JP2002514215A - 治療薬の徐放送達のための生分解性微粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、種々の活性成分（例えば、タンパク質薬物）を含有する重合体微粒子の、改良された製造方法に関する。また、本発明は、治療薬の徐放運搬のための組成物を製造するための、前記の活性タンパク質含有重合体微粒子の用途に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 治療薬の徐放送達のための生分解性微粒子 発明の分野 本発明は、一般に、活性成分を含有する生分解性重合体微粒子の、改良された 製造方法に関する。また、本発明は、治療薬の徐放送達のための組成物を製造す るための、該微粒子の用途に関する。 発明の背景 遺伝子工学技術および細胞工学技術における最近の進歩により、インビボで種 々の薬理作用を示すことが知られているタンパク質を、医薬用途のために大量生 産することが可能となっている。そのようなタンパク質には、エリトロポエチン （EPO）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、インターフェロン（α、β、γ、 コンセンサス）、腫瘍壊死因子結合タンパク質（TNFbp）、インターロイキン１ 受容体アンタゴニスト（IL-1ra）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、角質細胞増殖 因子（KGF）、幹細胞因子（SCF）、巨核球増殖分化因子（MGDF）、オステオプロ テゲリン（osteoprotegerin(OPG)）、グリア細胞株由来神経栄養因子 （GDNF）および肥満タンパク質（OBタンパク質）が含まれる。本発明では、OBタ ンパク質をレプチンと称することもある。 これらのタンパク質は、一般に、短いインビボ半減期および無視しうる程度の 経口バイオアベイラビリティしか有さないため、それらは、典型的には、頻繁な 注射により投与され、したがって患者に対する著しい身体的負担および付随する 投与費用を課す。そのため、現在、徐放製剤の開発および評価に多大な関心が寄 せられている。有効な徐放製剤は、活性成分の血中レベルを制御する手段を提供 し、また、より優れた効力、安全性、患者にとっての便宜性、および患者の応諾 をもたらしうる。残念ながら、ほとんどのタンパク質は不安定であるため(例え ば、熱、有機溶媒などにさらされると、変性したり生物活性を失う)、徐放製剤 の開発および評価は著しく制限されている。 徐放製剤を開発する試みには、活性成分を含有する種々の生分解性および非生 分解性重合体（例えば、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)）微粒子（例えば、Wise ら，Contraception，8:227-234(1973);およびHutchinsonら，Biochem.Soc.Trans .,13:520-523(1985)を参照されたい）の使用が含まれ、活性物質（例えば、タン パク質）を重合体ミクロスフェア(例えば、米 国特許第4,675,189号およびそれに引用されている参照文献を参照されたい)中に 取込ませるための種々の技術が公知である。 そのような１つの技術は、重合体および活性成分を該重合体用の溶媒中で共に 混合し、ついで該溶液を噴霧することにより該溶媒を蒸発させて、該活性成分を 含有する重合体液滴を得る噴霧乾燥である。噴霧乾燥の詳細な概説は、例えば、 Masters,K.,“Spray Drying Handbook”（John Wiley & Sons編，New York1984 ）を参照されたい。噴霧乾燥技術は一定の場合には有用であることが判明してい るが、それでもなお、それは、生物学的に活性なタンパク質が、有機性重合体お よび溶媒との接触により又は噴霧乾燥過程中に生じた熱により変性することが多 いという欠点を有する。 ミクロスフェアの形成に使用することができるもう１つの技術は、溶媒蒸発で ある。溶媒蒸発は、溶解または分散した活性成分を含有する有機溶媒に該重合体 を溶解することを含む。ついで該重合体／活性成分混合物を、典型的には水性で ある攪拌された連続相に加える。該水中油滴型エマルジョンを安定化するために 、該水相中に乳化剤を含有させる。ついで該有機溶媒を数時間以上かけて蒸発さ せ、それにより該コア材料の周囲に 該重合体を析出させる。溶媒蒸発法の完全な概説は、例えば、米国特許第4,389, 330号（およびそこに引用されている参照文献）を参照されたい。噴霧乾燥技術 の場合と同様に、溶媒蒸発技術は、一定の場合には有用であることが判明してい る。しかしながら、活性成分が溶媒抽出過程中に失われることが多いため、該技 術は、しばしば、好ましくない。これは、該過程が水相中への乳化を含み、水溶 性薬物が、より疎水性の重合体−溶液相から水性の周囲環境中に急速に分配され ることが多いからである。 ミクロスフェアの形成に使用することができる更にもう１つの技術は相分離で あり、これは、油中水滴型エマルジョンまたは水中油滴型エマルジョンの形成を 含む。温度、pH、イオン強度の変化または沈殿剤の添加により、重合体を連続相 から活性物質上に沈殿させる。相分離技術の概説は、例えば、米国特許第4,675, 800号（およびそこに引用されている参照文献）を参照されたい。この方法もま た、変性のために活性成分が失われるという主たる欠点を有する。 前記方法などの方法で調製された微粒子からの活性成分の放出特性は、連続的 または不連続となることがあり、場合によっ ては、活性成分の放出の初期レベルが高すぎたり低すぎたりする。