DE69828252T2

DE69828252T2 - Zusammensetzung mit verzögerter freisetzung, wobei medikamente in mikropartikel aus hyaluronsäure eingekapselt sind

Info

Publication number: DE69828252T2
Application number: DE69828252T
Authority: DE
Inventors: Myung Jin Yuseong-gu KIM; Sun Jin Kim; Oh Ryong Yuseong-gu KWON
Original assignee: LG Life Sciences Ltd
Current assignee: LG Chem Ltd
Priority date: 1997-04-01
Filing date: 1998-03-26
Publication date: 2005-11-10
Anticipated expiration: 2018-03-27
Also published as: BR9804802B1; NZ333019A; TR199802500T1; AU6524198A; BG102969A; BR9804802A; AU721929B2; PT918535E; MY132812A; PL195223B1; JP3445283B2; ZA982533B; ATE285245T1; HK1020885A1; US20130230598A1; CN1132625C; ES2232939T3; BG64642B1; KR19980075759A; CA2256596C

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung, bei der ein Protein- oder Peptid-Medikament in festen Mikropartikeln aus Hyaluronsäure oder deren Salzen eingekapselt ist; und eine Injektionsformulierung, die dieselbe enthält.
Hintergrund der Erfindung
Protein- oder Peptid-Medikamente werden üblicherweise wegen ihrer schleppenden Absorption über orale Verabreichung durch Injektion verabreicht. Nach Injektion halten ihre in-vivo-Aktivitäten nur einen kurzen Zeitraum an und aus diesem Grunde müssen wiederholte Injektionen verabreicht werden, wenn eine Langzeitbehandlung erforderlich ist. Die Behandlung von Kindern, die an Hypophysenwachstumshormonmangel leiden, wird zum Beispiel durch tägliche Injektionen von rekombinantem menschlichen Wachstumshormon über einen Zeitraum von mehr als 6 Monaten durchgeführt. Demgemäß ist eine Formulierung mit verzögerter Freisetzung, die keine lästigen täglichen Verabreichungen erfordert, bei solchen Anwendungen hoch wünschenswert.
Eine typische Formulierung mit verzögerter Freisetzung eines Protein- oder Peptid-Medikaments, z. B. menschlichen Wachstumshormons, wird hergestellt durch Einkaspeln des Medikaments in Mikropartikeln aus einem biologisch abbaubaren polymeren Matrixmaterial, das das Medikament langsam freisetzt, wenn das Matrixmaterial in-vivo abgebaut wird. Auf dieser Linie sind umfangreiche Studien durchgeführt worden, um biologische abbaubare Polymere zu entwickeln, die zur Verwendung in Medikamentenformulierungen mit verzögerter Freisetzung geeignet sind, und biologisch abbaubare Polyester, wie Polylactid, Polyglykolid, Poly(lactid-co-glykolid), Polyorthoester und Polyanhydrid, haben sich in einer solchen Verwendung als wirkungsvoll erwiesen [M. Chasin und R. Langer, et al., Biodegradable Polymers as Drug Delivery System, Mercel Dekker (1990) und J. Heller, Adv. Drug Del. Rev., 10, 163 (1993)].
Weitere Studien sind auch durchgeführt worden, um eine Medikamentenformulierung mit verzögerter Freisetzung zu entwickeln, die natürliche polymere Materialien verwendet, wie etwa Gelatine, Collagen, Chitosan, Carboxymethylcellulose, Alginat und Hyaluronsäure. Ein natürliches Polymer bildet im allgemeinen ein Gel, wenn es in eine wässrige Umgebung gegeben wird, und dieser Typ von hochviskoser Gelmatrix, durch die hindurch das Medikament sehr langsam diffundiert, ist bei der Formulierung von Medikamentenzusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung verwendet worden.
U.S.-Patent Nr. 5,416,071 offenbart zum Beispiel eine Injektionsformulierung mit verzögerter Freisetzung von Erythropoietin, die ein Gel einsetzt, das 0,01% bis 3% Hyaluronsäure enthält; die japanische Patentveröffentlichung Nr. 1-287041 (1989) beschreibt eine Injektionsformulierung mit verzögerter Freisetzung von Insulin, die ein Gel einsetzt, das aus 1% Hyaluronsäure gebildet ist; und die japanische Patentveröffentlichung Nr. 2-00213 (1990) berichtet über eine Formulierung mit verzögerter Freisetzung von Calcitonin, Elcanonin oder menschlichem Wachstumshormon, die ein Gel einsetzt, das 5% Hyaluronsäure enthält. In ähnlicher Weise haben Meyer et al. eine Formulierung mit verzögerter Freisetzung von Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktor entwickelt, die ein Gel einsetzt, das 0,5 bis 4% Hyaluronsäure enthält [James Meyer, et al., J. Controlled Release, 35, 67 (1995)].
Die Verabreichung solcher Formulierungen durch Injektion erfordert jedoch die Verwendung einer Spritzennadel mit großer Bohrung, weil ein Gel, das einige % Hylaluronsäure enthält, eine hohe Viskosität in der Größenordnung von 10⁷ Centipoise besitzt. Überdies wird, da das injizierte Gel durch Körperflüssigkeit verdünnt wird, seine Medikamentenrückhaltefähigkeit schnell herabgesetzt, und als ein Ergebnis hält die Verzögerung der Medikamentenfreisetzung nicht mehr als 1 Tag an. Zum Beispiel offenbart die japanische Patentveröffentlichung Nr. 1-287041 (1989), daß, wenn eine Injektionsformulierung mit verzögerter Freisetzung von Insulin, die 1% Hyaluronsäure enthält, Kaninchen verabreicht wurde, die therapeutische Wirkung der Unterdrückung des Blutzuckerspiegels nicht mehr als 24 Stunden anhielt. Auch wurde berichtet, daß die Medikamentenkonzentration in Blut in weniger als 24 Stunden auf weniger als 1/10 der anfänglichen Konzentration abnahm, wenn Testtieren eine Formulierung mit 2% Hyaluronsäure, die Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktor enthielt [James Meyer, et al., J. Controlled Release, 35, 67 (1995)], oder eine Formulierung mit 1,5% Hyaluronsäure, die Interferon-α und Plasmaprotein enthielt (U.S. Patent Nr. 5416071), injiziert wurde. Demgemäß hat eine Medikamentenformulierung mit verzögerter Freisetzung auf das Basis von Hyaluronsäure den schwerwiegenden Nachteil, daß die Medikamentenfreisetzung nicht für mehr als 24 Stunden aufrechterhalten werden kann.
