wobei die BDNF-Proteinkonzentration mittels
UV-Spektrophotometer bei 280 nm bestimmt worden ist) wird gegen
Zeit (Tage) aufgetragen.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG
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Polymere können aus der Gruppe ausgewählt werden,
bestehend aus biokompatiblem und/oder bioabbaubarem Polymer. Wie
hierin definiert, bedeutet bioabbaubar, daß sich die Zusammensetzung
zersetzt oder in vivo abbaut, um kleinere chemische Spezies zu bilden.
Ein Abbau kann z. B. über
enzymatische, chemische oder physikalische Prozesse erfolgen. Geeignete
bioabbaubare Polymere, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung
in Erwä gung
gezogen werden, schließen
Polylactid(e), Polyglycolid(e), Polymilchsäure(n), Polyglycolsäure(n),
Polyanhydride, Polyorthoester, Polyetherester, Polycaprolacton,
Polyesteramide, Polycarbonat, Polycyanoacrylat, Polyurethane, Polyacrylat,
Mischungen und Copolymere davon ein.
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Der Bereich an Molekulargewichten,
der für
die bei den für
die vorliegenden Verfahren zu verwendenden Polymere in Erwägung gezogen
wird, kann von einem Fachmann auf der Grundlage von solchen Faktoren,
wie die gewünschte
Polymerabbaurate, bestimmt werden.
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Typischerweise wird der Bereich des
Molekulargewichts von 2000 bis 2 Mio. Daltons betragen. Nahezu jeder
Typ Polymer kann verwendet werden, vorausgesetzt, daß geeignete
Lösungsmittel
und Nicht-Lösungsmittel
gefunden werden.
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Der Begriff „PLGA", wie hierin verwendet, soll sich auf
ein Polymer von Milchsäure
allein, ein Polymer von Glycolsäure
allein, eine Mischung solcher Polymere, ein Copolymer von Glycolsäure und
Milchsäure,
eine Mischung von solchen Copolymeren oder eine Mischung von solchen
Polymeren und Copolymeren beziehen. Bevorzugt wird das bioabbaubare
Polymer Polylactid-co-glycolid (PLGA) sein.
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Sofern nicht anders dargestellt,
kann der Begriff Mikropartikel verwendet werden, um Mikropartikel,
Mikrosphären
und Mikrokapseln zu umfassen. Die in die Mikropartikel einzubauenden
aktiven Mittel sind synthetische oder natürliche Verbindungen, die einen
biologischen Effekt aufweisen, wenn sie in ein Lebewesen eingeführt werden.
In Erwägung
gezogene aktive Mittel schließen
Peptide, kleine Moleküle,
Kohlenhydrate, Nukleinsäuren,
Lipide und Proteine ein. Proteine, die zur Verwendung in Erwägung gezogen
werden, schließen potente
Cytokine, einschließlich
verschiedener hämatopoietischer
Faktoren, wie etwa Granulocyten-Kolonie-stumulierende
Faktoren (siehe US-Patent Nr. 4,810,643, 4,999,291, 5,581,476, 5,582,823
und PCT-Veröffentlichungs-Nr.
94/17185), GM-CSF, M-CSF, MGDF, die Interferone (alpha, beta, gamma,
omega), Consensus-Interferon (siehe US-Patent Nr. 5,372,808, 5,541,293,
4,897,471 und 4,695,623), die Interleukine (1–12) (siehe US-Patent Nr. 5,075,222),
Erythropoietin (EPO) (siehe US-Patent Nr. 4,703,008, 5,441,868,
5,618,698, 5,547,933 und 5,621,080), Fibroblastenwachstumsfaktor,
TNF, TNFbp, IL-1ra, Stammzellenfaktor (PCT-Veröffentlichungs-Nr.
91/05795, 92/17505 und 95/17206), Nervenwachstumsfaktor, GDNF, BDNF,
NT3, Blutblättchen-abgeleiteter
Wachstumsfaktor und Tumorwachstumsfaktor (alpha, beta), Osteoprotegerin
(OPG) und OB-Protein (Leptin) ein.
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Ebenso werden zum Einbau in die Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung Derivate, Fusionsproteine, Konjugate,
Analoge oder modifizierte Formen der natürlichen aktiven Inhaltsstoffe
in Erwägung gezogen.
Es ist gefunden worden, daß eine
chemische Modifizierung von biologisch aktiven Proteinen zusätzliche
Vorteile unter bestimmten Bedingungen bereitstellt, wie etwa eine
Erhöhung
der Stabilität
und Zirkulationszeit des therapeutischen Proteins und eine abnehmende
Immunogenität.