したがって、 活性成分の放出を制御するために、しばしば、種々の添加剤を利用する（例えば 、1997年３月12日付け公開のEP 0 761 211 A1を参照されたい）。 古典的な技術による噴霧乾燥、溶媒蒸発または相分離の際に生じる、タンパク 質および他の不安定な生物学的分子の変性を避けるために、重合体と活性成分と のエマルジョンを、窒素などの液化ガスを重層した凍結非溶媒中に噴霧して粒子 を形成させ、ついで非常に低温で抽出することができる。非常に低い処理温度は 、タンパク質などの不安定な生物学的分子の活性および完全性を維持させるかも しれない。しかしながら、該方法は、不十分な負荷（loading）効率および収量 につながり、貴重な生物学的材料の喪失を引き起こし、商業的製造に要求される 大きな規模でそれを実施することは面倒かつ困難で高い経費を要する。 簡便かつ安価で汎用性に富み、最も重要なこととして、タンパク質の活性の喪 失を防ぎ、高い負荷効率および収量を与え、それにより、より一貫した活性成分 放出を長期にわたり可能にする、活性成分を含有する重合体微粒子を製造するた めの改良 方法が、依然として必要とされていることは明らかである。 発明の概要 後記で十分に記載するとおり、本発明は、エマルジョンまたは懸濁液の直接凍 結乾燥の独特な利用による、活性成分を含有する重合体微粒子の、改良された製 造方法を提供する。この改良された方法は、当技術分野において記載されている 方法より優れたいくつかの顕著な利点を与え、それらには、例えば、1）活性成 分を負荷した微粒子の製造の容易さ（すなわち、より少数の、より扱いやすい工 程）、および2）放出中に活性成分の活性および完全性を維持して、長期にわた り活性成分の制御放出をもたらす徐放製剤の提供が含まれる。また、本発明の方 法は、使用しうる重合体および／または活性成分のクラスに関する汎用性、なら びにより高い収量、高い負荷およびより高い負荷効率の達成の利点を与える。 したがって、本発明の１つの態様は、重合体微粒子内に含有させた活性成分を 含む組成物の、新規かつ改良された製造方法であって、該活性成分と該重合体（ ポリマー）との混合物を連続相内に分散させ、得られた分散液を凍結させ、水お よび有機溶媒を凍結乾燥により該分散液から除去することを特徴とする 製造方法に関する。重要なことは、本方法が、当技術分野において記載されてい る方法より更に改良されており、より簡便であり、活性成分の活性および完全性 が該方法の全体にわたり維持されることである。 本方法は、一般には、（a）重合体溶液を調製し、（b）活性成分を加えて混合 物を得、（c）該混合物を連続相（すなわち、非溶媒）内に分散させて分散液を 得、（d）該分散液に賦形剤を加え、（e）該分散液を凍結させて凍結混合物を得 、（f）該凍結混合物を凍結乾燥して、活性成分を含有する所望の微粒子を得る 工程を含むと記載することができる。あるいは、工程（b）を省略し、「ブラン ク」微粒子を調製し、ついで該ブランク微粒子を活性成分溶液中に懸濁させるこ とにより、該ブランク微粒子上に活性成分を負荷することができる。 本発明のもう１つの態様は、重合体微粒子内に含有させた生物学的に活性な成 分、または重合体微粒子上に負荷した生物学的に活性な成分を含んでなる、活性 成分の徐放のための医薬組成物である。重要なことは、本発明の徐放組成物が、 封入および放出中に活性成分の活性および完全性を維持し、それにより、より長 期にわたる一貫した放出をもたらすのを助けることであ る。 図面の簡単な説明 図１は、本発明の、活性成分を含有する微粒子の製造方法を示す図である。 図２は、種々のタンパク質を負荷した微粒子のインビトロ放出を示すプロット である。レプチン（液体形態で取込まれている）を含有する微粒子は-▲-の線、 Zn:レプチン(懸濁液形態で取込まれている)を含有する微粒子は-●-の線、Zn:レ プチン(粉末形態で取込まれている)を含有する微粒子は-■-の線で示されている 。レプチン放出率（％）(レプチン濃度は、UV分光光度計で280nmにて測定した) が、時間（日）に対してプロットされている。 図３は、レプチンを負荷した微粒子から７日目に放出（インビトロ）されたレ プチン（実線）と、製剤バッファー中のレプチンの対照サンプル（破線）とを比 較する円二色性（CD）のデータを示す。CDスペクトルは、Jacso J-720分光旋光 計（Japan Spectroscopic Co.，Tokyo，Japan）を使用して得た。該サンプル（A₂₈₀ による測定で3.5μM）は、0.1cmのセル経路長で22℃にて分析した。 図４は、レプチンを負荷した微粒子から種々の時点（0〜168時間）で放出（イ ンビトロ）されたレプチンに関する高速液体クロマトグラフィー（HPLC）のデー タを示す。分析用サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を、20mMリン酸ナトリウ ム、125mMNaCl(pH7.4)を0.8mL/分で使用するWaters HPLC(Milford,MA)を用いるT osoHaas G2000 SWカラム（Montgomery，PA）で行なった。280nmにおける吸光度 が、実施時間（分）に対してプロットされている。 図５は、以下のサンプルを含有するSDS-PAGEゲル（2〜20％Tris-グリシンゲル (Novex，San Diego，CA)）の図である：レーン1：レプチン基準；レーン2：分子 量基準；レーン3〜9：レプチンを負荷した微粒子からそれぞれ２時間、24時間、 68時間、92時間、116時間、140時間および168時間の時点で放出（インビトロ） されたレプチン；レーン10：分子量基準。