MXPA99009383A - Microparticulas biodegradables para la liberación prolongada de fármacos terapéuticos - Google Patents
Microparticulas biodegradables para la liberación prolongada de fármacos terapéuticosInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a métodos mejorados para la elaboración de micropartículas poliméricas, que contienen una variedad de ingredientes activos, p. ej. fármacos de proteínas. Además, la presente invención se refiere al uso de la proteína activa anterior que contiene las micropartículas poliméricas para preparar las composiciones para la liberación prolongada de los terapéuticos.
Description
MICROPARTICULAS BIODEGRADABLES PARA LA LIBERACIÓN PROLONGADA DE FÁRMACOS TERAPÉUTICOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención, en general se refiere a los métodos mejorados para la elaboración de micropart ículas poliméricas biodegradables que contienen un ingrediente activo. Además, la presente invención se refiere al uso de las micropart ículas para preparar las composiciones para la liberación prolongada de los terapéuticos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Debido a los recientes avances en las tecnologías genética y celular, las proteínas conocidas que exhiben varias acciones farmacológicas in vi vo son capaces de la producción en grandes cantidades para aplicaciones farmacéuticas. Tales proteínas incluyen e rit ropoyet ina (EPO), factor de estimulación de colonia granulocí tica (G-CSF), interferones (alfa, beta, gama, consenso), factor de necrosis tumoral que enlaza proteínas (TNFbp), antagonista del receptor de interleucma-1 (IL-lra), factor neurotrópico derivado del "cerebro (BDNF), factor de crecimiento querat inocí t ico (KGF), factor de células madre REF.: 31376 (SCF), factor de diferenciación del crecimiento megacariocítico (MGDF) , os tebprotegerina (OPG) , factor neutrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) y proteína de la obesidad (proteína OB) . La proteína OB también podría ser referida aquí como leptina.
Debido a que estas proteínas tienen en general vidas medias cortas in vi vo _y biodisponibilidad oral insignificante, se administran típicamente por inyección frecuente, de esta manera poseen un peso físico significativo sobre el paciente y costos administrativos asociados. Como tal, existe actualmente una gran parte de interés en el desarrollo y evaluación de las formulaciones de liberación prolongada. Las formulaciones de liberación prolongada efectivas, pueden proporcionar un medio de control de los niveles sanguíneos del ingrediente activo, y también proporcionar eficiencia superior, seguridad, conveniencia y obediencia del paciente. Desafortunadamente, la inestabilidad de la mayoría de las proteínas (p. ej . la desnaturalización y la pérdida de la bioactividad debido a la exposición al calor, disolventes orgánicos, etc.) ha limitado ampliamente el desarrollo y evaluación de las formulaciones de liberación prolongada.
Los intentos para desarrollar las formulaciones de liberación prolongada, han incluido el uso de una variedad de micropartículas de polímeros biodegradables y no biodegradables (p. ej . poli ( lact ida-co-glicolida ) ) que contienen el ingrediente activo (ver p. ej . , Wise et al., Con tra cept i on , 8. : 227-234 (1 91 3 ) ; y Hutchinson et al., Bi o chem . So c . Tran s . , 13_ : 520-523 (1985)), y se conocen una variedad de técnicas mediante las cuales los agentes activos, p. ej . proteínas, pueden incorporarse en las microesferas poliméricas (ver p. ej . , la Patente U.S. No. 4,675,189 y las referencias citadas aquí) .
Una de tales técnicas es el secado por atomizado, en donde el polímero y el ingrediente activo se mezclan en un disolvente para el polímero, y después se evapora el disolvente atomizando la solución, sacando las gotas poliméricas que contienen el—ingrediente activo. Para una revisión detallada del secado por atomizado ver p . ej . Masters, K., X Spray Dryin g Handbook" (John Wiley & Sons, eds . , New York 1984) . Aunque la técnica de secado por atomizado ha probado ser útil en ciertos casos, aún sufre del hecho de que las proteínas biológicamente activas frecuentemente se desnaturalizan debido al contacto con el polímero orgánico y el disolvente, o debido al calor generado durante los procesos de secado por atomizado.
Otra técnica que puede usarse para formar microesferas es la~ evaporación del disolvente. La evaporación del disolvente involucra la disolución del polímero en un disolvente orgánico que contiene el ingrediente activo ya sea disuelto o disperso. La mezcla del ingrediente del polímero/activo, después se adiciona a una fase continua agitada que es típicamente acuosa. Los emuls ificantes se incluyen en la fase acuosa para estabilizar la emulsión de aceite en agua. El disolvente orgánico, después se evapora durante un periodo de varias-horas o más, por lo cual se deposita del polímero alrededor del material del núcleo. Para una revisión completa del procedimiento de evaporación del disolvente, ver p . ej . la Patente U.S No. 4,389,330 (y las referencias citadas aquí) . Como con la técnica de secado por atomizado, las técnicas de evaporación del disolvente, han demostrado ser útiles en ciertos casos. Sin embargo, la técnica a menudo no se prefiere debido a que el ingrediente activo frecuentemente se pierde durante el proceso de extracción del disolvente. Esto es debido a que el proceso involucra la emulsif icación en una fase acuosa, y un fármaco soluble en agua será frecuentemente dividido rápidamente de la mayoría de la fase de la solución del polímero hidrofóbico en los alrededores acuosos.
Aún, otra técnica que puede usarse para formar microesferas es la separación de fases, que involucra la formación de una emulsión de agua en aceite o una emulsión de aceite en agua. El polímero se precipita de la fase continua sobre el agente activo mediante un cambio en la temperatura, pH, fuerza iónica o la adición de los precipitantes. Para una revisión de las técnicas de separación de fases, ver p. ej . la Patente U.S No. 4,675,800 (y referencias citadas aquí) . Nuevamente, este proceso sufre principalmente de la pérdida del ingrediente activo debido a la desnaturalización.
Las características de la liberación para el ingrediente activo de las micropartículas preparadas mediante los métodos, tal como los descritos anteriormente, podrían ser continuos o discontinuos, y en algunos casos, el nivel inicial de la liberación del ingrediente activo es demasiado alta o demasiado baja. Así, se utilizan a menudo varios aditivos en un intento para controlar la liberación del ingrediente activo (ver, p . ej . EP 0 761 211 Al, publicado el 12 de Marzo, 1997) .
