JP2003519651A - 微紛化凍結乾燥粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 薬物のような薬剤の乾燥微紛化粒子を作製するためのプロセスが提供される。この方法は、（ａ）高分子材料（好ましくは、ポリマー）を有効量の溶媒中に溶解させて、溶液を形成する工程；（ｂ）この溶液中に薬剤を溶解または分散させて混合物を形成する工程；（ｃ）この混合物を凍結する工程；および（ｄ）この混合物を真空乾燥して、固体高分子材料に拡散された薬剤の固体粒子を形成する工程を包含する。このプロセスでの微紛化は、高分子マトリクス内で直接起こり、溶媒の除去による薬剤の粒子の硬化は、バルクマトリクスの凍結乾燥によって行い、これは、硬化の間薬物粒子を安定化し、合体を妨げ、小さな最終薬物粒子を生じる。この方法は、タンパク質薬剤について特に好ましい。このプロセスは、典型的には、高分子マトリクスからの薬剤の分離に続いて、標準的なマイクロカプセル化技術と組み合わせて使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） 本発明は一般に、微小カプセル化技術の分野にあり、特に、薬物または他の生
物学的に活性な薬剤の送達における使用にある。

【０００２】 米国政府は、国立衛生研究所の補助金＃１Ｒ０１ＧＭ５５２４５−０１によっ
て、この出願における特定の権利を有する。

【０００３】 マトリックスまたは固体レザバ型薬物送達系は、一般に、微小カプセル化材料
内の薬物の均一な分布を必要とする。タンパク質は、溶液形態でかまたは乾燥粉
末として、ポリマーマトリックス中に取り込まれ得る。微小カプセル化に適した
固体粒子（例えば、約１０μｍ未満の大きさを有する粒子）を形成するためのタ
ンパク質および薬物の微粉化は、製粉、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥、および超臨界
の抗溶媒（ａｎｔｉ−ｓｏｌｖｅｎｔ）（ＳＡＳ）沈殿技術を含む、種々のアプ
ローチを使用して達成されてきた。タンパク質は、一般に、水和物状態よりも凍
結乾燥（乾燥）状態で、より安定しているが、乾燥微粉化された（２０μｍ未満
）タンパク質微粒子を生成することは、しばしば困難である。この粒子の大きさ
は、マトリックス型デバイスの薬物放出速度論に対して重要である。

【０００４】 種々の製粉技術が公知である。例えば、Ｂａｃｋｓｔｒｏｍらの米国特許第５
，９５２，００８号において、ジェット製粉を使用して、吸入投与のための１０
μｍより小さい粒子を生成するために、タンパク質およびポリペプチドの粒子サ
イズを減少する。Ｐｌａｔｚらの米国特許第５，３５４，５６２号は、引き続く
製粉の間に薬物の分解を阻害する製粉安定剤を含む薬物の溶液を凍結乾燥するこ
とによって作製されたポリペプチド薬物の固体粒子エアロゾル処方物を開示する
。凍結乾燥された薬物は、耐摩耗性材料と適合した液体エネルギー製粉機中で製
粉される。得られた粒子は、高圧で製粉された場合は０．５と４μｍの間に、低
圧で製粉された場合は４と１５μｍの間に存在する。Ｃｌａｒｋらの米国特許第
５，７４７，０２２号は、７μｍより小さい大きさの分布で、粒子を生成する塩
化ナトリウムのジェット製粉を開示する。製粉の直後に、微粉化された粒子を、
凝集を防止するために減圧乾燥した。Ｒｉｅｇｅｌｍａｎらの米国特許第４，１
５１，２７３号は、添加された溶媒を用いてかまたは用いずに、上昇した温度で
形成された、キャリアおよび薬物のガラス状の固体マトリックスを調製するため
の方法を開示する。マトリックスを迅速に冷却して、固体集団を形成し、そして
、カプセルでの経口投与のために粉末に粉砕する。

【０００５】 超臨界条件を使用する方法もまた周知である。例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒらの米
国特許第５，０４３，２８０号は、最小の溶媒残渣を有する薬学的調製物を作製
するための方法を開示する。この方法は、噴霧溶液から溶媒を抽出するために、
超臨界状態の溶液（物質およびキャリアの）を噴霧タワーに導入して、キャリア
中に包埋された物質を含む滅菌産物を形成する工程を包含する。Ｈａｎｎａらの
米国特許第５，８５１，４５３号は、超臨界流体を同時注入するための装置およ
び溶液または懸濁液中の少なくとも１つの物質（例えば、薬物またはタンパク質
）を含むビヒクルを開示し、その結果、ビヒクルの分散および抽出は、超臨界流
体の作用によって同時に発生する。１０μｍ未満の微小粒子が生成される。Ｓｕ
ｂｒａｍａｎｉａｍらの米国特許第５，８３３，８９１号は、近超臨界流体条件
または超臨界流体条件を使用して、粒子沈殿およびコーティングを開示する。連
続的な相分散剤および沈殿可能な物質を用いる流体分散は、集中した高振動数の
抗溶媒音波（これは、極端に小さい液滴への分散を中断しそして０．１と１０μ
ｍとの間の大きさの粒子の沈殿を引き起こす）を生成するために、超臨界流体抗
溶媒と接触される。Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍらの米国特許第５，８７４，０２９
号は、液滴中の溶媒の枯渇および大きさが０．６μｍの範囲にあるナノ粒子の生
成を引き起こすために、溶媒および溶質を超臨界抗溶媒に噴霧するためのアトマ
イザーノズル（ａｔｏｍｉｚｅｒ ｎｏｚｚｌｅ）を使用することを開示する。
Ｓｉｅｖｅｒｓらの米国特許第５，６３９，４４１号は、溶液中の溶質が超臨界
抗溶媒と混合される場合に、粒子のエアロゾルを生成することを開示する。この
粒子は、０．１〜６．５μｍの範囲の大きさである。

【０００６】 噴霧乾燥方法はまた、当該分野で周知である。例えば、Ｅｎｄらの米国特許第
５，７００，４７１号は、薬物の微細粒子の作製、または薬物の溶液の噴霧乾燥
粗粒子分散による染色、または、活性薬剤の融解点を超える温度での染色のため
のプロセスを開示する。溶液中の活性薬剤を、薬物の融解点を超えて加熱した水
中で、保護性のコロイド水溶液（例えば、ゼラチンまたはラクトースからなる）
と混合され、水中で薬物の溶融したエマルジョンを生じた。このエマルジョンは
、噴霧乾燥されており、１μｍ未満の粒子の大きさを有する自由に流れる（ｆｒ
ｅｅ−ｆｌｏｗｉｎｇ）粉末を得た。Ｈａｎｅｓらの米国特許第５，８５５，９
１３号およびＥｄｗａｒｄｓらの米国特許第５，８７４，０６４号は、界面活性
物質と混合した治療剤または生分解性ポリマーと混合した治療剤を噴霧乾燥する
ことによって調製された、５と３０μｍとの間の空気力学的に軽い粒子の調製を
開示する。Ｋｏｒｎｂｌｕｍ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．５８（１）：１２５−
２７（１９６９）は、１〜２０μｍの範囲の球を形成する微粉化の目的のための
純粋な薬物を噴霧乾燥すること、および引き続く錠剤の産生のための噴霧乾燥し
た処方物の圧縮を開示する。

【０００７】 多数の沈殿技術がまた公知である。例えば、Ｄｕｃｌｏｓらの米国特許第５，
７７６，４９５号は、有機溶媒中の少なくともいくらかの可溶性を有する親水性
ポリマーキャリアと共に、有機溶媒中で少なくとも１つの治療薬剤を乾燥するこ
とを介して同時沈殿することによって作製された固体分散の処方を開示する。Ｂ
ｅｒｎｉｎｉらの米国特許第４，３３２，７２１号は、０〜３０℃の温度範囲で
有機溶媒を有する溶液から水での沈殿によって、スピロノラクティブ（ｓｐｉｒ
ｏｎｏｌａｃｔｉｖｅ）を調製するためのプロセスを開示する。Ｓｐｉｒｅａｓ
らの米国特許第５，８００，８３４号は、液体親油性薬物からかまたは水不溶性
の薬物から自由に流れる粉末を生成するためのシステムの使用を開示する。この
薬物は、０．０１〜５μｍの大きさの範囲の粒子を産生するために、適切な非揮
発性溶媒中で溶解し、そして、キャリア物質（例えば、微結晶性または無定形セ
ルロース）と混合し、次いで、非常に微細なシリカ粉末でコーティングされる。
Ｆｒａｎｋらの米国特許第５，７８０，０６２号は、ポリマー／両親媒性物質複
合体を含む水性培地で沈殿することによる、有機化合物の小さい粒子の形成を開
示する。Ｂｕｒｋｅの米国特許第５，８１７，３４３号は、ポリマー溶液／不溶
性薬物混合物を形成することによって；ポリマー中の薬物粒子を含む硬いマトリ
ックスを形成する混合物から溶媒を除去することによって；そしてポリマーのガ
ラス転移点以下のマトリックスを断片化すること（例えば、粉砕すること、製粉
すること）によりマトリックスを微粉化することによって、ポリマー／薬物微小
粒子を形成するための方法を開示する。

【０００８】 超音波処理は、粒子を微粉化するために使用される別の技術である。例えば、
Ｆｏｎｇらの米国特許第４，３８４，９７５号は、乳化剤としてのオレイン酸ナ
トリウムを使用する溶媒除去によるミクロスフェアの調製を開示する。製粉によ
るコア物質の微粉化またはポリマー溶液中の固体薬物粒子の超音波的プローブ超
音波処理が開示される。Ｔｒａｃｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ，１４：
１４：１０８−１５（１９９８）は、超音波ノズルを使用する溶液中の成長ホル
モンを微粒化（ａｔｏｍｉｚｉｎｇ）すること、スラリーの凍結エタノール中に
分散した液滴を凍結すること、次いで、非溶媒（ｎｏｎ−ｓｏｌｖｅｎｔ）を除
去しそして液滴を硬化するために凍結乾燥することを開示する。得られたホロー
球体を、球体を断片化するために、超音波プローブ処理によって、さらに微粉化
し、次いで、球体のフラグメントをカプセル化した。

【０００９】 これらの方法は、特定の型の薬剤（例えば、タンパク質）を微粉化するために
望ましくない。例えば、高温および／または水溶性／有機性溶媒の界面への曝露
は、変性を導くタンパク質安定性に有害であることが公知である。タンパク質の
乾燥した微粉化された粒子、およびタンパク質の変性を実質的に避けるかまたは
最小化するこのような粒子を作製する方法を提供することは有利である。小さい
均一な大きさを有する乾燥した微粉化された粒子を提供することもまた有利であ
る。

【００１０】 従って、本発明の目的は、タンパク質または他の薬剤の乾燥粒子を作製する方
法を提供することであり、このプロセスは、薬剤の安定化を提供し、そして、最
小限の凝集を有するかまたは凝集を有さない均一な大きさの非常に小さい粒子を
生成する。

【００１１】 （発明の要旨） 薬剤の乾燥した微粉化された粒子を作製するプロセスが提供される。この方法
は、（ａ）溶液を形成するために、有効量の溶媒中で、高分子材料（好ましくは
、ポリマー）を溶解する工程；（ｂ）混合物を形成するために溶液中で薬剤を溶
解または分散する工程；（ｃ）混合物を凍結する工程；および（ｄ）固体高分子
材料中で、分散された薬剤の固体粒子を形成するために、混合物を減圧（例えば
、凍結乾燥すること）によって乾燥することを包含する。前の微粉化の方法と異
なり、このプロセスにおける微粉化は、高分子マトリックス中で直接発生し、そ
して、溶媒除去による薬剤の粒子の硬化が、大半のマトリックスの凍結乾燥によ
って発生し、凍結乾燥は、硬化の間、薬物粒子を安定化し、そして合体を妨げ、
それにより、より小さい最終薬物粒子を生じる。従って、タンパク質は、温度、
化学的曝露、および物理的曝露に対して、乾燥状態ではるかに安定であるので、
この方法は、タンパク質薬剤について特に好ましいが、この方法は、薬剤が水性
：有機性界面に曝露される時間を最小化する。１つの実施形態において、このプ
ロセスは、引き続き標準的な微小カプセル化技術と組み合わせて使用される別の
プレ処方工程であり、代表的に、高分子マトリックス由来の薬剤の分離の後に続
く。

【００１２】 このプロセスは、同種の大きさ（好ましくは、大きさが２μｍ未満、およびよ
り好ましくは１μｍ未満）の分布を有する微小粒子を生じる。微小粒子は、十分
に定義され、推定可能な性質を有し、この性質は、薬物送達適用において特に重
要である。

【００１３】 （発明の詳細な説明） 薬剤（例えば、薬物または他の分子）の乾燥した微粉化された粒子を作製する
ための改善された方法が、開発された。

【００１４】 （Ｉ．微粉化された凍結乾燥粒子を作製する） プロセスは、（ａ）溶液を形成するために、有効量の溶媒中で、高分子材料（
好ましくは、ポリマー）を溶解する工程；（ｂ）混合物を形成するために溶液中
で薬剤を溶解または分散する工程；（ｃ）混合物を凍結する工程；および（ｄ）
固体高分子材料中で、分散された薬剤の固体粒子を形成するために、混合物を減
圧によって乾燥することを包含する。このプロセスは、本明細書中で、時々「Ｆ
ＬＭプロセス」または単に「ＦＬＭ」といわれる。

【００１５】 （１．高分子溶液を調製すること） 高分子材料を、公知の混合技術を使用して、材料についての溶媒と組み合わせ
るかまたは溶媒中で溶解した。

【００１６】 （２．混合物を調製すること） 薬剤をその純粋な形態または溶液で、十分に分散された混合物を形成するよう
に、高分子溶液に直接添加した。本明細書中で使用される場合、用語「混合物」
は、他に示されない限り、エマルジョンおよび分散の両方をいう。混合物を調製
するための当該分野で公知の任意の方法が基本的に使用され得る。このような技
術の代表的な例としては、撹拌、振盪、ボルテックス、およびプローブ超音波処
理が挙げられる。界面活性物質が、エマルジョンを安定化するために使用され、
最初のエマルジョンの液滴の合体を防止し、そして、高分子マトリックス中の薬
剤粒子の最小の最終の大きさを維持し得る。

【００１７】 （３．混合物を凍結すること） 混合物は、当該分野で任意の技術を使用して、凍結され得る。しかし、溶媒に
感受性のタンパク質または他の薬剤について、混合物は、高分子溶液への薬剤の
添加後、迅速に凍結されるべきである。１つの実施形態において、一群の混合物
を、混合物の容器を、例えば、液体窒素を含む冷却装置につけること（ｉｍｍｅ
ｒｓｉｎｇ）によって、凍結した。閉サイクルの冷蔵システム（例えば、ＣＲＹ
ＯＴＩＧＥＲ^ＴＭ（ＩＧＣ−ＡＰＤ Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃｓ．、Ａｌｌｅｎｔｏ
ｗｎ，ＰＡ））はまた、例えば、−２０３℃もの低い温度を達成するために、使
用され得る。

【００１８】 （４．凍結された混合物を乾燥すること） 混合物は、凍結後、迅速かつすぐに乾燥されるべきである。この乾燥は、高分
子材料についての全てまたは実質上全ての溶媒、ならびに薬剤についての任意の
溶媒を除去すべきである。乾燥は、混合物が凍結したままである、当該分野で公
知の任意の技術を使用して行なわれ得る。

【００１９】 １つの好ましい実施形態において、乾燥は、減圧乾燥条件（すなわち、減圧下
）で行なわれる。言い換えると、混合物は凍結乾燥される。

【００２０】 （ＩＩ．微粉化された凍結乾燥粒子または薬剤をカプセル化すること） １つの実施形態において、上記の微粉化プロセスは、薬剤の微粉化された粒子
が、高分子マトリックスから分離され、そして／または、例えば、標準的な微小
カプセル化技術を使用して、さらなる微小カプセル化に供される、さらなるプロ
セシングが後に続く。

【００２１】 （１．高分子マトリックスからの微小化された薬剤の分離） マトリックスは、適切な溶媒中での溶解によってかまたは融解のいずれかによ
って、液化され得、次いで、標準的な分離技術（例えば、ろ過または遠心分離）
を使用して、液体化されたマトリックス材料中の薬剤の固体粒子から分離される
。マトリックスが溶解される場合、次いで、溶媒は、薬剤に対して非溶媒でなけ
ればならず、これは、薬剤を分解しない。マトリックスが融解される場合、次い
で、高分子材料は、薬剤の溶解温度（Ｔｍ）よりも低いＴｍを有さなければなら
ず、そして、薬剤の分解を避けるために十分に低くなければならない。

【００２２】 （２．カプセル化プロセス） 薬剤の微粉化された粒子（高分子材料のマトリックスを有するかまたは有さな
い）は、標準的なカプセル化プロセスにおけるコア材料として役立ち得る。この
コア材料は、代表的に、ポリマー材料でカプセル化される。一般的な微小カプセ
ル化技術としては、界面の重縮合、噴霧乾燥、ホットメルト微小カプセル化、お
よび相分離技術（溶媒除去および溶媒エバポレーション）が挙げられる。

【００２３】 （（ｉ）界面宿重合） 界面縮重合を使用して、以下の様式で、コア材料を微小カプセル化し得る。１
つの単量体およびコア材料を溶媒中に溶解する。第２の単量体を、第１の溶媒と
混合できない第２の溶媒（代表的に水性）中に溶解する。エマルジョンが、第２
の溶液中の撹拌を介して第１の溶液を懸濁することによって、形成される。一旦
エマルジョンが安定化されると、エマルジョンの各液滴の界面で界面の重合化を
引き起こす発動因子が、水相に添加される （（ｉｉ）スプレー乾燥） スプレー乾燥は、代表的に、カプセル化されるコア材料がポリマー溶液（代表
的に水性）中に分散または溶解される１〜１０μｍの大きさのミクロスフェアを
調製するためのプロセスであり、溶液または分散は、圧縮されたガスの流れによ
って駆動される微粉ノズルを介してポンプされ、そして生じるエアロゾルは、加
熱された空気のサイクロン中で懸濁され、溶媒が微小滴から蒸発するのを可能に
する。 凝固された粒子は、第２のチャンバへ通過し、そし収集される。

【００２４】 （（ｉｉｉ）ホットメルトマイクロカプセル化） ホットメルトマイクロカプセル化は、コア材料が、融解したポリマーに添加さ
れる方法である。この混合物は、ポリマーの融点よりも約１０℃越えて加熱され
たポリマーのための非溶媒（しばしばオイルベース）における融解小滴として懸
濁される。エマルジョンは、非溶媒浴をポリマーのガラス転移下へ急速に冷却し
ながら、激しい攪拌を介して維持され、コア材料を凝固し捕捉するための融解小
滴を生じる。この技術によって生成されたミクロスフェアは、代表的に、直径の
大きさが５０μｍ〜２ｍｍの範囲に広がる。このプロセスは、一般的に、かなり
低い融解温度（例えば、１５０℃未満）、室温より上のガラス転移温度を有する
ポリマー、および熱安定性であるコア材料の使用を必要とする。

【００２５】 （（ｉｖ）溶媒蒸発マイクロカプセル化） 溶媒蒸発マイクロカプセル化において、ポリマーは、代表的に、水に溶解する
ことのできない有機溶媒に溶解され、カプセル化される材料は、有機溶媒中の懸
濁液または溶液としてポリマー溶液に添加される。エマルジョンは、水を強く攪
拌するためのビーカーにこの懸濁液または溶液を添加することによって形成され
る（しばしば、このエマルジョンを安定化するために表面活性剤を含む）。有機
溶媒は、攪拌を続けながら蒸発される。蒸発は、ポリマーの沈澱を生じ、コア材
料を含む固体マイクロカプセルを形成する。