サンプルを非還元性SDSバッファーで 希釈し、100℃で５分間加熱し、1μgのタンパク質を各ウェル中に負荷した。該 ゲルをクーマシーブルー（Coomassie Blue）R-250で染色した。 図６は、バッファー対照に対する７日間にわたる体重減少率（％）に関する、 レプチンを負荷した微粒子の正常マウスにお けるインビボ生物活性を示す。毎日10mg/kgで注射されたレプチン(-●-)、0日目 のみに50mg/kgで注射されたレプチン(-×-)、0日目のみに50mg/kgで注射された レプチン負荷微粒子（-■-)、0日目のみに注射された対照微粒子（-○-）が、バ ッファー対照（-＊-）に対してプロットされている。 図７は、BDNFを吸収している微粒子からのBDNFのインビトロ放出を示すプロッ トである。BDNF放出率（％）(BDNFタンパク質濃度は、UV分光光度計で280nmにて 測定した)が、時間(日)に対してプロットされている。 詳細な説明 重合体は、生体適合性および／または生分解性重合体よりなる群から選択する ことができる。本明細書で定義する生分解性は、該組成物がインビボで侵食また は分解されて、より小さな化学種を形成することを意味する。分解は、例えば、 酵素的、化学的または物理的過程により生じうる。本発明での使用が意図される 適当な生分解性重合体には、ポリ(ラクチド)、ポリ(グリコリド)、ポリ(乳酸)、 ポリ(グリコール酸)、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリエーテルエステ ル、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリカルボナート、ポリシアノ ア クリラート、ポリウレタン、ポリアクリラート、それらのブレンドおよび共重合 体が含まれる。 本方法で使用する重合体に関して意図される分子量の範囲は、所望の重合体分 解速度などの因子に基づき、当業者が容易に決定することができる。典型的には 、分子量の範囲は、2000〜2,000,000ダルトンである。適当な溶媒および非溶媒 が存在する限り、ほとんどすべてのタイプの重合体を使用することができる。 本発明で使用する「PGLA」なる語は、乳酸単独の重合体、グリコール酸単独の 重合体、そのような重合体の混合物、グリコール酸と乳酸との共重合体、そのよ うな共重合体の混合物、またはそのような重合体と共重合体との混合物を意味す ると意図される。好ましくは、該生分解性重合体はポリラクチド-コ-グリコリド （PLGA）である。 特に示さない限り、微粒子なる語は、微粒子、ミクロスフェアおよびマイクロ カプセルを含めて使用することが可能である。該微粒子中に取込まれる活性物質 は、生物中に導入されると生物学的作用を示す合成または天然化合物である。意 図される活性物質には、ペプチド、小分子、炭水化物、核酸、脂質および タンパク質が含まれる。使用が意図されるタンパク質には、強力なサイトカイン 、例えば種々の造血因子、例えば顆粒球コロニー刺激因子（図面を含め参照によ り本明細書に組み入れる米国特許第4,810,643号、第4,999,291号、第5,581,476 号、第5,582,823号およびPCT公開第94/17185号を参照されたい）、GM-CSF、M-CS F、MGDF、インターフェロン（α、β、γ、ω）、インターフェロンコンセンサ ス（図面を含め参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,372,808号、第5,5 41,293号、第4,897,471号および第4,695,623号を参照されたい）、インターロイ キン（1〜12）(図面を含め参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,075,22 2号を参照されたい)、エリトロポエチン（EP0）(図面を含め参照により本明細書 に組み入れる米国特許第4,703,008号、第5,441,868号、第5,618,698号、第5,547 ,933号および第5,621,080号を参照されたい)、繊維芽細胞増殖因子、TNF、TNFbp 、IL-1ra、幹細胞因子（図面を含め参照により本明細書に組み入れるPCT公開第9 1/05795号、第92/17505号および第95/17206号）、神経成長因子、GDNF、BDNF、N T3、血小板由来増殖因子、および腫瘍増殖因子（α、β）、オステオプロテゲリ ン（osteoprotegerin(OPG)）、およびOBタ ンパク質（レプチン）が含まれる。 また、本発明の組成物中へ取込みが意図されるものとして、該天然活性成分の 誘導体、融合タンパク質、コンジュゲート、類似体または修飾体が挙げられる。 生物学的に活性なタンパク質の化学修飾は、一定条件下で追加的な利点（例えば 、治療用タンパク質の安定性および循環時間の増加ならびに免疫原性の減少）を もたらすことが判明している。例えば、1979年12月18日付け発行のDavisら,米国 特許第4,179,337号は、ポリエチレングリコール（PEG）に対する水溶性ポリペプ チド（例えば、酵素およびインスリン）のコンジュゲート化を開示している。ま た、1987年１月15日付け公開のWO 87/00056も参照されたい。 本発明の活性成分に関して意図されるもう１つのタイプの化学修飾は、スクシ ニル化である。種々のスクシニル化タンパク質の特性が、Holcenbergら，J．Bio l．