Para evitar la desnaturalización de la proteína y otras moléculas biológicas frágiles que se presentan en el secado por atomizado, la evaporación del disolvente o la separación de fases mediante las técnicas clásicas, la emulsión de los polímeros y él ingrediente activo pueden atomizarse en la sobrecapa que no es del disolvente congelado con gas licuado tal como nitrógeno para formar partículas, y después extraerse a temperaturas muy bajas. Las temperaturas de procesamiento extremadamente bajas, podrían preservar la actividad e integridad de las moléculas biológicas frágiles tal como las proteínas. Sin embargo, el método conduce a las eficiencias y rendimientos de carga pobres, resultando en la pérdida del material biológico precioso, y causa problemas, es difícil y costoso para implementar a las grandes escalas requeridas para la producción comercial.
claramente, aún existe la necesidad para un método mejorado para preparar las micropartículas poliméricas que contienen un ingrediente activo que es simple, barato, versátil, y de forma más importante, que protege contra la pérdida de la actividad de la proteína y que proporciona altas eficiencias y rendimientos de carga, por lo cual se permite la liberación más consistente del ingrediente activo durante un período de tiempo extendido.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Como se describe completamente más adelante, la presente invención proporciona un método mejorado para la preparación de micropartículas poliméricas que contienen un ingrediente activo a través de la utilización única de liofili zación directa de la emulsión o suspensión. Este método mejorado proporciona varias ventajas significati as sobre los procesos descritos en el arte, incluyendo, por ejemplo, 1) facilidad de elaboración de las micropartículas cargadas del ingrediente activo (p. ej . menos etapas que causan problemas); y 2) el suministro de formulaciones de liberación prolongada que mantienen la actividad e integridad del ingrediente activo durante la liberación, proporcionando de esta manera la liberación controlada del ingrediente activo en un período de tiempo extendido. Adicionalmente, los procesos de la presente invención proporcionan las ventajas de versatilidad con relación a la clase de polímeros y/o el ingrediente activo que podría utilizarse, así como el éxito de rendimientos superiores, carga alta y eficiencias de carga superiores.
Por lo tanto, un aspecto de la presente invención se refiere a un proceso nuevo y mejorado para preparar una composición que comprende un ingrediente activo contenido dentro de las micropartículas poliméricas, en donde una mezcla del ingrediente activo y el polímero se dispersan en una fase continua, la dispersión resultante se congela, y el agua y disolventes orgánicos se retiran de la dispersión mediante liofili zación . De manera relevante, el presente proceso es más refinado y más simple que los descritos en el arte, y la actividad e integridad del ingrediente activo se mantienen a través de todo el proceso.
Él presente proceso, en general, puede describirse comprendiendo las etapas de: (a) preparar una solución polimérica; (b) adicionar un ingrediente activo para producir una mezcla; (c) dispersar la mezcla dentro de una fase continua, p. ej . no disolvente ( s ) , para producir una dispersión; (d) adicionar un excipiente a la dispersión; (e) congelar la dispersión- para producir una mezcla conge lada; y (f) liofilizar la mezcla congelada para producir las micropart ículas-que contienen el ingrediente activo deseado. Alternativamente, la etapa (b) puede omitirse y se preparan las micropartículas "huecas", sobre las cuales después se carga el ingrediente activo, suspendiendo las micropartículas huecas en la solución del ingrediente activo.
Un segundo aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica para la liberación prolongada de un ingrediente activo que comprende un ingrediente biológicamente activo contenido dentro de las micropartículas poliméricas, o, alternativamente, un ingrediente biológicamente activo cargado sobre las micropartículas poliméricas. De manera importante, las composiciones de liberación prolongada de la presente invención, mantienen la actividad e integridad del ingrediente activo durante la encapsulación y liberación, lo que ayuda para proporcionar largos períodos de liberación consistente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 es un esquema del proceso de la presente invención para la elaboración de las micropartículas que contienen el ingrediente activo.
La Figura 2 es una gráfica que representa la liberación ín vi t ro de varias micropartículas cargadas de proteínas. Las microparticulas que contienen la leptina (incorporada en forma líquida) se representan mediante la línea -A-; las micropartículas que contienen la Znrleptina (incorporada en forma de suspensión) se representan mediante la línea -•-; y las micropartículas que contienen la Zn:leptina (incorporada en forma de polvo) se representan mediante la línea -M- . El % de leptina liberada (concentración de leptina que se ha determinado mediante el espect rofotómet ro UV a 280 nm) se gráfica vs . el tiempo (días) .
La Figura 3 muestra los resultados del dicroismo circular (DC) que comparan la leptina liberada a partir de las micropartículas cargadas de leptina ( i n vi t ro ) en el día 7 (línea sólida) vs . una muestra de control de leptina en la formulación amortiguadora (línea punteada) . Los espectros DC, se obtuvieron con un espect ropolar ímet ro Jasco J-720 (Japan Spect roscopic Co . , Tokio, Japan) . Las muestras (3.5 µM como se determinó mediante A280) se analizaron a 22°C con una longitud de ruta celular de 0.1 cm .
La Figura 4 muestra los resultados de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para la leptina liberada de las micropartículas cargadas de leptina ( í n vi t ro ) a varios puntos de tiempo (0 a 168 horas) . La cromatografía de exclusión de tamaño analítica (SEC) , se realizó con una columna SW G2000 TosoHaas (Montgomery, PA) usando una HPLC Waters (Milford, MA) con fosfato de sodio 20 mM, NaCl 125 mM, pH 7.4 a 0.8 mL/min. La absorbencia a 280 nm se gráfica vs . el tiempo de recorrido (minutos) .
La Figura 5 es uña ilustración de un gel SDS-PAGE (gel Tris-glicina 2-20% (Novex, San Diego, CA) ) que contiene las siguientes muestras: carril 1: leptina estándar; carril 2: pesos moleculares estándares; carriles 3-9: leptina liberada de las micropartículas cargadas de leptina ( i n vi tro ) a 2 horas, 24 horas, 68 horas, 92 horas, 116 horas, 140 horas y 168 horas, respectivamente; carril 10, pesos moleculares estándares. Las muestras se diluyeron con amortiguador SDS no reducido, se calentaron a 100 ° C durante cinco minutos y 1 µg de proteína se cargó en cada pozo. Los geles se tiñeron con azul coomassie R-250.