【００２６】 （（ｖ）相分離マイクロカプセル化） 相分離マイクロカプセル化は、代表的に、攪拌によってポリマー溶液にカプセ
ル化される材料を分散することによって実行される。攪拌を通じて材料を均一に
攪拌することを続けながら、ポリマーの非溶媒を、この溶液にゆっくり添加し、
ポリマーの溶解度を減少させる。ポリマーは、溶媒および非溶媒中のポリマーの
溶解度に依存して、沈澱するか、ポリマーに富む相およびポリマーが乏しい相に
相分離するかのいずれかである。適切な条件下で、ポリマーに富む相中のポリマ
ーは、連続する相を有する界面に移動し、小滴中のコア材料を外部ポリマー殻で
カプセル化する。

【００２７】 米国特許第５，４０７，６０９号（Ｔｉｃｅら）に記載されるこのプロセスの
１つの実施形態は、報告によると非常に速く進む相分離マイクロカプセル化プロ
セスを開示する。この方法において、ポリマーは、溶媒に溶解され、次いで、カ
プセル化される薬剤が、この溶媒中に溶解されるかまたは分散される。次いで、
この混合物は、過剰の非溶媒と合わせられ、乳化されそして安定化される。これ
によってポリマー溶媒は、もはや連続相ではない。強度な乳化条件が、ポリマー
溶媒の微小滴を生成するために適用される。次いで、安定なエマルジョンが大量
の非溶媒に導入され、ポリマー溶媒を抽出し、そして微粒子を形成する。微粒子
の大きさは、ポリマー溶媒の微小滴の大きさによって決定される。

【００２８】 （（ｖｉ）転相カプセル化） （ａ．一般的に） 転相は、連続相の溶媒系に溶解した固体高分子ネットワーク（ここでポリマー
は、連続相である）に転移する物理現象を記載するために使用される用語である
。この事象は、いくつかの手段を介して導入され得る：溶媒の除去（例えば、蒸
発；乾燥プロセスとしても公知）、別の種の添加、非溶媒の添加または非溶媒へ
の添加（湿潤プロセスとしても公知）。湿潤プロセスにおいて、ポリマー溶液は
、非溶媒の浴へ注がれるか、または押し出され得る。このプロセスは、以下の様
式で進行する。ポリマー溶液は、単一相の均一溶液から不安定な２相（ポリマー
に富む分画およびポリマーに乏しい分画）の混合物への転移を引き起す。ポリマ
ーに富む相における非溶媒のミセル小滴は、核生成部位としてはたらき、そして
ポリマーでコートされるようになる。臨界濃度のポリマーにおいて、小滴は、溶
液から沈澱し、そして凝固する。好都合な表面エネルギー、粘性およびポリマー
濃度が提供されると、ミセルは、合体しそして沈澱して、連続ポリマーネットワ
ークを形成する。

【００２９】 転相現象は、ガス分離、限外濾過、イオン交換、および逆浸透に使用される、
マクロおよびマイクロ孔のポリマー膜および中空繊維を生成するために適用され
ている。これらの膜の構造的な完全性および形態学的な特徴は、（ポリマー、溶
媒および非溶媒の）ポリマー分子量、ポリマー濃度、溶液粘性、温度および溶解
度パラメーターに依存する。湿潤プロセス転相に関して、ポリマー粘性は、膜完
全性を維持するために約１０，０００センチポイズ（「ｃＰ」）より上でなけれ
ばならない；低い粘性の溶液は、連続系とは対照的に、フラグメント化されたポ
リマー粒子を生成し得る。さらに、より速く溶液が沈澱を引起すと、より微細な
ものが、沈殿相に分散することが、公知である。

【００３０】 転相プロセスは、ポリマーマイクロカプセルを生成するために利用されている
。マイクロカプセルは、ポリマーを有機溶媒に溶解し、紡糸口金またはシリンジ
針を押し込み通して溶液の小滴を形成し（この小滴の大きさは、最終マイクロカ
プセルの大きさを決定する）、そしてこの小滴をポリマーに対する非溶媒（これ
は、ポリマー溶媒と非常に混和性である）と接触させ、それによって小滴の外層
の迅速な沈澱を引起すことによって調製される。マイクロカプセルは、実質的に
全ての溶媒が非溶媒と置換されるまで、非溶媒と接触させられたままでなければ
ならない。このプロセスは、非溶媒を接触させる前に、確立された寸法を有する
小滴の形成を必要とする。

【００３１】 前に記載された各方法は、最終微粒子の沈殿前に、エマルジョンまたは小滴の
形成を必要とする。沈澱前にエマルジョンの形成を必要としない、微粒子を生成
する方法。適切な条件下で、ポリマー溶液は、適切な非溶媒に添加された場合、
断片化された球状のポリマー粒子に転相され得る。このプロセスは、実施が簡単
であり、多数のポリマー系に適し（代表的に制御された徐放系として利用される
、多くの一般的な分解可能なポリマーおよび分解可能でないポリマーを含む）、
非常に小さな微粒子（１０ｎｍ〜１０μｍ）を生成し、そして非常に高収率をも
たらす。

【００３２】 （ｂ．転相ナノカプセル化（ＰＩＮ）） ＰＩＮは、ポリマー溶媒が良好な混和性を有する選択「非溶媒」における希釈
ポリマー溶液の非混和性を利用するナノカプセル化技術である。この結果は、狭
いサイズ幅内のナノスフェア（ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ）（１μｍ未満）およびミ
クロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）（１〜１０μｍ）の自発的な形成であ
り、これは、最初のポリマー溶液の濃度、ポリマーの分子量、適切な溶媒−非溶
媒対の選択および非溶媒に対する溶媒の割合に依存する。カプセル化効率は、代
表的に７５〜９０％であり、そして回収率は、７０〜９０％であり、そして生物
活性は、一般的に、敏感な生物薬剤に関して十分維持される。

【００３３】 特定の条件下でのポリマー溶液の「転相」は、分散した（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）
微粒子の自発的な形成を引き起こし得る。このプロセスは、「転相ナノカプセル
化」または「ＰＩＮ」と呼ばれ、本質的に１工程プロセスである既存のカプセル
化方法と異なり、ほぼ瞬間であり、そして溶媒の乳化を必要としない。適切な条
件下で、低い粘性のポリマー溶液が、適切な非溶媒に添加された場合、断片化さ
れた球状ポリマー粒子に転相される。

【００３４】 転相現象は、マクロ孔のポリマー膜およびマイクロ孔のポリマー膜および中空
線維を生成するために適用されており、この形成は、微小相分離の機構に依存す
る。微小相分離の有力な理論は、溶媒除去から生じる最初の沈澱事象として、「
１次」粒子が約５０ｎｍ直径を形成するという考えに基づく。このプロセスが続
けられるにつれ、１次粒子は、衝突し合体して約２００ｎｍの寸法を有する「２
次」粒子を形成すると考えられ、この２次粒子は、最終的に他の粒子と結びつい
てポリマーマトリックスを形成する。代替の理論である「核形成および成長」は
、（１次粒子の合体と対照的に）ポリマーがコアのミセル構造の周りに沈澱する
という概念に基づく。

【００３５】 合体することなくより低いポリマー濃度で、非常に均一な大きさの小粒子形成
の分布を引き起こすこのプロセスは、核形成および成長を支持するが、より大き
な粒子さらには凝集体が形成され得るより高いポリマー濃度（例えば、容積当た
り１０％重量より大きい）での合体を除外しない。（溶媒は、より大きな粒子か
らよりゆっくりと抽出され、その結果、ランダムな部分的に溶媒和された球の衝
突が、合体を生じ、そして最後に、繊維状ネットワークの形成を生じる）。ポリ
マー濃度ポリマー分子量、粘性、混和性および溶媒：非溶媒容積比を調整するこ
とによって、転相を用いた膜に特徴的な繊維間相互関係が回避され、微粒子が自
発的に形成される結果になる。これらのパラメーターは、相関し、そして１つの
調整は、別のものに対して許容された絶対値に影響を与える。

【００３６】 好ましいプロセス方法において、混合物は、カプセル化される薬剤、ポリマー
およびそのポリマーに対する溶媒で形成される。カプセル化される薬剤は、液体
または固体の形態であり得る。これは、溶媒に溶解され得るか、または溶媒に分
散され得る。従って、薬剤は、溶媒中に分散された微小滴に含まれ得るか、また
は溶媒中の固体微粒子として分散され得る。従って、転相プロセスは、広範な種
々の薬剤を微粉化された固形またはポリマー溶液中の乳化された液体形態のいず
れかで含むことによって、カプセル化され得る。

【００３７】 微粒子内の薬剤の充填範囲は、０．０１〜８０％の間（薬剤重量／ポリマー重
量）である。ナノスフェアを用いる場合、最適な範囲は、０．１〜５％（重量／
重量）である。

【００３８】 実用的なポリマーの分子量範囲は、ｌｋＤａ〜１５０，０００ｋＤａのオーダ
ーであるが、最適な範囲は、２ｋＤａ〜５０ｋＤａである。実用的なポリマー濃
度の範囲は、主に、ポリマーの分子量および生じるポリマー溶液の粘性に依存し
て、０．０１〜５０％（重量／容積）である。一般的に、小さい分子量ポリマー
は、より高い濃度のポリマーの使用を可能にする。好ましい濃度範囲は、．１％
〜１０％（重量／容積）のオーダーであるが、最適なポリマー濃度は、代表的に
５％より下である。１〜５％のオーダーのポリマー濃度が特に有用であることが
見出されている。

【００３９】 ポリマー溶液の粘性は、好ましくは、３．５ｃＰ未満であり、より好ましくは
２ｃＰ未満であるが、４または６ｃＰのようなより高い粘性が、分子量などの他
のパラメーターの調整に依存して可能である。ポリマー濃度、ポリマー分子量お
よび粘性は、相互関係を有すること、および１つを変更することは、おそらく他
のものも影響を与えるということが、当業者に理解される。

【００４０】 非溶媒または抽出媒体が、溶媒におけるその混和性に基づいて選択される。従
って、溶媒および非溶媒は、「対」として考えられる。溶解度パラメーター「δ
（ｃａｌ／ｃｍ^３）^１／２）は、溶媒／非溶媒対の溶解度の有用な指示因子であ
る。溶解度パラメーターは、２つの溶媒の混和性の有効なプロテクターであり、
一般的に、より高い値は、より親水性の液体を示し、一方、より低い値は、より
疎水性の液体を表す（例えば、δ_ｉ水＝２３．４（ｃａｌ／ｃｍ^３）^１／２）、
一方δ_ｉヘキサン＝７．３（ｃａｌ／ｃｍ^３）^１／２）。溶媒／非溶媒対は、０
＜δ溶媒−δ非溶媒＜６（ｃａｌ／ｃｍ^３）^１／２である場合、有用である。任
意の理論に束縛されることを望まないが、この知見の解釈は、溶媒および非溶媒
の混和性が、粒子成長のための中心として最終的にはたらく沈澱核の形成に重要
であるということである。ポリマー溶液が、非溶媒において完全に混和性である
場合、溶媒抽出は生じず、ナノ粒子は形成されない。中間的な場合は、わずかに
混和性を有する溶媒／非溶媒対を含み、ここで、溶媒除去の割合は、分散した微
粒子を形成するには十分に速くなく、粒子の合体の凝集を生じる。

【００４１】 「親水性」溶媒／非溶媒対（例えば、非溶媒としてエタノールを用いた塩化メ
チレン中に溶解されたポリマー）を用いて生成されたナノ粒子は、「疎水性」溶
媒／非溶媒対が使用された場合（例えば、非溶媒としてヘキサンを用いた塩化メ
チレンに溶解された同じポリマー）よりも、約１００％小さい粒子を生じること
が、発見された。

【００４２】 同様に、溶媒：非溶媒容積比は、微粒子が粒子凝集または粒子合体を伴わずに
形成されるか否かを決定する際に重要であることが、発見された。溶媒：非溶媒
容積比に関する適切な実用的な範囲は、１：４０〜１：１，０００，０００であ
ると考えられている。溶媒：非溶媒に関する最適な実用的な容積比の範囲は、１
：５０〜１：２００（容積／容積）であると考えられている。約１：４０未満の
比率は、おそらく不完全な溶媒抽出または大量の非溶媒相への溶媒分散のよりゆ
っくりとした速度に起因して、粒子の合体を生じる。

【００４３】 上記に提供された範囲が完全ではないが、代わりのものが相互関係にあるとい
うことは、当業者によって理解される。例えば、溶媒：非溶媒の最小の容積比は
１：４０のオーダーであると考えられているが、ポリマー濃度が非常に低い場合
、ポリマー溶液の粘性が非常に低い場合、そして溶媒および非溶媒の混和性が高
い場合、微粒子がより低い比率（例えば、１：３０）で形成され得ることは可能
である。従って、ポリマーは、有効量の溶媒に溶解され、そして薬剤の混合物、
ポリマーおよびポリマー溶媒は、有効量の非溶媒に導入され、自発的かつ実質的
に瞬間の微粒子形成を引き起こすポリマー濃度、粘性および溶媒：非溶媒容積比
を生成する。

【００４４】 種々のポリマーが、本明細書中に記載される方法において試験され、ポリ（乳
酸）、モル比が５０：５０および７５：２５のポリ（ラクチド−コ−グリコリド
）のようなポリエステル；ポリカプロラクトン；モル比が２０：８０および５０
：５０のポリ（フマル−コ−サバシック酸）（ｐｏｌｙ（ｆｕｍａｒｉｃ−ｃｏ
−ｓａｂａｃｉｃ）ａｃｉｄ）すなわちＰ（ＦＡ：ＳＡ）のようなポリ無水物；
モル比が２０：８０のポリ（カルボキシフェノキシプロパン−コ−セバシン酸）
すなわちＰ（ＣＰＰ：ＳＡ）；およびポリスチレン（ＰＳ）を含む。ポリ（オル
ト）エステル、これらのポリマーのブレンドおよびコポリマーがまた使用され得
、ならびに他の生物分解性ポリマーおよび非生物分解性ポリマー（例えば、酢酸
エチレンビニルおよびポリアクリルアミドなど）も使用され得る。

【００４５】 １０ｎｍ〜１０μｍの範囲のナノスフェアおよびミクロスフェアが、これらの
方法によって生成されている。塩化メチレンのような「良好」な溶媒および石油
エーテルまたはヘキサンのような強い非溶媒を用いて、最適な１：１００容積比
で、１〜２％（重量／容積）の範囲の初期ポリマー濃度および１〜２ｃＰの溶液
粘性を用いると、１００〜５００ｎｍの範囲の大きさを有する粒子を生成する。
類似の条件下で、２〜５％（重量／容積）の初期ポリマー濃度および２〜３ｃＰ
の溶液粘性は、代表的に、５００〜３，０００ｎｍの大きさを有する粒子を生成
する。非常に小さい分子量のポリマーを用いると（５ｋＤａ未満）、初期溶液の
粘性は、１０％（重量／容積）よりも高い初期ポリマー濃度（これは、一般的に
、１〜１０μｍの範囲の大きさを有する微粒子を生じる）の使用を可能にするほ
ど十分に低くあり得る。一般的に、おくらく１５％（重量／容積）の濃度および
約３．５ｃＰよりも大きい溶液粘性において、分散したミクロスフェアは、形成
されないが、代わりに、ミクロン厚の寸法を有する複雑な相互連絡している小繊
維性のネットワークに不可逆的に合体される。

【００４６】 限定された数のマイクロカプセル化技術のみが、１０μｍ未満の粒子を生成し
得、そしてこれらの技術は、ポリマーか、カプセル化される材料か、またはこれ
ら両方の有意な損失と関連することに注意する。活性薬剤が特定の医療剤のよう
な効果な実体である場合、これは特に問題である。これらの方法は、ナノ〜マイ
クロサイズの粒子の、８０％よりも大きい生成収率、および１００％もの高さの
カプセル化効率を引き起こし得る。

【００４７】 本明細書中に記載される方法はまた、均一なサイズ分布により特徴付けられる
微粒子を生成し得る。代表的なマイクロカプセル化技術は、１０μｍからｍｍサ
イズの範囲の非均一なサイズ分布を生じる。従来技術の方法論は、パラメーター
（例えば、撹拌速度、温度、およびポリマー／懸濁液の浴比）により粒子サイズ
を制御しようと試みる。しかし、このようなパラメーターにより、サイズ分布は
有意に狭くならなかった。本明細書中に記載される方法は、例えば、サイズが比
較的単分散性のナノメーターサイズの粒子を生成し得る。十分に規定されそして
可変性の小さいサイズを有する微粒子を生成することによって、生物活性剤の放
出のために使用されるような微粒子の特性をより制御し得る。従って、この方法
により、被験体に投与するための持続性放出処方物の調製を改良し得る。

【００４８】 この方法はまた、ミクロスフェアのサイズを制御するために有用である。これ
は、カプセル化される材料が溶媒中に最初に分散されるべきであり、カプセル化
される材料を超音波処理することが所望されない場合に特に有用である。カプセ
ル化される材料の混合物および溶媒（溶解したポリマーを含む）は、ポリマー中
にカプセル化される材料を分散するために、液体窒素中で凍結され、次いで凍結
乾燥され得る。次いで、得られた混合物は溶媒に再溶解され、次いで、非溶媒に
この混合物を添加することによって、分散される。この方法は、以下の実施例に
示される、ＤＮＡを分散する工程と共に用いられた。

【００４９】 多くの場合、この方法は、全体で５分未満で行われ得る。調製時間は、ポリマ
ーの溶解度および選択した溶媒、薬剤が溶媒中に溶解されるか分散されるかなど
に依存して、１分から数時間かかり得る。それにもかかわらず、実際のカプセル
化時間は、典型的に、３０秒未満である。

【００５０】 マイクロカプセルの形成後、これらは遠心分離、濾過、または他の標準的な技
術によって収集される。濾過および乾燥は、カプセル化された材料の量および非
溶媒を乾燥するために使用した方法に依存して、数分から１時間かかる。この全
体のプロセスは、不連続プロセスまたは連続プロセスであり得る。

【００５１】 このプロセスは、溶媒をエマルジョンに形成することを必要としないため、こ
れは一般に、乳化を必要とするプロセスよりも穏やかなプロセスと考えられ得る
。結果として、プロモーターの制御下にある遺伝子を含む全プラスミドのような
材料は、乳化プロセスの結果として、ＤＮＡが破壊することなく、カプセル化さ
れ得る。カプセル化される代表的なヌクレオチド分子としては、プラスミド、ベ
クター、ＲＮＡａｓｅ Ｐの外部ガイド配列、リボザイムおよび他の感受性オリ
ゴヌクレオチドが挙げられ、これらの構造および機能は、特定の従来技術のプロ
セスに典型的な挑戦的な乳化条件および他のパラメーターによって悪影響を受け
得る。

【００５２】 （ＩＩＩ．粒子の組成、材料の処理） 微粉化粒子は、一般に、１つ以上の高分子（代表的には、ポリマー）の固体マ
トリクス中に分散された薬剤の固体粒子を含む。

【００５３】 （１．薬剤） 粒子に形成される薬剤の代表的な例としては、接着剤、気体、殺虫剤、除草剤
、芳香剤、防汚剤、色素、塩、油、インク、化粧品、触媒、界面活性剤、硬化剤
、香味剤、食品、燃料、金属、ペンキ、定着剤、殺生剤、顔料、可塑剤、および
噴霧剤が挙げられる。