Chem，250:4165-4170(1975)および1988年３月10日付け公開のWO 88/01511（ およびそこに引用されている参照文献）に記載されている。 本発明で使用するレプチンは、好ましくは、細菌発現に付随するN末端メチオ ニル残基を所望により有する天然ヒトOBタン パク質［Zhangら，Nature 372:425-432(1994)を参照されたい。また、Nature 37 4 :479(1995)の訂正も参照されたい］のアミノ酸配列を有するものである（後記 「材料および方法」を参照されたい）。1996年２月22日付け公開のPCT公開WO 96 /05309（発明の名称“Modulators of Body Weight，Corresponding Nucleic Aci d and Poteins，and Diagnostic and Therapeutic Uses Thereof”）は、OBタン パク質および関連組成物および方法を十分に記載しており、それを参照により本 明細書に組み入れるものとする。ヒトOBタンパク質のアミノ酸配列は、WO 96/05 309の配列番号４および６（その公開の第172および174員）に記載されており、 該成熟タンパク質の第１アミノ酸残基は、22位に位置し、バリン残基である。該 成熟タンパク質は、146残基（あるいは、49位のグルタミンが存在しない場合に は、145残基（配列番号4））である。本発明での使用が意図される具体的なレプ チン誘導体には、Fc-レプチン融合体、スクシニル化レプチン、および亜鉛誘導 体化レプチン（Zn:レプチン）が含まれる。そのようなレプチンを含有する徐放 組成物を有することが望ましい。なぜなら、そのような組成物は、外因的に投与 された又は内因性のレプチンの有効性を増強するように機能し、 例えば外因性レプチンの投与の必要性を少なくしたり無くすために使用すること が可能だからである。 一般に、該活性物質の水溶液、懸濁液、固体形態を、該重合体を含有する有機 溶媒と混合することができる。活性成分の水溶液を使用する場合には、重合体： 活性成分エマルジョンを生成させ、それを使用して該微粒子を調製する。活性成 分の懸濁液または固体形態を使用する場合には、重合体：活性成分懸濁液を生成 させ、それを使用して該微粒子を調製する。 タンパク質を負荷した微粒子の製造方法の主要な実施形態は、（a）重合体を 有機溶媒に溶解して重合体溶液を得、（b）水溶液、懸濁液および粉末よりなる 群から選ばれる形態の活性成分を該重合体溶液に加えて、第１エマルジョンまた は懸濁液を含む活性成分−重合体混合物を得、（c）該第１エマルジョンまたは 懸濁液を連続相（すなわち、非溶媒）内で分散させて、分散液を得、（d）該分 散液に賦形剤を加えて最終分散液を得、（e）該最終分散液を凍結させ、（f）該 凍結最終分散液を凍結乾燥して種々の溶媒（水性および有機性）を除去して、タ ンパク質を負荷した所望の微粒子を得ることを含む。該方法を図１に図式的に示 す。図１に示すとおり、工程c）は、別法として、該第１ エマルジョンまたは懸濁液を重合体非溶媒で希釈することを含むことが可能であ る。また、工程a）は、該有機重合体溶液中に活性成分を直接溶解して、均一な 第１混合物を生成させることを含むことが可能である。 本方法の工程a）においてPLGAを溶解するために使用する溶媒には、例えば、 クロロホルム、酢酸エチル、塩化メチレン、アセトニトリル、THFおよびアセト ンが含まれる。本発明の1つの実施形態では、使用する溶媒はクロロホルムであ る。工程c）において使用が意図される非溶媒には、水、ヘキサン、エタノール 、メタノールおよび四塩化炭素またはそれらの混合物(例えば、水／エタノール) が含まれる。 本発明方法において使用が意図される重合体濃度は、5〜70gm/100mLである。P LGAを使用する本発明の実施形態では、該重合体濃度は、好ましくは、10〜20gm/ 100mLである。 本発明方法において使用が意図されるタンパク質濃度は、溶液または懸濁液中 では0〜300mg/mL、または同等の固体タンパク質である。レプチンを使用する本 発明の実施形態では、該タンパク質濃度は、好ましくは、100mg/mLである。 本発明方法で得たエマルジョンの場合、使用が意図される有 機物：水性物の比は、1：1から12：1である。PLGAおよびレプチンを使用する本 発明の実施形態では、有機物：水性物の比は、第１エマルジョンに関して、好ま しくは4：1である。通例、本発明方法により製造した微粒子は、一般に、0〜60 重量％のタンパク質を含む。 前記方法の工程d）における凍結乾燥賦形剤の添加は、該微粒子が凍結乾燥中 に凝集または融合しないことを保証するのに有用であることが判明した。1以上 の賦形剤を加えることができる。重要なのは、そのような賦形剤を該方法の工程 b）またはc）で加えることも可能なことである。本方法での使用が意図される凍 結乾燥賦形剤には、乳糖、マンニトール、デキストラン、ショ糖、ヘパリン、グ リシン、グルコース、グルタミン酸、ゼラチン、ソルビトール、デキストロース 、トレハロース、メトセル（methocel）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロ キシエチルデンプン、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(ビニルピロリドン)およ びポリビニルアルコール、またはそれらの種々の組合せ、ならびに当業者に一般 に使用される他のバッファー、タンパク質安定化剤、凍結保護物質および凍結保 存剤が含まれる。 