Zum Beispiel offenbart US-Patent Nr. 4,179,337, Davis et al., erteilt
am 18. Dezember 1979, die Konjugation von wasserlöslichen
Polypeptiden, wie etwa Enzymen und Insulin, an Polyethylenglycol
(PEG); siehe auch WO 87/00056, veröffentlicht am 15. Januar 1987.
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Ein anderer Typ chemischer Modifizierung,
der für
die aktiven Inhaltsstoffe der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen
wird, ist Succinylierung. Die Eigenschaften verschiedener succinylierter
Proteine werden in Holcenberg et al., J. Biol. Chem, 250: 4165–4170 (1975)
und WO 88/01511 (und darin zitierten Literaturangaben), veröffentlicht
am 10. März
1988, beschrieben.
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Die vorliegenden verwendeten Leptine
sind bevorzugt diejenigen mit einer Aminosäuresequenz von natürlichem
menschlichem OB-Protein; siehe Zhang et al., Nature 372: 425–432 (1994);
siehe ebenso die Berichtigung in Nature 374: 479 (1995), fakultativ
mit einem N-terminalen
Methionylrest, der bei bakterieller Expression auftritt. (Siehe
Materialien und Methoden, unten). PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 96/05309,
veröffentlicht
am 22. Februar 1996, mit dem Titel „Modulators of Body Weight,
Corresponding Nucleic Acids and Proteins, and Diagnostic and Therapeutic
Uses Thereof" offenbart
OB-Protein und verwandte Zusammensetzungen und Verfahren vollständig. Eine
Aminosäuresequenz
für menschliches
OB-Protein wird in WO 96/05309 SEQ ID NO. 4 und 6 (auf Seiten 172
und 174 dieser Publikation) dargestellt, und der erste Aminosäurerest
des reifen Proteins befindet sich an Position 22 und ist ein Valinrest.
Das reife Protein hat 146 Reste (oder 145, wenn das Glutamin an
Position 49 abwesend ist, SEQ ID NO. 4). Spezifische Leptinderivate,
die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen
werden, schließen
Fc-Leptin-Fusionen, succinyliertes Leptin und Zink-derivatisiertes
Leptin (Zn : Leptin) ein. Es ist wünschenswert, solche Leptin-enthaltenden
Zusammensetzungen mit verzögerter
Freisetzung zu haben, da solche Zusammensetzungen dazu dienen könnten, die Wirksamkeit
von entweder exogen verabreichten oder endogenem Leptin zu verbessern,
oder dazu verwendet werden könnten,
z. B. um den Bedarf für
eine exogene Leptinverabreichung zu reduzieren oder zu eliminiern.
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Im allgemeinen kann eine wäßrige Lösung, eine
Suspension oder eine feste Form des aktiven Mittels dem organischen
Lösungsmittel,
enthaltend das Polymer, beigemischt werden. Wenn eine wäßrige Lösung an aktiven
Inhaltsstoff verwendet wird, werden Polymer : aktive Inhaltsstoff-Emulsionen
gebildet und verwendet, um Mikropartikel herzustellen. Wenn eine
Suspension oder feste Form von aktivem Inhaltsstoff verwendet wird,
werden Polymer : aktive Inhaltsstoff-Suspensionen gebildet und verwendet,
um die Mikropartikel herzustellen.
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Die Hauptausführungsform des Verfahrens zum
Herstellen der Protein-beladenen Mikropartikel umfaßt: (a)
Auflösen
eines Polymers in einem organischen Lösungsmittel, um eine polymere
Lösung
zu erzeugen; (b) Zugeben eines aktiven Inhaltsstoffes in einer Form,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus einer wäßrigen Lösung, einer Suspension und
einem Pulver, zu besagter polymerer Lösung, um eine aktive Inhaltsstoff-Polymer-Mischung
zu erzeugen, umfassend eine erste Emulsion oder Suspension; (c)
Dispergieren besagter erster Emulsion oder Suspension in einer kontinuierlichen
Phase, d. h. Nicht-Lösungsmittel(n),
um eine Dispersion zu erzeugen; (d) Zugeben eines Bindemittels zu
besagter Dispersion, um eine endgültige Dispersion zu erzeugen;
(e) Einfrieren besagter endgültiger
Dispersion; und (f) Lyophilisieren besagter gefrorener endgültiger Dispersion,
um unterschiedliche Lösungsmittel
zu entfernen (wäßrig und
organisch), um die erwünschten
Protein-beladenen Mikropartikel zu erzeugen. Das Verfahren wird
schematisch in 1 gezeigt. Wie
in 1 gezeigt, kann Schritt
(c) alternativ das Verdünnen
besagter erster Emulsion oder Suspension mit einem Polymer-Nicht-Lösungsmittel
umfassen. Zusätzlich
kann Schritt a) umfassen, daß aktiver
Inhaltsstoff direkt in die organische Polymerlösung aufgelöst wird, um eine homogene erste
Mischung zu bilden.