【００５４】 好ましい実施形態において、この薬剤は、生物活性剤である。生物活性剤の代
表的な例としては、以下が挙げられる：アドレナリン作動剤；副腎皮質ステロイ
ド；副腎皮質抑制剤；アルドステロンアンタゴニスト；アミノ酸；興奮薬；鎮痛
薬；麻酔薬；食欲抑制薬；抗アクネ剤；抗アドレナリン作動薬；抗アレルギー薬
；抗アメーバー薬；抗貧血薬；抗狭心薬；抗関節炎薬；抗喘息薬；抗アテローム
硬化症薬；抗菌剤；抗コリン作動性薬；抗凝血薬；抗痙攣薬；抗鬱薬；抗糖尿病
薬；下痢止め薬；抗利尿薬；抗嘔吐薬；抗癲癇薬；抗線維素溶解薬；抗真菌薬；
抗出血薬；抗ヒスタミン薬；抗高脂血症薬；抗高血圧薬；抗低血圧薬；抗感染薬
；抗炎症薬；抗菌薬；抗偏頭痛薬；抗有糸分裂薬；抗真菌剤；制吐薬；抗腫瘍薬
；抗好中球減少症薬；抗寄生生物薬；抗増殖薬；抗精神病薬；抗リウマチ薬；抗
脂漏薬；抗分泌薬；鎮痙薬；抗トロンビン薬；抗潰瘍薬；抗ウイルス薬；食欲抑
制薬；血糖調節薬；骨吸収インヒビター；気管支拡張薬；心血管薬；コリン作用
薬；抑制薬；診断補助薬；利尿薬；ドーパミン作動薬；エストロゲンレセプター
アゴニスト；線維素溶解剤；蛍光剤；遊離酸素ラジカルスカベンジャー；胃腸運
動エフェクター；グルココルチコイド；発毛刺激薬；止血剤；ヒスタミンＨ２レ
セプターアンタゴニスト；ホルモン；低コレステロール血症薬；低血糖薬；抗高
脂血症薬；低血圧薬；画像化剤；免疫薬；免疫調節薬；免疫調製薬；免疫刺激薬
；免疫抑制薬；角質溶解薬；ＬＨＲＨアゴニスト；気分調節薬；粘液溶解薬；散
瞳剤；鼻づまり薬；神経筋遮断薬；神経保護薬；ＮＭＤＡアンタゴニスト；非ホ
ルモン性ステロール誘導体；プラスミノゲン活性化因子；血小板活性化因子アン
タゴニスト；血小板凝集インヒビター；神経作用薬；放射性剤；殺疥癬虫薬；硬
化薬；鎮静薬；鎮静睡眠薬；選択性アデノシンＡ１アンタゴニスト；セロトニン
アンタゴニスト；セロトニンインヒビター；セロトニンレセプターアンタゴニス
ト；ステロイド；甲状腺ホルモン；甲状腺インヒビター；甲状腺炎薬；精神安定
薬；筋萎縮性側索硬化症薬；大脳虚血薬；パジェット病薬；不安定狭心症薬；血
管収縮薬；血管拡張薬；創傷治癒薬；およびキサンチンオキシダーゼインヒビタ
ー。

【００５５】 生物活性剤としては、アレルゲンのような免疫学的薬剤（例えば、ネコのフケ
、樺の花粉、ハウスダスト、ダニ、および花粉）、および病原体由来の抗原（例
えば、ウイルス、細菌、真菌および寄生生物）が挙げられる。これらの抗原は、
全不活性生物、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、炭水化物、またはそれら
の組み合わせの形態であり得る。薬理学的または免疫学的な薬剤の特定の例は、
上記のカテゴリーに含まれ、そしてヒトの使用が公開された文献に見出され得る
ことが認められる。

【００５６】 （２．マトリクス材料／カプセル化材料） 好ましいマトリクス材料はポリマーである。このマトリクス材料はまた、乾燥
した微粉化薬剤のさらなるカプセル化のための材料として使用され得る。

【００５７】 ポリマーは、任意の適切なマイクロカプセル化材料であり得、これには、非生
腐食性ポリマーおよび生腐食性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない
。このようなポリマーは、従来技術において非常に詳細に記載されている。これ
には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ポリアミド、ポリカーボネ
ート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、
ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、
ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコ
リド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびこれらのコポリマー、セルロース（
例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエー
テル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセル
ロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロー
ス、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロ
ース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシエチルセルロ
ース、三酢酸セルロース、およびセルロース硫酸ナトリウム塩）、アクリル酸エ
ステルおよびメタクリル酸エステルのポリマー、ポリ（メチルメタクリレート）
、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソ
ブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシル
メタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリ
レート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、
ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリエ
チレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシ
ド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（酢
酸ビニル）、ポリ塩化ビニルポリスチレン、およびポリビニルピロリドン。

【００５８】 好ましい非生腐食性ポリマーの例としては、エチレン酢酸ビニル、ポリ（メタ
）アクリル酸、ポリアミド、それらのコポリマーおよび混合物が挙げられる。

【００５９】 好ましい生分解性ポリマーの例としては、以下が挙げられる：合成ポリマー（
例えば、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エス
テル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（カプロラクトン）
、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、およ
びポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン））、ならびに天然のポリマー（例え
ば、アルギネートおよび他の多糖類（デキストランおよびセルロースを含む）、
コラーゲン、それらの化学的誘導体（化学基の置換体、付加体（例えば、アルキ
ル、アルキレン、ヒドロキシル化体、酸化体、および当業者によって慣用的に行
われる他の修飾体））、アルブミンおよび他の親水性タンパク質、ゼインおよび
他のプロラミン、ならびに疎水性タンパク質、それらのコポリマーおよび混合物
）。一般的に、これらの材料は、酵素的加水分解によりまたはインビボで水に曝
されることによりのいずれかで、表面浸食またはバルク浸食により分解する。上
記の材料は、単独でか、物理的混合物（ブレンド）としてか、またはコポリマー
として使用され得る。最も好ましいポリマーは、ポリエステル、ポリ無水物、ポ
リスチレンおよびそれらのブレンドである。生体付着性ポリマーが特に好ましい
。生体付着性ポリマーは、通常の生理学的条件下で粘膜上皮に結合するポリマー
である。胃腸管における生体付着は、以下の２段階で進行する：（１）粘膜基質
と合成材料との接触時点における粘弾性の崩壊、および（２）付着性合成材料と
粘膜または上皮細胞との間の結合の形成。一般的に、ポリマーの組織への付着は
、（ｉ）物理的結合または力学的結合、（ｉｉ）一次結合または共有化学結合、
および／または（ｉｉｉ）二次化学結合（すなわち、イオン結合）によって達成
され得る。物理的結合または力学的結合は、粘膜の間隙または粘膜のひだの中へ
の付着材料の沈着および封入から生じ得る。生体付着特性に関与する二次化学結
合は、分散性相互作用（すなわち、ファンデルワールス相互作用）およびより強
力な特定の相互作用（これは、水素結合を含む）からなる。主に水素結合の形成
に関係する親水性官能基は、ヒドロキシル基およびカルボキシル基である。多数
の生体付着性ポリマーが、本明細書中で議論される。特に関心が持たれる代表的
な生体付着性ポリマーとしては、以下が挙げられる：Ｓａｗｈｎｅｙら、Ｍａｃ
ｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：５８１−８７（１９９３）に記載される生腐食
性ヒドロゲル、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン（ｇｌｕｔｉ
ｎ）、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギネート、キトサン、ポリ（メチルメ
タクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート
）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポ
リ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フ
ェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルア
クリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、およびポリ（オクタデシルア
クリレート）。ポリ（フマル酸−ｃｏ−セバシン酸）が最も好ましい。

【００６０】 増強された生体付着特性を有するポリマーが提供され得、ここで、無水物モノ
マーまたはオリゴマーがポリマーに組み込まれる。オリゴマー賦形剤は、広範な
親水性ポリマーおよび疎水性ポリマー（タンパク質、多糖類および合成生体適合
性ポリマーを含む）にブレンドされるかまたは組み込まれ得る。無水物オリゴマ
ーは、有機添加剤単独よりもさらに生体付着性を改善するために、金属酸化物粒
子と組み合わされ得る。それらの電荷および疎水性／親水性のため、有機色素は
、ポリマーに組み込まれた場合、このポリマーの生体付着性を増加するかまたは
減少し得る。通常は生体付着性ではない広範な異なるポリマーへのオリゴマー化
合物の組込みは、粘膜のような組織表面へのそれらの付着を劇的に増加させる。

【００６１】 本明細書で使用する場合、用語「無水物オリゴマー」とは、無水物結合により
結合された二塩基酸または多価二塩基酸（ｐｏｌｙｄｉａｃｉｄ）をいい、これ
は無水物結合によって酢酸のような一塩基酸に結合されたカルボキシ末端基を有
する。無水物オリゴマーは、約５０００、代表的には約１００ダルトンと５００
０ダルトンとの間の分子量を有するか、または無水物結合によって結合された１
〜約２０の二塩基酸単位を含むとして定義される。一実施形態において、この二
塩基酸は、クレープス解糖サイクルにおいて通常見出される二塩基酸である。無
水物オリゴマー化合物は、高い化学的反応性を有する。

【００６２】 オリゴマーは、二塩基酸と過剰の酸無水物との還流反応において形成され得る
。過剰の無水酢酸を減圧下でエバポレートし、そして得られたオリゴマー（これ
は、無水物結合により結合された約１〜２０個の二塩基酸単位を含む種の混合物
である）は、例えば、トルエンまたは他の有機溶媒からの再結晶により精製され
る。このオリゴマーは、濾過によって収集され、例えば、エーテルで洗浄される
。この反応は、無水物結合により互いに結合された末端カルボン酸基を有する一
塩基酸および多塩基酸の無水物オリゴマーを生成する。

【００６３】 この無水物オリゴマーは、加水分解に対して不安定である。ゲル透過クロマト
グラフィーにより分析されるように、この分子量は、例えば、フマル酸オリゴマ
ー（ＦＡＯ）について２００〜４００のオーダーであり、セバシン酸オリゴマー
（ＳＡＰＰ）について２０００〜４０００のオーダーである。無水物結合は、フ
ーリエ変換赤外線分光法により、１７００ｃｍ^−１における通常のカルボン酸の
ピークの対応する消失を伴う、１７５０ｃｍ^−１および１８２０ｃｍ^−１におけ
る特徴的な二重線のピークによって検出され得る。

【００６４】 一実施形態において、オリゴマーは、例えば、米国特許第４，７５７，１２８
号（Ｄｏｍｂら）、米国特許第４，９９７，９０４号（Ｄｏｍｂ）、および米国
特許第５，１７５，２３５号（Ｄｏｍｂら）に記載される二塩基酸から作製され
得る。例えば、セバシン酸、ビス（ｐ−カルボキシ−フェノキシ）プロパン、イ
ソフタル酸、フマル酸、マレイン酸、アジピン酸またはドデカンジオン酸のよう
なモノマーが使用され得る。

【００６５】 有機色素は、それらの電荷および親水性／疎水性のために、ポリマーマトリク
スに組み込まれた場合、またはポリマーの表面に結合した場合に、様々なポリマ
ーの生体付着特性を変化させ得る。生体付着特性に影響を与える色素の一部の列
挙としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：酸性フクシン、アル
シアンブルー、アリザリンレッドｓ、アウラミンｏ、アズールａおよびｂ、ビズ
マークブラウンｙ、ブリリアントクレシルブルーａｌｄ、ブリリアントグリーン
、カーマイン、シバクロン（ｃｉｂａｃｒｏｎ）ブルー３ＧＡ、コンゴレッド、
クレシルバイオレットアセテート、クリスタルバイオレット、エオシンｂ、エオ
シンｙ、エリトロシンｂ、ファストグリーンｆｃｆ、ギームザ、ヘマトイリン（
ｈｅｍａｔｏｙｌｉｎ）、インジゴ、カーミン、ヤーヌスグリーンｂ、ジェンナ
ー染料、マラカイトグリーンオキサレート、メチルブルー、メチレンブルー、メ
チルグリーン、メチルバイオレット２ｂ、ニュートラルレッド、ナイルブルーａ
、オレンジＩＩ、オレンジＧ、オルセイン、パラオサニリン（ｐａｒａｏｓａｎ
ｉｌｉｎｅ）クロリド、フロキシンｂ、ピロニンｂおよびｙ、反応性ブルー（ｒ
ｅａｃｔｉｖｅ ｂｌｕｅ）４および７２，反応性ブラウン１０、反応性グリー
ン５および１９、反応性レッド１２０、反応性イエロー２、３、１３および８６
、ローズベンガル、サフラニンｏ、スダンｉｉｉおよびＩＶ、スダンブラックＢ
、およびトルイジンブルー。

【００６６】 （３．薬剤のための溶媒） 好ましい実施形態において、溶媒は、生体適合性かつ水性である。

【００６７】 （４．マトリクス材料のための溶媒） 溶媒は、ポリマーを溶解するために適切な任意の溶媒である。代表的に、この
溶媒は、以下の一般的な有機溶媒である：ハロゲン化脂肪族炭化水素（例えば、
塩化メチレン、クロロホルムなど）；アルコール；芳香族炭化水素（例えば、ト
ルエン）；ハロゲン化芳香族炭化水素；エーテル（例えば、メチルｔ−ブチル）
；環式エーテル（例えば、テトラヒドロフラン）；酢酸エチル；ジエチルカルボ
ネート；アセトン；またはシクロヘキサン。この溶媒は、単独でかまたは組み合
わせて使用され得る。選択された溶媒は、ポリマーを溶解し得なければならず、
そしてこの溶媒は、カプセル化されている薬剤およびポリマーに対して不活性で
あることが所望される。

【００６８】 （ＩＶ．微粉化粒子の適用） 好ましい実施形態において、薬剤は、生物活性剤であり、そして粒子は、それ
らを必要とする患者に投与される。粒子は、単独で、例えば、乾燥粉末として投
与され得るか、または生理学的に受容可能なキャリア（例えば、生理食塩水）に
組み込まれ得る。

【００６９】 微粉化粒子はまた、微粉化プロセスにおいて形成された高分子マトリクスと共
にかまたはなしで、送達のためにマイクロカプセル化され得る。

【００７０】 本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに理解される。

【００７１】 （実施例１：レシチンおよびＳＰＡＮ^ＴＭ８５を含むＦＬＭマトリクス中の初
期のエマルジョンにおけるタンパク質の安定化） この実験は、凍結の前のＦＬＭの第１の工程の間の、小さな（５μｍ未満）一
次エマルジョンサイズを得る工程において重要な因子を研究した。試験タンパク
質として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（蛍光標識のフルオレセインイソチオ
シアネート（ＦＩＴＣ）で共有結合標識した）を、０．２Ｍリン酸ナトリウム（
ｐＨ７．６）中の１０ｍｇ／ｍｌ溶液として使用した。いくつかの場合では、タ
ンパク質溶液を、１０％マンニトール（ｗ／ｖ）で希釈し（最終のＢＳＡ濃度：
５ｍｇ／ｍｌ）、エマルジョンの安定化に対するマンニトールの効果を試験した
。

【００７２】 使用したポリマー溶液は、３〜６％（ｗ／ｖ）の濃度で塩化メチレン（「ＭＣ
」）に溶解した５０：５０のモル比（ＭＷ＝１２ｋＤＡ、ＲＧ ５０２Ｈ、Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）中のポリラクチド−ｃｏ−グリコリド
（ＰＬＧＡ）であった。さらに以下の２つの界面活性剤を、一次エマルジョンサ
イズを安定化しそしてこれを減少するそれらの能力について試験した：塩化メチ
レン中１％（ｖ／ｖ）溶液としてのＳＰＡＮ^ＴＭ８５（「ＭＣＳ８５」）および
塩化メチレン中１％（ｗ／ｖ）溶液としてのレシチン（「ＭＣＬ」）。塩化メチ
レン中のこれら２つの界面活性剤溶液を、ＰＬＧＡポリマーのための溶媒として
使用した。

【００７３】 （材料および方法） 代表的な実験は、０．０５ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ溶液を、塩化メチレ
ン中の１０ｍｌの３％ ＰＬＧＡ（ｗ／ｖ）に、界面活性剤の添加ありまたはな
しのいずれかで添加する工程からなった。この水／油混合物を、「Ｓｕｐｅｒｍ
ｉｘｅｒ ２」（Ｌａｂｏｃｒａｆｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）の最大振幅にお
いて、３０秒間ボルテックスした。エマルジョンの液滴サイズを、即座に、蛍光
顕微鏡を用いて評価し、そしてそのサイズをレチクルを使用して判定した。各試
験の結果を表１に示す。

【００７４】

【表１】 （実施例２：インスリンのＦＬＭおよびＰＩＮ） （ＦＬＭ手順） この処方物において、１．１７６ｇ ＰＬＧＡ ５０：５０ ＲＧ ５０２
Ｈを、２８ｍｌの塩化メチレンに溶解し、これらのベースポリマーの３．０９％
ｗ／ｖ溶液を得た。次いで、０．１１９８ｇのＦｅ_３Ｏ_４（全体の５．２％
ｗ／ｗ）をブレンドし、そして０．５８８０ｇのフマル酸プレポリマー（「ＦＡ
Ｏ」）を１０ｍｌのアセトンに溶解し、そして全体の２５．６％ ｗ／ｗの負荷
でブレンドした。ウシインスリン亜鉛（ＵＳＢ Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、３６．
２ｍｌの０．０１Ｎ ＨＣｌ中１３．６ｍｇ／ｍｌインスリン亜鉛を３８ｍｌの
このポリマー溶液に添加することによって、この混合物に分散させた。この混合
物を手で激しく１分間撹拌し、３０秒間ボルテックスし、次いで、マイクロチッ
プ（ｍｉｃｒｏｔｉｐ）を用いて２８％振幅で１分間、プローブ超音波処理した
。このエマルジョンをすぐに、液体窒素中で５分間、凍結させ、そして４６時間
凍結乾燥した。この乾燥固体の得られた組成を、表２に示す。

【００７５】

【表２】 （転相ナノカプセル化） ＦＬＭ手順からの乾燥固体を５８．８ｍｌの塩化メチレンに再懸濁し、その結
果、ＰＬＧＡ濃度は２％ ｗ／ｖとなった。この懸濁液を連続的に浴で超音波処
理し、その後、転相プロセシングを行った。単一のバッチは、２０ｍｌのポリマ
ー溶液を、１Ｌのビーカー中の１．０Ｌの石油エーテルに注ぐことからなった（
溶媒対非溶媒の比＝１：５０）。３０秒後、粒子を分析濾紙を用いる減圧濾過に
よって収集し、室温で１０分間風乾し、そして濾紙から掻き取った。大きな集塊
を、かみそりの刃で「さいの目に切る」ことによって破壊した。最後の粉末をさ
らに、水冷したマイクロミルで１分間処理して、集塊を破壊した。３バッチを調
製し、そして得られた粒子をプールし、収集し、そして秤量して、１．５９７２
ｇのミクロスフィアを、６９．５％の収率で得た。

【００７６】 （走査電子顕微鏡） これらのミクロスフィアをＳＥＭによって試験し、そして０．１μｍ未満〜０
．５μｍ（平均サイズ約０．２μｍ）の非常に狭い粒度分布を有する小さな別個
の粒子からなることがわかった。これらのミクロスフィアは、平滑な無孔質の表
面を有する球状であった。

【００７７】 （インスリンの抽出およびインビトロ放出の研究） 三連のミクロスフィアの名目上約１０ｍｇのアリコートを、０．５ｍｌの塩化
メチレンに溶解し、そして１．０ｍｌの０．００５Ｎ ＨＣｌで抽出した。タン
パク質を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡアッセイを用いて決定した。インスリンの負荷
は、効率１０６．６％に対して、名目上の負荷１８％ ｗ／ｗと比較して、１９
．２％±０．１％（ｗ／ｗ）であると決定された。