本方法の凍結工程（工程e）での使用が意図される温度は、−283℃（液体窒素 ）〜−20℃である。これらの温度を用いるのは、該エマルジョンまたは懸濁液を 安定化するためである。該最終エマルジョンまたは懸濁液は、前記温度を用いて 直ちに凍結することができ、あるいは凍結前に室温で保存することができる。本 発明の１つの実施形態では、該最終エマルジョンを直ちに凍結し、凍結に用いた 温度は−80℃であった。 本方法の工程f）での使用が意図される温度は、−100℃〜室温である。好まし くは、工程e）の凍結サンプルの温度を−80℃に低下させ、1時間保った後、真空 系に接続する。ついで該温度を、5℃/時間の増加率で−25℃まで段階的に上昇さ せて、該水相およびいずれかの残留有機相を除去する。ついで該サンプルを真空 下で4〜5日間（あるいは真空計が、それ以上の蒸気除去を示さない場合はいつで も）維持し、ついで該温度を6〜8時間、−5℃まで上昇させた後、該サンプルを 該真空系から取り出す。複数の工程を要し面倒な場合が多い既に記載されている 方法に対して、本方法を改良し簡便にするのは、この単一工程（すなわち、該最 終エマルジョンまたは懸濁液の直接凍結乾燥）の利用である。また、重要なこと は、この直接凍結乾燥が、イン ビボにおける多種多様な活性成分の安定性の増強、およびより高い負荷、より高 い負荷効率およびより高い収量の達成をもたらすことである。したがって、当技 術分野で記載されている方法と比べた場合の本方法の顕著な利点には、例えば、 1）活性成分を負荷した微粒子の製造の容易さ、2）使用しうる重合体および／ま たは活性成分のクラスに関する汎用性、3）より高い収量および負荷効率、およ び4）活性な無傷の活性成分をインビボで放出して、長期にわたり（例えば、180 日まで）活性成分の制御放出をもたらす徐放製剤の提供が含まれる。本発明で用 いる「含有（させた）」なる語は、長期にわたる活性成分の制御放出に有用な組 成物中に活性成分を製剤化するための方法を示す。 本発明の徐放組成物においては、活性成分の有効量を使用する。本発明で用い る徐放は、重合体マトリックスから活性成分が長期にわたり徐々に放出されるこ とを意味する。該徐放は、連続的または不連続的、線形または非線形であること が可能であり、これは、1以上の重合体組成物、薬物負荷、賦形剤の選択または 他の修飾により達成することができる。 一般に、本発明は、本発明のタンパク質または誘導体産物の 有効量と、医薬上許容される希釈剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、佐 剤および／または担体とを含んでなる医薬組成物を含む。そのような組成物は、 種々のバッファー含有物（例えば、Tris-HCl、リン酸塩）、pHおよびイオン強度 の希釈剤；添加剤、例えば界面活性剤および可溶化剤（例えば、Tween80、Polys orbate80）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、 保存剤（例えば、Thimersol、ベンジルアルコール）および増量物質（例えば、 乳糖、マンニトール）を含む。例えば、参照により本明細書に組み入れるReming ton's Pharmaceutical Sciences，第18版(1990，Mack Publishing Co.，Easton ，PA 18041)，p.1435-1712を参照されたい。活性成分の有効量は、治療的、予防 的または診断的に有効な量であり、体重、年齢、治療的または予防的または診断 的目的、所望の放出速度などの因子を考慮することにより当業者が容易に決定す ることができる。 本発明に従い製造したタンパク質負荷微粒子の懸濁液は、好ましくは、腹腔内 、皮下または筋肉内への注射により投与する。しかしながら、本発明の組成物を 使用して、他の運搬経路も有効に利用可能なことは、当業者に明らかであろう。 以下の実施例は、本発明をより十分に例示するためのものであり、本発明の範 囲を限定するものではない。実施例１は、タンパク質を負荷した微粒子を製造す るための新規方法を記載する。レプチン（水溶液の形態）を、例示用のタンパク 質として使用し、レプチンを負荷した微粒子がインビトロおよびインビボの両方 でレプチンの徐放をもたらしうることを示す。実施例２は、レプチンを負荷した 微粒子を製造するために、異なる重合体が使用可能なことを示す。実施例３は、 異なるレプチン誘導体および全く異なるタンパク質（すべて、水溶液の形態）が 、本発明の新規方法において使用可能なことを示す。実施例４は、本発明方法の 凍結工程および凍結乾燥工程に対する温度の影響を示す。実施例５は、本発明方 法においてPLGA重合体を溶解するために異なる有機溶媒が使用可能なことを示す 。実施例６は、Zn:レプチン懸濁液およびZn:レプチン凍結乾燥粉末が、本発明の 新規方法において使用可能なことを示す。実施例７は、噴霧乾燥したタンパク質 （噴霧乾燥したIL-1ra）が本発明の新規方法において使用可能なことを示す。実 施例８は、活性成分（例えば、BDNF）を吸収している「ブランク」微粒子がまた 、インビトロで活性成分の徐放をもたらしうることを示す。それに続 いて、材料および方法を示す。 実施例1 本実施例は、タンパク質を負荷した微粒子を製造するための、特に、レプチン を含有するポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)ミクロスフェアを製造するための 新規方法を記載する。 