Natürliche Hyaluronsäure oder ein anorganisches Salz derselben löst sich nur in Wasser. Hyaluronsäurebenzylester HYAFF^® löst sich andererseits nicht in Wasser, sondern in einem organischen Lösungsmittel, z. B. Dimethysulfoxid. Medikamentenzusammensetzungen, die feste Mikropartikel aus solchen hydrophoben Hyaluronsäure-Derivaten und darin eingeschlossene Medikamente umfassen, sind mit dem herkömmlichen Emulsions-Lösungsmittelextraktions-Verfahren hergestellt worden [N.S. Nightlinger, et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 22nd, Paper No. 3205 (1995), L. Ilum, et al., J. Controlled Rel., 29, 133 (1994)]. Solche Herstellung wird typischerweise wie folgt durchgeführt: Ein Protein-Medikament wird in einer Dimethylsulfoxid-Lösung von Hyaluronsäurebenzylester dispergiert und die so erhaltene Dispersion wird zu Mineralöl zugegeben, um eine Emulsion zu bilden. Ein organisches Lösungsmittel, z. B. Ethylacetat, wird zur Emulsion zugegeben, um Dimethylsulfoxid zu extrahieren; und Mikropartikel, die aus dem Medikament und Hyaluronsäurebenzylester bestehen, werden daraus gewonnen.
Dieses Verfahren hat jedoch das Problem, daß das Protein-Medikament durch seinen Kontakt mit dem organischen Lösungsmittel oder mit dem hydrophoben Hyaluronsäurebenzylester dinaturiert werden könnte. Tatsächlich wurde berichtet, daß eine mikropartikuläre Zusammensetzung von Granulocytenmakrophagenkolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF), die hergestellt war durch Verwendung eines vollständig veresterten Hyaluronsäure-Derivats, nur etwa 25% GM-CSF während der ersten paar Tage und keinen nach 17 Tagen freisetzte [N.S. Nightlinger, et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 22nd, Paper No. 3205 (1995)]. In diesem Fall war ein Großteil des Protein-Medikaments verloren, höchstwahrscheinlich aufgrund von Denaturierung desselben durch seine Wechselwirkung mit Hyaluronsäurebenzylester und/oder dem organischen Lösungsmittel.
Zusammenfassung der Erfindung
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung eines Protein- oder Peptid-Medikaments zur Verfügung zu stellen, insbesondere eines Medikaments, das eine Denaturierung durchläuft, wenn es mit einem organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht wird. Es ist eine weitere Aufgabe, eine Injektionsformulierung und eine Aerosolformulierung zur Verfügung zu stellen, die eine Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung gemäß der Erfindung umfassen.
Die erste Aufgabe wird gelöst durch eine Medikamentenzusammensetzung mit verzögerter Freisetzung, die im wesentlichen aus Mikropartikeln aus Hyaluronsäure oder einem anorganischen Salz derselben; und einem Protein- oder Peptid-Medikament und einem Stabilisator, und eingeschlossen in besagten Mikropartikeln, besteht, wobei besagte Mikropartikel eine durchschnittliche Größe in einem Bereich von 0,1 bis 40 Mikrometern besitzen und der Stabilisator ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einem Polysaccharid, Protein, Aminosäure, anorganischen Salz, Tensid und einer Mischung derselben besteht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die obigen und weitere Aufgaben und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der Erfindung deutlich werden, zusammengenommen mit den folgenden beigefügten Zeichnungen, in denen:
1 die zeitabhängigen Veränderungen der freigesetzten Menge von menschlichem Wachstumshormon (hGH) in vitro zeigt;
2A und 2B die Stabilität der Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung der vorliegenden Erfindung, die hGH enthält, durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie belegt (A: hGH, freigesetzt aus der Formulierung der vorliegenden Erfindung; und B: wässrige hGH-Kontrolle);
3A und 3B die Stabilität der Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung der vorliegenden Erfindung, die hGH enthält, durch Ausschlußchromatographie veranschaulicht (A: hGH, freigesetzt aus der Formulierung der vorliegenden Erfindung; und B: wässrige hGH-Kontrolle);
4 die zeitabhängigen Veränderungen des Gewichtszunahmemusters von Zwergratten, die mit der erfinderischen Formulierung mit verzögerter Freisetzung von menschlichem Wachstumshormon behandelt worden sind, denjenigen herkömmlicher Formulierungen vergleicht;
5 die zeitabhängigen Veränderungen der Gewichtszunahmemuster von Zwergratten, die mit der erfinderischen Formulierung mit verzögerter Freisetzung von menschlichem Wachstumshormon behandelt worden sind, mit denjenigen von herkömmlichen Formulierungen gegenüberstellt;
6 die zeitabhängigen Veränderungen der Konzentration von menschlichem Wachstumshormon (hGH) in Blut zeigt; und
7 die zeitabhängigen Veränderungen des Gewichtszunahmemusters von Zwergratten, die mit der erfinderischen Formulierung mit verzögerter Freisetzung von menschlichem Wachstumshormon behandelt worden sind, im Vergleich mit denjenigen von herkömmlichen Formulierungen beschreibt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung der vorliegenden Erfindung besteht im wesentlichen aus festen Mikropartikeln aus Hyaluronsäure oder einem Salz derselben und einem Protein- oder Peptid-Medikament und einem Stabilisator, die in besagten Partikeln eingekapselt sind. Diese erfinderische Zusammensetzung ist herkömmlichen Formulierungen auf der Basis von Hyaluronsäure-Gelen in bezug auf Freisetzungseigenschaften und Einfachheit in der Handhabung überlegen: das heißt, daß eine Injektionsformulierung, die unter Verwendung der erfinderischen mikropartikulären Zusammensetzung hergestellt ist, wegen ihrer geringeren Viskosität leichter zu injizieren ist und die Zusammensetzung das Medikament in vivo mit einer konstanten Geschwindigkeit über einen längeren Zeitraum freisetzt.
Überdies ist die erfinderische Zusammensetzung insofern vorteilhaft, als die Denaturierung des Medikamentes nicht auftritt, bis 100% desselben aus der Zusammensetzung freigesetzt sind.
Die mikropartikuläre Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die eine mittlere Teilchengröße in einem Bereich von 0,1 bis 40 μm, vorzugsweise von 0,1 bis 10 μm aufweist, kann hergestellt werden durch Sprühtrocknung oder Gefriertrocknung einer wässrigen Lösung, die ein Protein- oder Peptid-Medikament und Hyaluronsäure oder ihr Salz enthält.
Beispielhafte Medikamente, die bei der Herstellung der festen mikropartikulären Zusammensetzung dieser Erfindung verwendet werden können, schließen menschliches Wachstumshormon, Rinder-Somatotropin, Schweine-Somatotropin, Wachstumshormon-freisetzendes Hormon, Wachstumshormon-freisetzendes Peptid, Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktor, Granulocytenmakrophagenkolonie-stimulierenden Faktor, Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor, Erythropoietin, Knochenmorphogenese-Protein, Interferon, Insulin, Atriopeptin-III, monoklonalen Antikörper, TNF, Makrophagen-aktivierenden Faktor, Interleukin, Tumor-denaturierenden Faktor, insulinähnlichen Wachstumsfaktor, Epidermis-Wachstumsfaktor, Gewebeplasminogenaktivator und Urokinase ein.