La Figura 6 muestra la bioactividad in vi vo de las micropartículas cargadas de leptina en ratones normales, en términos del % de la pérdida de peso corporal con relación al amortiguar de control durante un periodo de 7 días. El amortiguador de control (-*-) se gráfica vs . la leptina inyectada @ 10 mg/kg diariamente (-•-) vs . la leptina inyectada @ 50 mg/kg solo en el día 0 (-x-) vs . las micropartículas cargadas de leptina inyectadas @ 50 mg/kg solo en el día 0 _(-_i-) vs . el control de micropartículas inyectadas en el día solo en el día (-o-) .
La Figura 7 es una gráfica que representa la liberación in vi t ro de BDNF de las micropartículas sobre las que el BDNF se había absorbido. El % de BDBF liberado (concentración de proteína BDNF que se ha determinado mediante el espect rofotómetro UV a 280 nm) se gráfica vs . el tiempo (días) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los polímeros podrían seleccionarse del grupo que consiste de polímeros biocompat ibles y/o biodegradables. Como se define aquí, biodegradable significa que la composición corroerá o degradará i n vi vo para formar especies químicas más pequeñas. La degradación podría presentarse, por ejemplo, mediante procesos enzimáticos, químicos o físicos. Los ~ polímeros biodegradables apropiados contemplados para usarse en la presente invención incluyen po1 i ( 1 ct ida ) s , poli (glicolida) s, poli (ácido láctico) s, poli (ácido glicólico) s, polianhídridos, poliortoésteres, policaprolactona, polie s t eramidas , policarbonato, policianoacr ilat o , poliuretanos, pol iacrilat o , mezclas y copolímeros de los mismos .
El rango de pesos moleculares contemplados para los políme'ros para ser usados en los presentes procesos, puede determinarse fácilmente por una persona experta en el arte, basado en tales factores de velocidad de degradación del polímero deseado. Típicamente, el rango de peso molecular será de 2000 a 2,000,000 Daltons. Casi cualquier tipo de polímero puede usarse, que proporciona el disolvente y no disolvente apropiado.
El término " PGLA" como se usa aquí se refiere a un polímero de ácido láctico sólo, un polímero de ácido glicólico sólo, una mezcla de tales polímeros, un copolímero del ácido glicólico y ácido láctico, una mezcla de tales copolímeros, o una mezcla de tales polímeros y copolímeros. Preferentemente", el polímero biodegradable será poli lactida-co-gl icolida (PLGA).
A menos que se indique lo contrario, el término micropartículas puede usarse para abarcar las micropartículas, microesferas y microcápsulas . Los agentes activos se van a incorporar en las micropartículas son compuestos sintéticos o naturales que demuestran un efecto biológico cuando se introducen en una criatura viviente. Los agentes activos contemplados incluyen péptidos, moléculas pequeñas, carbohidratos, ácidos nucleicos, lípidos y proteínas. Las proteínas contempladas para el uso incluyen citocinas potentes,- incluyendo varios factores hematopoyét icos , tal como los factores de estimulación de colonia granulocít ica (ver las Patentes U.S Nos. 4,810,643, 4,999,291, 5,5^81,476, 5,582,823 y la Publicación PCT No. 94/17?85, incorporada aquí por referencia incluyendo los dibujos), GM-CSF, M-CSF, MGDF, los interferones (alfa, beta, gama, omega), el interferón de consenso (ver las Patentes U.S Nos. 5,372,^808, 5,541,293, 4,897,471 y 4, 695", 623 incorporadas aquí por referencia incluyendo los dibujos), las interleucinas (1-12) (ver la Patente U.S No. 5,075,222, incorporada aquí por re fer_encia incluyendo los dibujos), eritropoyetina (EPO) (ver -" las Patentes U.S Nos. 4,703,008, 5,441,868, 5,618,698, 5,547,933 y 5,621,080 incorporadas aquí por referencia incluyendo los dibujos), factor de crecimiento del fibroblasto, TNF, TNFbp, Il-lra, factor de las células madre (Publicaciones PCT Nos. 91/05795, 92/17505 y 95/17206, incorporadas aquí por referencia incluyendo los dibujos), factor de crecimiento nervioso, GDNF, BDNF, NT3, factor de crecimiento derivado de plaquetas y factor de crecimiento tumoral (alfa, beta), os teoprotegerina (OPG) y proteína OB (leptina) .
También se contemplan para la incorporación en las composiciones de la presente invención, derivados, las proteínas de fusión, conjugados, formas análogas o las formas^ modificadas de los ingredientes activos naturales. La modificación química de las proteínas biológicamente activas, se han encontrado que proporciona ventajas adicionales bajo ciertas circunstancias, tal como el incremento de la estabilidad y el tiempo de circulación de la proteína terapéutica y la inmunogenicidad disminuida. Por ejemplo, la Patente U.S No. 4,179,337, Davis et al., publicada el 18 de diciembre de 1979, expone la conjugación de los polipéptidos solubles en agua tal como enzimas e insulina para polietilenglicol (PEG); ver tambi én WO 87/00056, publicada el 15 de enero de 1987.
Otro tipo de modificación química contemplada para los ingredientes activos de la presente invención es la succinilación . Las propiedades de varias proteínas succiniladas se describen en Holcenberg et al., J . Bi ol . Ch em / 250 : 4165-4170 (1975) y la WO 88/01511 (y las referencias citadas aquí) , publicada el 10 de marzo de 1988.