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Das zum Auflösen des PLGA in Schritt a)
der vorliegenden Verfahren zu verwendende Lösungsmittel schließt z. B.
Chloroform, Ethylacetat, Dichlormethan, Acetonitril, THF und Aceton
ein. In einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist das zu verwendende Lösungsmittel
Chloroform. Nicht-Lösungsmittel,
die zur Verwendung in Schritt c) in Erwägung gezogen werden, schließen Wasser,
Hexan, Ethanol, Methanol und Tetrachlorkohlenstoff oder Mischungen
davon (z. B. Wasser/Methanol) ein.
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Die zur Verwendung bei den Verfahren
der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogenen Polymerkonzentrationen
liegen im Bereich von 5–70
gm/100 ml. Bei den Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung, die PLGA verwenden, wird die Polymerkonzentration
bevorzugt im Bereich von 10–20
gm/100 ml liegen.
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Die zur Verwendung bei den Verfahren
der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogenen Proteinkonzentrationen
liegen im Bereich von 0–300
mg/ml, in Lösung
oder Suspension oder in äquivalentem
festen Protein. Bei den Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung, die Leptin verwenden, beträgt die Proteinkonzentration
bevorzugt 100 mg/ml.
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Für
die bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugten Emulsionen
sind die zur Verwendung in Erwägung
gezogenen organisch : wäßrig-Verhältnisse
1 : 1 bis 12 : 1. Bei den Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung, die PLGA und Leptin verwenden, wird
das Verhältnis
organisch : wäßrig bevorzugt
4 : 1 für
die erste Emulsion betragen. Im allgemeinen werden die durch die
Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Mikropartikel
im allgemeinen 0–60
Gew.-% Protein umfassen.
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Die Zugabe eines Lyophilisierungsbindemittels
in Schritt d) des oben beschriebene Verfahrens wurde dahingehend
nützlich
befunden, daß sie
sicherstellt, daß die
Mikropartikel während
der Lyophilisierung nicht aggregierten oder miteinander verschmolzen.
Ein oder mehrere Bindemittel können
zugegeben werden. Wichtig, ein solches Bindemittel (solche Bindemittel)
könnte(n)
ebenso in Schritt b) oder c) des Verfahrens zugegeben werden. Das
Lyophilisierungsbindemittel (die Lyophilisierungsbindemittel), das
(die) zur Verwendung bei dem vorliegenden Verfahren in Erwägung gezogen
wird (werden), schließt
(schließen)
Lactose, Mannitol, Dextran, Saccharose, Heparin, Glycin, Glucose,
Glutaminsäure,
Gelatine, Sorbitol, Dextrose, Trehalose, Methocel, Hydroxyethylcellulose,
Hydroxyethylstärke,
Polyethylenglycol, Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol oder verschiedene
Kombinationen davon sowie andere Puffer, Proteinstabilisatoren,
Cryoschutzmittel und Cryokonservierungsmittel ein, die von Fachleuten
auf diesem Gebiet üblicherweise
verwendet werden.
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Die zur Verwendung bei dem Gefrierschritt
(Schritt e) der vorliegenden Verfahren in Erwägung gezogenen Temperaturen
liegen im Bereich von –283°C (flüssiger Stickstoff)
bis –20°C. Diese
Temperaturen werden verwendet, um die Emulsion oder Suspensionen
zu stabilisieren.
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Die endgültige Emulsion oder Suspension
kann unmittelbar unter Verwendung der oben beschriebenen Temperaturen
eingefroren werden oder kann bei Zimmertemperatur vor dem Einfrieren
gelagert werden. In einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wurde die endgültige Emulsion unmittelbar
eingefroren, und die zum Einfrieren verwendete Temperatur betrug –80°C.
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Die zur Verwendung in Schritt f)
der vorliegenden Verfahren in Erwägung gezogenen Temperaturen liegen
im Bereich von –100°C bis Zimmertemperatur.