Beispielhafte anorganische Salze von Hyaluronsäure, die bei der Herstellung der festen mikropartiulären Zusammensetzung dieser Erfindung verwendet werden können, schließen Natrium-, Kalium-, Lithium-, Calcium-, Ammonium-, Magnesium-, Zink-, Kupfer- und Cobaltsalze ein.
In der vorliegenden Erfindung verwendbare Stabilisatoren sind Polysaccharid, Protein, Aminosäure, anorganisches Salz und Tensid.
Die mikropartikuläre Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung der vorliegenden Erfindung kann ein Protein- oder Peptid-Medikament in einer Menge enthalten, die in einem Bereich von 1 bis 90 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung, liegt, und einen Stabilisator in einer Menge, die von 1 bis 90 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung, liegt.
Die Injektionsformulierung mit verzögerter Freisetzung der vorliegenden Erfindung wird hergestellt durch Dispergieren der mikropartikulären Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung der vorliegenden Erfindung in einer Menge, die in einem Bereich von 0,01 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der Injektionsformulierung, liegt, in einem Injektionsmedium. Falls gewünscht, können ein Dispergiermittel oder Konservierungsstoffe zugesetzt werden. Typische Injektionsmedien, die in der Injektionsformulierung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen eine gepufferte wässrige Lösung, Ethanol, Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöl, Mineralöl, Squalen, Dorschleberöl, Mono-, Di- und Triglycerid oder eine Mischung derselben ein.
Beispielhafte Pflanzenöle sind Maisöl, Olivenöl, Sojabohnenöl, Sonnenblumenöl, Baumwollsamenöl, Erdnußöl, Sesamöl und eine Mischung derselben.
Weiter kann eine Aerosolformulierung, die die mikropartikuläre Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung der vorliegenden Erfindung enthält, hergestellt werden. Die so hergestellte Aerosolformulierung der vorliegenden Erfindung kann auf die Nasen- oder Bronchialschleimhaut aufgebracht werden, wobei die mikropartikuläre Zusammensetzung das Medikament in einer gesteuerten Art und Weise freisetzt.
Die folgenden Beispiele und Testbeispiele sind dazu gedacht, die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen, ohne ihren Schutzumfang zu beschränken.
Beispiel 1: Mikropartikel-Herstellung
Zu einer 5 mM phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS), die 2 mg/ml menschliches Wachstumshormon (hGH) enthielt, wurde Tween 80 bis zu einer Konzentration von 0,01 Gew.-% zugegeben. Natriumhyaluronat mit einem Molekulargewicht von 1.000.000 wurde bis zu einer Konzentration von 2 mg/ml hinzugegeben. Die resultierende Lösung wurde einem Sprühtrockner (Büchi 190) mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Min. zugeführt, um Mikropartikel herzustellen. Die Temperatur der einströmenden Luft zum Sprühtrockner betrug 85°C. Der mittlere Durchmesser der so erhaltenen Mikropartikel betrug 3,0 μm.
Beispiel 2: Mikropartikel-Herstellung
Zu einer 5 mM PBS, die 1 mg/ml hGH enthielt, wurde Tween 80 bis zu einer Konzentration von 0,01 Gew.-% zugegeben. Natriumhyaluronat mit einem Molekulargewicht von 2.000.000 wurde bis zu einer Konzentration von 1 mg/ml hinzugegeben. Die resultierende Lösung wurde einem Sprühtrockner (Büchi 190) mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/Min. zugeführt, um Mikropartikel herzustellen. Die Temperatur der einströmenden Luft zum Sprühtrockner betrug 85°C. Der mittlere Durchmesser der so erhaltenen Mikropartikel betrug 2,0 μm.
Beispiel 3: Mikropartikel-Herstellung
Zu einer 5 mM PBS, die 0,1 mg/ml hGH enthielt, wurde Tween 80 bis zu einer Konzentration von 0,01 Gew.-% zugegeben. Natriumhyaluronat mit einem Molekulargewicht von 2.000.000 wurde bis zu einer Konzentration von 0,9 mg/ml hinzugegeben. Die resultierende Lösung wurde einem Sprühtrockner (Büchi 190) mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Min. zugeführt, um Mikropartikel herzustellen. Die Temperatur der einströmenden Luft zum Sprühtrockner betrug 85°C. Der mittlere Durchmesser der so erhaltenen Mikropartikel betrug 2,0 μm.
Testbeispiel 1: in-vitro-Freisetzungstest
Die in den Beispielen 1, 2 und 3 hergestellten Mikropartikel wurden jeweils in einem Puffer (150 mM Natriumchlorid, 10 mM Phosphat und 0,05% Natriumazid, pH 7,4) suspendiert, so daß sich eine Konzentration von hGH von 1,0 mg/ml ergibt. Die so erhaltene Dispersion wurde in einen Ofen gegeben und die Freisetzung von hGH in einem Rührer bei 37°C getestet. Bei der vorbestimmten Probennahmezeit wurde die resultierende Dispersion bei 800 g für 10 Min. zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten, und eine Fraktion des Überstandes, die 1/10 der gesamten Dispersion entsprach, wurde daraus entnommen. Eine gleiche Menge des Puffers wurde zur Dispersion zugegeben und der Freisetzungstest wurde bei 37°C fortgesetzt. Die Konzentration von hGH in der Überstandfraktion wurde mit der Lowry-Methode und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gemessen, um die Menge an freigesetztem hGH relativ zur Zeit zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
1 zeigt die zeitabhängigen Veränderungen der freigesetzten Menge hGH in vitro. Wie in 1 gezeigt, ist die Geschwindigkeit der hGH-Freisetzung langsamer, wenn das Molekulargewicht von Hyaluronsäure höher ist und der Gehalt an hGH niedriger ist. Tatsächlich zeigt das Mikropartikel, das in Beispiel 3 erhalten wird, die langsamste Freisetzungsgeschwindigkeit. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Zeitraum der verzögerten Freisetzung des Medikaments gesteuert werden kann durch Regulierung des Molekulargewichts der Hyaluronsäure, des Gehalts an hGH und dergleichen. Überdies zeigen in der vorliegenden Erfindung hergestellte Mikropartikel eine konstante Geschwindigkeit in vitro, bis 70% hGH freigesetzt sind, ohne eine anfängliche Burstfreisetzung.
Testbeispiel 2: Stabilität von hGH in Mikropartikeln
Um zu bestätigen, ob das hGH in den erfinderischen Mikropartikeln identisch ist mit dem wässrigen hGH, das für die Herstellung der Mikropartikel verwendet wurde, wurde aus den Mikropartikeln im in-vitro-Freisetzungstest freigesetztes hGH getestet, durch Einsatz von Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitchromatographie (RP-HPLC) und Ausschlußchromatographie (SEC).