Las presentes leptinas usadas son preferentemente aquellas con la secuencia de ^aminoácido de la proteína OB natural de humano; ver Zhang et al., Na t ure 372: 425-432 (1994); ver tambi én , la Correc t i on a t Na ture 374 : (1995), opcionalmente se usa con un residuo de metionilo N-terminal para la expresión bacteriana. ( Ver , Ma t eri a l s a nd Me th ods , in fra ) . La publicación del PCT No. WO 96/05309, publicada el 22 de febrero de 1996, titulada, "Modulators of Body Weight, Corresponding Nucleic Acids and Proteins, and Diagnostic and Therapeutic Uses Thereof" satisfice completamente la proteína OB las composiciones y métodos relacionados, y se incorpora aquí por referencia. Una secuencia de aminoácido para la proteína OB humana se establece en la WO 96/05309 Sec. ID Nos. 4 y 6 (en las páginas 172 y 174 de tal publicación), y el primer residuo de aminoácido de la proteína madura está en la posición 22 y es un residuo de valina. La proteína madura es de 146 residuos (o 145 si la glutamina en la posición 49 está ausente, Sec. ID No. 4) . Los derivados leptina específicos contemplados para el uso en la presente invención, incluyen fusiones de Fc-leptina, leptina succinilada y leptina derivada de zinc (Zn:lept?na) . Es deseable tener tal leptina que contiene las composiciones de liberación prolongada conforme tales composiciones podrían servir para mejorar las efectividades del leptina ya sea administrada exógenamente o la leptina endógena, o podría usarse, por ejemplo, para reducir o eliminar la necesidad para la administración de la leptina exógena .
En general, una solución acuosa, una suspensión, o una forma sólida del agente activo puede mezclarse con el disolvente orgánico que contiene el polímero. Cuando se usa una solución acuosa del ingrediente activo, las emulsiones del ingrediente activo del polímero serán formadas y usadas para preparar las micropartículas. Cuando se usa una suspensión o forma sólida del ingrediente activo, se forman y usan las suspensiones del ingrediente polímero activo para preparar las micropart ícúlas .
La principal modalidad del método para la elaboración de las micropartículas cargadas de proteínas comprende: (a) disolver un polímero en un disolvente orgánico para producir una solución polimérica; (b) adicionar un ingrediente activo en una forma seleccionada del grupo que consiste de una solución acuosa, una suspensión, y un polvo a la "solución polimérica para producir una mezcla del polímero del ingrediente activo que comprende una primera emulsión o suspensión; (c) dispersar la primera emulsión o suspensión dentro de una fase continua, p. ej . , no disolvente ( s ) , para producir una dispersión; (d) adicionar un excipiente a la dispersión para producir una dispersión final; (e) congelar la dispersión final; y (f) liofilizar la dispersión final congelada para retirar los diferentes disolventes (acuosos y orgánicos) para producir las micropartículas cargadas de proteína deseadas. El proceso se muestra esquemáticamente en la Figura 1. Como se representa en la Figura 1, la etapa c) puede alternativamente comprender la dilución de la primera emulsión o suspensión con un polímero no disolvente. Adicionalmente, la etapa _a) puede comprender el ingrediente activo que se disuelve directamente en la solución del polímero orgánico para formar una primer mezcla homogénea.
El disolvente que se va a usar para disolver la PLGA en la etapa a) del presente proceso incluye, por ejemplo, cloroformo, acetato de etilo, cloruro de metileno acet on t rilo , THF y acetona. En una modalidad de la presente invención, el disolvente que va a usarse es cloroformo. Los no disolventes contemplados para usar en la etapa c) incluyen agua, hexano, etanol, metanol y tetracloruro de carbono o mezclas de los mismos (p> ej . agua/et anol ) .
Las concentraciones del pplímero contempladas para el uso en los procesos de la presente invención, están en el rango de 5-70 gm/100 mL . En las modalidades de la presente invención que utilizan PLGA, la concentración del polímero estará preferentemente en el rango de 10-20 gm/100 L .
!9 Las concentraciones de proteína contempladas para el uso eñ los procesos de la pre senté invención están en el rango de 0-300 mg/mL cuando están en solución o suspensión o la proteina sólida equivalente. En las modalidades de la presente invención que usan la leptina, la concentración de proteína es preferentemente de 100 mg/mL.
Para las emulsiones producidas en los procesos de la presente invención, las -relaciones orgánica:acuosa contempladas para el uso son 1:1 a 12:1. En.-las modalidades de la presente invención que usan PLGA y leptina,! la relación orgánica: acuosa será preferentemente de 4:1 para la primer emulsión. En general, las micropartículas preparadas mediante los métodos de la presente invención, comprenderán generalmente 0-60% en peso de la proteína.
La adición de un excipiente de liofili zación en la etapa d) del proceso descrito anteriormente, se encontró que era útil para asegurar que las micropartículas no se agregaron o fusionaron durante la liofilización . Podrían adicionarse uno o más excipientes. De manera importante, tales excipientes, también podrían adicionarse en la etapa b) o c) del proceso. Los excipientes de liofili zación contemplados para el uso eh los presentes procesos, incluyen lactosa, manitol, dextrano, sacarosa, heparina, glicina, glucosa, ácido glutámico, gelatina, sorbitol, dextrosa, trehalosa, metocel, hidroxi etil celulosa, almidón de hidroxi etilo poli (etilen glicol), poli (vinil pirrolidona) y alcohol polivinílico o varios combinaciones de los mismos, así como otros amortiguadores, est bilizadores de proteínas, cr ioprot ect ores y ciropreservat ivos comúnmente usados para aquellos expertos en el arte .
Las temperaturas contempladas para el uso en la etapa de congelado (etapa e) de los presentes procesos están en el rango de -283°C (nitrógeno líquido) a -20°C. Estas temperaturas se usan para estabilizar las emulsiones o suspensiones. La emulsión o suspensión final puede congelarse inmediatamente usando las temperaturas descritas anteriormente, o pueden almacenarse a temperatura ambiente antes del congelado. En una modalidad de la presente invención, la emulsión final se congeló inmediatamente y la temperatura se usada para el congelado fue de -80°C.