Bevorzugt wird die Temperatur der gefrorenen Probe aus Schritt e)
auf –80°C gesenkt
und für
eine Stunde vor dem Verbinden mit dem Vakuumsystem gehalten. Die Temperatur
wird dann schrittweise in 5°C/Stunde-Inkrementen
auf –25°C erhöht, um ein
Entfernen der wäßrigen Phase
und jeglicher verbleibender organischer Phase zu bewirken. Die Probe
wird dann unter Vakuum für 4– 5 Tage
gehalten (oder wann immer der Vakuummesser anzeigt, daß kein Dampf
mehr entfernt wird), und dann wird die Temperatur auf –5°C für 6–8 Stunden
erhöht,
bevor die Probe von dem Vakuumsystem entfernt wird. Es ist das Verwenden
dieses einzelnen Schritts, d. h. der direkten Lyophilisierung der
endgültigen
Emulsion oder Suspension, welcher das vorliegende Verfahren gegenüber zuvor
beschriebenen Verfahren, die vielfache Schritte benötigen und
oft aufwendig sind, verfeinert und vereinfacht. Und, wichtig, diese
direkte Lyophilisierung sorgt für
die verbesserte Stabilität
für eine
große
Vielzahl von aktivem Inhaltsstoff in vivo, ebenso wie für das Erreichen
einer höheren
Beladung, höherer
Beladungseffizienzen und höherer
Ausbeuten. Daher schließen
die signifikanten Vorteile der vorliegenden Verfahren im Vergleich
mit den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren z. B. ein :
1) Leichtigkeit der Herstellung der mit aktivem Inhaltsstoff beladenen
Mikropartikel, 2) Vielseitigkeit im Hinblick auf die Klasse an Polymeren
und/oder aktiven Inhaltsstoffen, die verwendet werden können, 3)
höhere
Ausbeuten und Beladungseffizienzen, und 4) die Bereitstellung von
Formulierungen mit verzögerter
Freisetzung, die aktiven, intakten aktiven Inhaltsstoff in vivo
freisetzen, wodurch für
eine kontrollierte Freisetzung von aktivem Inhaltsstoff über eine
ausgedehnte Zeitperiode (z. B. bis zu 180 Tagen) gesorgt wird. Wie
hierin verwendet, bezeichnet die Wendung „enthalten innerhalb von" ein Verfahren zum
Formulieren eines aktiven Inhaltsstoffes in einer Zusammensetzung,
die für
eine kontrollierte Freisetzung dieses aktiven Inhaltsstoffes, über eine
ausgedehnte Zeitperiode nützlich
ist.
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Bei den Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung mit verzögerter
Freisetzung wird eine wirksame Menge an aktivem Inhaltsstoff verwendet
werden. Wie hierin verwendet, be zieht sich verzögerte Freisetzung auf die allmähliche Freisetzung
an aktivem Inhaltsstoff aus der Polymermatrix über eine ausgedehnte Zeitperiode.
Die verzögerte
Freisetzung kann kontinuierlich oder diskontinuierlich, linear oder
nicht-linear sein, und dies kann unter Verwendung von einer oder
mehreren Polymerzusammensetzungen, Arzneibeladungen, Auswahl an
Bindemitteln oder anderen Modifizierungen erreicht werden.
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Im allgemeinen werden von der vorliegenden
Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen eingeschlossen, die
wirksame Mengen an Protein oder Derivatprodukten der Erfindung zusammen
mit pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln, Stabilisatoren,
Konservierungsmitteln, Löslichkeitsvermittlern, Emulgatoren,
Adjuvantien und/oder Trägern
umfassen. Solche Zusammensetzungen schließen Verdünnungsmittel mit unterschiedlichem
Puffergehalt (z. B. Tris-HCl, Phosphat), pH und Ionenstärke; Zusatzstoffe,
wie Detergentien und Löslichkeitsverbessernde
Mittel (z. B. Tween 80, Polysorbat 80), Antioxidantien (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit),
Konservierungsmittel (z. B. Thimersol, Benzylalkohol) und Füllsubstanzen
(z. B. Lactose, Mannitol) ein; siehe z. B. Remington's Pharmaceutical
Sciences, 18. Aufl. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042),
Seiten 1435–1712.
Eine wirksame Menge an aktiven Inhaltsstoff ist eine therapeutisch,
prophylaktisch oder diagnostisch wirksame Menge, die in leichter
Weise von einem Fachmann bestimmt werden kann, indem er Faktoren,
wie Körpergewicht,
Alter, therapeutisches oder prophylaktisches oder diagnostisches
Ziel und die erwünschte
Freisetzungsrate berücksichtigt.
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Eine Suspension von Protein-beladenen
Mikropartikeln, die in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung hergestellt worden ist, wird bevorzugt
mittels intraperitonealer, subkutaner oder intramuskulärer Injektion
verabreicht. Jedoch wäre
es für
einen Fachmann klar, daß andere
Verabreichungsrouten ebenso in effektiver Weise unter Verwendung
der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnten.