0.6gのRG-502H、ポリ（D,L-ラクチド-コ-グリコリド）（Boehringer Ingelhei m Chemicals(B．I．Chemicals)，Henley Div.，Montvale，NJ）を4mLのクロロホ ルムに溶解し、0.2μmPTFEフィルターで濾過した。10mM酢酸ナトリウム（pH4.8 ）(後記「材料および方法」に記載のとおりに調製)中の100mg/mLのレプチン1mL を、まず、滅菌濾過し、ついで該重合体溶液の上に徐々に加えた。Polytronホモ ジナイザー（PT-DA3012/2Tジェネレーター，Brinkman，Westbury，NY）を使用し て、15,000〜20,000rpmで30〜45秒間、それらの２層をホモジナイズしながら、 該エマルジョン容器を氷浴中に浸した。 得られた第１エマルジョン（w/o）を、15,000rpmで20〜30秒間ホモジナイズし ながら10mLの水に加えた。得られた第２エマルジョン（w/o/w）に、1mLの凍結乾 燥賦形剤（100mg/mLグリシン、100mg/mLショ糖、10mg/mLポリビニル-アルコール （PVA） [分子量22,000，88%加水分解]、10% v/vエタノール）を加え、短時間ホモジナイ ズして、完全な混合が保証されるようにした。光学顕微鏡下の該最終エマルジョ ンは、1〜10μmの自由流動性球状物を示した。該最終エマルジョンをフラスコ中 に注ぎ、−45℃で凍結させた。 ついで該浴の温度を１時間で−80℃に減少させた。−80℃で１時間後、該フラ スコを真空系に接続し、凍結乾燥をまず−80℃で行なった。真空から該系レベル への減少により有機溶媒の除去が測定されうるように、該真空レベルをモニター した。ついで該温度を段階的に5℃/時間の増加率で−25℃まで上昇させて、該水 相およびいずれかの残留有機相の除去を行なった。 4〜5日後（この時点で、真空計は、それ以上の蒸気除去を示さなかった）、該 浴の温度を、6〜8時間、−5℃に上昇させ、ついで該サンプルを該真空系から取 り出した。該微粒子を秤量し、ついで、必要になるまで−20℃で保存した。 また、以下の変更を行なって、前記方法を試験した：1）該第１エマルジョン （w/o）または懸濁液（s/o）を、5,000rpmで30秒間ホモジナイズしながら20mLの 水/エタノール（75%/25%）に加えた；2）10〜40mLの水または冷エタノールを該 第２エマル ジョン（（w/o/w）または（s/o/w））にゆっくりと加え、ついで、凍結前に、該 最終エマルジョンを室温で３時間までインキュベートした；および3）該最終エ マルジョンを、凍結前に、種々の時間間隔（0〜4時間）で室温でインキュベート することにより硬化させた。各場合において、レプチンが負荷された微粒子を得 た。PLGA 微粒子からのレプチンのインビトロ放出 前記のとおりに製造した微粒子からのレプチンの「インビトロ」放出速度論を 、20mLのリン酸ナトリウム、5％ソルビトール（pH7.4）（あるいは、リン酸塩の 代わりに20mMヒスチジンが使用可能）中の該粒子の20mg/mL懸濁液を調製するこ とにより測定した。各時間間隔で、該ミクロスフェア懸濁液を遠心し、該上清中 のレプチン濃度を、UV分光光度計により280nmで、また、SEC-HPLCにより220nmで 測定した。時間経過に対するレプチン放出率（％）を図２に示す。該PLGA微粒子 から放出されたレプチンの完全性を、円二色性（CD）（図3）、HPLC（図4）、イ ンビトロバイオアッセイおよびゲル電気泳動（SDS-PAGE）(図5)により確認した 。該CDデータは、二次構造の保持を示し、HPLCおよびゲル電気泳動は、明らかな 化学分解も凝集も示さな かった。レプチンを負荷した微粒子のインビボ生物活性 20mMリン酸ナトリウム、5％ソルビトール（pH7.4）バッファー中に80〜100mg/ mLの微粒子を懸濁することにより、レプチンを負荷した微粒子の「インビボ」生 物活性を正常なマウスおよびラットにおいて評価した。皮下注射の１時間前に、 該微粒子およびバッファーを5℃の冷室内の振とう機上に配置することにより該 懸濁液を調製した。その後の、注射直前のすべての操作は、冷凍シリンジおよび 25ゲージ針を使用して行なった。バッファー対照に対する体重減少率（％）を、 7日間にわたり測定した。7日目の後、該注射部位の組織学検査のために動物を犠 牲にした。レプチンを負荷した微粒子の単回注射は、7日間で、マウスにおいて 持続的な体重減少を引き起こした（図6）。該注射部位の組織学的検査は、局在 化した最小から軽度の炎症反応を示し、これは、時間経過に伴う該微粒子の生分 解により完全に回復可能であった。実施例2 本実施例は、レプチンを負荷した微粒子の調製物における種々の分子量のPLGA またはブレンドの有効性を試験するよう に計画した。実施例１に記載の製造および評価方法を用いて、以下の表２に示す 種々の重合体を試験した。 表２ * 20：80および50：50の重量比のRG-501HおよびRG-502Hを混合することにより調 製した重合体ブレンド。 ** PLGA(501H)およびPLGA(501H)：PEG(1000)ABブロック共重合体［80：20（重量 比）］のブレンド。 表２に記載の各重合体を使用して、タンパク質が負荷された微粒子を有効に製造 することができた。 実施例3 本実施例は、レプチン誘導体および他のタンパク質を含有する微粒子の製造を 記載する。実施例１に記載の製造および評価方法を用いて、以下の表３に記載の 種々のタンパク質を試験した。 表３a 凍結乾燥バッファー＝10mg/mLグリシン、5mg/mLショ糖、10mMグルタミン酸（p H4.5）。 