JP4316682B2 - 制御放出マイクロカプセル化ｎｇｆ製剤 - Google Patents

Description

背景
発明の分野
本発明は、神経成長因子（「ＮＧＦ」）の製剤、及びインビトロ、インビボまたはエクスビボでの神経細胞成長、分化、生存、修復、成熟、または機能を導くためのその使用に関する。とりわけ、本発明は、ＮＧＦ構成成分、特にヒト組換えＮＧＦ（「ｒｈＮＧＦ」）のための、好ましくは増大した安定性を有する、制御放出特性を有するマイクロカプセル化組成物に関する。上記組成物を作製及び使用する方法が提供される。
関連開示の説明
神経成長因子（ＮＧＦ）は、発育の間、及び成熟した動物における交感及び感覚ニューロンの成長及び生存に必要とされる神経栄養因子である（Thoenen等,Physiol.Rev.60:1284-1335（1980））。組換えヒトＮＧＦについての臨床上の効用は、末梢感覚神経障害及びアルツハイマー病を含む。ＮＧＦの全身投与は、マウスに対するシスプラチン及びタキソールの投与によって誘導される感覚神経障害を減少することが示されている（Apfel等,Ann.Neurol.28:87-90（1991）;Apfel等,Ann.Neurol.31:76-80（1992））。最近の臨床試験において、ＮＧＦは、糖尿病性神経障害における感覚機能の改良のために、ヒトに対して投与されている（Petty等,Ann.Neurol.36:244-246（1994））。液体非経口製剤におけるＮＧＦの投与は、毒性がなく有効ではあるが、注射部位の痛覚過敏、及び特に最近の臨床試験においては筋痛覚過敏（myalgesia）と関連するものとして報告されている。
ｒｈＮＧＦの脳室内（ＩＣＶ）投与は、線毛脳弓の病変（fimbria-fortex lesions）を有するラット及びサルにおける、基底の前脳コリン作用性ニューロンの変性を防止することができる（Koliatsos等,Exp.Neurol.112:161-73（1991）;Koliatsos等,Ann.Neurol.30;831-40（1991）;Tuszynski等,Ann.Neurol.30:626-36（1991））。研究により、ｒｈＮＧＦのＩＣＶ投与は、コリンアセチルトランスフェラーゼ活性を増大し、高齢のラットにおける空間に関する記憶を改良可能であることが示されている（Williams,Neurobiol.Aging 12:39-46（1991）;Fisher等,J.Neurosci.11（7）:1889-1906（1991））。血液脳関門を横切るｒｈＮＧＦのＩＣＶ輸送は、シリンジ、Ommaya（登録商標）レザバーまたはAlzetポンプによって達成されている。アルツハイマー病の治療のため、脳室に継続的且つ直接的にｒｈＮＧＦを輸送する目的で、カテーテルを用いた移植可能な注入ポンプの使用が考慮されている。しかしながら、ｒｈＮＧＦは、ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定したところ、３７℃で（生理的状態）いくつかの移植可能なポンプにおいて脱アミド化およびイソアスパラギン酸塩形成を介して分解することが観察されている。特に液体における、ＮＧＦの安定性を得ることは、ＮＧＦのダイマー構造の結果として、通常の化学的及び物理的分解経路の下では困難である。タンパク質の安定性は、組換えタンパク質がＣ末端クリップ化ＮＧＦ変異体の混合物である場合、さらに困難であろう。ＮＧＦは通常ダイマーとして存在し（ネズミＮＧＦの結晶構造は、平坦な表面を形成するｂ−鎖の３つの逆平行のペアを示し、それを介してモノマーがダイマー形成する（McDonald等,Nature 354:411-414（1991））；ダイマー解離定数は、１０^-13Ｍである（Bothwell等,J.Biol.Chem.252:8532-8536（1977）;Timm等,Biochem.33:4667-4676（1994））一方、ＮＧＦのより高いオーダーの分解が、観察されている。