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Die folgenden Beispiele werden dargeboten,
um die Erfindung vollständiger
zu veranschaulichen. Beispiel 1 beschreibt das neue Verfahren zum
Herstellen von Protein-beladenen Mikropartikeln. Leptin (in der Form
einer wäßrigen Lösung) wird
als ein Beispielprotein verwendet, und die Fähigkeit von Leptin-beladenen Mikropartikeln,
eine verzögerte
Freisetzung von Leptin bereitzustellen sowohl in vitro als auch
in vivo, wird demonstriert. Beispiel 2 demonstriert, daß unterschiedliche
Polymere verwendet werden können,
um Leptin-beladene Mikropartikel herzustellen. Beispiel 3 zeigt,
daß unterschiedliche
Leptinderivate, ebenso wie voll ständig unterschiedliche Proteine
(alle in der Form einer wäßrigen Lösung) bei
den neuen Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden
können.
Beispiel 4 zeigt die Effekte der Temperatur auf den Gefrierschritt
und auf den Lyophilisierungsschritt des Verfahrens der vorliegenden
Erfindung. Beispiel 5 zeigt, daß unterschiedliche organische
Lösungsmittel
verwendet werden können,
um die PLGA-Polymere bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung
aufzulösen.
Beispiel 6 zeigt, daß eine
Zn : Leptin-Suspension und Zn : Leptinlyophilisiertes Pulver bei
den neuen Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden
können.
Beispiel 7 zeigt, daß ein sprühgetrocknetes
Protein, sprühgetrocknetes
IL-1ra, bei den neuen Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet
werden können.
Beispiel 8 zeigt, daß „blanke" Mikropartikel, auf
die aktiver Inhaltsstoff (z. B. BDNF) absorbiert worden ist, ebenso
für eine
anhaltende Freisetzung von aktiven Inhaltsstoff in vitro sorgen
können. Materialien
und Methoden folgen.
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BEISPIEL 1
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Dieses Beispiel beschreibt die neuen
Verfahren zum Herstellen von Protein-beladenen Mikropartikeln, insbesondere
die Herstellung von Poly(D,L-lactid-co-glycolid)-Mikrosphären, enthaltend
Leptin.
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0,6 g RG-502H, Poly(D,L-lactid-co-glycolid)
(Boehringer Ingelheim Chemicals (B.I. Chemicals), Henley Div., Montvale,
NJ) wurde in 4 ml Chloroform aufgelöst und durch einen 0,2 μm PTFE-Filter
gefiltert. 1 ml Leptin bei 100 mg/ml in 10 mM Natriumacetat, pH
4,8 (hergestellt, wie in Materialien und Methoden, unten, beschrieben),
wurde zuerst steril gefiltert und dann vorsichtig oben zu der Polymerlösung zugegeben.
Die beiden Schichten wurden unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators
(PT-DA3012/2T-Generator, Brinkman, Westbury, NY) bei 15.000 bis
20.000 upm für
30–45
Sekunden homogenisiert, während
der Emulsionsbehälter
in ein Eisbad eingetaucht war.
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Die resultierende erste Emulsion
(w/o) wurde zu 10 ml Wasser zugegeben, während bei 15.000 upm für 20–30 s homogenisiert
wurde. Zu der resultierenden zweiten Emulsion (w/o/w) wurden 1 ml
Lyophilisierungs-Bindemittel (100 mg/ml Glycin, 100 mg/ml Saccharose,
10 mg/ml Polyvinylalkohol (PVA) [22.000 M. W., 88% hydrolysiert],
10% v/v Ethanol) zugegeben und kurz homogenisiert, um ein vollständiges Mischen
sicherzustellen. Die end gültige
Emulsion zeigte unter dem optischen Mikroskop frei fließende 1–10 μm-Sphären. Die endgültige Emulsion
wurde in einen Kolben gegossen und bei –45°C gefroren.
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Die Temperatur des Bades wurde dann
in einer Stunde auf –80°C reduziert.
Nach einer Stunde bei –80°C wurde der
Kolben mit einem Vakuumsystem verbunden, und eine Lyophilisierung
wurde zuerst bei –80°C durchgeführt. Das
Niveau des Vakuums wurde überwacht,
so daß das
Entfernen von organischem Lösungsmittel
aufgrund eines Vakuumabfalls auf das Niveau des System bestimmt
werden konnte. Die Temperatur wurde dann schrittweise in 5°C/Stunde-Inkrementen
auf –25°C erhöht, um das
Entfernen der wäßrigen Phase
und jeglicher verbleibender organischen Phase zu bewirken.
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Nach 4–5 Tagen, wenn der Vakuummesser
anzeigte, daß keine
weitere Dampfentfernung stattfand, wurde die Temperatur des Wasserbades
auf –5°C für 6–8 Stunden
erhöht,
bevor die Proben aus dem Vakuumsystem genommen wurden. Die Mikropartikel
wurden gewogen und dann bei –20°C bis zum
Gebrauch gelagert.