Die Denaturierung von hGH aufgrund der Oxidation und Desamidierung kann durch RP-HPLC bestätigt werden und die Ergebnisse sind in 2A und 2B dargestellt.
2A und 2B zeigen die Stabilität der Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung der vorliegenden Erfindung, die hGH enthält, mit RP-PHLC, wobei 2A das RP-HPLC-Profil von hGH, freigesetzt aus der Formulierung der vorliegenden Erfindung, und 2B wässrige hGH-Kontrolle ist.
Die Denaturierung von hGH aufgrund der Aggregation kann bestätigt werden mit SEC und die Ergebnisse sind dargestellt in 3A und 3B.
3A und 3B zeigen die Stabilität der Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung der vorliegenden Erfindung, die hGH enthält, durch SEC, wobei 3A das SEC-Profil von hGH, freigesetzt aus der Formulierung der vorliegenden Erfindung, und 3B wässrige hGH-Kontrolle ist.
Wie dargestellt in den 2A, 2B, 3A und 3B ist aus den erfinderischen Zusammensetzungen freigesetztes hGH identisch mit der wässrigen hGH-Kontrolle und der Gehalt an hGH-Monomer ist höher als 95%. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Denaturierung von hGH während der Herstellung der erfinderischen Mikropartikelzusammensetzungen und der Freisetzung derselben bei 37°C nicht auftritt.
Testbeispiel 3: in-Vivo-Freisetzungstest
Zwergratten mit der Erbanlage niedriger Wachstumshormonsekretion wurden in einem Test eingesetzt, um die Eigenschaft der verzögerten Freisetzung des Mikropartikels der vorliegenden Erfindung zu untersuchen.
Das in Beispiel 1 hergestellte Mikropartikel mit verzögerter Freisetzung wurde in einer Mischung auf Propylenglykol und Ethanol (7:3 (v/v)) dispergiert, so daß die Konzentration von hGH bei 5 mg/ml lag. Die resultierende Dispersion wurde mit einer gepufferten wässrigen Lösung (150 mM NaCl und 10 mM Phosphat, pH 7,4) verdünnt, so daß die Konzentration von hGH bei 0,5 mg/ml lag.
Achtzehn Exemplare von sieben Wochen alten Zwergratten mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 103 g wurden in drei Gruppen unterteilt, die jede aus sechs Ratten bestand. Den Ratten der ersten Gruppe wurde eine subkutane Injektion mit 0,1 ml der Mikropartikeldispersion, hergestellt oben, (entsprechend 50 μg hGH) täglich für einen Zeitraum von zwei Wochen verabreicht (Experimentelle Gruppe). Den Ratten der zweiten Gruppe wurde Eutropin^®, eine kommerziell verfügbare hGH-Formulierung für wässrige Injektion, unter derselben Bedingung verabreicht (Vergleichsgruppe). Den Ratten der dritten Gruppe wurde kein hGH verabreicht (nicht-behandelte Kontrollgruppe). Die Ratten wurden jeden Tag gewogen, um die Veränderung ihres Körpergewichtes zu untersuchen.
4 vergleicht die zeitabhängigen Veränderungen des Gewichtszunahmemusters bei den Ratten der Experimentellen Gruppe, der Vergleichsgruppe und der Kontrollgruppe.
Wie dargestellt in 4, zeigten die Ratten der Experimentellen Gruppe eine kontinuierliche Gewichtszunahme über einen Zeitraum von 2 Wochen, die größer ist als diejenige der Vergleichsgruppe und der Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse zeigen, daß die erfinderische Mikropartikelformulierung dank ihrer Eigenschaft der verzögerten Freisetzung wirksamer ist als die herkömmlichen Formulierungen.
Testbeispiel 4: In-vivo-Freisetzungstest
Das Mikropartikel mit verzögerter Freisetzung, hergestellt in Beispiel 2, wurde in einem Baumwollsamenöl dispergiert, so daß die Konzentration von hGH bei 1,5 mg/ml lag.
Vierundzwanzig Exemplare von sieben Wochen alten Zwergratten mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 105 g wurden in vier Gruppen unterteilt, die jede aus sechs Ratten bestand. Den Ratten der ersten Gruppe wurde eine subkutane Injektion mit 0,1 ml der Mikropartikeldispersion, hergestellt oben, (entsprechend 150 μg hGH) alle drei Tage für einen Zeitraum von zwei Wochen verabreicht (Experimentelle Gruppe). Den Ratten der zweiten Gruppe wurde Eutropin^® unter derselben Bedingung verabreicht (Vergleichsgruppe 1). Den Ratten der dritten Gruppe wurde Eutropin^®, entsprechend 50 μg hGH, täglich für einen Zeitraum von zwei Wochen verabreicht (Vergleichsgruppe 2). Den Ratten der vierten Gruppe wurde kein hGH verabreicht (nicht-behandelte Kontrollgruppe). Die Ratten wurden jeden Tag gewogen, um die Veränderung ihres Körpergewichtes zu untersuchen.
5 stellt die zeitabhängigen Veränderungen der Gewichtszunahmemuster der Experimentellen Gruppe, der Vergleichsgruppen und der Kontrollgruppe gegenüber.
Wie dargestellt in 5, zeigten die Ratten der Experimentellen Gruppe eine größere Gewichtszunahme als die Ratten der Vergleichsgruppe und der Kontrollgruppe. Die Ratten der Vergleichsgruppe 1 zeigten signifikante Gewichtszunahmen am Tag 1, sie zeigten jedoch geringere Gewichtszunahme als die Ratten der Kontrollgruppe an den Tagen 2 und 3 nach der Verabreichung. Die Ratten der experimentellen Gruppe und der Vergleichsgruppe 2 zeigen kontinuierliche Gewichtszunahme. Diese Ergebnisse zeigen, daß die erfinderische Mikropartikelformulierung die wirksame Eigenschaft der verzögerten Freisetzung besitzt, die wenigstens für 3 Tage bleibt.
Testbeispiel 5: in-Vivo-Freisetzungstest
Das in Beispiel 2 hergestellte Mikropartikel mit verzögerter Freisetzung wurde in einem Baumwollensamenöl dispergiert, so daß die Konzentration von hGH bei 1,5 mg/ml lag. Acht Kaninchen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 2,5 kg wurden in zwei Gruppen unterteilt, die jede aus vier Kaninchen bestand. Den Kaninchen einer Gruppe wurde eine Injektion mit der oben hergestellten Mikropartikeldispersion in einer Menge verabreicht, die 3.700 μg hGH entsprach (Experimentelle Gruppe). Den Kaninchen der anderen Gruppe wurde kein hGH verabreicht (Kontrollgruppe).