【００７８】 三連の約１０ｍｇのアリコートを使用して、連続的な１．０ｍｌ容量の新鮮な
リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２）（「ＰＢＳ」）中３７℃でミクロスフィ
アをインキュベートすることによって、インビトロでの放出を決定した。タンパ
ク質を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡアッセイを使用して、１時間、２．２５時間、３
．２５時間、４．２５時間、６．２５、および２４時間の時点からのインキュベ
ーション流体において決定した。全てのインキュベーション流体へのインスリン
の溶解度を向上させるために、１０μＬの濃ＨＣｌを、インキュベーションの完
了後に添加した。酸性化された流体の最終ｐＨは、３未満であった。Ｐｉｅｒｃ
ｅアッセイは、０．１Ｎ ＨＣｌは妨害物ではないと述べる。これらの放出結果
を、標準誤差（「Ｓ．Ｅ．」）とともに表３に示す。インスリン負荷のほぼ１５
％が、インキュベーションの最初の１時間後に放出され、そして９２％が、３．
２５時間後に放出された。２４時間の終了時には、最終抽出は、１％のインスリ
ンが残っていることを示した。

【００７９】

【表３】 （粒子サイズ分析） 約１００ｍｇのミクロスフィアを、２０ｍｌの０．９％ ＮａＣｌ、０．０１
％ ＴＷＥＥＮ^ＴＭ２０（ｗ／ｖ）、および０．０１％ ＴＷＥＥＮ^ＴＭ８０（
ｗ／ｖ）に再懸濁させ、次いで、２×３０秒間の交互サイクルのボルテックスお
よび浴超音波処理によって分散させた。この懸濁液を、ＬＳ ２３０ Ｃｏｕｌ
ｔｅｒレーザー粒子サイズ分析器に導入し、そして容量および数の分布に関する
統計を決定した。

【００８０】 （ＨＰＬＣ分析） ＨＰＬＣを、Ｗａｔｅｒｓ ９９６ Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ（Ｐ
ＤＡ）検出器を備えるＷａｔｅｒｓ ２６９０ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｍｏ
ｄｕｌｅを使用して実施した。このインスリンアッセイは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．プロト
コルの改変バージョンであり、７５％リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．７）お
よび２５％アセトニトリルの無勾配移動相で流す。使用したカラムは、Ｎｏｖａ
Ｐａｋ Ｃ１８ ３．９×１５０ｍｍ逆相カラムであった。サンプルを、０．０
１Ｎ ＨＣｌで抽出／可溶化し、そして０．２μｍのシリンジフィルタで濾過し
た。ピークを、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍクロマトグラフィーソフトウェアを使用して
分析した。これらの結果は、二連の実施において、２．９２７分および３．１９
７分の保持時間を有する単一のピークを示した。ピーク面積は、１６３２４０μ
Ｖ^＊秒（実施１）および１６９０００μＶ^＊秒（実施２）であった。

【００８１】 （実施例３：インスリンのＦＬＭおよびＰＩＮ） （ＦＬＭ手順） この処方において、１．１７６ｇ ＰＬＧＡ ５０：５０ ＲＧ ５０２ Ｈ
を、２８ｍｌの塩化メチレンに溶解して、ベースポリマーの３．７９％ ｗ／ｖ
溶液を得た。次いで、０．１１９８ｇのＦｅ_３Ｏ_４（全体の５．２％ ｗ／ｗ）
をブレンドした。次いで、０．５８８０ｇのＦＡＯを、３ｍｌのアセトンに溶解
し、そして全体の２５．６％ ｗ／ｗの負荷でブレンドした。次いで、ウシイン
スリン亜鉛（ＧＩＢＣＯ）を、５６．１ｍｌの０．００５Ｎ ＨＣｌ中７．３６
ｍｇ／ｍｌインスリン亜鉛を３１ｍｌのポリマー溶液に添加することによって、
この混合物に分散させた。この混合物を２０秒間ボルテックスし、そしてマイク
ロチップを用いて、３８％の振幅で１分間プローブ超音波処理した。このエマル
ジョンをすぐに、液体窒素中で５分間凍結させ、そして６９時間凍結乾燥した。
乾燥固体の得られた組成を、表４に示す。

【００８２】

【表４】 （転相ナノカプセル化） 得られた乾燥固体を４３．０ｍｌの塩化メチレンに再懸濁し、その結果、ＰＬ
ＧＡ濃度は２％ ｗ／ｖとなった。この懸濁液を連続的に浴で超音波処理し、そ
の後、転相プロセシングを行った。単一のバッチは、２１．５ｍｌのポリマー溶
液を、１Ｌのビーカー中の１．１Ｌの石油エーテルに注ぐことからなった（溶媒
対非溶媒の比＝１：５０）。３０秒後、粒子を分析濾紙を用いる減圧濾過によっ
て収集し、室温で１０分間風乾し、そして濾紙から掻き取り、大きな集塊を、実
施例１に示すように「さいの目に切った」。２バッチを調製し、そして得られた
粒子をプールし、収集し、そして秤量して、１．３７ｇのミクロスフィアを、８
１．５％の収率で得た。いくらかの原料損失が、微粉化工程に続く凍結乾燥の間
に起こり、そしてこれらは、ＰＩＮからの収率計算には含めなかった。

【００８３】 （走査電子顕微鏡） ミクロスフィアをＳＥＭによって試験し、そして小さな別個の粒子および板状
物の混合物からなることがわかった。これらの粒子は、球状の形態と不規則な形
状の形態との混合物であった。多くの凝集物および板状凝集物が観察された。粒
子は、大きさが０．００１μｍと３μｍとの間であり、平均サイズは約０．５μ
ｍであった。全ての形態は、平滑な無孔質の表面を有した。

【００８４】 （インスリンの抽出およびインビトロ放出の研究） アリコートを、実施例２においてと同様に調製した。インスリンの負荷は、９
１％の効率に関して、名目上１８％ ｗ／ｗの負荷と比較して、１６．４％±１
．９％（ｗ／ｗ）であると決定された。

【００８５】 三連の約１０ｍｇのアリコートを使用して、連続的な１．０ｍｌ容量のＰＢＳ
（ｐＨ７．２）中３７℃でミクロスフィアをインキュベートすることによって、
インビトロでの放出を決定した。タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡアッセイ
を使用して、１時間、２時間、３時間、４時間、および５時間の時点からのイン
キュベーション流体において決定した。全てのインキュベーション流体へのイン
スリンの溶解度を向上させるために、５μＬの濃ＨＣｌを、インキュベーション
の完了後に添加した。酸性化された流体の最終ｐＨは、３未満であった。これら
の放出結果を表６に示す。インスリン負荷のほぼ１６％が、インキュベーション
の最初の１時間後に放出され、そして６５％が、３時間後に放出された。５時間
の終了時には、最終抽出は、２８．２％のインスリンが残っていることを示した
。この結果を表５に示す。

【００８６】

【表５】 （実施例４：インスリンのＦＬＭおよびＰＩＮ） （ＦＬＭ手順） この処方に関して、１．７６２７ｇ ＰＬＧＡ ５０：５０ ＲＧ ５０２
Ｈを、４２ｍｌの塩化メチレンに溶解して、ベースポリマーの３．８３％ ｗ／
ｖ溶液を得た。この実施においては、０．１８０２ｇのＦｅ_３Ｏ_４（全体の５．
５％ ｗ／ｗ）をブレンドし、そして４ｍｌのアセトンに溶解した０．８８１４
ｇのＦＡＯを、そして全体の２６．８％ ｗ／ｗの負荷でブレンドした。ウシイ
ンスリン亜鉛（ＧＩＢＣＯ）を、６３．９ｍｌの０．００５Ｎ ＨＣｌ中７．３
６ｍｇ／ｍｌインスリン亜鉛を４６ｍｌのポリマー溶液に添加することによって
、この混合物に分散させた。この混合物を乳化し、凍結させ、そして実施例３に
おいてと同様に凍結乾燥した。乾燥固体の得られた組成を、表６に示す。

【００８７】

【表６】 （転相ナノカプセル化） 得られた乾燥固体を６１．０ｍｌの塩化メチレンに再懸濁して、ＰＬＧＡ濃度
を２％ ｗ／ｖとした。この懸濁液を連続的に浴で超音波処理し、その後、転相
プロセシングを行った。単一のバッチは、２０ｍｌのポリマー溶液を、１Ｌのビ
ーカー中の１．０Ｌの石油エーテルに注ぐことからなった（溶媒対非溶媒の比＝
１：５０）。３０秒後、粒子を分析濾紙を用いる減圧濾過によって収集し、室温
で１０分間風乾し、そして濾紙から掻き取った。大きな集塊をさいの目に切った
。３バッチを調製し、そして得られた粒子をプールし、収集し、そして秤量して
、６．８５３ｇのミクロスフィアを、７４．１％の収率で得た。

【００８８】 （走査電子顕微鏡） ＳＥＭによって試験したミクロスフィアは、一般に大きさが１μｍ未満であり
、平均サイズ約０．２μｍの、小さな別個の粒子からなることがわかった。形態
は、平滑な無孔質の表面を有する、球状および不規則な形状の混合物であった。

【００８９】 （インスリンの抽出およびインビトロ放出の研究） 三連のミクロスフィアの名目上約１０ｍｇのアリコートを、０．５ｍｌの塩化
メチレンに溶解し、そして１．０ｍｌの０．００５Ｎ ＨＣｌで抽出した。タン
パク質を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡアッセイを用いて決定した。インスリンの負荷
は、効率１１４．３％に対して、名目上の負荷１４．３％ ｗ／ｗと比較して、
１６．４％±０．５％（ｗ／ｗ）であると決定された。

【００９０】 三連の約１０ｍｇのアリコートを使用して、連続的な１．０ｍｌ容量の新鮮な
ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中３７℃でミクロスフィアをインキュベートすることによ
って、インビトロでの放出を決定した。タンパク質を、１時間、２時間、３時間
、４時間、および５時間の時点からのインキュベーション流体において決定した
。全てのインキュベーション流体へのインスリンの溶解度を向上させるために、
１０μＬの濃ＨＣｌを、インキュベーションの完了後に添加した。酸性化された
流体の最終ｐＨは、３未満であった。これらの放出結果を表７に示す。インスリ
ン負荷のほぼ１７％が、インキュベーションの最初の１時間後に放出され、そし
て３４％が、３時間後に放出された。５時間の終了時には、最終抽出は、６５．
１％のインスリンが残っていることを示した。

【００９１】

【表７】 （実施例５：インスリンのＦＬＭおよびＰＩＮ） （ＦＬＭ手順） この処方物に関して、１．５ｇ ＰＬＧＡ ５０：５０ ＲＧ ５０２ Ｈを
、２０ｍｌのアセトンに溶解し、これらのベースポリマーの１．６％ ｗ／ｗ溶
液を得た。この実施において、０．３０ｇのＦｅ_３Ｏ_４（全体の１０．５％ ｗ
／ｗ）をブレンドし、そして４ｍｌのアセトンに溶解した０．７５ｇのＦＡＯを
、全体の２６．３％ ｗ／ｗの負荷でブレンドした。ウシインスリン亜鉛（ＵＳ
Ｂ Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、２３ｍｌの０．０１Ｎ ＨＣｌ中１３．６ｍｇ／ｍ
ｌインスリン亜鉛を９５ｍｌのポリマー溶液に添加することによって、この混合
物に分散させた。この混合物を手で激しく０．５分間撹拌し、３０秒間ボルテッ
クスし、次いで、マイクロチップを用いて２８％振幅で１分間、プローブ超音波
処理し、そしてＶｉｒｔｉｓｈｅａｒ回転子−固定子ヘッドを用いて７０％の振
幅で１分間、ひだ付きの５００ｍｌ均質化容器を使用して均質化した。このエマ
ルジョンをすぐに、液体窒素中で５分間、凍結させ、そして７３時間凍結乾燥し
た。この乾燥固体の得られた組成を、表８に示す。

【００９２】

【表８】 （転相ナノカプセル化） 得られた乾燥固体を７５ｍｌの塩化メチレンに再懸濁し、その結果、ＰＬＧＡ
濃度は２％ ｗ／ｖとなった。この懸濁液を連続的に浴で超音波処理し、その後
、転相プロセシングを行った。単一のバッチは、２０ｍｌのポリマー溶液を、１
Ｌのビーカー中の１．０Ｌの石油エーテルに注ぐこと（溶媒対非溶媒の比＝１：
５０）、または１５ｍｌのポリマー溶液を、７５０ｍｌの石油エーテルに注ぐこ
とからなった。３０秒後、粒子を分析濾紙を用いる減圧濾過によって収集し、室
温で１０分間風乾し、濾紙から掻き取り、そして大きな集塊をさいの目に切った
。最後の粉末をさらに、水冷したマイクロミルで１分間処理して、集塊を破壊し
た。４バッチ（３つの２０ｍｌポリマー：１Ｌ非溶媒、および１つの１５ｍｌポ
リマー：７５０ｍｌ非溶媒）を調製し、そして得られた粒子をプールした。これ
により、１．５４２５ｇのミクロスフィアを、５３．５％の収率で収集した。

【００９３】 （走査電子顕微鏡） ミクロスフィアをＳＥＭで試験して、０．０１μｍ未満〜０．０２μｍの非常
に狭い粒度分布（平均サイズ約０．０２μｍ）で、いくらかの小さな別個の粒子
からなることがわかった。大部分の粒子は集塊状であったが、依然として別個で
あり、平滑な表面形態を有した。１〜５μｍのサイズ範囲の多くの板状結晶もま
た、観察された。

【００９４】 （インスリン抽出およびインビトロ放出研究） 名目上約１０ｍｇのアリコートのミクロスフェアを３連で０．５ｍｌの塩化メ
チレンに溶解し、そして１．０ｍｌの０．００５Ｎ ＨＣｌで抽出した。タンパ
ク質を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡアッセイを用いて決定した。インスリンのローデ
ィングを、１３５．２％の有効性について、名目上の１０．５％ ｗ／ｗのロー
ディングに比べて、１４．２％±１．３％（ｗ／ｗ）であると決定した。

【００９５】 三連で約１０ｍｇのアリコートを用いて、連続的な１．０ｍｌ容積の新鮮ＰＢ
Ｓ中で、ｐＨ７．２、３７℃で、ミクロスフェアをインキュベートすることによ
って、インビトロでの放出を決定した。インキュベーション溶液中のタンパク質
を１、２、３、４、５、７および２４時間の時点で、決定した。全てのインキュ
ベーション液中のインスリンの溶解度を亢進するため、１０μＬの濃ＨＣｌを、
インキュベーション終了後に添加した。酸性化した溶液の最終ｐＨは、３未満で
あった。放出結果を表９に示す。最初の１時間のインキュベーション後、およそ
３％のインスリンローディングを、そして３時間後９８％を放出した。２４時間
の終わりに、最終抽出によってインスリンの残りが０％となった。

【００９６】

【表９】 （実施例６：インスリンのＦＬＭおよびＰＩＮ） （ＦＬＭ手順） この処方物のために、１．５ｇ ＰＬＧＡ ５０：５０ ＲＧ ５０２ Ｈを
、７５ｍｌの塩化メチレンに溶解し、塩基性ポリマーの１．６％（ｗ／ｖ）溶液
を得た。この実施の際、０．３０ｇのＦｅ_３Ｏ_４（総量８．３３％（ｗ／ｗ））
を混合し、そして２０ｍｌのアセトン中に溶解した１．５ｇのＦＡＯを総量４１
．６６％（ｗ／ｗ）のローディングに混合した。ウシ亜鉛インスリン（ｂｏｖｉ
ｎｅ ｚｉｎｃ ｉｎｓｕｌｉｎ）（ＵＳＢ Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、２３ｍｌ
の１３．６ｍｇ／ｍｌ亜鉛インスリン（ｚｉｎｃ ｉｎｓｕｌｉｎ）含有０．０
１Ｎ ＨＣｌを９５ｍｌのポリマー溶液に添加することによって、この混合物中
に分散した。この混合物を、実施例５に記載のように、乳化し、凍結し、そして
凍結乾燥した。得られた乾燥固体の組成物を表１０に示す。

【００９７】

【表１０】 （転相ナノカプセル封入（Ｐｈａｓｅ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｎａｎｏｅｎｃ
ａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）） 得られた乾燥固体を、収集した１．２６２ｇのミクロスフェアとともに、実施
例５のように、再懸濁し、カプセル封入し、そして分析した。収率は３５．１％
であった。

【００９８】 （走査型電子顕微鏡） ミクロスフェアをＳＥＭによって試験し、そしていくつかの小さい別々の粒子
からなることを見出した。これは、０．０１〜０．０３μｍ未満という非常に狭
いサイズ分布であり、約０．０３μｍの平均サイズを有していた。ほとんどの粒
子は、凝集していたが、なお別々であり、円滑な表面形態を有していた。

【００９９】 （インスリン抽出およびインビトロ放出研究） アリコートを実施例５のように調製した。インスリンのローディングは、１５
８．４６％の有効性に関して、名目上８．３３％（ｗ／ｗ）のローディングと比
べて、１３．２％±０．７％（ｗ／ｗ）であることが決定された。

【０１００】 タンパク質を実施例５のように決定した。放出結果を表１１に示す。インキュ
ベーションの最初の１時間後に３％近くのインスリンローディングを、そして３
時間後に８０％を放出した。２４時間の終わりに、最終抽出によってインスリン
の残りが１％となった。

【０１０１】

【表１１】 （実施例７：インスリンのＦＬＭおよびＰＩＮ−第６実験） （ＦＬＭ手順） この処方物のために、１．５ｇ ＰＬＧＡ ５０：５０ ＲＧ ５０２ Ｈを
、７５ｍｌの塩化メチレンに溶解し、塩基性ポリマーの１．６％（ｗ／ｖ）溶液
を得た。この実施の際、０．３０ｇのＦｅ_３Ｏ_４（総量８．３３％（ｗ／ｗ））
を混合し、そして２０ｍｌのアセトン中に溶解した１．５ｇのＦＡＯを総量４１
．６６％（ｗ／ｗ）のローディングで混合した。ウシ亜鉛インスリン（ｂｏｖｉ
ｎｅ ｚｉｎｃ ｉｎｓｕｌｉｎ）（ＵＳＢ Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、２３ｍｌ
の１３．６ｍｇ／ｍｌ亜鉛インスリン（ｚｉｎｃ ｉｎｓｕｌｉｎ）含有０．０
１Ｎ ＨＣｌを、（滴下して添加した１０ｍｌの１０％硫酸亜鉛とともに）９５
ｍｌのポリマー溶液に添加することによって、この混合物中に分散した。この混
合物を、０．５分間激しく手で振盪し、そしてマイクロチップを用いた３５％振
幅で１．５分間プローブ超音波処理した。このエマルジョンを、液体窒素中で５
分間直ちに凍結し、そして４８時間凍結乾燥した。得られた乾燥固体の組成物を
、表１２に示す。

【０１０２】

【表１２】 （転相ナノカプセル封入（Ｐｈａｓｅ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｎａｎｏｅｎｃ
ａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）） 得られた乾燥固体を、収集した１．５８７５ｇのミクロスフェアとともに、実
施例５のように、再懸濁し、カプセル封入し、そして分析した。収率は４４．１
％であった。濾紙に対して高い損失があった；すなわち、大量の物質が濾紙につ
まり、そして除去できなかった。