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Das oben beschriebene Verfahren wurde
ebenso mit den folgenden Modifizierungen getestet: 1) die erste
Emulsion (w/o) oder Suspension (s/o) wurde zu 20 ml Wasser/Ethanol
(75%/25%) zugegeben, während bei
5.000 upm für
30 Sekunden homogenisiert wurde; 2) 10– 40 ml von entweder Wasser
oder kaltem Ethanol wurde langsam zu der zweiten Emulsion ((w/o/w)
oder (s/o/w)) zugegeben und dann wurde die endgültige Emulsion bei Zimmertemperatur
für bis
zu 3 Stunden vor dem Einfrieren inkubiert; und 3) die endgültige Emulsion
wurde durch Inkubieren bei Zimmertemperatur für unterschiedliche Zeitintervalle
(0–4 Stunden)
vor dem Einfrieren gehärtet.
In jedem Falle wurden Leptin-beladene Mikropartikel erhalten.
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In-vitro-Freisetzung
von Leptin aus PLGA-Mikropartikeln
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„In-vitro"-Freisetzungskinetiken von Leptin aus
den wie oben beschrieben hergestellten Mikropartikeln wurden bestimmt,
indem man eine 20 mg/ml-Suspension der Partikel in 20 mM Natriumphosphat,
5% Sorbitol, pH 7,4 (alternativ könnten 20 mM Histidin anstelle
von Phosphat verwendet werden) herstellte. Zu jedem Zeitintervall
wurde die Mikrosphärensuspension
zentrifugiert, und die Leptinkonzentration in dem Überstand
wurde mittels UV-Spektrophotometer
bei 280 nm ebenso wie mittels SEC-HPLC bei 220 nm bestimmt. Der prozentuale
Anteil von mit der Zeit freigesetztem Leptin wird in 2 dargestellt. Die Unversehrtheit
des aus den PLGA-Mikropartikeln freigesetzten Leptins wurde mittels
Circulardichroismus (CD) (3),
HPLC (4), in-vitro-Bioassay
und Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
(5) bestätigt. Die
CD-Daten zeigten eine Beibehaltung der Sekundärstruktur, und HPLC und Gelelektrophorese
zeigten keinen offensichtlichen chemischen Abbau oder Aggregation.
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In-vivo-Bioaktivität von Leptin-beladenen
Mikropartikeln
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„In-vivo"-Bioaktivität von Leptin-beladenen Mikropartikeln
wurde in normalen Mäusen
und Ratten durch Suspendierung von 80–100 mg/ml Mikropartikeln in
20 mM Natriumphosphat, 5% Sorbitol, pH 7,4, -Puffer bewertet. Die
Suspensionen wurden eine Stunde vor subkutaner Injektiott hergestellt,
indem man die Mikropartikel und Puffer auf einen Schüttler in
eine 5°C-Kühlkammer brachte. Alle darauffolgenden
Handhabungsschritte unmittelbar vor der Injektion wurden mit gekühlten Spritzen
und 25-Gauge-Nadeln durchgeführt. Der
prozentuale Körpergewichtsverlust
relativ zu der Pufferkontrolle wurde für eine siebentägige Periode
bestimmt. Nach Tag 7 wurden die Tiere für eine histologische Untersuchung
der Injektionsstelle geopfert. Eine einzelne Injektion von Leptin-beladenen
Mikropartikeln führte
zu einem anhaltenden Gewichtsverlust bei den Mäusen für eine siebentägige Periode
(6). Eine histologische
Untersuchung der Injektionsstelle zeigte eine lokalisierte minimale
bis milde entzündliche
Reaktion, die mit dem Bioabbau der Mikropartikel über die Zeit
vollständig
reversibel war.
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BEISPIEL 2
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Dieses Beispiel war darauf ausgerichtet,
um die Wirksamkeit unterschiedlicher Molekulargewichte von PLGA
oder Mischungen bei der Herstellung von Leptin-beladenen Mikropartikeln
zu testen. Die Herstellungs- und Bewertungsprozeduren, die in Beispiel
1 beschrieben sind, wurden verwendet, um die verschiedenen Polymere,
die in Tabelle 2 unten aufgelistet sind, zu testen.
Tabelle
2
| Polymere: | Ursprung: |
| RG-501H | B.I.
Chemicals |
| RG-502H | B.I.
Chemicals |
| RG-502 | B.I.
Chemicals |
| RG-503H | B.I.
Chemicals |
| (RG-501H)
: (RG-502H)-Mischungen | B.I.
Chemicals |
| (RG-501H)
: (PEG/PLGA) | B.I.
Chemicals |
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Unter Verwendung von jedem der in
Tabelle 2 aufgelisteten Polymere konnten Proteinbeladene Mikropartikel
in wirksamer Weise hergestellt werden.