Las temperaturas contempladas para el uso en la etapa f) de los presentes procesos están en el rango de -100°C hasta la temperatura ambiente. Preferentemente, la temperatura de la muestra congelada de la etapa e) se disminuirá a -80°C y se mantendrá durante una hora antes de ser conectada al sistema de vacío. Después la temperatura se aumenta etapa-por etapa en incrementos de 5°C/hora a -25°C para efectuar la remoción de la fase acuosa y cualquier fase orgánica residual. La muestra después se mantiene a vacío durante 4-5 días (o en cualquier parte en donde el medidor de vacío _no indique más remoción de vapor), y después de que la temperatura aumente hasta -5°C durante 6-6 horas antes de la remoción de la muestra del sistema de vacío. Es la utilización de esta etapa simple, i . e . , - liofilización directa de la emulsión o suspensión final, que refina y simplifica el presente proceso sobre los procesos descritos previamente, en los que se requieren múltiples etapas y frecuentemente causan problemas. Y, de manera importante, esta liofili zación directa proporciona la estabilidad mejorada para una amplia variedad del ingrediente activo i n vi vo , así como el éxito de mayor carga, mayores eficiencias de carga, y mayores rendimientos. De esta manera, las ventajas significativas de los procesos actuales comparados con los procesos descritos en el arte, incluyen por ejemplo, 1) la facilidad de elaboración de las micropartículas cargadas del ingrediente activo; 2) versatilidad con relación a la clase de polímeros y/o los ingredientes activos que podrían utilizarse; 3) mayores rendimientos y eficiencias de carga; y 4) el suministro de las formulaciones de liberación prolongada que liberan el ingrediente activo, activo intacto in vi vo , proporcionando de esta manera la liberación controlada del ingrediente activo sobre un período de tiempo extendido (p. ej . hasta 180 días) . Como se usa aquí la frase "contenido dentro" representa un método para formular un ingrediente en una composición útil para la liberación controlada, durante un período de tiempo extendido del ingrediente activo.
En las composiciones de liberación prolongada de la presente invención, se utilizará una cantidad efectiva del ingrediente activo. Como se usa aquí, la liberación prolongada se refiere a la liberación gradual del ingrediente activo desde la matriz de polímero, durante un período de tiempo extendido'. La liberación prolongada puede ser continua o discontinua, lineal o no lineal y esta puede realizarse usando una o más composiciones de polímeros, cargas de fármacos, selección de excipientes u otras modificaciones.
En general, se comprenden por la presente invención, las composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades efectivas de productos proteínicos o derivados de la invención junto con los diluyentes, estabilizadores, preservativos, solubilizadores , emulsi ficantes , adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen diluyentes o varios contenidos de amortiguador (p. ej . , Tris-HCl, fosfato), pH y fuerza iónica, aditivos tales como detergentes y agentes solubili zant es (p. ej . , Tween 80, Polysorbate 80), antioxidantes (p. ej . , ácido ascórbico, met abisulfi t o de sodio), preservativos (p. ej . , Trimersol, alcohol bencílico) y sustancias voluminosas (p. ej . , lactosa, manitol); ver, p . ej . , Remington's Phar aceut ical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712 que se incorpora aquí por referencia. Una cantidad efectiva del ingrediente activo es una cantidad terapéutica, profiláctica o diagnósticamente efectiva, que puede determinarse fácilmente por una persona experta en el arte tomando en consideración tales factores como el peso corporal, la edad, el destino terapéutico o profiláctico o de diagnóstico, y la velocidad de liberación deseada.
Uña suspensión de las micropartículas cargadas de proteínas preparada de acuerdo con la presente invención, se administra preferentemente por inyección intraperitoneal, subcutánea -O intramuscularment e . Sin embargo, sería claro para un experto en el arte que otras rutas- de liberación también podrían utilizarse efectivamente usando las composiciones de la presente invención .
Los siguientes ejemplos" se ofrecen para ilustrar completamente la invención, pero no se elaboran para limitar el alcance de la misma. El Ejemplo 1 describe el nuevo método para preparar las_ micropartículas cargadas de proteínas. La leptina (en la forma de una solución acuosa) se usa como una proteína de ejemplo y se demuestra la capacidad de las micropartículas cargadas de leptina para proporcionar la liberación prolongada de la leptina, ambas in vi t ro e i n vi vo . El Ejemplo 2 demuestra que los diferentes polímeros pueden usarse para hacer las micropartículas cargadas de leptina. El Ejemplo 3 demuestra que los diferentes derivados de leptina, así como las proteínas completamente diferentes (todas en la forma de una solución acuosa), pueden usarse en los métodos nuevos de la presente invención. El Ejemplo 4 demuestra los efectos de la temperatura sobre la etapa de congelación y la etapa de liof ili zación del proceso de la presente invención. El Ejemplo 5 demuestra que los diferentes disolventes orgánicos pueden usarse para disolver los polímeros_de PLGA en los métodos de la presente invención. El Ejemplo 6 demuestra que una suspensión de Zn: leptina y polvo liofilizado de Zn: leptina pueden usarse en los nuevos métodos de la presente invención. El Ejemplo 7 demuestra que 1 proteína secada por atomizado, IL-lra secada por atomizado, puede usarse en los métodos novedosos de la presente invención. El Ejemplo 8 demuestra que _ las micropartículas "huecas" sobre las que el ingrediente activo (p. ej . BDNF) se ha absorbido, también pueden proporcionar la liberación prolongada del ingrediente activo in vi tro . A continuación se presentan los materiales y métodos .
EJEMPLO 1
Este ejemplo describe los nuevos métodos para la preparación de las micropartículas cargadas de proteínas; específicamente, la preparación de microesferas de poli (TJ, L-lact ida-co-glicolida ) que contienen leptina.
0.6 g de RG-502H, poli ( D, L-lact ida-co-glicolida ) (Boehringer Ingelheim Chemicals (B.l. Chemicals), Henley Div., Motvale, NJ) se disolvió en 4 mL de cloroformo y se filtr-ó a través de un filtro de PTFE de 0.2 µm . 1 mL de leptina a 100 mg/mL en acetato de sodio 10 mM, pH 4.8 (preparado como se describió en Materiales y Métodos, infra ) , primero se filtró -esterilizado y después se adicionó lentamente hacia la parte superior de la solución del polímero. Las dos capas se homogenei zaron usando un homogeneizador Polytron ( PT-DA3012 /2T generator , Brinkman, Westbury, NY) de 15,000 hasta 20,000 rpm durante 30-45 segundos, mientras que el contenedor de la emulsión se sumergió en un baño de hielo.
La primer emulsión resultante (w/o) se adicionó a 10 L de agua mientras que se homogeneizó a 15,000 rpm durante 20-30 seg. A la segunda emulsión resultante (w/o/w) , 1 mL del excipiente de liofili zación (100 mg/mL de Glicina, 100 mg/mL de Sacarosa, 10 mg/mL de alcohol polivinílico (PVA)
[P.M de 22,000, 88% hidrol i zado ] , etanol al 10% v/v) se adicionó y se homogeneizó brevemente para asegurar el mezclado completo. La emulsión final bajo el microscopio óptico mostró esferas que fluían libremente de 1-10 µm . La emulsión final se vertió en un matraz y se congeló a -45°C.