【０１０３】 （走査型電子顕微鏡） ミクロスフェアをＳＥＭによって試験し、そしていくつかの小さい別々の粒子
からなることを見出した。これは、０．０１〜０．０３μｍ未満という非常に狭
いサイズ分布であり、約０．０３μｍの平均サイズを有していた。ほとんどの粒
子は、凝集していたが、なお別々であり、円滑な表面形態を有していた。小さい
スフェア、未カプセル封入のインスリン結晶、および小さいプレート（約１〜８
μｍのサイズ）がまた観察された。

【０１０４】 （インスリン抽出およびインビトロ放出研究） アリコートを実施例５のように調製した。インスリンのローディングは、１８
７．３％の有効性に関して、名目上８．３３％（ｗ／ｗ）のローディングと比べ
て、１５．６％±１．９％（ｗ／ｗ）であることが決定された。

【０１０５】 タンパク質を実施例５のように決定した。放出結果を表１３に示す。インキュ
ベーションの最初の１時間後に１％近くのインスリンローディングが、そして３
時間後に９０％が放出された。２４時間の終わりに、最終抽出によってインスリ
ンの残りが０％となった。

【０１０６】

【表１３】 （実施例７：バンコマイシンのＦＬＭおよびＰＩＮ） （ＦＬＭ手順） この処方物のために、１．０ｇ ＰＬＧＡ ５０：５０ ＲＧ ５０２ Ｈを
、２０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、塩基性ポリマーの２．８６％（ｗ／ｖ）溶
液を得た。次いで、０．２０ｇのＦｅ_３Ｏ_４（総量８．１６％（ｗ／ｗ））を混
合し、そして１．０ｇのＦＡＯを、１５ｍｌのアセトン中に溶解して、総量４０
．８２％（ｗ／ｗ）のローディングに混合した。バンコマイシン ＨＣｌ（Ｓｉ
ｇｍａ）を、５ｍｌの５％塩酸バンコマイシン含有蒸留水を、３５ｍｌのポリマ
ー溶液に添加することによって、この混合物中に分散した。この混合物を、０．
５分間激しく手で振盪し、そしてマイクロチップを用いた３６％振幅で１．０分
間プローブ超音波処理した。このエマルジョンを、５分間液体窒素中で直ちに凍
結し、そして６４時間凍結乾燥した。得られた乾燥固体の組成物を、表１４に示
す。

【０１０７】

【表１４】 （転相ナノカプセル封入） 得られた乾燥固体を、収集した１．４７９７ｇのミクロスフェアとともに、実
施例５のように、再懸濁し、カプセル封入し、そして分析した。収率は６０．４
％であった。

【０１０８】 （走査型電子顕微鏡） ミクロスフェアをＳＥＭによって試験し、そしていくつかの小さい別々の粒子
からなることを見出した。これは、０．１〜３μｍ未満という非常に狭いサイズ
分布であり、約１μｍの平均サイズを有していた。未カプセル封入のバンコマイ
シンが観察された。粒子は不規則な形状であり平滑な表面形態を有した。

【０１０９】 （実施例８：バンコマイシンのＦＬＭおよびＰＩＮ） （ＦＬＭ手順） この処方物のために、１．０ｇ ＰＬＧＡ ５０：５０ ＲＧ ５０２ Ｈを
、２０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、塩基性ポリマーの３．３３％（ｗ／ｖ）溶
液を得た。次いで、０．２０ｇのＦｅ_３Ｏ_４（総量８．４７％（ｗ／ｗ））を混
合し、そして１．０ｇのＦＡＯを、１０ｍｌのアセトン中に溶解して、総量４２
．３８％（ｗ／ｗ）のローディングで混合した。０．７ｍｌの２２７．３ｍｇ／
ｍｌ塩酸バンコマイシン含有蒸留水を３０ｍｌのポリマー溶液に添加することに
よって、バンコマイシン ＨＣｌ（塩酸バンコマイシン）（Ｓｉｇｍａ）を、こ
の混合物に分散した。この混合物を、実施例７に記載のように、乳化し、凍結し
、そして凍結乾燥した。得られた乾燥固体の組成物を表１５に示す。

【０１１０】

【表１５】 （転相ナノカプセル封入） 得られた乾燥固体を、収集した１．３８２１ｇのミクロスフェアとともに、実
施例５のように、再懸濁し、カプセル封入し、そして分析した。収率は５８．９
％であった。

【０１１１】 （実施例９：バンコマイシンのＦＬＭおよびＰＩＮ） （ＦＬＭ手順） この処方物のために、１．０ｇ ＰＬＧＡ ５０：５０ ＲＧ ５０２ Ｈを
、２０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、塩基性ポリマーの３．３３％（ｗ／ｖ）溶
液を得た。次いで、０．２０ｇのＦｅ_３Ｏ_４（総量８．４７％（ｗ／ｗ））を混
合し、そして１．０ｇのＦＡＯを、１０ｍｌのアセトン中に溶解して、総量４３
．６７％（ｗ／ｗ）のローディングで混合した。０．４ｍｌの２２７．３ｍｇ／
ｍｌ塩酸バンコマイシン含有蒸留水を３０ｍｌのポリマー溶液に添加することに
よって、塩酸バンコマイシン（Ｓｉｇｍａ）を、この混合物に分散した。この混
合物を、実施例７に記載のように、乳化し、凍結し、そして凍結乾燥した。得ら
れた乾燥固体の組成物を表１６に示す。

【０１１２】

【表１６】 （転相ナノカプセル封入） 得られた乾燥固体を、ＰＬＧＡ濃度が２％（ｗ／ｖ）になるように、５０ｍｌ
の塩化メチレン中に再懸濁した。この懸濁液を転相プロセスの前に、連続槽超音
波処理した。単一のバッチは、１Ｌビーカー（溶媒対非溶媒比＝１：５０）中の
１．０Ｌの石油に２０ｍｌのポリマー溶液を注ぎ入れる工程、または１０ｍｌの
ポリマー溶液を５００ｍｌの石油エーテルに注ぎ入れる工程からなった。３０秒
後、粒子を、分析用濾紙での減圧ろ過によって収集し、１０分間室温で風乾し、
そして濾紙から捨てた。大きい凝集を四角く切った。３つのバッチ（２０ｍＬポ
リマー：１Ｌ非溶媒で２、そして１０ｍｌポリマー：５００ｍｌ非溶媒で１）を
準備し、得られた粒子をプールした。得られた１．４２０８ｇのミクロスフェア
を６３．０％の収率で収集した。

【０１１３】 （実施例１０：プラスミドＤＮＡのＦＬＭおよびＰＩＮ） （ＦＬＭ手順） ２００ｍｇのポリ（フマル酸−コ−セバシン酸）２０：８０（「Ｐ（ＦＡ：Ｓ
Ａ）２０：８０」）（ＭＷ＝８ｋＤａ）を、２ｍｌの塩化メチレンに溶解して、
２ｍＬのｐＣＭＶ−Ｂｇａｌ（１ｍｇ／ｍｌ）を含有する蒸留水とともに１５秒
間ボルテックスし、エマルジョンを生成した。このエマルジョンを液体窒素中で
凍結し、そして一晩凍結乾燥した。

【０１１４】 （転相ナノカプセル封入） 得られたマトリックスを、４ｍｌの塩化メチレン（５％Ｐ（ＦＡ：ＳＡ）２０
：８０（ｗ／ｖ）で再構成し、そして溶媒対非溶媒の比が１：５０で石油エーテ
ル中に分散した。得られた粒子を、ろ過によって回収し、風乾し、そして凍結乾
燥して残りの溶媒を除去した。

【０１１５】 （分析） アガロースゲル上で、ミクロスフェアから抽出したプラスミドＤＮＡ、および
１０ｍｇのミクロスフェアを含有する１ｍｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５、２３℃
）の放出試験由来のサンプルを、泳動した。両方のサンプルとも、分解の証拠な
しに、スーパーコイル化ＤＮＡおよび開放環状（オープンサーキュラー）ＤＮＡ
の混合物を示した。ＰＩＮミクロスフェアのサイズは、一般に１０μｍ未満であ
った。

【０１１６】 （実施例１１：プラスミドＤＮＡのＦＬＭおよびＰＩＮ） （ＦＬＭ手順） ３．０ｇのＰ（ＦＡ：ＳＡ）２０：８０（ＭＷ＝８ｋＤａ）を、１０ｍｌの塩
化メチレンに溶解して、１．５ｍＬのｐＣＭＶ−Ｂｇａｌ（１ｍｇ／ｍｌ）を含
有する蒸留水（４．５ｍｇ／ｍｌ）とともに６０秒間ボルテックスし、エマルジ
ョンを生成した。このエマルジョンを液体窒素中で凍結し、そして一晩凍結乾燥
した。

【０１１７】 （転相ナノカプセル封入） 得られたマトリックスを、１００ｍｌの塩化メチレン（５％Ｐ（ＦＡ：ＳＡ）
２０：８０（ｗ／ｖ）で再構成し、そして溶媒対非溶媒の比が１：５０で石油エ
ーテル中に分散した。得られた粒子を、ろ過によって回収し、風乾し、そして凍
結乾燥して残りの溶媒を除去した。回収されたのは２．５ｇのスフェアであり、
８３％の収率であった。

【０１１８】 このスフェアを、塩化メチレンを用いて既知の量のスフェアを溶解すること、
およびＴＥ緩衝液を用いて抽出（２回）することによって、３連で抽出した。こ
の抽出物をプールして、プラスミド濃度を２６０ｎｍでのＯＤによって定量した
。平均ローディングは、８７．５％のカプセル化効率について、理論ローディン
グの２００μｇ／１００ｍｇスフェアに比較して、１９６μｇ±２３．８μｇプ
ラスミドＤＮＡ／１００ｍｇスフェアであった。得られたミクロスフェアは、約
３μｍの平均サイズにまとめられ分散した。

【０１１９】 （分析） ＴＥ緩衝液での放出試験を、３連で実施した。結果を表１７に示す。

【０１２０】

【表１７】 アガロースゲル上で、ミクロスフェアから抽出したプラスミドＤＮＡ、および
１０ｍｇのミクロスフェアを含有する１ｍｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５、２３℃
）の放出試験由来のサンプルを、泳動した。両方のサンプルとも、分解の証拠な
しに、スーパーコイル化ＤＮＡおよび開放環状（オープンサーキュラー）ＤＮＡ
の混合物を示した。

【０１２１】 （実施例１２：プラスミドＤＮＡのＦＬＭおよびＰＩＮ） （ＦＬＭ手順） １．５ｇのＰ（ＦＡ：ＳＡ）２０：８０（ＭＷ＝８ｋＤａ）を１０ｍｌの塩化
メチレン中に溶解し、そして０．９％塩化ナトリウム（３．６ｍｇ／ｍｌ）中で
ルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する１．０ｍｌのＶＲ−１２２３ Ｖｉｃ
ａｌプラスミドと共に６０秒間ボルテックスして、エマルジョンを得た。このエ
マルジョンを液体窒素中で凍結し、そして一晩凍結乾燥した。

【０１２２】 （転相ナノカプセル化） 得られたマトリックスを５０ｍｌの塩化メチレン（３％ Ｐ（ＦＡ：ＳＡ）２
０：８０（ｗ／ｖ）（ＭＷ＝８ｋＤａ））で再構成し、そして石油エーテル中に
、溶媒：非溶媒＝１：８０の比で分散させた。粒状物を濾過によって回収し、風
乾し、そして凍結乾燥して残りの溶媒を除去した。回収されたのは、１．１ｇの
スフェアであり、収率７３％であった。得られたミクロスフェアは丸く、そして
別々であり、平均サイズは約３μｍであった。

【０１２３】 （分析） ＴＥ緩衝液中で放出研究を三連で行った。結果を表１８に示す。

【０１２４】

【表１８】 アガロースゲルに、このミクロスフェアから抽出したプラスミドＤＮＡおよび
また２３℃の１ｍｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）中の１０ｍｇのミクロスフェア
の放出研究からのサンプルを泳動した。両方のサンプルが、超螺旋ＤＮＡと開環
状ＤＮＡとの混合物を示し、分解の証拠は存在しなかった。

【０１２５】 （実施例１３：プラスミドＤＮＡのＦＬＭおよびＰＩＮ） （ＦＬＭ手順） １．０ｇのＰ（ＦＡ：ＳＡ）２０：８０（ＭＷ＝８ｋＤａ）を１０ｍｌの塩化
メチレン中に溶解し、そしてＴＥ緩衝液（２．３ｍｇ／ｍｌ）中でＬＤＬレセプ
ター遺伝子を有する１．０ｍｌの１０Ｂプラスミドと共に６０秒間ボルテックス
して、エマルジョンを得た。このエマルジョンを液体窒素中で凍結し、そして一
晩凍結乾燥した。

【０１２６】 （転相ナノカプセル化） 得られたマトリックスを３３ｍｌの塩化メチレン（３％ Ｐ（ＦＡ：ＳＡ）２
０：８０（ｗ／ｖ）（ＭＷ＝８ｋＤａ））で再構成し、そして石油エーテル中に
、溶媒：非溶媒＝１：８０の比で分散させた。粒状物を濾過によって回収し、風
乾し、そして凍結乾燥して残りの溶媒を除去した。回収されたのは、０．９ｇの
スフェアであり、収率９０％であった。得られたミクロスフェアは丸く、そして
別々であり、平均サイズは約３μｍであった。

【０１２７】 （分析） ＴＥ緩衝液中で放出研究を二連で行った。結果を表１９に示す。

【０１２８】

【表１９】 アガロースゲルに、このミクロスフェアから抽出したプラスミドＤＮＡおよび
また２３℃の１ｍｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）中の１０ｍｇのミクロスフェア
放出研究からのサンプルを泳動した。両方のサンプルが、超螺旋ＤＮＡと開環状
ＤＮＡとの混合物を示し、分解の証拠は存在しなかった。

【０１２９】 （実施例１４：成長ホルモンの亜鉛沈澱） 亜鉛に対する成長ホルモン（「ＧＨ」）の錯体形成を、Ｊｏｈｎｓｏｎらに対
する米国特許第５，６６７，８０８号に記載される手順から改変した手順を用い
て行った。最初に、５００μｌのストックＧＨおよび４５００μｌの４ｍＭ重炭
酸ナトリウムを５０００μｌの０．９ｍＭ酢酸亜鉛中に滴下してＧＨ−亜鉛沈澱
物を形成させた。次いで、この沈澱物を遠心分離し、上清を除去し、そして０．
０５％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ^ＴＭ２０を添加した。次いで、ＰＩＮプロセスを
利用して、ＧＨ−亜鉛の粒子を微小カプセル化した。本明細書中に記載されるこ
の手順を、１ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇおよび４０ｍｇのＧＨのバッチサイズで
行った。

【０１３０】 錯体形成の効率（ＢＣＡタンパク質定量）データを以下の表２０に示す。

【０１３１】

【表２０】 この結果は、約１００％の錯体形成を示す。

【０１３２】 （実施例１５：凍結−エマルジョンポリマーマトリックス中のＦｃＯＰＧの安
定性およびＦｃＯＰＧ抽出手順の試験） オステオプロテゲリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ；ＯＰＧ）は、天然
に存在するサイトカインであり、骨に対する防御機能を有するタンパク質である
。Ａｍｇｅｎの組換えバージョンのＯＰＧはＦＣに対してカップリングされて、
産生の間の分離が容易にされており、そしてこれは、ジスルフィド結合によって
連結されているダイマーである。このモノマーは、配列から誘導されたアミノ酸
の付加から、４５．３ｋＤａの平均質量を有する。このタンパク質は、さらなる
何の賦形剤も安定剤も伴わずに、Ａｍｇｅｎから供給されたままで用いられ、ほ
ぼ良好な結果が得られた。全ての場合、このタンパク質は、異なる油：水比の単
純エマルジョンまたは本明細書中に記載される「凍結−エマルジョン」技術のい
ずれかを用いて液体状態でポリマー中に取り込まれた。

【０１３３】 凍結−エマルジョンマトリックスを、異なる３つのポリマーについて調製し、
次いで、ポリマー中に固体粒子として分散された場合にＦｃＯＰＧを抽出してＦ
ｃＯＰＧの安定性を試験した。各処方物は、１ｍｌの塩化メチレン（６％ ｗ／
ｖ）中の６０ｍｇのポリマーを用い、これに、１．０６ｍｇのＦｃＯＰＧを含有
する０．１１６ｍｌのストックＦｃＯＰＧ（９．１８ｍｇ／ｍｌ）を添加した。
このタンパク質溶液を、最大の振幅で３０秒間ボルテックスすることによって、
さもなければ３０秒間のボルテックスとマイクロチップを用いた２５％の振幅で
の５秒間のプローブ超音波処理との組合せを用いて、ポリマー溶液中に乳化した
。ＦｃＯＰＧのローディングは１．７４％（ｗ／ｗ）であり、そしてｗ／ｏ比は
約１：１０であった。エマルジョンを液体窒素中で５分間直ぐに凍結させ、そし
て２４時間凍結乾燥した。

【０１３４】 ポリマーを含まず、そしてボルテックスおよびボルテックス／プローブ−超音
波処理を塩化メチレンのみの中で行った場合の、ＦｃＯＰＧに対する微粉化処理
の影響もまた試験した。これらの実験について、凍結−エマルジョン手順後のＦ
ｃＯＰＧを、０．５ｍｌの１０ｍＭグルタメート（ｐＨ５．０）、３．５％マン
ニトール（ｗ／ｖ）、０．０１％ ＴＷＥＥＮ^ＴＭ ２０（ｖ／ｖ）および０．
０３％アジ化ナトリウム（Ａｍｇｅｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ
（「ＡＦＢ」））中に再懸濁した。抽出手順は必要でなかった。なぜなら、ポリ
マーマトリックスが存在しなかったからである。

【０１３５】 この実験セットにおいてまた試験したのは、３つの異なる方法を用いてのＦｃ
ＯＰＧの抽出効率であった：油／水抽出（Ｏ／Ｗ）；油／油抽出（Ｏ／Ｏ）およ
び「迅速放出」（ＲＲ）。Ｏ／Ｗ抽出を、約８〜１０ｍｇの凍結−エマルジョン
マトリックスを０．７ｍｌの塩化メチレン中に溶解し、そして０．５ｍｌのＡＦ
Ｂで抽出することによって行った。Ｏ／Ｏ抽出を、約８〜１０ｍｇの凍結−エマ
ルジョンマトリックスを、塩化メチレン：メチルエチルケトン（ＭＥＫ）の１．
４ｍｌの１：１混合物中に溶解し、１５Ｋｒｐｍで１０分間での遠心分離によっ
て不溶性タンパク質をペレット化し、上清の有機流体を廃棄し、そして風乾した
ペレットを０．５ｍｌのＡＦＢ中に再懸濁することによって行った。ＲＲを、室
温で２時間にわたる、０．５ｍｌのＡＦＢ中での約８〜１０ｍｇの凍結−エマル
ジョンマトリックスのボルテックスと攪拌との組み合わせによって行った。この
実験の設計を表２１に示す。

【０１３６】

【表２１】 この実験の結果を表２２に示す。

【０１３７】

【表２２】 ボルテックスおよびボルテックス−超音波処理は、ポリマーなしで塩化メチレ
ンのみを凍結−エマルジョンプロセスの間に用いた場合、ＦｃＯＰＧに対して影
響がなかった。還元条件下では、このタンパク質は、約４５ｋＤＡでストックＦ
ｃＯＰＧと同様に移動し、そして非還元条件では、このタンパク質は、約９０ｋ
ＤＡの見かけの分子量でストックＦｃＯＰＧと同様に移動した。どの例において
も凝集が観察されず、そしてＡＦＢ中に再溶解したタンパク質の量は同じようで
あった。