それ故、ＮＧＦの安定性及び活性を維持する一方で、哺乳動物、特にヒト患者に対する治療上の投与、特に大脳内の投与のために有効である、各種の疾患を治療するための手段を提供する製剤が必要である。本発明の利点は、これらの必要性、同様に他のものに適合する。
概要
本発明は、低い初期放出速度及び放出期間におけるＮＧＦの増大した安定性を有する、ＮＧＦの制御持続放出のための製剤条件及び方法の発見に基づく。低い初期放出速度を提供し、ＮＧＦの増大した安定性を維持するＮＧＦの制御持続放出製剤は、インビトロ、インビボまたはエクスビボでの神経細胞成長、生存、分化、成熟、修復、または機能を効率的に導くために提供される。放出期間の間でほとんど全く活性の損失または凝集を示さない、ＮＧＦ、またはその遺伝学的に操作された形態、特にヒトＮＧＦ、好ましくは１１８形態を含むポリマー状ミクロスフェアを含む制御放出製剤が提供される。好ましい実施態様として、該製剤は、亜鉛複合体化ＮＧＦを含む。各種の実施態様において、制御持続放出特性を有する製剤は、攪拌、凍結、解凍、光、または貯蔵に対して増大した安定性を有する。
ＮＧＦが有用な生物学的活性を維持し、投与に続く少なくとも１日、より典型的には１から２週間の延長された期間に渡って放出される、ＮＧＦポリマー状制御放出系が記載される。好ましい実施態様として、ＮＧＦポリマー状ミクロスフェアは、ポリマー−ＮＧＦ混合物を、生物学的活性及び物質を非常に高く維持するポリマー状ミクロスフェア内に凍結するために、非常に低い温度を使用して作製される。ＮＧＦは最初、好ましくは金属と溶液内で複合体化され、任意にトレハロースまたはマンニトールのような安定化（及びＮＧＦ積み込み量増大化）ポリオールと混合され、そして乾燥、好ましくは噴霧凍結乾燥される。乾燥粉末は、ポリマー、好ましくはポリ（ラクチド）、またはコポリマーと混合され、酢酸エチルまたは塩化メチレンのような溶媒中に溶解される。ポリマー／ＮＧＦ混合物は、エタノールのような凍結不凍溶媒を含む容器内に微細化され、ポリマー−活性剤溶液または懸濁液の凝固点より低い温度で、窒素のような液化ガスで重層される。該微細化粒子は、冷たい液化ガスと接触することでミクロスフェア内で凍結し、次いで凍結不凍溶媒層に沈降する。次いで凍結不凍溶媒を解凍する。不凍溶媒が解凍する一方で、該ミクロスフェアはまだ凍結しており、液体不凍溶媒に沈降する。ミクロスフェア中の溶媒も解凍され、不凍溶媒中へゆっくりと分離され、ＮＧＦを含む硬化したミクロスフェアが導かれる。
インビトロ、エクスビボまたはインビボでの、該ミクロスフェアからの生物学的に活性なＮＧＦの持続放出は、１週間から３ヶ月間以上の期間に延長されるという実施態様が提供される。放出プロフィールは、ポリマー分解調節剤、孔（pore）形成剤、ポリマー−コポリマー比、及びＮＧＦの安定剤、特に亜鉛を含めることによって達成可能である。
製剤化工程の間、活性または物質の損失がほとんどない、ＮＧＦまたはその遺伝学的に操作された形態、好ましくは金属複合体化形態、好ましくは亜鉛との金属複合体化形態を含む、制御放出ミクロスフェアを作成するための方法もまた提供される。制御された方式で放出可能な活性ＮＧＦを含む、広範囲のポリマーから形成されるミクロスフェアを作製する方法、及び上記方法によって生産されたミクロスフェアが提供される。