La temperatura del baño, después se redujo en una hora a -80°C. Después de una hora a -80°C, el matraz se conectó a un sistema de vacío y la primera liof ili zación se llevó a cabo a -80°C. El nivel de vacío se monitoreó de modo que la remoción del disolvente- orgánico pudo determinarse mediante una caída en el vacío al nivel del sistema. Después se aumentó la temperatura etapa por etapa en incrementos de 5°C/hora hasta -25°C para efectuar la remoción de la fase acuosa ~ y cualquier fase orgánica residual .
Después de 4-5 días, cuando el medidor de vacío ya no indicó remoción de vapor, ia temperatura del baño se aumentó a -5°C durante 6-8 horas antes de la remoción de las muestras des sistema de vacío. Las micropartículas se pesaron y después se almacenaron a -20°C hasta que se neces it aran .
El proceso descrito anteriormente, también se probó con las siguientes modificaciones: 1) la primer emulsión (w/o) o suspensión (s/o) se adicionó a 20 mL de agua/etanol (75%/25%) mientras que se homogeneizó a 5,000 rpm durante 30 segundos; 2) 10-40 mL de agua o etanol frío, se adicionó lentamente a la segunda emulsión ((w/o/w) o (s/o/w)) y después la emulsión final se incubó a temperatura ambiente durante hasta tres horas antes de congelar; y 3) la emulsión final se endureció incubándola a temperatura ambiente a diferentes intervalos de tiempo (0-4 horas) antes de congelar. En cada caso, se obtuvieron las micropartículas cargadas con leptina.
Liberación i n vi t ro de Leptina de las micropartículas de PLGA
La cinética de liberación " i n vi tro" de la leptina de las micropartículas preparadas como se describió anteriormente, se determinaron haciendo una suspensión de 20 mg/mL de las partículas en fosfato de sodio 20 mM, Sorbitol al 5%, pH 7.4 (alternativamente, podría usarse histidina 20 nM en lugar de fosfato) . En cada intervalo de tiempo, la suspensión de microesfera se centrifugó y la concentración de leptina en el sobrenadante se determinó mediante espect rofotomet ría UV a 280 nm así como por SEC-HPLC a 220 nm . La integridad de la leptina liberada de las micropartículas de PLGA, se confirmó por dicroismo circular ( DC ) (Figura 3), HPLC (Figura 4), bioensayo in vi tro~ y electroforesis en gel (SDS-PAGE) (Figura 5) . Los resultados de DC mostraron la retención de la estructura secundaria, y la HPLC y la electroforesis en gel no mostraron la degradación o agregación química.
Bioactividad i n vi tro de las micropartículas cargadas de Leptina
La bioactividad "in vi vo" de las micropartículas cargadas de leptina se evaluaron en ratones y ratas normales suspendiendo 80-100 mg/mL de micropartículas en amortiguador de fosfato de sodio 20 nM, Sorbitol al 5%, pH 7.4. Las suspensiones se prepararon una hora antes de la inyección subcutánea, colocando las micropartículas y el amortiguador sobre un agitador en un cuarto frío a 5°C. Todas las manipulaciones subsecuentes inmediatamente antes de la inyección, se hicieron con las jeringas refrigeradas y las agujas de calibre 25. Se determinó el % de la pérdida de peso corporal con relación al control del amortiguador durante un período de 7 días. Después de 7 días, los animales se sacrificaron para_ la examinación histológica del sitio de inyección. Una sola inyección de las micropartículas cargadas de leptina, resultó en la pérdida de peso prolongado en los ratones durante el período de 7 días (Figura 6) . La examinación histológica del sitio de inyección reveló un mínimo localizado en la reacción inflamatoria ligera, que fue completamente reversible con la biodegradación de las micropartículas durante todo el tiempo .
EJEMPLO 2
Este ejemplo se designó para probar la efectividad de los diferentes pesos moleculares de PLGA o las mezclas en la preparación de las micropartículas cargadas de leptina.
Los procedimientos de preparación y evaluación descritos en el Ejemplo 1, se utilizaron para probar los varios polímeros listados en la Tabla 2 posterior.
Tabla 2
Polímeros Fuente : RG-501H Químicos B . I RG-502H Químicos B . I RG-502 Químicos B . I RG-503H Químicos B . I mezclas de ( RG-501H) : ( RG-502H ) * Químicos B . I (RG-501H) : (PEG/PLGA)** Químicos B . I
^Mezclas de polímeros hechas mezclando relaciones en peso de 20:80 & 50:50 de RG-501H y RG-502H
"Mezcla 80:20 (en peso) de PLGA (501H) y copolímero de bloque AB PLGA (501H) :PEG(1000) .
Usando cada uno de los polímeros listados en la Tabla
2, podrían prepararse efectivamente las micropartículas cargadas con la proteína.
EJEMPLO 3
Este ejemplo describe la preparación de las micropartículas que contienen los derivados de leptina así como otras proteínas. Los procedimientos de preparación y evaluación descrito en el Ejemplo 1, se usaron para probar los varias proteínas listadas en la Tabla 3 posterior.
Tabla 3
Proteína Peso Concentración Formulación: molecular (mg/mL) (Daltons )
Leptina 16158 50-130 NaAcO lOnM, pH 4.8- 8.0 80 NaAcO lOmM pH 4.8 + 10% de sacarosa 100 amortiguador Lyoa 60 Lípido acomplejado13
PEG-leptina -3615! 64-122 NaAcO lOmM, pH 4.8- 20 kd 8.0
Leptina 16258 60-80 Fosf de Na 10 mM, pH succini lada 7.0-8.0 G-CSF 18798 50-100 NaAco lOmM, pH 4.8- 8.0 60-100 NaAco lOmM, pH 4.8- 8.0 + 5-16% de sacarosa 55 NaCl lmM, 10% de trehalosa, pH 7.6 60 Lípido acomplejado13
BDNF 13513 45-120 Fosf de Na lOOmM, pH 7
IL-lra 17258 100-200 Citrato de Na lOmM, NaCl 140 mM, pH 6.5
TNFbp 18278 105 Fosf de Na 10 mM, 2% Gly, 1% de sacarosa, pH 7
BSA 66262 100 NaAcO lOmM, pH 4.8
amortiguador de liofili zación = Glicina 10 mg/mL, Sacarosa 5 mg/mL, ácido glutámico 10 mM, pH 4.5.
bLípido acomplejado relación mol 30:1. relación DMPG o DCPG a proteína en NaAcO 200 mM, pH 4.8.