【０１３８】 ボルテックス処理は、凍結−エマルジョン手順の間、使用されたポリマーにか
かわらず、ＦｃＯＰＧに対して無視できる効果を有した。しかし、ボルテックス
−超音波処理後に、用いたポリマーとも抽出プロトコルとも独立して、実質的に
より少ないＦｃＯＰＧが回収された。特に、ボルテックス−超音波処理後のＰ（
ＦＡ：ＳＡ）２０：８０からのＦｃＯＰＧの回収は常に乏しく、このことは、表
に示すように、タンパク質とポリマーとの不可逆的な会合、さもなければ凝集を
示した。従って、大部分の処方物がＰＬＧＡ（受け入れられた生物医学的ポリマ
ーである）を用いて調製されること、および生体接着性賦形剤とブレンドするこ
とによって生体接着特性が最終処方物に導入されることが決定された。

【０１３９】 試験した３つの抽出手順のうち、Ｏ／Ｏ方法はＦｃＯＰＧの最大回収をもたら
し、それに次ぐのがＯ／Ｗ法であり、そして最後にＲ／Ｒであるようであった。
Ｏ／Ｏ手順を、大部分の処方物についてのデフォールト抽出手順として用いた。

【０１４０】 （実施例１６：Ｐ（ＦＡ：ＳＡ）におけるＦｃＯＰＧのカプセル化） この実験の目的は、ＦｃＯＰＧの統合性に対する、凍結したエマルジョンの微
粉化工程、続いてＰＩＮの影響を試験し、そして放出反応速度に対する、ポリマ
ーマトリックスの影響を決定することであった。Ｐ（ＦＡ：ＳＡ）２０：８０（
約７ｋＤＡのＭＷ）中の３．４％ ＦｃＯＰＧ ｗ／ｗのローディングを用いた
。

【０１４１】 （微粉化方法：） 最初に、０．３ｇのＰ（ＦＡ：ＳＡ）２０：８０固体を５ｍｌの塩化メチレン
中に溶解し、６％溶液（ｗ／ｖ）を得た。次いで、１．１５ｍｌのストックＦｃ
ＯＰＧ（１０．５６ｍｇのＦｃＯＰＧ（９．１８ｍｇ／ｍｌ）を含有する）を−
８０℃での貯蔵から解凍し、５ｍｌのポリマー溶液に添加した。水：油エマルジ
ョン比は約１：５であった。この混合物を３０秒間最大振幅でボルテックスし、
そして液体窒素中で５分間直ちに凍結した。凍結した混合物を２４時間凍結乾燥
した。

【０１４２】 （カプセル化方法：） 乾燥したエマルジョンマトリックスを新鮮な５ｍｌ容量の塩化メチレン中に再
溶解し、２分間ボルテックスし、次いで２５０ｍｌの石油エーテル中に分散させ
た。粒子を、Ｐ８定量フィルターを用いた減圧濾過によって収集し、風乾し、そ
して計量した。約０．２８７２ｇの出発物質が回収され、これは、９２．５％の
回収に相当した。

【０１４３】 （実施例１７：ＰＬＧＡ ５０：５０におけるＦｃＯＰＧのカプセル化） この実験を、ＰＬＧＡ ５０：５０ ＲＧ５０２Ｈ（約１２ｋＤａのＭＷ）が
用いたポリマーであること以外は、実施例１６と本質的に同一に行った。約０．
２９３７ｇの出発物質が回収され、これは、９４．６％の回収に相当した。

【０１４４】 （実施例１８：ＰＬＡにおけるＦｃＯＰＧのカプセル化） この実験を、ＰＬＡ（約２４ｋＤａのＭＷ）が用いたポリマーであること以外
は、実施例１６と本質的に同一に行った。約０．２３０７ｇの出発物質が回収さ
れ、これは、７４．３％の回収に相当した。

【０１４５】 （実施例１９：ＰＬＧＡ ５０：５０、３．４％ローディングにおけるＦｃＯ
ＰＧのＦＬＭ） この実験は、エマルジョン−凍結微粉化、続いてＰＩＮプロセスを用いたＦｃ
ＯＰＧのカプセル化に対する異なる水：油（ｏ：ｗ）比およびローディングの影
響を試験するための一連の３つの処方物のうちの最初の処方物である。ポリマー
およびローディングは、実施例１７のとおりであった。

【０１４６】 （微粉化方法：） 最初に、０．３ｇのＰＬＧＡ固体を５ｍｌの塩化メチレン中に溶解して、６％
溶液（ｗ／ｖ）を得た。次いで、１．１５ｍｌのストックＦｃＯＰＧ（１０．５
６ｍｇのＦｃＯＰＧ（９．１８ｍｇ／ｍｌ）を含有する）を−８０℃の貯蔵から
とり、そして２４時間凍結乾燥させた。各バイアルからの残渣を０．３ｍｌの０
．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に再溶解し、３０秒間ボルテックスし、そして
５ｍｌのポリマー溶液に添加した。水：油エマルジョン比は約３：５０であった
。この混合物を最大振幅で６０秒間ボルテックスし、そして液体窒素中で５分間
直ちに凍結した。凍結した混合物を２４時間凍結乾燥した。

【０１４７】 （カプセル化方法：） 乾燥したエマルジョンマトリックスを新鮮な５ｍｌ容量の塩化メチレン中に再
溶解し、２分間ボルテックスし、次いで２５０ｍｌの石油エーテル中に分散させ
た。粒子をＰ８定量フィルターを用いて減圧濾過によって収集し、凍結し、凍結
乾燥し、そして計量した。約０．３０８４ｇの出発物質が回収され、９９．３％
の回収に相当した。

【０１４８】 （実施例２０：ＰＬＧＡ ５０：５０、６．５８％ローディングにおけるＦｃ
ＯＰＧのＦＬＭ） この実験を、ＦｃＯＰＧのローディングが６．５８％であり、ストックＦｃＯ
ＰＧの２つのバイアルを用いることによって達成されたこと以外は、実施例１９
と本質的に同一に行った。約０．３２１１２ｇの出発物質が回収され、これは、
８５．７％の回収に相当した。

【０１４９】 （実施例２１：ＰＬＧＡ ５０：５０、９．５５％ローディングにおけるＦｃ
ＯＰＧのＦＬＭ） この実験を、ＦｃＯＰＧのローディングが６．５８％であり、ストックＦｃＯ
ＰＧの３つのバイアルを用いることによって達成されたこと以外は、実施例１９
と本質的に同一に行った。また、この実験において、各バイアルからの残渣を、
合計０．４５ｍｌの０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ ７．２）中に再溶解して、約９：
１００の水：油エマルジョン比を得た。約０．３３１６８ｇの出発物質が回収さ
れ、これは、１０３．１１％の回収に相当した。

【０１５０】 （実施例２２：ＰＬＧＡ ５０：５０におけるＦｃＯＰＧのＦＬＭ、Ｗ：Ｏ比
１１：５０） この実験は、エマルジョン−凍結微粉化、その後のＰＩＮプロセスを使用する
ＦｃＯＰＧのカプセル化に対する、異なる水：油（ｏ：ｗ）比および充填の効果
を試験するための、一連の４つの処方物の最初のものである。ＰＬＧＡ ５０：
５０ ＲＧ ５０２Ｈ（分子量約１２ｋＤＡ）中の３．４％ ＦｃＯＰＧ（ｗ／
ｗ）の充填を使用する。

【０１５１】 （微粉化方法） 最初に、０．３ｇのＰＬＧＡ固体を、５ｍｌの塩化メチレン溶液に溶解し、６
％溶液（ｗ／ｖ）を得た。１．１５ｍｌのストックＦｃＯＰＧの１つのバイアル
（１０．５６ｍｇのＦｃＯＰＧ（９．１８ｍｇ／ｍｌ）を含む）を、−８０℃で
の保存から解凍し、そして５ｍｌのポリマー溶液に添加した。水：油のエマルジ
ョン比は、約１１：５０であった。混合物を、最大振幅で３０秒間ボルテックス
し、そして５分間液体窒素中で即座に凍結した。この凍結混合物を、２４時間凍
結乾燥化した。

【０１５２】 （カプセル化方法） この乾燥エマルジョンマトリクスを、新たな５ｍｌ容量の塩化メチレン中に再
溶解し、２分間ボルテックスし、次いで、２５０ｍｌの石油エーテルに分散させ
た。粒子を、Ｐ８定量フィルターを用いる減圧濾過によって収集し、凍結し、凍
結乾燥しそして秤量した。約０．３１０５６ｇの出発材料を回収し、これは、５
６．３％の回収率に相当する。

【０１５３】 （実施例２３：ＰＬＧＡ ５０：５０におけるＦｃＯＰＧのＦＬＭ、Ｗ：Ｏ比
２２：５０） この実験は、ＦｃＯＰＧの充填が６．６％であり、ストックＦｃＯＰＧの２つ
のバイアルを使用して達成したことを除いて、本質的に実施例２２と同じように
行った。水：油のエマルジョン比は、約２２：５０であった。約０．３２１１２
ｇの出発材料を回収し、これは、９７．１％の回収率に相当する。

【０１５４】 （実施例２４：ＰＬＧＡ ５０：５０におけるＦｃＯＰＧのＦＬＭ、Ｗ：Ｏ比
３３：５０） この実験は、ＦｃＯＰＧの充填が９．６％であり、ストックＦｃＯＰＧの３つ
のバイアルを使用して達成したことを除いて、本質的に実施例２２と同じように
行った。水：油のエマルジョン比は、約３３：５０であった。約０．３３１６８
ｇの出発材料を回収し、これは、１１９．５％の回収率に相当する。

【０１５５】 （実施例２５：ＰＬＧＡ ５０：５０におけるＦｃＯＰＧのＦＬＭ、Ｗ：Ｏ比
４４：５０） この実験は、ＦｃＯＰＧの充填が１２．３％であり、ストックＦｃＯＰＧの４
つのバイアルを使用して達成したことを除いて、本質的に実施例２２と同じよう
に行った。水：油のエマルジョン比は、約４４：５０であった。約０．５１５４
ｇの出発材料を回収し、これは、１５０．６％の回収率に相当する。このサンプ
ルは、おそらく、完全には凍結乾燥化されなかった。

【０１５６】 （実施例２６：レシチンを含まないＰＬＧＡ５０：５０におけるＦｃＯＰＧの
ＦＬＭ） この実験は、エマルジョン−凍結微粉化工程中のタンパク質エマルジョンの安
定化および異なる溶媒−非溶媒対を用いるＰＩＮプロセスを使用するＦｃＯＰＧ
のカプセル化に対するレシチンの効果を試験するための、一連の２つの処方物の
最初のものである。ＰＬＧＡ ５０：５０ ＲＧ ５０２Ｈ（分子量約１２ｋＤ
Ａ）中の３．４％のＦｃＯＰＧ（ｗ／ｗ）を使用した。

【０１５７】 微粉化を、実施例２２のように行った。カプセル化のために、次いで、この乾
燥エマルジョンマトリクスを、新たな５ｍｌ容量の酢酸エチル中に溶解し、２分
間ボルテックスし、次いで、４５ｍｌのイソプロパノールに分散させた。７ｍｌ
部の処方物を、液体窒素中で１５分間凍結し、３日間凍結乾燥化した。

【０１５８】 （実施例２７：レシチンを含むＰＬＧＡ ５０：５０におけるＦｃＯＰＧの凍
結エマルジョンカプセル化） この実験は、塩化メチレンが１０ｍｇのレシチン（２ｍｇレシチン／ｍｌ）を
含むことを除き、本質的に実施例２６と同じように行った。３．２９％のＦｃＯ
ＰＧの充填を達成した。

【０１５９】 （実施例２８：ＰＬＧＡ ５０：５０におけるＦｃＯＰＧのＦＬＭ） この実験は、エマルジョン凍結微粉化工程中のタンパク質エマルジョンの安定
化に対するレシチンの効果を試験するための、一連の３つの処方物のうちの最初
のものである。微粉化工程中にエマルジョンサイズを減少するためのプローブ超
音波処理の使用もまた、溶媒−非溶媒対として塩化メチレンおよび石油エーテル
を用いるＰＩＮプロセスを使用するＦｃＯＰＧのカプセル化と共に、試験した。
ＰＬＧＡ ５０：５０ ＲＧ ５０２Ｈ（分子量約１２ｋＤＡ）中の２．９％の
ＦｃＯＰＧ（ｗ／ｗ）を使用した。

【０１６０】 （微粉化方法） 最初に、０．３ｇのＰＬＧＡ固体を、５ｍｌの塩化メチレン溶液に溶解し、６
％溶液（ｗ／ｖ）を得た。０．９２ｍｌのストックＦｃＯＰＧの１つのバイアル
（２６．９ｍｇ／ｍｌの濃度）を、−８０℃での保存から解凍した。次いで、８
．９７ｍｇのＦｃＯＰＧを含むこのストック溶液のうちの０．３ｍｌを、５ｍｌ
のポリマー溶液（この溶液には、レシチンを加えなかった）に添加した。水：油
のエマルジョン比は、約３：５０であった。混合物を、最大振幅で３０秒間ボル
テックスし、２５％振幅で５秒間プローブ超音波処理し、そして５分間液体窒素
中で即座に凍結させた。この凍結乾燥物を、２４時間凍結乾燥化した。

【０１６１】 （カプセル化方法） この乾燥エマルジョンマトリクスを、新たな５ｍｌ容量の塩化メチレン中に再
溶解し、２分間ボルテックスし、次いで、２５０ｍｌの石油エーテルに分散させ
た。粒子を、Ｐ８定量フィルターを用いる減圧濾過によって収集し、凍結し、凍
結乾燥しそして秤量した。約０．２８７６ｇの出発材料を回収し、これは、９３
．１％の回収率に相当する。

【０１６２】 （実施例２９：ＰＬＧＡ５０：５０中のＦｃＯＰＧのＦＬＭ） 実験を、ＦｃＯＰＧの充填が２．６８％であり、そして２５ｍｇのレシチン（
５ｍｇレシチン／ｍｌ）がこのポリマー溶液に含まれ、７．４９％（ｗ／ｗ）の
レシチン充填を得たことを除いて、本質的には実施例２８と同じように行った。
カプセル化のために、乾燥エマルジョンマトリクスを、新たな５ｍｌ容量の塩化
メチレン中に再溶解し、２分間ボルテックスし、次いで、２５０ｍｌの石油エー
テルに分散させた。粒子は、Ｐ８定量フィルターを用いる減圧濾過を行った後の
フィルター上で合体された。

【０１６３】 （実施例３０：ＰＬＧＡ５０：５０中のＦｃＯＰＧのＦＬＭ） 実験を、ＦｃＯＰＧの充填が２．４９％であり、そして５０ｍｇのレシチン（
１０ｍｇレシチン／ｍｌ）をこのポリマー溶液に含んで、１３．２９％（ｗ／ｗ
）のレシチン充填を得たことを除いて、本質的には実施例２９と同じように行っ
た。

【０１６４】 実施例１６〜３０におけるプロセスの変数および作製された処方物についての
理論的ＦｃＯＰＧ充填 対 実際のＦｃＯＰＧ充填の要約を、それぞれ、表２３
および２４に提供する。表２５は、Ｃｏｕｌｔｅｒサイズ分布の結果を要約し、
そして表２６は、これらの処方物のＳＥＭ形態学的研究を要約する。表２７およ
び２８は、それぞれ、ＳＥＣ ＨＰＬＣ／ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびこれらの処方
物についてのＦｃＯＰＧ放出を要約する。 表２３：実施例１６〜３０についてのプロセス変数の要約

【０１６５】

【表２３】 表２４：実施例１６〜３０についてのＦｃＯＰＧの理論的および実際の充填

【０１６６】

【表２４】 表２５：実施例１６〜３０の処方物のＣｏｕｌｔｅｒサイズ分布

【０１６７】

【表２５】 表２６：実施例１６〜３０の処方物のＳＥＭ形態

【０１６８】

【表２６】 表２７：実施例１６〜３０の処方物のＳＥＣ ＨＰＬＣ／ＳＤＳ−ＰＡＧＥ

【０１６９】

【表２７】 表２８：実施例１６〜３０の処方物からのＦｃＯＰＧ放出

【０１７０】

【表２８】 （実施例３１：ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて行ったＦｃＯＰＧ放出研究） 実施例２２、２３、２４、２５、２８および３０由来のミクロスフェアの約６
〜２０ｍｇアリコートを、０．００３％アジ化ナトリウムを含む１ｍｌの０．１
Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ ７．２）中、３７℃でインキュベートした。１、３、５およ
び２４時間間隔で、これらのスフェアを、５分間１５ＫＧ平均で遠心分離し、上
清の放出液を収集し、そして残ったスフェアを、１ｍｌの新たなＰＢＳ中に再懸
濁した。最終時点後、これらのミクロスフェアを、Ｏ／Ｏ手順を用いて抽出し、
そしてタンパク質ペレットを、１ｍｌの新たなＰＢＳ中に再懸濁した。

【０１７１】 次いで、０．２ｍｌの放出液を、１０μＬのエチレングリコール（内部標準）
と混合し、ＨＰＬＣを行った。ストック９．１８ｍｇ／ｍｌ溶液（Ａｍｇｅｎか
ら供給される）の希釈によって調製したＦｃＯＰＧ標準もまた、６２．５、１２
５、２５０、５００および１０００μｇ／ｍｌの濃度で流した。標準ＦｃＯＰＧ
ピーク（Ｒｆ値７．９分）下の面積を積分し、そして検量線を、ＦｃＯＰＧの濃
度を面積に関係付けることによって構築した。サンプルの濃度を、この関係から
計算し、そしてこれを使用して、これらの処方物の放出を測定した。

【０１７２】 実施例２２および３０を除いて、試験した全ての処方物は、７７，０００の見
かけの分子量を有するストックＦｃＯＰＧと同様に移動したＦｃＯＰＧを有した
。実施例２２は、約６．９分の保持時間（１４５，０００の見かけの分子量に相
当する）で移動した、実質的な量の凝集ＦｃＯＰＧと共に、いくらかのネイティ
ブＦｃＯＰＧを有した。実施例３０は、約４．９分の保持時間（８５８，０００
の見かけの分子量に対応する）を有する実質的な量の凝集体と共に、ほとんど、
ネイティブＦｃＯＰＧを有した。実施例２２および３０の両方について、この量
の凝集タンパク質（おそらく、ＦｃＯＰＧ）は、放出の計算に使用しなかった。
これらの結果を、表２９および図１〜４に示す。 表２９：放出ＦｃＯＰＧの累計（μｇ ＦｃＯＰＧ／ｍｇ ミクロスフェア）

【０１７３】

【表２９】 （実施例３２：ヒト成長ホルモン粒子サイズ） ＦＬＭプロセスに従って薬物粒子サイズを決定するために、カプセル化ポリマ
ー材料を、塩化メチレンに再溶解し、そして不溶性粒子（ヒト成長ホルモンおよ
び安定化賦形剤）を、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＳ ２３０レーザー回析を使用してサ
イズ化した。ＦＬＭを生成するために使用した成分組成物は、６７．７％ ＰＬ
ＧＡ（５０：５０ 分子量１２Ｋ）、２．１％ヒト成長ホルモン、１３．３％
ＦｅＯ、２．３％ マンニトール、０．２％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^ＴＭ Ｆ１２７
および１４．４％スクロースであった。ヒト成長ホルモン、スクロース、マンニ
トール、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ^ＴＭ Ｆ１２７を含む水相（２．５ｍｌ）を、
ＰＬＧＡを含む酢酸エチル相（１０ｍｌ）と共に１分間ボルテックスし、そして
１５分間液体窒素中で瞬間凍結した。この凍結混合物を、Ｔｉｔａｎ Ｃｏｌｄ
Ｔｒａｐ（ＦＴＳ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｓｔｏｎｅ Ｒｉｄｇｅ，ＮＹ）を用
いて４８時間凍結乾燥した。その後、凍結乾燥マトリクスを、ＰＩＮプロセスを
使用してミクロスフェアに製造した。