ニューロンまたは哺乳動物に対する改良された適用のための増大した適合性を有するＮＧＦ製剤が、ここで提供される。ＮＧＦの治療上の有効量を提供するために、ＮＧＦ治療の必要のある哺乳動物、好ましくはヒトの治療における使用のための安定なＮＧＦ製剤が提供される。マイクロカプセル化製剤もまた、例えば一次ニューロン培養物またはニューロン性細胞系を用いる細胞培養法における使用が見出される。これら及び他の態様は、本明細書及び図面を参考として、当業者に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＮＧＦミクロスフェア生産のための一つの実施態様を表す図式である。
図２は、スプレー凍結乾燥タンパク質製剤の安定性の予備製剤化スクリーニングを表す（乾燥タンパク質Ｉ）。
図３は、スプレー凍結乾燥タンパク質製剤の安定性のさらなる予備製剤化スクリーニングを表す（乾燥タンパク質ＩＩ）。
図４は、異なる量の炭酸亜鉛を含むＰＬＧＡミクロスフェアからの、ｒｈＮＧＦの放出のタイムコースを表す：０（○）、３（●）または６％（■）ｗ／ｗ。ミクロスフェアを、ｐＨ７．０及び３７℃でインキュベーションした。放出緩衝液を完全に除去し、各時点で再補充した。亜鉛含有製剤は、３日後に２から３週間の継続的なｒｈＮＧＦの放出を提供する。
図５は、異なる量の界面活性剤を含むＰＬＧＡミクロスフェアからの、ｒｈＮＧＦの放出のタイムコースを表す：０（○）、０．０１％ ＰＦ６８（●）または０．０１％ ＰＥＧ（■）ｗ／ｗ。ミクロスフェアを、ｐＨ７．０及び３７℃でインキュベーションした。放出緩衝液を完全に除去し、各時点で再補充した。タンパク質製剤中の界面活性剤は、ｒｈＮＧＦ放出の速度に影響しない。
図６は、ＮＧＦが乾燥された後に亜鉛が加えられたＰＬＧＡミクロスフェアの一つの実施態様から放出されたｒｈＮＧＦの安定性を示す。
図７は、４週間後に維持されたパーセントモノマーによって測定された（ＳＥＣによって）、亜鉛を含むＮＧＦ（１１８／１１８ｒｈＮＧＦ）製剤の安定性を示す。
図８は、４週間後の亜鉛を含むＮＧＦ製剤のタンパク質濃度を示す（タンパク質濃度はＵＶ吸光度によって測定された）。
図９は、タンパク質製剤に対して加えられた酢酸亜鉛（亜鉛を使用した予備製剤化）の存在下（●）及び非存在下（■）で調製された、ＰＬＧＡミクロスフェアからのｒｈＮＧＦのインビトロ放出を示す。全てのミクロスフェアは、１２ＫＤａ、非ブロック化５０：５０ＰＬＧＡ、及び１０％（ｗ／ｗ）タンパク質の積み込み量を使用して調製された。放出調節剤は、６％炭酸亜鉛であった；「ＮＧＦ ＰＬＧＡ」に対する放出緩衝液は、酢酸塩、ｐＨ５．５であり、「亜鉛−ＮＧＦ−ＰＬＧＡ」に対するものは、ＰＢＳ、ｐＨ７．２であった。
図１０は、ＰＬＧＡミクロスフェアから放出されたｒｈＮＧＦの安定性に対する、亜鉛−予備製剤の効果を表す。
詳細な説明
本発明は、生物学的ポリマーマイクロカプセル化形態において、亜鉛のような金属と製剤化されたＮＧＦが、ミクロスフェアからの顕著に低い初期放出速度を有する一方、一日より長い時間、典型的には少なくとも１から２週間に渡る制御持続放出を可能にするという発見に基づく。さらに、生物学的ポリマーとのカプセル化の前に、亜鉛のようなＮＧＦを結合する金属を使用した、ＮＧＦの水溶液中の製剤化は、驚くべきことに、これらのカプセル化製剤から放出されるＮＧＦの安定性を増大した。従って、好ましい実施態様として、該ＮＧＦは、乾燥の、前に、若しくはマイクロカプセル化ポリマーまたは放出調節剤との混合の前に、溶液中で金属と共に製剤化される。数個のタンパク質薬剤が、制御放出形態で製剤化されている一方で、所望の速度で所望の期間に渡る制御放出は、成し遂げるのが困難である。例えば、ｒｈＧＨが亜鉛と複合体を形成でき、ミクロスフェア製造方法の間、及び後のインビボでの放出の間、酢酸亜鉛と該タンパク質の複合体化によって安定化できることが報告された（Johnson等,Nature Medicine 2:795-799（1996））。しかしながら、薬剤をカプセル化するために使用される条件は、輸送される薬剤の分解を引き起こしてはならず、該薬剤を不活性化またはそれに結合するために、ポリマー状マトリックスと該薬剤が反応してはならない。臨床のケースにおいては、該輸送は、生産するのに効率的なコストで、貯蔵に安定で、標準的な方法を使用して投与されなければならないことを意味する。これらの必要性は、本発明に適合している。