b 20mM NaAcO（pH4.8）中でタンパク質に対して30：1のモル比で複合化している DMPGまたはDCPG脂質。 前記の各タンパク質を用いて、タンパク質が負荷された微粒子が得られた。この ことは、本発明の新規方法の柔軟性を示している。そして重要なことは、タンパ ク質が負荷された微粒子がまた、種々のレプチン誘導体を使用して有効に製造可 能なこと が示されていることである。 実施例4 本実施例では、本発明方法の凍結工程および凍結乾燥工程に対する温度の影響 を評価した。凍結工程（工程5）に関しては、液体窒素、−80℃および−45℃を 試験した。凍結乾燥工程（工程6）に関しては、−80℃、−45℃および−25℃を 試験した。実施例１に記載の方法を用いて種々の温度を試験したところ、試験し た温度が、該方法の両工程に対して非常に小さな影響しか及ぼさないことが確認 された。 実施例5 本実施例では、本発明方法においてPLGA重合体を溶解するために種々の有機溶 媒を試験した。酢酸エチル、塩化メチレンを使用して、実施例１に記載の方法を 繰返した。該試験有機溶媒のそれぞれは、本発明方法において有効であることが 判明した。実施例6 本実施例は、活性成分懸濁液および／または凍結乾燥粉末が本発明方法におい て使用される可能性を試験した。 10mM Tris、50μM塩化亜鉛（pH7.0）中の100mg/mLのZn/OBタンパク質懸濁液（ 後記「材料および方法」の節に記載のとおりに調製）を、実施例１に記載のとお りに試験し評価した。また、100mgのZn:レプチン凍結乾燥粉末(後記「材料およ び方法」の節に記載のとおりに調製)を試験し評価した。取込まれたZn:レプチン 懸濁液およびZn:レプチン粉末は、本発明の新規方法により微粒子を製造するた めに有効に使用可能であることが示された（インビトロ放出データに関しては、 図２を参照されたい）。 実施例7 本実施例では、噴霧乾燥したタンパク質、噴霧乾燥したIL-1raが本発明方法に おいて使用される可能性を試験した。150mgの噴霧乾燥IL-1ra粉末（後記「材料 および方法」の節に記載のとおりに調製）を、実施例１に記載のとおりに試験し 評価した。該噴霧乾燥IL-1ra調製物は、本発明の新規方法により微粒子を製造す るために有効に使用可能であることが示された。実施例8 本実施例では、実施例１に記載の方法を改変して、20mM NaAcO（pH4.8）を、 まず、該重合体と混合して、「ブランク」微粒子を製造した。ついで6mgのブラ ンク微粒子を1mLのBDNF（0.1Mリン酸ナトリウム(pH6.9)中、4.4mg/mL）で希釈し 、該混合物を、振とうしながら37℃でインキュベートした。2時間後、微粒子を 遠心分離により単離し、未結合タンパク質画分をUV分光光度計で測定した。1.76 gのBDNFが重合体に結合して、該微粒子上で22％のタンパク質負荷を与えた。つ いで、実施例１に記載のとおり、インビトロ放出速度論を測定した。時間経過に 対するBDNF放出率（％）を図７に示す。材料および方法 1．組換えメチオニルヒトレプチンの調製 この組換えメチオニル-ヒト-レプチンは、参照により本明細書に組み入れる前 記PCT公開WO 96/05309（第151〜159頁）に従い調製することができる。この実施 例では、35位にアルギニンの代わりにリシンを、74位にイソロイシンの代わりに イソロイシンを有する（第158頁のアミノ酸配列と比較した場合）ヒトレプチン を使用した。他の組換えヒトレプチンは、組換えDNA 技術を用いるタンパク質発現の分野で一般に公知の方法に従い調製することがで きる。 2．組換えメチオニルスクシニル化ヒトレプチンの調製 この組換えメチオニルスクシニル化ヒトレプチンは、リン酸ナトリウムバッフ ァー（pH7.0）中の〜150mg/mLの組換えヒトレプチンと3〜7モル過剰の無水コハ ク酸とを4℃で２時間反応させることにより調製した。該反応は、固体ヒドロキ シルアミンを最終濃度0.5MおよびpH8.5まで加えることによりクエンチする。つ いで該反応混合物を10mMリン酸ナトリウム（pH7.0）に対して透析し、モノスク シニル化レプチン形態を、ジ-およびポリ-スクシニル化レプチン形態から、イオ ン交換クロマトグラフィーにより分離する。 3．亜鉛誘導体化組換えメチオニルヒトレプチン懸濁液の調製 この亜鉛誘導体化組換えメチオニルヒトレプチン懸濁液は、133mg/mLの組換え ヒトレプチンのサンプル752μlを1mM HCl中に取り、48μlの水、ついで500μM塩 化亜鉛100μl、ついで1M TRIS(pH8.5)100μlを加えることにより調製した。室温 で溶液から急速に析出するZn:レプチンの沈殿が直ちに生じるが、これは、容易 に再懸濁させることが可能である。 4．亜鉛誘導体化組換えメチオニルヒトレプチン凍結乾燥粉末の調製 この亜鉛誘導体化組換えメチオニルヒトレプチン凍結乾燥粉末の凍結乾燥を、 ビルティスシェルフ（Virtis shelf）凍結乾燥機中で行なった。簡単に説明する と、Zn:レプチン懸濁液をシェルフ上で−50℃で凍結し、2時間維持した。該サン プルを−25℃で２時間アニールさせ、ついで−50℃で再び凍結させた。シェルフ 温度を−50℃で２時間維持しながら、チャンバー内の圧力を100mTorrまで低下さ せた。該シェルフ温度を−25℃まで上昇させ、10時間保ち、その間、チャンバー 内の圧力を100mTorrに維持することにより、一次乾燥を行なった。該シェルフ温 度を７時間かけて25℃まで傾斜上昇（ramping）させ、10時間保ち、その間、チ ャンバー内の圧力を100mTorrに維持することにより、二次乾燥を行なった。