Con cada una de las proteínas listadas anteriormente, se obtuvieron las micropartículas cargadas de proteínas, demostrando de esta manera la flexibilidad del nuevo proceso de la presente invención. Y de manera importante, se demuestra que las micropartículas cargadas de proteínas también pueden prepararse efectivamente usando los diferentes derivados de leptina.
EJEMPLO 4
En este ejemplo, se evaluaron los efectos de la temperatura sobre la etapa de congelado y la etapa de liofilización del proceso de la presente invención. Con relación a la etapa de congelado (etapa 5) , se probaron nitrógeno líquido, -80°C y -45°C. Con relación a la etapa de liofíli zación (etapa 6), se probaron -80°C, -45°C y -25°C. El procedimiento descrito en el Ejemplo 1, se usó para probar las varias temperaturas y se determinó que las temperatura probadas tuvieron muy poco efecto en cualquier etapa en el proceso. ~~
EJEMPLO 5
En este ejemplo, se probaron los diferentes disolventes orgánicos para disolver los polímeros de PLGA en los métodos de la presente invención. El procedimiento descrito en el Ejemplo 1, se repitió usando acetato de etilo, cloruro de metileno. Cada uno de los disolventes orgánicos probados se encontraron que son efectivos en los métodos de la presente invención.
EJEMPLO 6
Este ejemplo probó la capacidad de una suspensión del ingrediente activo y/o polvo liof ili zado que va a usarse en los métodos de la presente invención.
Una suspensión de 100 mg/mL, en Tris 10 mM, cloruro de zinc 50 µm, pH 7.0, proteína Zn/OB (preparada como se describió en los Materiales y Métodos de la sección posterior) se probó y evaluó como se describió en el Ejemplo 1. También se probó y evaluó un polvo liofilizado de Zn: leptina (preparado como se describió en los Materiales y Métodos de la sección posterior) . Se demostró que lá~ suspensión de Zn: leptina incorporada y el polvo de Zn:leptina podría utilizarse efectivamente para preparar las micropartículas de acuerdo a los métodos nuevos de la presente invención (ver Figura 2 para los resultados de liberación in vi t ro ) .
EJEMPLO 7
Este ejemplo probó la capacidad de una proteína secada por atomizado, IL-lra secada por atomizado, que se va a usar en los métodos de la presente invención. 150 mg de un polvo secado por atomizado _ IL-lra (preparado como se describió en los Materiales y Métodos de la sección posterior) se probó y evaluó como se describió en el Ejemplo 1. Se demostró que la preparación IL-lra secada por atomizado podría utilizarse efectivamente para preparar las micropartículas de acuerdo a los métodos novedosos de la presente invención.
EJEMPLO 8
En este ejemplo, el método descrito en el Ejemplo 1 se modificó, tal que se mezcló inicialmente con el polímero NaAcO 20 M, pH 4.8, resultando en la preparación de las micropartículas "huecas". 6 mg de micropartículas huecas después se diluyeron con 1 mL de BDNF (4.4 mg/mL en fosfato de sodio 0.1M, pH 6.9) y la mezcla se incubó a 37°C con agitación. Después de 2 horas, las micropartículas se aislaron por centrifugación y se determinó la fracción de la proteína no enlazada por espect rofotomet ría UV. 1.76 mg de BDNF se enlazó al polímero" para dar 22% de la carga de proteína sobre las micropartículas. La cinética de liberación in vi t ro , después s"e determinó como se describió en el-Ejemplo 1. El % de BDNF liberado durante el tiempo se representa en la Figura 7.
Materiales y Métodos
1 • Preparación de la leptina de humano de metionilo recombinante
La presente leptina de humano de metionilo recombinante podría prepararse de acuerdo a la publicación del PCT WO 96/05309 anterior ~ incorporada por referencia, en las páginas 151-153. Para los presentes ejemplos de trabajo, se usó una leptina de humano que tuvo (como se compara con la secuencia aminoácido en la página 158) una lisina en la posición 35 en lugar de una arginina, y una isoleucina en la posición 74 en lugar de una isoleucina. Otras leptinas recombinantes de humano, podrían prepararse de acuerdo a los métodos conocidos en general en el arte de expresión de proteínas usando la tecnología de ADN recombinante .
Preparación de la leptina de humano succinilada de metionilo recombinante.
La presente leptina de humano succinilada de metionilo recombinante se preparó mediante la reacción de la leptina recombinante de humano a -150 mg/mL en amortiguador de fosfato de sodio a pH 7.0 con un exceso molar de 3-7 de anhídrido succínico a 4°C durante dos horas. La reacción se apagó mediante la adición de la hidroxil amina sólida hasta una concentración final de 0.5 M y pH 8.5. La mezcla de reacción después se dializa vs . fosfato de sodio 10 mM, pH 7.0 y la leptina mono-succinilada forma las leptina di-y poli-succinilada mediante cromatografía pro intercambio iónico .
3. Preparación de la suspensión de la leptina de humano de metionilo recombinante derivada de zinc.
La presente suspensión de la leptina de humano de metionilo recombinante derivada de zinc, se preparó tomando una muestra de 752 µl en HCl 1 mM y adicionando 48 µl de agua, seguido por 100 µl de cloruro de zinc 500 µM, seguido por 100 µl de TRIS 1 M, pH 8.5. Existe un precipitado de Zn: leptina inmediato que precipitará de la solución a temperatura ambiente, pero que puede resuspenderse fácilmente.
4. Preparación del polvo liofilizado de la leptina de humano de metionilo recombinante derivado de zinc.
La liofili zación del presente polvo liofilizado de leptlría de humano de metionilo recombinante derivado de zinc se llevó a cabo en un liofilizador de anaquel Virtis. Brevemente, se congeló una suspensión de Zn: leptina en anaquel a -50°C y se mantuvo durante 2 horas. Las muestras se descongelaron a -25°C durante 2 horas y después se congelaron nuevamente a -50°C_. Lam presión de la cámara se disminuyó a 100 mTorr, mientras que se mantuvo la temperatura de anaquel a -50°C durante horas. El secado primario se llevó a cabo aumentando la temperatura de anaquel a -25°C y manteniéndola durante 10 horas, mientras que s_e mantuvo la presión de la cámara a 100 mTorr. El secado secundario se llevó a cabo disminuyendo la temperatura a -25°C durante 7 horas y manteniéndola durante 10 horas, mientras que se mantuvo la presión de la cámara a 100 mTorr. El ciclo se terminó al final del secado secundario, la cámara se aereó a la presión atmosférica y el producto liofilizado se removió desde el liofilizador.