ここで使用される用語、「ポリオール」は、炭素原子に結合した少なくとも二個のヒドロキシルを含む炭化水素を表す。ポリオールは、他の官能基を含んでも良い。約７０，０００ｋＤより小さい分子量のポリオールが好ましい。本発明の実施について有用なポリオールの例は、マンニトール及びトレハロースのような糖アルコール、ポリエチレングリコールのようなポリエーテルを含む。1996年12月31日に発行された米国特許第5,589,167号を参照、それは参考としてここに取り込まれる。ＮＧＦは、ポリオール、好ましくは糖アルコール、より好ましくはトレハロース、マンニトールまたはショ糖、最も好ましくはトレハロースと該ポリペプチドを混合することによって有機溶媒を使用して処理された場合、変性に対して安定化可能である。
ここで使用される用語、「ポリエーテル」は、少なくとも三個のエーテル結合を含む炭化水素を表す。ポリエーテルは、他の官能基を含んでも良い。本発明の実施のために有用なポリエーテルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
ここで使用される用語、「乾燥ポリペプチド」は、少なくとも５０％の水分が除去されたような凍結乾燥といった乾燥方法を受けたポリペプチドを表す。
ここで使用される用語、「カプセル化」は、治療薬の制御放出に有用な組成物（ミクロスフェア製剤）中にポリペプチドのような治療薬を製剤化するための方法を表す。本発明において有用なカプセル化物質の例は、乳酸及びグリコール酸のポリマーまたはコポリマー、若しくは上記ポリマー及び／またはコポリマーの混合物、一般的に「ポリラクチド」と称されているものを含む。
ここで使用される用語、「混合」は、乾燥試薬の混合、若しくは溶液または懸濁液中の試薬と乾燥試薬の混合、または試薬の水性製剤の混合によるような、興味あるポリペプチドに対して賦形剤を加えることを表す。
ここで使用される用語、「賦形剤」は、所望の適用性または安定化効果を提供するために、製薬組成物に加えられる非治療剤を表す。
ここで使用される用語、「有機溶媒」は、いずれかの炭素ベース液体溶媒を意味することを企図する。例示的な有機溶媒は、塩化メチレン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、及びエタノールを含む。ここで使用される用語、「アルコール」及び「アルコール性溶媒」は、アルコール、好ましくは１から１０の炭素原子を有するアルコール、より好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、n-プロパノール、またはt-ブタノール、同様にグリセリン、プロピレングリコール、エチレングリコール、ヘキシレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリエチレングリコール、最も好ましくはエタノールまたはイソプロパノールに対する一般的に使用される専門用語の意味で使用される。上記アルコールは、水溶液に加えられた場合、溶液の極性を減少することによって該溶液の疎水性度を増大する溶媒である。
ここで使用される用語、有機溶媒を使用したポリペプチドの「処理」は、有機溶媒と乾燥ポリペプチドを混合すること、または有機溶媒を使用して水性製剤中のポリペプチドのエマルションを作製すること、有機溶媒を使用して水性製剤中のポリペプチドの間の界面を作製すること、または有機溶媒を使用して水性製剤からポリペプチドを抽出することを指す。