Nach der Verabreichung wurden den Kaninchen täglich über einen Zeitraum von sechs Tagen Blutproben abgenommen.
Die Menge an hGH in den Blutproben wurde mit RIA(Radioimmunoassay)-Methode quantifiziert.
6 zeigt die zeitabhängigen Veränderungen der Konzentration von menschlichem Wachstumshormon in Blut.
Wie dargestellt in 6, wurde die Menge an hGH im Blut in einem Bereich von 0 bis 11 ng/ml für vier Tage nach der Verabreichung gehalten und wurde anschließend nach Tag 5 ein wenig verringert. Dieses Ergebnis zeigt, daß die erfinderische Mikropartikelzusammensetzung eine konstante Freisetzungsgeschwindigkeit über 4 Tage besitzt und die Freisetzungsgeschwindigkeit danach allmählich verringert wurde. Dieses Ergebnis stimmt überein mit dem Ergebnis von Testbeispiel 1, in dem die in-vivo-Freisetzungsgeschwindigkeit von hGH linear ist, bis 70% hGH freigesetzt sind. Im Gegensatz dazu lag die Konzentration von hGH im Blut der Kontrollgruppe unterhalb der mit RIA-Methode nachweisbaren Konzentration (1 ng/ml) und kann demgemäß ignoriert werden.
Beispiel 4: Mikropartikel-Herstellung und in-vitro-Freisetzungstest
(Schritt 1) Mikropartikelherstellung
Zu einer 5 mM PBS, die 2 mg/ml Rindersomatotropin (bST) enthielt, wurde Tween 80 bis zu einer Konzentration von 0,01 Gew.-% zugegeben. Natriumhyaluronat mit einem Molekulargewicht von 1.000.000 wurde bis zu einer Konzentration von 2 mg/ml zugegeben. Die resultierende Lösung wurde einem Sprühtrockner (Büchi 190) mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Min. zugeführt, um Mikropartikel herzustellen. Die Temperatur der einströmenden Luft zum Sprühtrockner betrug 85°C. Der mittlere Durchmesser der so erhaltenen Mikropartikel betrug 3,0 μm.
(Schritt 2) in-vitro-Freisetzungstest
Ein in-vitro-Freisetzungstest wurde durchgeführt durch Einsatz der in Schritt 1 hergestellten Mikropartikel gemäß der Methode von Testbeispiel 1 und die Stabilität des freigesetzten bST wurde gemäß der Methode von Testbeispiel 2 getestet.
Das freigesetzte bST wurde quantifiziert und qualifiziert, in dem SEC durchgeführt wurde. Als ein Ergebnis wurde bST zu mehr als 85% über 72 Stunden freigesetzt und die Denaturierung von bST trat nicht auf.
Beispiel 5: Mikropartikel-Herstellung und in-vitro-Freisetzungstest
(Schritt 1) Mikropartikelherstellung
Zu einer 5 mM PBS, die 2 mg/ml Schweinesomatotropin (pST) enthielt, wurde Tween 80 bis zu einer Konzentration von 0,01 Gew.-% zugegeben. Natriumhyaluronat mit einem Molekulargewicht von 1.000.000 wurde bis zu einer Konzentration von 2 mg/ml zugegeben. Die resultierende Lösung wurde einem Sprühtrockner (Büchi 190) mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Min. zugeführt, um Mikropartikel herzustellen. Die Temperatur der einströmenden Luft zum Sprühtrockner betrug 85°C. Der mittlere Durchmesser der so erhaltenen Mikropartikel betrug 3,0 μm.
(Schritt 2) in-vitro-Freisetzungstest
Ein in-vitro-Freisetzungstest wurde durch Einsatz der in Schritt 1 hergestellten Mikropartikel gemäß der Methode von Testbeispiel 1 durchgeführt und die Stabilität des freigesetzten pST wurde gemäß der Methode von Testbeispiel 2 getestet.
Das freigesetzte pST wurde quantifiziert und qualifiziert, in dem SEC durchgeführt wurde. Als ein Ergebnis wurde pST zu mehr als 90% über 72 Stunden freigesetzt und die Denaturierung von pST trat nicht auf.
Beispiel 6: Mikropartikel-Herstellung und in-vitro-Freisetzungstest
(Schritt 1) Mikropartikelherstellung
Zu einer 5 mM PBS, die 0,4 mg/ml Granulocytenmakrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) enthielt, wurde Tween 80 bis zu einer Konzentration von 0,01 Gew.-% zugegeben. Natriumhyaluronat mit einem Molekulargewicht von 1.000.000 wurde bis zu einer Konzentration von 1,6 mg/ml zugegeben. Die resultierende Lösung wurde einem Sprühtrockner (Büchi 190) mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Min. zugeführt, um Mikropartikel herzustellen. Die Temperatur der einströmenden Luft zum Sprühtrockner betrug 85°C. Der mittlere Durchmesser der so erhaltenen Mikropartikel betrug 3,0 μm.
(Schritt 2) in-vitro-Freisetzungstest
Ein in-vitro-Freisetzungstest wurde durch Einsatz der in Schritt 1 hergestellten Mikropartikel gemäß der Methode von Testbeispiel 1 durchgeführt und die Stabilität des freigesetzten GM-CSF wurde gemäß der Methode von Testbeispiel 2 getestet.
Der freigesetzte GM-CSF wurde quantifiziert und qualifiziert, indem SEC durchgeführt wurde. Als ein Ergebnis wurde GM-CSF zu mehr als 92% über 72 Stunden freigesetzt und die Denaturierung von GM-CSF trat nicht auf.
Beispiel 7: Mikropartikel-Herstellung und in-vitro-Freisetzungstest
(Schritt 1) Mikropartikelherstellung
Zu einer 5 mM PBS, die 1000 IU/ml Erythropoietin (EPO) und 0,5 mg/ml Serumalbumin enthielt, wurde Tween 80 bis zu einer Konzentration von 0,01 Gew.-% zugegeben. Natriumhyaluronat mit einem Molekulargewicht von 1.000.000 wurde bis zu einer Konzentration von 2,5 mg/ml zugegeben. Die resultierende Lösung wurde einem Sprühtrockner (Büchi 190) mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Min. zugeführt, um Mikropartikel herzustellen. Die Temperatur der einströmenden Luft zum Sprühtrockner betrug 85°C. Der mittlere Durchmesser der so erhaltenen Mikropartikel betrug 3,5 μm.
(Schritt 2) in-vitro-Freisetzungstest
Ein in-vitro-Freisetzungstest wurde durch Einsatz der in Schritt 1 hergestellten Mikropartikel gemäß der Methode von Testbeispiel 1 durchgeführt und die Stabilität des freigesetzten EPO wurde gemäß der Methode von Testbeispiel 2 getestet.