【０１７４】 薬物粒子（以下のＦＬＭ）の容積の平均は、３．１５６±１．６μｍであった
。薬物粒子の数の平均は、１．０２２±２．００μｍであった。この異なるサイ
ズ分布は、以下の通りである： （表３０：増殖したホルモン粒子のサイズ分布）

【０１７５】

【表３０】 この結果は、ヒト増殖ホルモンは、首尾良く微紛化され、粒子の９０％が２．
６２３μｍのサイズ未満であることを示す。

【０１７６】 （実施例３３：ｈＧＨの会合に影響を与えるプロセスの変化） （プロトコル：） ｈＧＨのストック溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を、多数の異なる条件下（溶媒選択
、ボルテックス期間、界面活性剤の選択および界面活性剤の濃度）で、ＦＬＭを
使用して、ＰＬＧＡ５０：５０（Ｍｗ 約１１ｋＤａ）に取り込み、ＦＬＭプロ
セスの間の、ｈＧＨ会合の効果を評価した。具体的に、種々の量のＰＬＵＲＯＮ
ＩＣ^ＴＭＦ１２７またはポリエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ＴＷ
ＥＥＮ^ＴＭ２０）を含むｈＧＨのストック溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を、水性のｈ
ＧＨ相に添加し、そして塩化メチレンまたは酢酸エチル（５０ｍｇ／ｍｌ）のい
ずれかに溶解したＰＬＧＡ中で、１５または６０分間のいずれかでボルテックス
にかけ、そして液体窒素中でクエンチした。この凍結したエマルジョンを、４８
時間かけて凍結乾燥し、水性溶媒および有機性溶媒の両方を除去した。続いて、
得られた混合物を、緩衝液中で懸濁させ、そして上清を、水和の１および２４時
間後に、ｈＧＨ会合についてＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用して分析した。

【０１７７】 （結果：） モノマーｈＧＨは、約１４分間で移動し、そして会合形成が、８分と１３分と
の間に見出された。同一の製造条件下で、溶媒として酢酸エチルの使用により、
塩化メチレンと比較して、ＧＨの有意に低い会合を提供する。さらに、会合の割
合は、酢酸エチルへの曝露後１〜２４時間変化せず、一方で、会合の割合は、塩
化メチレンの使用時間と共に増加した。最良の処方物の組合せは、溶媒（０．２
％のＦ１２７を含むストックＧＨを含む）として酢酸エチルの使用を通じて明ら
かとなり、１５分間攪拌して、０．７％の会合が生じる（表３１を参照のこと）
。

【０１７８】 （異なる溶媒を使用するｈＧＨ会合の割合）

【０１７９】

【表３１】 （実施例３４：ｈＧＨ放出の調節） （プロトコル：） ストックｈＧＨは、２工程のプロセスを使用して、生分解可能なミクロスフェ
ア中にマイクロカプセル化させた。まず、ｈＧＨを、ＦＬＭプロセスを使用して
ポリマー中に取り込んだ。具体的には、ｈＧＨ（２０ｍｇ／ｍｌ）およびＰＬＵ
ＲＯＮＩＣ^ＴＭＦ１２７（０．２％ ｗ／ｖ）を、ＲＧ５０２Ｈ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ Ｉｎｎｇｅｌｈｅｉｍ）またはＢＰＩ−０．２（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａ
ｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ）ＰＬＧＡ中でボルテックスにかけ、これを、１
５秒かけて５％（ｗ／ｖ）の酢酸エチル中に溶解させ、そして液体窒素中でクエ
ンチした。次いで、この凍結したエマルジョンを、４８時間かけて凍結乾燥し、
水性溶媒および有機性溶媒を除去した。第２に、分散したｈＧＨの凍結乾燥した
混合物、ポリマー、界面活性剤およびスクロースを、酢酸エチル中に再溶解させ
、そして転相ナノカプセル化（ＰＩＮ）を使用してミクロスフェアに組み立てら
れる。具体的に、このマトリクスは、５％（ｗ／ｖ）の酢酸エチル−ポリマー溶
液に再溶解され、そして５０倍過剰の石油エーテルまたは５０％のイソプロパノ
ールのいずれかに迅速に注ぎ、４つのミクロスフィアのバッチを生成した。バッ
チ１：ＲＧ５０２Ｈ／イソプロパノールの組合せ；バッチ２：ＲＧ５０２Ｈ／石
油エーテルの組合せ；バッチ３：ＢＩＰ−０．２／イソプロパノールの組合せ；
バッチ４：ＢＰＩ−０．２／石油エーテルの組合せ。石油エーテルの抽出物で形
成されたミクロスフェアを、２．７μｍの濾紙を用いて濾過することによって回
収し、そして溶媒を完全に除去するために２４時間凍結乾燥した。イソプロパノ
ールを用いて形成されたミクロスフェアを、凍結乾燥により回収した。すべての
ミクロスフェアは、３．５％（ｗ／ｗ）のＧＨ充填で作製した。ミクロスフェア
（約１０ｍｇ）を、１００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．
０５％の ＰＬＵＲＯＮＩＣ^ＴＭＦ１２７（５０ｍｇ／ｍｌ）で水和させた。ミ
クロスフェアを分散し（ボルテックスにかけた後、５秒間の浴中での超音波処理
）、そしてインキュベートした。１時間、４時間、２４時間、および１２０時間
の時点で、この上清をサンプリングし、そして放出したＧＨおよび会合をＳＥＣ
−ＨＰＬＣ定量で分析した。

【０１８０】 （結果） （ＧＨ放出割合） 累積放出割合（ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより定量）が、図５に示される。理論上の
３．５％（ｗ／ｗ）のＧＨの充填から算出される累積放出割合（％）が、表３２
に示される。第１に、より親水性のＰＬＧＡ（５０：５０）の使用は、石油エー
テルおよびイソプロパノールに基づくＰＩＮ技術の両方においてより速いＧＨの
放出を誘導した。さらに、同じポリマー型の中では、溶媒抽出媒体としての石油
エーテルの使用は、イソプロパノールと比較して、より速いＧＨの放出を誘導し
た。４時間と１２０時間との間の直線の一致が、放出割合における量的な差異の
性質に対して生じた。バッチ１は、緩やかな継続的な放出を示した（およそ０．
１μｇ／ｍｇ／ｈｒ、ｒ^２＝０．９３）。バッチ２は、１時間でほぼ総バースト
を示し、その後ほとんど放出しなかった（およそ０．０２μｇ／ｍｇ／ｈｒ、ｒ ^２ ＝０．７９）。バッチ３は１時間で最小のバーストを示し、その後ほとんど放
出しなかった（およそ０．０１μｇ／ｍｇ／ｈｒ、ｒ^２＝０．７５）。バッチ４
は、１時間で穏やかなバーストを示し、その後ほとんど放出しなかった（およそ
０．０４μｇ／ｍｇ／ｈｒ、ｒ^２＝０．３２）。ｒ^２係数は、ある程度変化し得
るが、４つバッチの間で明らかな差異が存在する。４つのバッチ全てに対する理
論上の充填率は、ミクロスフィア１ｍｇあたり３５．４μｇであった。

【０１８１】

【表３２】 （実施例３４：ＰＩＮミクロスフィアを用いた経口ＧＨ送達） ＣＤ雄ラット（２５０〜３００ｇ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。グループ１に、ＵＳＰトウモロコシ油１ｍｌ
に乳化されたストックＧＨ １．２４ｍｇを与え；グループ２に、トウモロコシ
油１ｍｌに含まれるＰＩＮミクロスフィア（ＰＬＧＡに２Ｂ４３０９９−２．４
７％ Ｚｎ−ＧＨを含む）５０ｍｇを与え；グループ３に、トウモロコシ油１ｍ
ｌに含まれるＰＩＮミクロスフィア（ＰＬＧＡに２Ｂ５１７９９−２．４７％ス
トックＧＨ、１６％ＦｅＯを含む）５０ｍｇを与えた。ミクロスフィアをボルテ
ックス、その後の簡単な（５秒間）プローブ超音波処理によってトウモロコシ油
に乳化させた。同様にストックＧＨを、ボルテックスおよびプローブ超音波処理
によってトウモロコシ油に乳化した。動物を一晩絶食し、メトキシフルオレンを
用いて簡単に麻酔し、そして１８−Ｇステンレス鋼摂食チューブを用いて強制栄
養法により処方物を与え、そして以下のスケジュールに従い全ての動物から血清
を獲得した：−１時間（摂食前コントロール）、摂食後０．５時間、１時間、２
時間、３時間、４時間、６時間、２４時間、４８時間、および７２時間。テイル
ブリーディング（ｔａｉｌ ｂｌｅｅｄｉｎｇ）を通じて獲得された血清サンプ
ルを、ｈＧＨ特異的ＥＬＩＳＡ（ＤＳＬ Ｉｎｃ，Ｗｅｂｓｔｅｒ ＴＸ）を用
い製造者のプロトコルに従ってｈＧＨについて分析した。

【０１８２】 単一投与用量のｈＧＨの後に検出されるラット血清のｈＧＨレベルは６に示さ
れる。グループ１の動物は、摂食後２時間で検出可能なレベルのｈＧＨ（３．３
７±２．１４ｎｇ／ｍｌのＣ_ｍａｘ）を示した。グループ２の動物はまた、摂食
後１時間で検出可能なレベルのｈＧＨ（２．１４±０．６５ｎｇ／ｍｌのＣ_{ｍａ ｘ} ）を示した。グループ３の動物は、摂食後１時間で最も高いレベルのｈＧＨを
示し（１９．２３±２．６６ｎｇ／ｍｌのＣ_ｍａｘ）、そして摂食後２４時間ま
での期間全体に渡って高い血清ｈＧＨレベルを一貫して有した。

【０１８３】 （実施例３５：ミクロンサイズのＰＬＧＡミクロスフェアからの放出に対する
タンパク質分子量の影響） この研究の目的は、ポリマーミクロスフィアからの放出反応速度論に対する５
つのタンパク質の種々の分子量の影響を調査することであった。タンパク質を、
位相転換技術によってポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）に２％お
よび７．３％の充填にてカプセル化した。ミクロスフィアからのタンパク質の放
出は、次の順番で続いた：リゾチーム（１４．３ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン
（６６ｋＤａ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（１５０ｋＤａ）、およびサイロ
グロブリン（６６９ｋＤａ）。炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ）は、予想よりも緩や
かに放出された。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのその切断された外見によるも
のと考えられ得る。最初の拡散フェーズに続き、全てのサンプルは、短縮された
タンパク質の放出により特徴付けられるラグフェーズを示した。４週と８週の間
、最も小さいタンパク質（リゾチーム、および炭酸脱水酵素）を充填されたミク
ロスフィアのみが、さらなる増加したタンパク質の放出フェーズを示したが、大
きなタンパク質はそうではなかった。８週まで、ＰＬＧＡの分解は、より小さい
タンパク質のさらなる放出を可能にするのに十分な程度進行したが、大きなタン
パク質に対して同じ影響を生じるためにはさらなる分解が必要であり得たことが
結論付けられる。さらに、大きなタンパク質をカプセル化したミクロスフィアは
、ゼロオーダーに近い放出割合を維持した。タンパク質分子量とミクロスフィア
薬物粒子サイズまたはミクロスフィア孔サイズとの間に関連はなかった。

【０１８４】 （材料および方法） この研究において使用されるタンパク質の全ては、Ｓｉｇｍａから得た。Ｍｉ
ｃｒｏ ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キットは、Ｐｉｅｒｃｅから購入した。
プレキャストポリアクリルアミド電気泳動ゲルおよび分子量マーカーは、Ｎｏｖ
ｅｘから得た。

【０１８５】 （ミクロスフェアの製造） ミクロスフェアを、ＰＬＧＡ ５０：５０（Ｍｗ １２，０６８）の２％ポリ
マー溶液（ｗ／ｖ）から、相転移技術によって製造した（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８６，４１０−４１４（１９９７））。簡潔には、２つの
溶液、水中のタンパク質およびジクロロメタン中のポリマーを、１：１０の容量
比で一緒に添加した。この２つの相系を、次いで、３０秒間、２０％の振幅でプ
ローブ超音波処理した。超音波処理の後、液体窒素中で即時に凍結し、続いて４
８時間凍結乾燥することによって、得られた油エマルジョン中の水を安定化させ
た。次いで、この乾燥した生成物を、２％のポリマー対溶媒の濃度で、ジクロロ
メタン中に再懸濁した。次いで、可溶化されたポリマーおよび不溶性のタンパク
質粒子のこの懸濁液を、１：５０の溶媒：非溶媒で、石油エーテルの非溶媒浴に
迅速に導入した。次いで、得られたミクロスフェアを、高圧濾過システムで収集
した。ミクロスフェアに、２％または７．３％（ｗ／ｗ）のいずれかの５つのタ
ンパク質：リゾチーム（１３．４ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ）、ウシ
血清アルブミン（６６ｋＤａ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（１５０ｋＤａ）
、またはサイログロブリン（６６９ｋＤａ）のうちの１つを充填した。充填して
いないミクロスフェアもまた製造し、そしてポリマーのＭｗおよび質量損失のた
めのコントロールとして使用した。

【０１８６】 （タンパク質放出分析） ミクロスフェアを、３０ｍｇのアリコートに分割し、ガラスシンチレーション
バイアルに入れた。３ｍＬのｐＨ７．０のＨＰＬＣグレードの水（細菌増殖を阻
止するために０．０３％アジ化ナトリウムを含む）を、各バイアルに添加した。
これらのバイアルに栓をし、そして各サンプルの最大表面積が水への放出に使用
可能であるように、それらの横に配置した。サンプルを、３７℃で合計８週間イ
ンキュベートし、そして様々な時点：０．５、１、２、４、８、２４および７２
時間、ならびに１、２、４および８週間でアッセイした。各時点において、これ
らのサンプルを、２０００ｇで５分間遠心分離し、そして上清を取り出し、そし
てさらなる分析のために保存した。真水を各時点で各バイアルにいれ、さらなる
タンパク質の放出を可能にした。タンパク質放出を、ミクロＢＣＡ試薬キットを
用いてアッセイし、そしてサンプルを５６２ｎｍで、Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ−６
５分光計で読みとった。値を、累積的な放出を得るように足し、そしてロードタ
ンパク質の放出％として報告した。上清を４〜４０％の勾配のトリスーグリシン
ゲルに９０分間、１２５Ｖ、３５ｍＡ、および５．０Ｗで溶離して、放出された
タンパク質の発生率を決定した。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅブルー（０．０４％
Ｇ−２５０、３．５％過塩素酸）溶液で染色した。

【０１８７】 （ポリマー分解分析） １０、３０、５０、６０、７０または９０ｍｇのいずれかのさらなるミクロス
フェアアリコートを、マイクロ遠心分離管または１５ｍＬのコニカルチューブに
入れ、そして様々な時間：１、２、３、４、５、６日、ならびに１、２、３、４
、５、６、７および８週間の間、１０ｍｇ／ｍＬの濃度のＨＰＬＣグレードの水
中で、３７℃で分解させた。各時点において、これらの管を遠心分離し、そして
上清を取り出し、そして処分した。残りのペレットを凍結し、そして凍結乾燥し
、そして最終のペレットの乾燥重量を、最初のサンプルの重量と比較した。この
研究について、各時点は、累積ではなく終点であった。質量損失研究の乾燥させ
たＰＬＧＡペレットもまた使用して、分解しているミクロスフェアの分子量を決
定した。各サンプルについて、クロロホルム中５％の溶液を作製し、そしてＰｅ
ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＬＣポンプモデル２５０（イソクラチックＬＣポンプモ
デル２５０、ＬＣカラムオーブンモデル１０１、およびＬＣ−３０ ＲＩ検出器
を備える）および９００シリーズインターフェースコンピューターで分析した。
サンプルを、直列に連結されたＰＬゲルの５ミクロンの混合カラムおよび５ミク
ロン／５０Åカラムを通して、１．０ｍＬ／分の流速、４０℃の温度で溶離した
。

【０１８８】 （ミクロスフェアのサイジングおよび画像化） ＳＥＭについて、サンプルを取付け、そして金および白金の混合物で２．５分
間コーティングし、そしてＨｉｔａｃｈｉ Ｓ−２７００走査電子顕微鏡を用い
て、形態およびサイズについて試験した。次いで、３０のミクロスフェアをラン
ダムに選択し、そしてＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを使用して
直径を測定し、そして結果をミクロスフェアの型に従って平均した。ＴＥＭにつ
いて、サンプルを１００％エタノール中で脱水し、ＯｓＯ_４でオスミウム染色し
、ゼラチンカプセル中のＬＲ Ｗｈｉｔｅ包埋培地中に包埋し、そして３０℃の
オーブンで３日間硬化した。次いで、切片を、ダイアモンドナイフを用いて、Ｒ
ｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｅミクロトームにおいて９５ｎ
ｍ厚に切断した。Ｐｈｉｌｉｐｓ ＥＭ ４１０透過電子顕微鏡を使用して、切
片を試験した。単一の切片からの１４〜２８のミクロスフェアの測定から直径の
平均をとり、そしてＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して分析した。細孔
サイズ分析について、１〜３の多孔性マクロスフェアのサンプルを、各タイプに
ついて選択したが、これらの多孔性ミクロスフェアは、小数のミクロスフェアの
集団を構成したにすぎなかった。４０と８０との間の細孔を、ミクロスフェア毎
に測定した。このミクロスフェア内のタンパク質粒子サイズを決定するために、
ミクロスフェアの２ｍｇのアリコートを、カバーガラス上で、ジクロロメタンに
溶解した。分散した固体のタンパク質粒子を含む得られたポリマーフィルムを、
ＳＥＭで観察し、そして粒子サイズ分析をＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用
いて行った。サイズは、ミクロスフェアのタイプごとに４０〜５０の粒子の中で
平均化した。粒子サイズ分布について、ロードされていないコントロールのミク
ロスフェアの３ｍｇのアリコートを、Ｓｙｍｐａｔｅｃ粒子サイズ分析器を用い
て、乾燥モードで測定した。

【０１８９】 （結果） （タンパク質放出分析） 分子量マーカーとして一般的に使用される５個のタンパク質、リゾチーム、炭
酸脱水酵素、ウシ血清アルブミン、アルコールデヒドロゲナーゼ、およびサイロ
グロブリンを、拡散、ポリマー分解、およびタンパク質の分子量が、ミクロスフ
ェアからの放出にどのように影響を与えるかを決定するために、ＰＬＧＡにカプ
セル化した。タンパク質を、２％および７．３％（ｗ／ｗ）のレベルでロードし
、そしてシンク条件（１０ｍｇミクロスフェア／ｍＬ）で放出させた。これらの
結果を図７および８に示す。

【０１９０】 ３相をこれらの処方物からの放出の間に観察した。バースト効果（この場合、
これは、第１相の一部である）は、２％のロードミクロスフェアについて、リゾ
チームについて最も大きく、ウシ血清アルブミン、アルコールデヒドロゲナーゼ
、カルボニックデヒドロゲナーゼ、サイログロブリンが続いた（図７）。類似の
パターンは、７．３％のロードミクロスフェアについて観察され、リゾチームか
らのバーストが最も大きく、ウシ血清アルブミン、炭酸脱水酵素、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ、およびサイログロブリンが続いた（図８）。