用語、「ミクロスフェア」は、全体的に分散したＮＧＦを有するポリマーの固体球状形態を意味し、同様に他に断り書きがなければミクロ粒子及びマイクロカプセルを意味するために使用される。ミクロ粒子は、不定型なポリマーまたはポリマー−薬剤粒子を記載する場合に特に示される。マイクロカプセルは、非ポリマーコアまたは外殻とは異なるポリマーのコアを有する球状成型ポリマー製剤である。
用語、ＮＧＦの「持続」または「延長」放出は、継続的または非継続的、線状（linear）または直線状であり得る。これは、一つ以上のタイプのポリマー組成物、薬剤積み込み量、賦形剤または分解促進剤の選択、もしくは他の修正、所望の効果を提供するために単独で、組み合わせてまたは連続的に投与することを使用して達成することができる。
用語、「ＮＧＦ」は、ネズミ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、トリ、好ましくはヒトを含む、いずれかの種から得た神経成長因子で、天然配列のものまたは遺伝学的に操作された変異体形態、及び天然、合成または組換え生産されたいずれかのソースから得たものを指す。好ましくは、ＮＧＦは組換え的に生産される。好ましい態様として、該ＮＧＦはクローン化され、そのＤＮＡは例えば哺乳動物細胞、細菌細胞において発現される。
ヒト天然配列成熟ＮＧＦ、より好ましくは１２０アミノ酸配列、さらにより好ましくは１１８アミノ酸配列形態は、ヒトでの使用について好ましい。ヒトプレ−プロ−ＮＧＦ及びヒト成熟ＮＧＦに対する好ましいアミノ酸配列は、米国特許第5,288,622号によって提供され、それは特別に参考としてここに取り込まれる。付加的な翻訳後修飾を有しない１２０アミノ酸形態は、ホモダイマー形態（即ち１２０／１２０）が好ましい形態である。付加的な翻訳後修飾を有さない、特にホモダイマー（即ち１１８／１１８）のような１１８形態が、さらにより好ましい。哺乳動物ＮＧＦ（マウスＮＧＦ）の一次構造は、Angeletti及びBradshaw,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 68:2417（1971）によって最初に解明された。その前駆体、プレ−プロ−ＮＧＦの一次構造は、マウスＮＧＦ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列から推定されている（Scott等,Nature 302:538（1983）;Ullrich等,Nature 303:821（1983））。同種ヒトＮＧＦ（ｈＮＧＦ）遺伝子もまた同定されている（Ullrich,Symp.on Quan.Biol.,Cold Spring Harbor 48:435（1983）;1994年2月22日に発行された米国特許第5,288,622号で、それは参考としてここに取り込まれる）。マウスＮＧＦに対するその相同性は、アミノ酸及びヌクレオチド配列レベルでそれぞれ約９０％及び８７％である。ＮＧＦは、グリコシル化または非グリコシル化されていても良い。
他の実施態様として、本発明のミクロスフェア製剤は、1996年1月30日に発行された米国特許第5,488,099号、Urfer等,EMBO J.13（24）:5896-909（1994）、及び1995年12月14日に発行された国際特許出願WO 95/33829（参考としてここに取り込まれる）に報告されたような、ＮＧＦキメラ及び向汎性神経栄養因子を含み、ここで該ＮＧＦは、一つ以上のレセプターに対して結合するように修飾されており、天然のＮＧＦにおいて通常顕著な程度では存在しないレセプター結合活性を含む。