Das freigesetzte EPO wurde quantifiziert und qualifiziert, in dem SEC durchgeführt wurde. Als ein Ergebnis wurde EPO zu mehr als 70% über 72 Stunden freigesetzt und die Denaturierung von EPO trat nicht auf.
Beispiel 8: Mikropartikel-Herstellung und in-vitro-Freisetzungstest
(Schritt 1) Mikropartikelherstellung.
Zu einer 5 mM PBS, die 2 × 10⁵ IU/ml Interferon-α, 0,2 mg/ml D-Mannitol und 0,2 mg/ml Serumalbumin enthielt, wurde Tween 80 bis zu einer Konzentration von 0,01 Gew.-% zugegeben. Natriumhyaluronat mit einem Molekulargewicht von 1.000.000 wurde bis zu einer Konzentration von 2,5 mg/ml zugegeben. Die resultierende Lösung wurde einem Sprühtrockner (Büchi 190) mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Min. zugeführt, um Mikropartikel herzustellen. Die Temperatur der einströmenden Luft zum Sprühtrockner betrug 105°C. Der mittlere Durchmesser der so erhaltenen Mikropartikel betrug 3,5 μm.
(Schritt 2) in-vitro-Freisetzungstest
Ein in-vitro-Freisetzungstest wurde durch Einsatz der in Schritt 1 hergestellten Mikropartikel gemäß der Methode von Testbeispiel 1 durchgeführt und die Stabilität des freigesetzten Interferon-α wurde gemäß der Methode von Testbeispiel 2 getestet.
Das freigesetzte Interferon-α wurde quantifiziert und qualifiziert, indem RP-HPLC durchgeführt wurde. Als ein Ergebnis wurde Interferon-α zu mehr als 90% über 72 Stunden freigesetzt und die Denaturierung von Interferon-α trat nicht auf.
Beispiel 9: Mikropartikel-Herstellung und in-vitro-Freisetzungstest
(Schritt 1) Mikropartikelherstellung
Zu einer 5 mM PBS, die 2 × 10⁵ IU/ml Interferon-γ, 0,2 mg/ml Glycin und 0,2 mg/ml Serumalbumin enthielt, wurde Tween 80 bis zu einer Konzentration von 0,01 Gew.-% zugegeben. Natriumhyaluronat mit einem Molekulargewicht von 1.000.000 wurde bis zu einer Konzentration von 2,5 mg/ml zugegeben. Die resultierende Lösung wurde einem Sprühtrockner (Büchi 190) mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Min. zugeführt, um Mikropartikel herzustellen. Die Temperatur der einströmenden Luft zum Sprühtrockner betrug 105°C. Der mittlere Durchmesser der so erhaltenen Mikropartikel betrug 3,5 μm.
(Schritt 2) in-vitro-Freisetzungstest
Ein in-vitro-Freisetzungstest wurde durch Einsatz der in Schritt 1 hergestellten Mikropartikel gemäß der Methode von Testbeispiel 1 durchgeführt und die Stabilität des freigesetzten Interferon-γ wurde gemäß der Methode von Testbeispiel 2 getestet.
Das freigesetzte Interferon-γ wurde quantifiziert und qualifiziert, indem RP-HPLC durchgeführt wurde. Als ein Ergebnis wurde Interferon-γ zu mehr als 85% über 72 Stunden freigesetzt und die Denaturierung von Interferon-γ trat nicht auf.
Beispiel 10: Mikropartikel-Herstellung und in-vitro-Freisetzungstest
(Schritt 1) Mikropartikelherstellung
Zu einer 10 mM PBS, die 20 IU/ml Insulin enthielt, wurde Tween 80 bis zu einer Konzentration von 0,01 Gew.-% zugegeben. Natriumhyaluronat mit einem Molekulargewicht von 1.000.000 wurde bis zu einer Konzentration von 2 mg/ml zugegeben. Die resultierende Lösung wurde einem Sprühtrockner (Büchi 190) mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Min. zugeführt, um Mikropartikel herzustellen. Die Temperatur der einströmenden Luft zum Sprühtrockner betrug 85°C. Der mittlere Durchmesser der so erhaltenen Mikropartikel betrug 3,0 μm.
(Schritt 2) in-vitro-Freisetzungstest
Ein in-vitro-Freisetzungstest wurde durch Einsatz der in Schritt 1 hergestellten Mikropartikel gemäß der Methode von Testbeispiel 1 durchgeführt und die Stabilität des freigesetzten Insulins wurde gemäß der Methode von Testbeispiel 2 getestet.
Das freigesetzte Insulin wurde quantifiziert und qualifiziert, indem RP-HPLC durchgeführt wurde. Als ein Ergebnis wurde Insulin zu mehr als 95% über 72 Stunden freigesetzt und die Denaturierung von Insulin trat nicht auf.
Beispiel 11: Mikropartikel-Herstellung und in-vitro-Freisetzungstest
(Schritt 1) Mikropartikelherstellung
Zu einer 5 mM PBS, die 2 mg/ml insulinähnlichen Wachstumsfaktor enthielt, wurde Tween 80 bis zu einer Konzentration von 0,01 Gew.-% zugegeben. Natriumhyaluronat mit einem Molekulargewicht von 1.000.000 wurde bis zu einer Konzentration von 2 mg/ml zugegeben. Die resultierende Lösung wurde einem Sprühtrockner (Büchi 190) mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Min. zugeführt, um Mikropartikel herzustellen. Die Temperatur der einströmenden Luft zum Sprühtrockner betrug 85°C. Der mittlere Durchmesser der so erhaltenen Mikropartikel betrug 3,0 μm.
(Schritt 2) In-vitro-Freisetzungstest
Ein in-vitro-Freisetzungstest wurde durch Einsatz der in Schritt 1 hergestellten Mikropartikel gemäß der Methode von Testbeispiel 1 durchgeführt und die Stabilität des freigesetzten insulinähnlichen Wachstumsfaktors wurde gemäß der Methode von Testbeispiel 2 getestet.
Der freigesetzte insulinähnliche Wachstumsfaktor wurde quantifiziert und qualifiziert, indem RP-HPLC durchgeführt wurde. Als ein Ergebnis wurde insulinähnlicher Wachstumsfaktor zu mehr als 90% über 72 Stunden freigesetzt und die Denaturierung von insulinähnlichem Wachstumsfaktor trat nicht auf.
Vergleichsbeispiel 1: Herstellung einer Gelformulierung und in-vitro-Freisetzungstest
(Schritt 1) Herstellung einer Gelformulierung
Zu einer 5 mM PBS, die 2,3 mg/ml hGH enthielt, wurde Natriumhyaluronat mit einem Molekulargewicht von 2.000.000 wurde bis zu einer Konzentration von 20 mg/ml zugesetzt, um eine 2%-ige Hyaluronat-Gelformulierung, die hGH enthielt, zu erhalten.