二次 乾燥の終了時に該サイクルを終了し、該チャンバーを大気圧に通気し、凍結乾燥 産物を該凍結乾燥機から取り出した。 5．噴霧乾燥組換えIL-1raの調製 この噴霧乾燥組換えIL-1raタンパク質は、Buchi 190小型噴霧乾燥機を使用し て20mg/mLのIL-1ra溶液を噴霧乾燥すること により調製した。噴霧乾燥中の入口および出口の温度は、それぞれ、130℃およ び90℃であった。供給速度は1〜2mL/分であり、噴霧乾燥されたIL-1ra粉末が得 られた。 本発明は一定の好ましい実施形態に関して説明されているが、変更および修飾 が当業者に見出されると理解される。したがって、添付の請求の範囲は、特許請 求されている本発明の範囲内に含まれる同等なすべての変更を含むと意図される 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 重合体微粒子内に含有させた活性成分を含む組成物の製造方法であって、 該活性成分と該重合体との混合物を連続相内に分散させ、得られた分散液を凍結 させ、水および有機溶媒を凍結乾燥により該分散液から除去することを特徴とす る製造方法。 ２． 該連続相が水性相または有機相またはそれらの混合物である、請求項１に 記載の製造方法。 ３． 該連続相への添加前に、該活性成分の水溶液を、該重合体を含有する第２ の非水相中に分散させることにより、該活性成分−重合体混合物を得る、請求項 １に記載の製造方法。 ４． 該連続相への添加前に、該活性成分−重合体混合物の両成分を非水性溶媒 中に溶解することにより、該活性成分−重合体混合物を得る、請求項１に記載の 製造方法。 ５． 該活性成分を該重合体の非水性溶液中の固体粒子の分散液として存在させ 、ついでそれを該連続相に加える、請求項１に記載の製造方法。 ６． 該活性成分を該混合物中に混合するのを省略して、ブランク重合体微粒子 を得る、請求項１に記載の製造方法。 ７． 該ブランク重合体微粒子を活性成分溶液中に懸濁させることにより、該ブ ランク重合体微粒子上に活性成分を負荷することを更に含む、請求項６に記載の 製造方法。 ８． 該分散液中に含有させる前の該活性成分−重合体混合物と１以上の賦形剤 とを一緒にする、請求項1〜7のいずれか１項に記載の製造方法。 ９． 該連続相が１以上の賦形剤を含有する、請求項1〜7のいずれか１項に記載 の製造方法。 10． １以上の賦形剤を該活性成分と混合し、同一または異なる賦形剤を該連続 相中に存在させる、請求項1〜7のいずれか１項に記載の製造方法。 11． 該重合体が、生分解性および／または生体適合性重合体よりなる群から選 ばれる、請求項１に記載の製造方法。 12． 該生分解性重合体が、ポリ(ラクチド)、ポリ(グリコリド)、ポリ(乳酸)、 ポリ(グリコール酸)、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリエーテルエステ ル、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリカルボナート、ポリシアノ アクリラート、ポリウレタン、ポリアクリラート、それらのブレンドおよび共重 合体よりなる群から選ばれる、請求項11に記載の製造方法。 13． 該重合体がポリ(ラクチド-コ-グルコリド)(PLGA)であり、該重合体を、ク ロロホルム、酢酸エチル、塩化メチレン、アセトニトリル、THFおよびアセトン よりなる群から選ばれる有機溶媒中に溶解する、請求項12に記載の製造方法。 14． 該活性成分が、ペプチド、小分子、糖、炭水化物、核酸、脂質およびタン パク質よりなる群から選ばれる、請求項1〜10のいずれか１項に記載の製造方法 。 15． 該活性成分が、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MGDF、インターフェロン（α、β およびγ）、インターフェロンコンセンサス、インターロイキン（1〜12）、エ リトロポエチン（EPO）、繊維芽細胞増殖因子、TNF、TNFbp、IL-1ra、幹細胞因 子、神経成長因子、GDNF、BDNF、NT3、血小板由来増殖因子、腫瘍増殖因子(α、 β)、OPGおよびレプチン；またはそれらの誘導体、類似体、融合体、コンジュゲ ートもしくは化学修飾体よりなる群から選ばれるタンパク質である、請求項14に 記載の製造方法。 16． 該タンパク質がレプチンまたはその誘導体、類似体、融合体、コンジュゲ ートもしくは化学修飾体である、請求項15に記載の製造方法。 17． レプチンの該修飾体が、Fc-レプチン融合体、スクシニル 化レプチンおよび亜鉛誘導体化レプチンよりなる群から選ばれる、請求項16に記 載の製造方法。 18． 該タンパク質がG-CSFまたはその誘導体、類似体、融合体、コンジュゲー トもしくは化学修飾体である、請求項15に記載の製造方法。 19． 該タンパク質がBDNFまたはその誘導体、類似体、融合体、コンジュゲート もしくは化学修飾体である、請求項15に記載の製造方法。 20． 請求項1〜15のいずれか１項に記載の製造方法により製造される、活性成 分の徐放のための医薬組成物。 21． 重合体微粒子内に含有させたレプチンまたはその誘導体、類似体、融合体 、コンジュゲートもしくは化学修飾体を含んでなる医薬組成物。 22． 重合体微粒子内に含有させたG-CSFまたはその誘導体、類似体、融合体、 コンジュゲートもしくは化学修飾体を含んでなる医薬組成物。 23． 重合体微粒子内に含有させたBDNFまたはその誘導体、類似体、融合体、コ ンジュゲートもしくは化学修飾体を含んでなる医薬組成物。