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BEISPIEL 3
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Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung
von Mikropartikeln, enthaltend Leptinderivate ebenso wie andere
Proteine. Die in Beispiel 1 beschriebenen Herstellungs- und Bewertungsprozeduren
wurden verwendet, um die in Tabelle 3 unten aufgelisteten, verschiedenen
Proteine zu testen.
-
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Mit jedem der oben aufgelisteten
Proteine wurden Protein-beladene Mikropartikel erhalten, was die Flexibilität des neuen
Verfahrens der vorliegenden Erfindung demonstriert. Und, wichtig,
es wird gezeigt, daß Protein-beladene
Mikropartikel ebenso in wirksamer Weise hergestellt werden unter
Verwendung unterschiedlicher Leptinderivate.
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BEISPIEL 4
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In diesem Beispiel wurden die Effekte
von Temperatur auf den Gefrierschritt und den Lyophilisierungsschritt
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung bewertet. Im Hinblick
auf den Gefrierschritt (Schritt 5), flüssiger Stickstoff, wurden –80°C und –45°C getestet.
Im Hinblick auf den Lyophilisierungsschritt (Schritt 6), wurden –80°C, –45°C und –25°C getestet.
Die in Beispiel 1 beschriebene Prozedur wurde verwendet, um die
verschiedenen Temperaturen zu testen, und es wurde bestimmt, daß die getesteten
Temperaturen einen sehr geringen Effekt auf jeden der Schritte in
dem Verfahren hatten.
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BEISPIEL 5
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In diesem Beispiel wurden unterschiedliche
organische Lösungsmittel
getestet, um die PLGA-Polymere bei den Verfahren der vorliegenden
Erfindung aufzulösen.
Die in Beispiel 1 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung von
Ethylacetat, Dichlormethan wiederholt. Jedes der getesteten organischen
Lösungsmittel
wurde als effektiv bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung
gefunden.
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BEISPIEL 6
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Dieses Beispiel testete die Fähigkeit
einer aktiven Inhaltsstoffsuspension und/oder lyophilisierten Pulvers,
bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden.
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Eine 100 mg/ml in 10 mM Tris, 50 μM Zinkchlorid,
pH 7,0, Zn/OB-Proteinsuspension (hergestellt, wie in dem Abschnitt
Materialien und Methoden, unten, beschrieben) wurde getestet und
wie in Beispiel 1 beschrieben bewertet. Ebenso getestet und bewertet
wurden ein 100 mg Zn : Leptin-lyophilisiertes Pulver (hergestellt, wie
in dem Abschnitt Materialien und Methoden, unten, beschrieben).
Es wurde gezeigt, daß die
eingebaute Zn : Leptin-Suspension und Zn : Leptin-Pulver in effektiver
Weise verwendet werden konnte, um Mikropartikel gemäß den neuen
Verfahren der vorliegenden Erfindung herzustellen (siehe 2 für in-vitro-Freisetzungsdaten).
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BEISPIEL 7
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Dieses Beispiel testete die Fähigkeit
eines sprühgetrockneten
Proteins, sprühgetrocknetes
L-1ra, bei den Verfahren
der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden. Ein 150 mg sprühgetrocknetes
IL-1ra-Pulver (hergestellt, wie in dem Abschnitt Materialien und
Methoden, unten, beschrieben), wurde getestet und wie in Beispiel
1 beschrieben bewertet. Es wurde gezeigt, daß die sprühgetrocknete IL-1ra-Zubereitung
in effektiver Weise verwendet werden konnte, um Mikropartikel gemäß den neuen
Verfahren der vorliegenden Erfindung herzustellen.
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BEISPIEL 8
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In diesem Beispiel wurde das in Beispiel
1 beschriebene Verfahren modifiziert, so daß 20 mM NaAcO, pH 4,8, anfänglich mit
dem Polymer gemischt wurde, was zur Herstellung von „blanken" Mikropartikeln führte. 6
mg blanke Mikropartikel wurden dann mit 1 ml BDNF (4,4 mg/ml in
0,1 M Natriumphosphat, pH 6,9) verdünnt, und die Mischung bei 37°C unter Schütteln inkubiert.
Nach 2 Stunden wurden die Mikropartikel mittels Zentrifugation isoliert,
und die nicht-gebundene Proteinfraktion wurde mittels UV-Spektrophotometer
bestimmt. 1,76 mg BDNF wurde an das Polymer gebunden, um 22% Proteinbeladung
auf den Mikropartikeln zu ergeben. Es wurden dann in-vitro-Freisetzungskinetiken
bestimmt, wie in Bei spiel 1 beschrieben. Der prozentuale Anteil
an mit der Zeit freigesetztem BDNF wird in 7 gezeigt.