(Schritt 2) in-vitro-Freisetzungstest
Die in Schritt 1 hergestellte Gelformulierung wurde mit dem Verfahren von Testbeispiel 1 getestet. Als ein Ergebnis wurden 100% hGH innerhalb von 1 Stunde freigesetzt. Dieses Ergebnis zeigt, daß die Gelformulierung ein Medikament innerhalb eines kürzeren Zeitraums als die erfinderischen Mikropartikel freisetzt, weil sie leichter durch Wasser verdünnt wird.
Vergleichsbeispiel 2: Herstellung einer Gelformulierung und in-vitro-Freisetzungstest
(Schritt 1) Herstellung einer Gelformulierung
Zu einer 5 mM PBS, die 1,5 mg/ml hGH enthielt, wurde Natriumhyaluronat mit einem Molekulargewicht von 2.000.000 bis zu einer Konzentration von 20 mg/ml zugegeben, um eine nicht-fließfähige Gelformulierung, die hGH enthielt, zu erhalten.
1 ml der so erhaltenen Gelformulierung wurde in 2 ml Baumwollsamenöl dispergiert und die Mischung wurde homogenisiert, um eine Emulsion zu bilden.
(Schritt 2) in-vivo-Freisetzungstest
Vierundzwanzig Exemplare von sieben Wochen alten Zwergratten mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 95 g wurden in vier Gruppen unterteilt, die jede aus sechs Ratten bestand. Den Ratten einer Gruppe wurde eine subkutane Injektion mit 0,3 ml der in Schritt 1 hergestellten Emulsion (entsprechend 150 μg hGH) (Gruppe 1) verabreicht.
Um die Wirksamkeit der Emulsionsformulierung mit anderen Formulierungen zu vergleichen, wurde den Ratten der anderen zwei Gruppen eine Dispersion verabreicht, die die Mikropartikel mit verzögerter Freisetzung, hergestellt in Beispiel 2, dispergiert in einem Baumwollsamenöl, enthielt, so daß die Konzentration von hGH bei 150 μg lag (Gruppe 2); bzw. Eutropin^®, entsprechend 150 μg hGH (Gruppe 3). Den Ratten der letzten Gruppe wurde keine hGH-Formulierung verabreicht (Kontrollgruppe). Nach der Verabreichung wurden die Veränderungen der Gewichtszunahme der Ratten für 6 Tage beobachtet.
7 beschreibt die zeitabhängigen Veränderungen der Gewichtszunahmemuster von Zwergratten, die mit der erfinderischen Formulierung mit verzögerter Freisetzung von menschlichem Wachstumshormon behandelt worden waren, im Vergleich mit denjenigen von herkömmlichen Formulierungen. Als ein Ergebnis waren die zeitabhängigen Veränderungen des Gewichtszunahmemusters von Zwergratten, die mit der Hyaluronat-Gelformulierung behandelt worden waren, ähnlich zu der Eutropin^®-Gruppe. Das heißt, daß das Körpergewicht von Zwergratten, die mit der Hyaluronat-Gelformulierung behandelt worden waren, 2 oder 3 Tage nach der Verabreichung verringert war und ähnlich war zu demjenigen der Ratten der Kontrollgruppe danach. Ratten der mit der erfinderischen Formulierung behandelten Gruppe zeigten jedoch kontinuierliche Gewichtszunahme, die höher war als bei den anderen Gruppen, um 150% während 6 Tagen.
Vergleichsbeispiel 2: Herstellung einer Mikropartikelformulierung unter Verwendung von Natriumcarboxymethylcellulose und in vivo- und in-vitro-Freisetzungstest
(Schritt 1) Herstellung einer Mikropartikelformulierung
Zu einer 5 mM PBS, die 0,2 mg/ml hGH enthielt, wurde Tween 80 bis zu einer Konzentration von 0,01 Gew.-% zugegeben. Natriumcarboxymethylcellulose (Na-CMC, Qualität mit mittlerer Viskosität) wurde bis zu einer Konzentration von 1,8 mg/ml zugegeben. Die resultierende Lösung wurde einem Sprühtrockner (Büchi 190) mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/min. zugeführt, um Mikropartikel herzustellen. Die Temperatur der einströmenden Luft zum Sprühtrockner betrug 85°C. Der mittlere Durchmesser der so erhaltenen Mikropartikel betrugt 3,0 μm.
(Schritt 2) in-vitro-Freisetzungstest
Die in Schritt 1 hergestellte Mikropartikelformulierung wurde mit dem Verfahren von Testbeispiel 1 getestet und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgelistet. Tabelle 1
Wie in Tabelle 1 gezeigt, unterscheiden sich die zeitabhängigen Änderungen des in-vitro-Freisetzungsmusters der Mikropartikelformulierung, die in Schritt 1 hergestellt ist, von demjenigen des erfinderischen Mikropartikels. Das heißt, es zeigt das schlecht ausgeglichene Freisetzungsmuster, daß mehr als 30% hGH während der anfänglichen 1 Stunde freigesetzt wurden, weitere 30% bis 48 Stunden freigesetzt wurden und anschließend danach kaum Freisetzung von hGH auftrat. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Freisetzungsmuster eines Medikaments durch die Wechselwirkung zwischen dem Protein-Medikament und der Matrix in einen schlecht ausgeglichenen Zustand kommt und die Möglichkeit der Denaturierung des Medikaments sehr hoch ist, wenn ein natürliches Kohlehydrat-Polymer mit einer stärkeren Hydrophobie als Hyaluronsäure als ein Matrixmaterial verwendet wird.
(Schritt 3) in-vivo-Freisetzungstest
Die in Schritt 1 hergestellte Mikropartikelformulierung wurde in einem Baumwollsamenöl dispergiert. Die resultierende Dispersion wurde 7 Wochen alten Zwergratten in einer Menge von 300 μg hGH pro Kopf verabreicht und eine Gruppe ohne Verabreichung wurde als eine Kontrollgruppe verwendet. Die Gewichtszunahmen der Ratten wurden über einen Zeitraum von 7 Tagen gemessen und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 als eine akkumlierte Gewichtszunahme aufgelistet. Tabelle 2
Wie dargestellt in Tabelle 2, zeigten die mit dem in Schritt 1 hergestellten Mikropartikel behandelten Ratten das Gewichtszunahmemuster, das ähnlich ist zu demjenigen der Hyaluronat-Gelformulierung in Vergleichsbeispiel 2. Das heißt, sie zeigten die Gewichtszunahme nur an Tag 1 und ihr Körpergewicht war an Tag 2 verringert. Überdies zeigten sie eine geringere Gewichtszunahmegeschwindigkeit als die Kontrollgruppe danach und zeigen schließlich eine ähnliche Gewichtszunahme wie die Kontrollgruppe an Tag 7. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Na-CMC-Formulierung eine unterlegene Freisetzungseigenschaft und Titer besitzt als das erfinderische Hyaluronat-Mikropartikel, obgleich Na-CMC ein natürliches Kohlehydrat-Polymer wie Hyaluronsäure ist.