Preparación de IL-lra recombinante secada por atomi zado .
La presente proteína IL-lra recombinante secada por atomizado se preparó secando por atomizado una solución de IL-lra de 20 mg/mL, usando un secador por atomizado Buchi 190 mini. Las temperaturas de entrada y de salida durante el secado por atomizado fueron de 130°C y 90°C, respectivamente. La velocidad de alimentación fue de 1-2 mL/min, y se obtuvo un polvo de IL-lra secado por at omi zado .
Mientras que la presente invención se ha descrito en términos de ciertas modalidades preferidas, se entiende que las variaciones y modificaciones se presentarán para aquellos expertos en el arte. Por lo tanto, se pretende que las reivindicaciones anexadas cubran todas las variaciones equivalentes que están dentro del espíritu de la invención con se reivindica.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere.
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.
Claims (23)
1. Un método para elaborar una composición, que comprende un ingrediente activo contenido dentro de las micropartículas poliméricas, caracterizado porque una mezcla del ingrediente activo y el polímero se dispersan dentro de una fase continua, la dispersión resultante se congela, y el agua y los disolventes orgánicos se retiran de la dispersión mediante liofili zación .
2. Un método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque la fase continua es acuosa u orgánica o una mezcla de la misma.
3. Un método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque la mezcla de polímero del ingrediente activo se obtiene dispersando una solución acuosa del ingrediente activo en una segunda fase no acuosa que contiene el polímero, antes de la adición de la fase continua. —
4 ?G Un método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque la mezcla de polímero del ingrediente activo_ se obtiene disolviendo ambos componentes en un disolvente no acuoso antes de la adición de la fase continua
5. Un método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque el ingrediente activo está presente como una dispersión de partículas sólidas en una solución no acuosa del polímero, que después se adiciona a la fase continua .
6. Un método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque el ingrediente activo se omite de la mezcla, por lo cual se producen las micropartículas poliméricas huecas.
7. Un método de acuerdo a la reivindicación 6, caracterizado porque además comprende el ingrediente activo que se carga sobre las micropartículas poliméricas huecas suspendiendo las micropartículas poliméricas huecas en la solución del ingrediente activo.
8. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque uno o más excipientes se combinan con la mezcla de polímero del ingrediente activo antes de la incorporación en la dispersión .
9. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque la fase continua contiene uno o más excipientes.
10. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque uno o más excipientes se mezcla con el ingrediente activo y el mismo o un excipiente diferente está presente en la fase continua .
11. Un método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero se selecciona del grupo que consiste de los polímeros biodegradables y/o biocompatibies .
12. Un método de acuerdo la reivindicación 11, caracterizado porque los polímeros biodegradables se seleccionan del grupo que consiste de poli ( lact ida ) s , poli ( glicolida ) s , poli(ácidó láctico)s, poli(ácido glicólico) s, p o 1 i a n h i d r i d o s , p o 1 i o r t o é s t e r e s , poliet eres teres , policaprolactona, pol ies t eramidas , policarbonato, po 1 i c i ano a c r i 1 a t o , poliuretanos, poliacrilato , mezclas y copolímeros de los mismos.
13. Un método de acuerdo a la reivindicación 12, caracterizado porque el polímero es poli ( lact ida-co-glicolida) (PLGA), y en donde el polímero se disuelve en un disolvente orgánico seleccionado del grupo que consiste de cloroformo, acetato de etilo, cloruro de metileno, acetonitrilo, THF y acetona.
14. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque el ingrediente activo se selecciona del grupo que consiste de péptidos, moléculas pequeñas, azúcares, carbohidratos, ácidos nucleicos, lípidos y proteínas.
15. Un método de acuerdo a la reivindicación 14, caracterizado porque el ingrediente activo es una proteína seleccionada del grupo que consiste de G-CSF, GM-CSF, ;-CSF, MGDF, los interferones (alfa, beta y gama), el interferón de consenso, las int erleucinas (1-12), eritropoyet ina (EPO), factor de crecimiento de fibroblasto, TNF, TNFbp, IL-lra, factor de células madre, factor de crecimiento nervioso, GDNF, BDNF, NT3, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento tumoral, (alfa, beta), OPG y leptina; o derivados, análogos, fusiones, conjugados o formas químicamente modificadas de los mismos.
16. Un método de acuerdo a la reivindicación 15, caracterizado porque la proteína es leptina, o un derivado, análogo, fusión, conjugado o formas químicamente modificadas de los mismos.
17. Un método de acuerdo a la reivindicación 16, caracterizado porque la forma modificada de la leptina se selecciona del grupo que consiste de la fusión de Fc-leptina, leptina succinilada y leptina derivada de zinc.
18. Un método de acuerdo a la reivindicación 15, caracterizado porque la proteína es G-CSF o un derivado, análogo, fusión, conjugado o las formas químicamente modificadas de los mismos.
19. Un método de acuerdo a la reivindicación 15, caracterizado porque la proteína es BDNF o un derivado, análogo, fusión, conjugado o las formas químicamente modificadas de los mismos.
20. Una composición farmacéutica para la liberación prolongada de un ingrediente activo, caracterizada porque la composición se produce mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-15.
21. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende leptina o un derivado, análogo, fusión, conjugado o las formas químicamente modificadas de los mismos contenidas dentro de una micropart ícula polimérica.
22. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende G-CSF, o un derivado, análogo, fusión, conjugado o las formas químicamente modificadas de los mismos contenidas dentro de una micropartícula polimérica.
23. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende BDNF, o un derivado, análogo, fusión, conjugado o las formas químicamente modificadas de los mismos contenidas dentro de una mi cropart ícula polimérica.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08843975 | 1997-04-17 | ||
| US09/061,665 | 1998-04-16 |
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