【０１９１】 第１相の持続時間（迅速な非線形放出によって特徴付けられる）は、タンパク
質のサイズに依存したが、ロードの量には非依存性であった。この相は、リゾチ
ームについて３０分間、ウシ血清アルブミンについては４時間、そしてアルコー
ルデヒドロゲナーゼ、サイログロブリンおよび炭酸脱水酵素については１週間持
続した。この相の間のタンパク質放出の量は、相の持続時間にかかわらず類似し
ており、２％および７．３％ロード系からの放出％はそれぞれ以下のとおりであ
った：リゾチームについて９．１９％および５６．７８％であり、ウシ血清アル
ブミンについて２０．４２％および４１．１４％であり、アルコールデヒドロゲ
ナーゼについて２３．４５％および５８．５５％であり、サイログロブリンにつ
いて１１．５２％および５０．４９％であり、炭酸脱水酵素について１２．９２
％および３８．１５％であった。第２相は、リゾチームについて約４週間、２％
炭酸脱水酵素について３週間、７．３％炭酸脱水酵素について７週間、ウシ血清
アルブミンについて約８週間、およびアルコールデヒドロゲナーゼおよびサイロ
グロブリンの両方について７週間持続した。このラグ相（ｌａｇ ｐｈａｓｅ）
は、分子量にかかわらず、全てのタンパク質に見出された。第３相（第２相に続
く迅速なさらなるタンパク質の噴出）は、４週間と８週間との間に起こった。こ
の第３相の存在は、タンパク質の分子量に依存し、分子量が２９ｋＤａ以下の、
２％および７．３％リゾチームおよび２％炭酸脱水酵素におけるミクロスフェア
でカプセル化されたタンパク質についてのみ起こった。

【０１９２】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる放出されたタンパク質の分析は、３０分間ＰＬＧＡミ
クロスフェアから放出されたリゾチームおよびウシ血清アルブミンが、ネイティ
ブのタンパク質と同様に移動したことを示した。リゾチームはまた、８週間放出
された後に同様に移動した。放出された炭酸脱水酵素は、３０分でいくらか変性
したようであり、８週で完全に変性したが、放出されたアルコールデヒドロゲナ
ーゼは、３０分で完全に変性したようである。サイログロブリンは、この系に溶
解させるには大きすぎた。ミクロスフェアから依然として放出されないタンパク
質の性質（ｎａｔｉｖｉｔｙ）は、決定されなかった。

【０１９３】 （ポリマー分解分析） ＰＬＧＡ Ｍｗ損失は、全てのサンプルについて類似した（図９）。Ｍｗは、
１日で元の分子量（Ｍｗ＝１２，０６８）の７０〜８０％に、１週間で４０〜５
０％に、４週間で５〜１０％に、そして６週間で５％に減少した。予期されたよ
うに、質量の損失は、分子量の損失に一致しなかった（図１０）。サンプル質量
は、一日で元の質量の９５〜９９％に、１週間で９０〜９８％に、４週間で１５
〜３５％に、６週間で５％に、そして８週間で２％に減少した。コントロールの
ミクロスフェアの補充的な分解の研究は、ロードされていないＰＬＧＡマイクロ
スフェアがタンパク質をロードしたミクロスフェアと非常に類似して分解するこ
とを明かにし、これは、分子量に関わらず、カプセル化したタンパク質が、この
系において分解または侵食に影響しないことを示す。この研究において取られた
さらなるデータ点は、全てのポリマーミクロスフェアがどのように実際に経時的
に分解し得るかのより良い理解を与える。コントロールミクロスフェアは、最初
の週の間、元のＭｗの３３．４％にほとんど直線的に減少する。これらは、第２
週まで１３．２％に減少し続け、そして６週で元の分子量の７．２％を依然とし
て保持する。質量の損失は、最初の週の終わりで９４％に減少し、第４週で１４
．７％に質量の直線的な低下を示す。表３３は、別の期間の分解に対するロード
されていないコントロールミクロスフェアについてのＭｗおよび質量の損失を示
す。

【０１９４】 （ミクロスフェアサイジングおよびイメージング） ＳＥＭは、すべてのＰＬＧＡミクロスフェア（タンパク質をロードしたかまた
はコートロール）が、球形の形状であり、凝集しないようであったことを示した
。ロードされたタンパク質のタイプは、ミクロスフェアの形態に影響しないよう
であった。Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）で分析する場合、ＳＥ
Ｍミクロスフェアは、ウシ血清アルブミングループ（０．３７４ミクロン±０．
０８ミクロン（これは、炭酸脱水酵素（０．２１１ミクロン±０．０４６ミクロ
ン）、サイログロブリン（０．２０７ミクロン±０．４４ミクロン）、およびコ
ントロールグループ（０．１９６ミクロン±０．４９ミクロン）より有意に高い
）を除いて、ミクロスフェアグループの任意についての平均粒子サイズ直径の間
で統計的に有意な差異は示さなかった（表３４）。これらの差異にもかかわらず
、ＳＥＭミクロスフェアサイズは、ロードされるタンパク質の分子量に依存しな
いようである。粒子サイズ分析はまた、Ｓｙｍｐａｔｅｃ ＨＥＬＯＳ ｍｏｄ
ｅｌ Ｈ０８４９乾燥粉末分析システムを用いて３ｍｇのコントロールミクロス
フェアで行われた。ミクロスフェアは、この方法によって２．２３ミクロンの容
積サイズ分布中央直径を有することが分かった。この矛盾は、おそらく、スフェ
アの有意な凝集に起因する。ミクロスフェアの形態は、ＳＥＭで観測されるよう
に、４週間で非常に分解したことを示した。

【０１９５】 ＴＥＭ顕微鏡写真は、ＳＥＭと一致し、ミクロスフェアグループのそれぞれに
おいて試料の球形の性質を確認した。ＴＥＭはまた、ミクロスフェアの内部構造
についてさらなる情報を提供する。ロードされていないコントロールスフェアは
、外観において顆粒状であるが、真の孔を有さなかった。しかし、４つのミクロ
スフェアグループ（炭酸脱水酵素、ウシ血清アルブミン、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ、およびサイログロブリンをロードされたグループ）は、多様な集団のミ
クロスフェア構造を有した。各グループにおけるミクロスフェアの大部分は高密
度であるが、各サンプルは、種々のタイプの多孔性構造を含み、これは、ミクロ
スフェア全体にわたって開いた分枝したネットワークを有するようなもの、なら
びに外側層に対して開いており、ミクロスフェアの内側層の近くでより高密度の
ようなものを含む。さらに、ＴＥＭはまた、粒子サイズ直径の見積りを得るため
に使用される（表３３）。これらの結果はＳＥＭの結果と正確には一致しないが
、これらは、ミクロスフェアがサブミクロンから１ミクロンの範囲であるという
考えをさらに強化した。ＴＥＭの結果、およびＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ
（登録商標）ソフトウェアによる分析は、試験されたミクロスフェアグループに
ついて、０．８１９ミクロン±０．１５６ミクロン（アルコールデヒドロゲナー
ゼ）と１．０７７ミクロン±０．１１６ミクロン（炭酸脱水酵素）との間の直径
値を生じた。ＴＥＭはまた、平均孔サイズ直径および孔サイズ範囲を決定する際
に有用なツールであった。可視の孔は、ＴＥＭの処理の間にミクロスフェアから
放出したタンパク質に帰し、従って、内部タンパク質粒子サイズと同義であると
みなされる。全体として、孔は、３．２２ｎｍ〜１５１．６１ｎｍの範囲である
（表３４）。孔サイズの平均は、隣の１つのミクロスフェアタイプと有意には異
ならず、そしてこれらは、タンパク質の分子量に依存する傾向を示さないようで
あった。孔は、リゾチームロードスフェアにおいて視覚化され得なかった。ＳＥ
Ｍによって得られたタンパク質粒子のイメージは、同様に、分析され、ＴＥＭに
よって得られたミクロスフェアのサイズの平均と類似したサイズ平均を有するこ
とが見出された。アルコールデヒドロゲナーゼをロードされたミクロスフェアは
、６３．５ｎｍ±１２．８２ｎｍを有するタンパク質粒子を有することが見出さ
れ、そしてリゾチームをロードされたミクロスフェアは、ＳＥＭによって５７．
４８ｎｍ±１０．３４ｎｍの非常に類似した平均サイズを有した。タンパク質粒
子サイズとミクロスフェア孔サイズとの間の類似性は、ＴＥＭによって見られる
孔がタンパク質カプセル化に起因するという理論を支持する。

【０１９６】 拡散が第１相におけるタンパク質放出に対する主な寄与であると結論付けられ
る。なぜなら、質量は、この相が完了する時間で、元の値の約９７〜１００％に
減少するのみであったからである。拡散、分解、および膨潤の組み合わせは、遅
延期間（ｌａｇ ｐｈａｓｅ）を生じる。第三相は、主に分解によって制御され
る。なぜなら、水の浸透および引き続く膨潤に起因して形成されたガムによって
、拡散が困難であるからである。従って、質量損失は、タンパク質放出に対して
、分子量減少よりも大きく寄与すると考えられる。

【０１９７】 この研究において試験されたタンパク質は、幅広い領域の分子量にわたり、最
も小さい分子量は、１４．３ｋＤａであり、最も大きい分子量は、６６９ｋＤａ
である。これらのタンパク質のそれぞれは、ＰＬＧＡミクロスフェアによってカ
プセル化されそしてそのＰＬＧＡミクロスフェアから放出されるとき、ＰＬＧＡ
の固有の性質、タンパク質の分子量、ならびにポリマーミクロスフェアの拡散相
、膨潤相、および分解相におけるタンパク質放出の結果的な依存性に起因し得る
放出プロフィールを示す。この研究におけるミクロスフェアからの放出は、ミク
ロスフェア内のタンパク質粒子サイズに依存しなかった。ミクロスフェアからの
タンパク質放出は、１５０ｋＤａ以上の分子量を有するタンパク質についての拡
散および分解効果の近似によって非常に制御された速度に調節された。この調節
された放出は、５６日にわたる実験の全体について続けられた。

【０１９８】

【表３３】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１ａおよび１ｂは、実施例１６〜１８に記載されるように調製されたポリマ
ーミクロスフェア由来の一定期間（時間）のＦｃＯＰＧの累積放出（マイクログ
ラムＦｃＯＰＧ／ｍｇ、図１ａ；％総放出、図１ｂ）のグラフである。

【図２】 図２ａおよび２ｂは、実施例１９〜２１に記載されるように調製されたポリマ
ーミクロスフェア由来の一定期間（時間）のＦｃＯＰＧの累積放出（マイクログ
ラムＦｃＯＰＧ／ｍｇ、図２ａ；％総放出、図２ｂ）のグラフである。

【図３】 図３ａおよび３ｂは、実施例２２〜２４に記載されるように調製されたポリマ
ーミクロスフェア由来の一定期間（時間）のＦｃＯＰＧの累積放出（マイクログ
ラムＦｃＯＰＧ／ｍｇ、図３ａ；％総放出、図３ｂ）のグラフである。

【図４】 図４ａおよび４ｂは、実施例２５、２８および３０に記載されるように調製さ
れたポリマーミクロスフェア由来の一定期間（時間）のＦｃＯＰＧの累積放出（
マイクログラムＦｃＯＰＧ／ｍｇ、図４ａ；％総放出、図４ｂ）のグラフである
。

【図５】 図５は、実施例３４に記載されるように調製されたポリマーミクロスフェア由
来の一定期間（時間）のヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の累積放出のグラフである
。

【図６】 図６は、実施例３２に記載されるように調製されたミクロスフェア中のｈＧＨ
の経口投与後の血清ｈＧＨレベル 対 時間（時間）のグラフである。

【図７】 図７は、リゾチーム（黒四角）、炭酸脱水酵素（黒丸）、アルブミン（黒三角
）、アルコール脱水素酵素（白四角）、およびサイログロブリン（白丸）につい
ての一定期間（時間）のパーセント放出のグラフである。

【図８】 図８は、リゾチーム（黒四角）、炭酸脱水酵素（黒丸）、アルブミン（黒三角
）、アルコール脱水素酵素（白四角）、およびサイログロブリン（白丸）につい
ての一定期間（時間）のパーセント放出のグラフである。

【図９】 図９は、リゾチーム（黒四角）、炭酸脱水酵素（黒丸）、アルブミン（黒三角
）、アルコール脱水素酵素（白四角）、およびサイログロブリン（白丸）につい
ての一定期間（時間）の本来の分子量のパーセントのグラフである。

【図１０】 図１０は、リゾチーム（黒四角）、炭酸脱水酵素（黒丸）、アルブミン（黒三
角）、アルコール脱水素酵素（白四角）、サイログロブリン（白丸）およびコン
トロールミクロスフェア（−ｘ−）についての一定期間（時間）の本来の質量の
パーセントのグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/34 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ａ６１Ｐ 19/08 Ａ６１Ｋ 37/02 43/00 １１１ 37/36 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ジョング， ヨング エス． アメリカ合衆国 ロード アイランド 02906， プロビデンス， ウェイランド アベニュー 198， アパートメント ４ (72)発明者 ジャコブ， ジュールズ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02780， トウントン， レイク リッジ ドライブ 95 Ｆターム(参考） 4C076 AA30 AA64 CC29 CC30 DD29 EE03H EE15H EE22H EE24H EE48H FF22 FF32 GG06 GG24 GG27 GG30 GG31 GG32 4C084 AA02 AA03 BA44 DA01 DB22 MA38 MA44 NA03 ZB022 ZC022 ZC032 ZC352

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 タンパク質、ペプチド、または薬物である薬剤の乾燥微紛化
   粒子を作製するための方法であって、以下： （ａ）高分子材料を有効量の溶媒中に溶解して溶液を形成する工程； （ｂ）該薬剤を該溶液中に溶解または分散させて混合物を形成する工程： （ｃ）該混合物を凍結する工程；および （ｄ）該混合物を真空乾燥して、１０ｎｍと１０ミクロンとの間の直径の該薬
   剤が固体高分子材料中に分散した固体微紛化粒子を形成する工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、さらに、前記薬剤の固体粒
   子を前記固体高分子材料から分離する工程を包含する、方法。
3. 【請求項３】 請求項２に記載の方法であって、さらに、前記薬剤の固体粒
   子をカプセル化材料中にカプセル化する工程を包含する、方法。
4. 【請求項４】 請求項１に記載の方法であって、ここで、９０％より多くの
   固体粒子が、０．２μｍ未満のサイズである、方法。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の方法であって、ここで、９０％より多くの
   固体粒子が、１μｍ未満のサイズである、方法。
6. 【請求項６】 請求項１に記載の方法であって、ここで、９０％より多くの
   固体粒子が、１０ｎｍと１μｍとの間である、方法。
7. 【請求項７】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記薬剤が生物学
   的に活性な薬剤である、方法。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の方法であって、ここで、前記薬剤が、タン
   パク質である、方法。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法であって、ここで、前記タンパク質が
   、成長ホルモンである、方法。
10. 【請求項１０】 請求項８に記載の方法であって、ここで、前記タンパク質
    が、オステオプロテグレニンである、方法。
11. 【請求項１１】 請求項７に記載の方法であって、ここで、前記薬剤が、合
    成薬物からなる群より選択される、方法。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記高分子材料
    が、ポリマーである、方法。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記ポリマー
    が、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル
    、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポ
    リ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（ラ
    クチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ならびにこれらのブレンドおよびコポリマー
    からなる群より選択される、方法。
14. 【請求項１４】 請求項１に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）の混
    合物が、エマルジョンである、方法。
15. 【請求項１５】 請求項１に記載の方法であって、ここで、工程（ｄ）が、
    凍結乾燥を利用する、方法。
16. 【請求項１６】 請求項３に記載の方法であって、ここで、前記カプセル化
    が、界面重縮合、スプレー乾燥、ホットメルトマイクロカプセル化、および相分
    離技術からなる群より選択される、方法を使用して行われる、方法。
17. 【請求項１７】 請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記相分離技
    術が、溶媒抽出、溶媒エバポレーション、および転相からなる群より選択される
    、方法。
18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の方法であって、ここで、前記混合物が
    、前記溶媒を含む連続相を有し、そして前記転相技術が、以下： 該混合物を非溶媒に導入する工程であって、ここで、溶媒：非溶媒の容積比が
    、少なくとも１：４０であり、マイクロカプセル化生成物の自発的な形成を引き
    起こし、ここで、該溶媒および該非溶媒が、混和性である、工程、 を包含する、方法。
19. 【請求項１９】 請求項１８に記載の方法であって、ここで、δ溶媒−δ非
    溶媒が０より大きく６より小さい、方法。
20. 【請求項２０】 請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記溶媒：非
    溶媒の容積比が１：５０と１：２００との間である、方法。
21. 【請求項２１】 請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記高分子材
    料が、容積当たり１０重量％未満の濃度で前記溶媒に溶解し、そして前記混合物
    が、３．５ｃＰ未満の粘度を有する、方法。
22. 【請求項２２】 請求項２０に記載の方法であって、ここで、前記溶媒中の
    高分子材料の濃度が、容積当たり０．５重量％と５重量％との間である、方法。
23. 【請求項２３】 請求項８に記載の方法であって、ここで、前記混合物の凍
    結が、前記タンパク質の変性が実質的に避けられるように、前記薬剤の前記溶液
    への添加に続いて実質的に素早く行われる、方法。
24. 【請求項２４】 請求項２に記載の方法であって、ここで、前記薬剤の粒子
    が、以下： 前記高分子材料を該高分子材料について有効容量の溶媒に溶解する工程であっ
    て、ここで、該溶媒が、該薬剤に対して非溶媒である、工程、 を包含する方法を使用して、該固体高分子材料から分離される、方法。
25. 【請求項２５】 請求項３に記載の方法であって、ここで、前記カプセル化
    する材料が、生体適合性ポリマーである、方法。
26. 【請求項２６】 請求項２５に記載の方法であって、ここで、前記生体適合
    性ポリマーが、ポリエステル、ポリ無水物、ポリスチレン、ポリ（オルト）エス
    テル、これらのコポリマー、およびこれらのブレンドから選択される、方法。
27. 【請求項２７】 生物活性タンパク質、ペプチド、または薬物である薬剤の
    粒子を含む、ポリマー組成物または高分子組成物であって、ここで、９０％より
    多い該生物活性薬剤粒子が、２μｍ未満のサイズである、ポリマー組成物または
    高分子組成物。
28. 【請求項２８】 請求項２７に記載の組成物であって、ここで、９０％より
    多くの前記粒子が、１μｍ未満のサイズである、組成物。
29. 【請求項２９】 請求項２７に記載の組成物であって、ここで、粒子が、固
    体高分子材料中に分散される、組成物。
30. 【請求項３０】 請求項２９に記載の組成物であって、ここで、前記材料が
    、ポリマーである、組成物。
31. 【請求項３１】 請求項２７に記載の組成物であって、以下： （ａ）高分子材料を有効量の溶媒に溶解させて溶液を形成する工程； （ｂ）前記生物活性薬剤を該溶液中に溶解または分散させて混合物を形成する
    工程： （ｃ）該混合物を凍結する工程；および （ｄ）該混合物を真空乾燥して、固体高分子材料中に分散した該薬剤の乾燥固
    体粒子を形成する工程、 を包含する方法によって作製される、組成物。
32. 【請求項３２】 薬学的に受容可能なキャリア中の、請求項２７に記載の組
    成物。
33. 【請求項３３】 生物活性なタンパク質またはペプチドの薬剤のそれが必要
    な患者への送達を促進する方法であって、該生物活性薬剤を粒子として投与する
    工程を包含し、ここで、９０％より多くの粒子が、２μｍ未満のサイズである、
    方法。