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Materialien und Methoden
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1. Herstellung von rekombinantem,
menschlichen Methionylleptin
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Das vorliegende rekombinante menschliche
Methionylleptin kann gemäß der oben
durch Bezugnahme einbezogenen PCT-Veröffentlichung WO 96/05309, auf
den Seiten 151–159,
hergestellt werden. Für
die vorliegenden Arbeitsbeispiele wurde ein menschliches Leptin
verwendet, das (im Vergleich zu der Aminosäuresequenz auf Seite 158) ein
Lysin an Position 35 anstelle eines Arginin und ein Isoleucin an
Position 74 anstelle eines Isoleucins enthält. Andere rekombinante menschliche
Leptine können
gemäß den Verfahren,
die allgemein auf dem Gebiet der Proteinexpression unter Verwendung
von rekombinanter DNA-Technologie bekannt sind, hergestellt werden.
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2. Herstellung von rekombinantem,
menschlichen succinylierten Methionylleptin
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Das vorliegende rekombinante menschliche
succinylierte Methionylleptin wurde durch Reaktion von rekombinantem
menschlichem Leptin in ~150 mg/ml in Natriumphosphatpuffer bei pH
7,0 mit einem 3-7-molaren Überschuß von Bernsteinsäureanhydrid
bei 4°C
für zwei
Stunden hergestellt. Die Reaktion wird durch Zugabe von festem Hydroxylamin
auf eine Endkonzentration von 0,5 M und pH 8,5 gequencht. Die Reaktionsmischung
wird dann gegen 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0, dialysiert, und die
mono-succinylierte Leptinform von den di- und poly- succinylierten Leptinformen
mittels Ionenaustauschchromatographie getrennt.
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3. Herstellung von einer
Suspension von rekombinantem meschlichem Zink-derivatisiertem Methionylleptin
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Die vorliegende Suspension von rekombinantem
menschlichem Zink-derivatisiertem Methionylleptin wurde hergestellt
durch Aufnehmen einer 752 μl-Probe
von rekombinantem menschlichen Leptin in 133 mg/ml in 1 mM HCl und
Zugeben von 48 μl
Wasser, gefolgt von 100 μl
500 μM Zinkchlorid,
gefolgt von 100 μl
1 M TRIS, pH 8,5. Es gibt einen sofortigen Zn : Leptin-Niederschlag,
der bei Zimmertemperatur rasch aus der Lösung ausfällt, der aber in leichter Weise
resuspendiert werden kann.
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4. Hestellung von rekombinantem
menschlichem Zink-derivatisiertem Methionylleptin – lyophilisiertem
Pulver
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Lyophilisierung des vorliegenden
lyophilisierten Pulvers von rekombinantem menschlichem Zink-derivatisiertem
Methionylleptin wurde in einem Virtis-Lyophilisator für den Tischgebrauch
("Virtis shelf lyophilizer") durchgeführt. Kurz
gesagt, wurde eine Zn : Leptin-Suspension
auf der Laborbank bei –50°C eingefroren
und für
2 Stunden gehalten. Die Proben wurden bei –25°C für 2 Stunden getempert und dann
wieder auf –50°C gefroren.
Der Kammerdruck wurde auf 100 mTorr gesenkt, während eine Kühlregalremperatur
("shelf temperature") von –50°C für 2 Stunden
beibehalten wurde. Die Haupttrocknung wurde durchgeführt, indem
die Kühlregaltemperatur
auf –25°C erhöht und für 10 Stunden
gehalten wurde, während
der Kammerdruck auf 100 mTorr gehalten wurde. Ein sekundäres Trocknen
wurden durchgeführt,
indem die Regaltemperatur auf 25°C über 7 Stunden
hochgefahren und für
10 Stunden gehalten wurde, während
der Kammerdruck auf 100 mTorr gehalten wurde. Der Zyklus wurde am
Ende des sekundären
Trocknens beendet, die Kammer wurde auf Atmosphärendruck gelüftet und
das lyphilisierte Produkt von dem Lyophilisator entfernt.
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5. Herstellung von rekombinantem
sprühgetrocknetem
IL-1ra
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Das vorliegende rekombinante sprühgetrocknete
IL-1ra-Protein wurde hergestellt durch Sprühtrocknung einer 20 mg/mL IL-1ra-Lösung unter
Verwendung eines Buchi 190-Mini-Sprühtrockners.
Die Eingangs- und Ausgangstemperaturen während des Sprühtrocknens
waren 130°C
bzw. 90°C.
Die Zuführrate
betrug 1–2 ml/min,
und ein sprühgetrocknetes
IL-1ra-Pulver wurde
erhalten.
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Während
die vorliegende Erfindung hinsichtlich bestimmter bevorzugter Ausführungsformen
beschrieben worden ist, ist klar, daß Variationen und Modifizierungen
Fachleuten auf dem Gebiet einfallen werden.