Vergleichsbeispiel 4: Herstellung einer Mikropartikelformulierung unter Verwendung von Hyaluronsäurebenzylester und in-vivo- und in-vitro-Freisetzungstest
(Schritt 1) Herstellung einer Mikropartikelformulierung
Natürliche Hyaluronsäure und Benzylalkohol wurden chemisch miteinander umgesetzt, um Hyaluronsäurebenzylester herzustellen, und anschließend wurden Mikropartikel, die hGH enthielten, hergestellt, wie unten beschrieben.
Zu einer 5 mM PBS, die 2 mg/ml hGH enthielt, wurde Tween 80 bis zu einer Konzentration von 0,01 Gew.-% zugegeben. Die resultierende Lösung wurde einem Sprühtrockner (Büchi 190) mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Min. zugeführt, um Mikropartikel herzustellen. Die Temperatur der einströmenden Luft zum Sprühtrockner betrug 85°C. Der mittlere Durchmesser der so erhaltenen Mikropartikel betrug 2,5 μm.
Die so erhaltenen Teilchen wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO), das 6% Hyaluronsäurebenzylester enthielt, dispergiert und die resultierende Dispersion wurde zu Mineralöl zugegeben, das ein Tensid, Aracel ATM (ICI, U.S.A.) enthielt, und die Mischung wurde homogenisiert, um eine Mikroemulsion zu bilden. Die resultierende Mikroemulsion besteht aus einer kontinuierlichen Phase aus Mineralöl und einer dispersen Phase aus Hyaluronsäurebenzylester/DMSO-Lösung, die hGH darin dispergiert enthält.
Ethylacetat wurde zu der so erhaltenen Mikroemulsion unter Rühren zugegeben und anschließend wurde DMSO mit Ethylacetat extrahiert und Hyaluronsäurebenzylester härtet aus, um Hyaluronsäurebenzylester-Teilchen zu bilden, die hGH enthalten. Der mittlere Durchmesser der so erhaltenen endgültigen Teilchen betrug 5,5 μm und der Gehalt an hGH betrug 45%.
(Schritt 2) in-vivo-Freisetzungstest
Die in Schritt 1 hergestellten Mikropartikel wurden mit dem Verfahren von Testbeispiel 1 getestet und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgelistet. Tabelle 3
Wie dargestellt in Tabelle 3, trat die Freisetzung von hGH, bei dem Mikropartikel, das hergestellt worden war, indem der natürlichen Hyaluronsäure durch Verwendung von Hyaluronsäurebenzylester Hydrophobie verliehen wurde, nach anfänglichen 5 Stunden kaum auf. Der Grund, warum hGH nicht freigesetzt wurde, ist, daß die Wechselwirkung zwischen dem Protein-Medikament (hGH) und der Hyaluronsäurebenzylester-Matrix zu stark ist.
(Schritt 3) in-vivo-Freisetzungstest
Die in Schritt 1 hergestellten Mikropartikel wurden in einem Baumwollsamenöl dispergiert. Die resultierte Dispersion wurde 7 Wochen alten Zwergratten in einer Menge von 300 μg hGH pro Kopf verabreicht und eine Gruppe ohne Verabreichung wurde als eine Kontrollgruppe verwendet. Die Gewichtszunahmen der Ratten wurden über einen Zeitraum von 7 Tagen gemessen und die Ergebnisse sind in Tabelle 4 als eine akkumulierte Gewichtszunahme aufgelistet. Tabelle 4

A:: Kontrollgruppe
B:: Hyaluronsäurebenzylester-Mikropartikelformulierungsgruppe

Wie dargestellt in Tabelle 4, zeigt die Hyaluronsäurebenzylester-Mikropartikelformulierung kaum eine Wirksamkeit nach Tag 1.
Obgleich die Erfindung in bezug auf die obigen spezifischen Ausführungsformen beschrieben worden ist, sollte anerkannt werden, daß verschiedene Modifikationen und Veränderungen vorgenommen werden können und ebenfalls in den Schutzumfang der Erfindung, wie definiert durch die Ansprüche, die folgen, fallen.

Claims

Medikamentenzusammensetzung mit verzögerter Freisetzung, die im wesentlichen aus Mikropartikeln aus Hyaluronsäure oder einem anorganischen Salz derselben; und einem Protein- oder Peptid-Medikament und einem Stabilisator, eingeschlossen in besagten Mikropartikeln, besteht, wobei besagte Mikropartikel eine durchschnittliche Größe in einem Bereich von 0,1 bis 40 μm besitzen und der Stabilisator ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einem Polysaccharid, Protein, Aminosäure, anorganischen Salz, Tensid und einer Mischung derselben besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die durchschnittliche Mikropartikelgröße in einem Bereich von 1 bis 10 μm liegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Medikament ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus menschlichen Wachstumshormon, Rinder-Somatotropin, Schweine-Somatotropin, Wachstumshormon-freisetzendem Hormon, Wachstumshormon-freisetzendem Peptid, Granulocytenkolonie-stimulierendem Faktor, Granulocytenmakrophagenkolonie-stimulierendem Faktor, Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor, Erythropoietin, Knochenmorphogenese-Protein, Interferon, Insulin, Atriopeptin-III, monoklonalem Antikörper, TNF, Makrophagen-aktivierendem Faktor, Interleukin, Tumor-denaturierendem Faktor, insulinähnlichem Wachstumsfaktor, Epidermis-Wachstumsfaktor, Gewebeplasminogenaktivator, Urokinase und einer Mischung derselben besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das anorganische Salz ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Natrium-, Kalium-, Lithium-, Calcium-, Ammonium-, Magnesium-, Zink-, Kupfer- und Cobaltsalzen von Hyaluronsäure besteht.
Injektionsformulierung, die die Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung nach Anspruch 1, dispergiert in einem Injektionsmedium, umfaßt.
Injektionsformulierung nach Anspruch 5, die außerdem ein Dispergiermittel oder einen Konservierungsstoff umfaßt.
Injektionsformulierung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Injektionsmedium ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus gepufferter wäßriger Lösung, Ethanol, Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöl, Mineralöl, Squalen, Dorschleberöl, Mono-, Di- und Triglycerid und einer Mischung derselben besteht.
Injektionsformulierung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Pflanzenöl ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Maisöl, Olivenöl, Sojabohnenöl, Safloröl, Baumwollsamenöl, Erdnußöl, Sesamöl, Kokosnussöl, Rizinusöl und einer Mischung derselben besteht.
Aerosolformulierung, die die Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung nach Anspruch 1 umfaßt.