ＮＧＦアミノ酸骨格を有するが、ｔｒｋＢまたはｔｒｋＣのような、ｔｒｋＡ以外のレセプターを結合するように修飾されたキメラが、特に興味が持たれる。これらのＮＧＦ形態は、ＮＧＦのアミノ酸配列に対してアミノ酸配列相同性（通常８０％より大きい、好ましくは９０％より大きい、より好ましくは９５％より大きい、最も好ましくは９７％より大きい）を有し、他の神経栄養因子特異性を与える置換を有する。好ましい実施態様として、該ドメインは、ＮＧＦ残基に対して置換される：つまり、数個のアミノ酸が、ＮＧＦ配列から欠失され、さらなる特異性を与える同等のまたは同様の数のアミノ酸が置換される。例えば向汎性ＮＧＦは、ＢＤＮＦ特異性（ｔｒｋＢ結合活性）を与える一方で、ｔｒｋＡ結合活性を維持するＤ１６Ａ置換を使用して作製される。アミノ酸置換が、ＮＴ−３に対するｔｒｋＣレセプターの結合に関与するＮＴ−３中の相当する位置から得たアミノ酸を使用してＮＧＦ中でなされたものが好ましい。上記ＮＧＦ突然変異体は、ＮＴ−３様のｔｒｋＣレセプター結合活性を有する一方で、ＮＧＦ構造、薬物動態、及び精製態様を維持する（Urfer等,Biochemistry 36（16）:4775-4781（1997））。例えば、ｔｒｋＣ結合活性を可能にする、予備可変領域１（Ｖ１８Ｅ＋Ｖ２０Ｌ＋Ｇ２３Ｔ）及び可変領域４（Ｙ７９Ｑ＋Ｔ８１Ｋ＋Ｈ８４Ｑ＋Ｆ８６Ｙ＋Ｋ８８Ｒ）中の置換が含まれる。予備可変領域１中の置換は、可変領域４中のわずか１アミノ酸置換と共になすことができる；例えばＶ１８Ｅ＋Ｖ２０Ｌ＋Ｇ２３Ｔ及びＹ７９Ｑ、Ｔ８１Ｋ、Ｈ８４Ｑ、Ｆ８６ＹまたはＫ８８Ｒの一つ以上がなされても良い。これらのＮＧＦ突然変異体は、例えば、ＮＧＦのＮ末端１から９アミノ酸を除去または修飾することによって、ｔｒｋＡ結合活性を欠くように操作することもできる。精製組換えヒトＮＧＦのＮ末端の最初の９残基及びＣ末端から得た少なくとも２個の残基の欠失から生じる、１０９アミノ酸種（１０−１１８）ｈＮＧＦは、（１−１１８）ｈＮＧＦと比較してヒトｔｒｋＡレセプターからマウス［¹²⁵Ｉ］ＮＧＦを置換するのに３００倍非効率的である（Shin等,J.Biol.Chem.269（44）:27679-86（1994））。上記ＮＧＦの遺伝学的に操作された突然変異体−−ｔｒｋＣを結合するがｔｒｋＡを結合しない−−は、ここに記載される本発明の使用のために特に好ましい。
組換えヒトＮＧＦの単離は、各種の多様化した宿主細胞の混在物からの該タンパク質の分離を含む。各工程は、十分な分離を実施することが可能な特別な緩衝液を含む。ＮＧＦの最終のまたは最後から２番目の加工工程は、通常のクロマトグラフィー媒体を使用して共精製するいくつかのＮＧＦ変異体の存在によって複雑化される。回収及び精製法において再ホールディング工程が含まれる場合、該変異体はＮＧＦのミスホールディング形態を含む。変異体はまた、カルバミル化、アミド化、または蛋白分解的な切断形態のような、ＮＧＦとは化学的に異なるものを含む。ＮＧＦの場合には、これらの種は、主にダイマー形態−−ホモダイマー、例えば１２０／１２０または１１７／１１７であり、１１８／１１８が好ましい、またはヘテロダイマー、例えば１２０／１１８，１１７／１１８−−または化学的に修飾された変異体−−イソアスパラギン酸塩、モノ酸化変異体、グリコシル化変異体、Ｎ末端及びＣ末端切り詰め形態、及びそれらのダイマーより成る（Schmelzer等,（J.Neurochem.59:1675-1683（1992））;Canova-Davis等,In Peptides:Chemistry,Structure and Biology,Escom Science Publishers,Leiden,The Netherlands,pp.（1993）（Proceeding of the Thirteenth American Peptide Symposium,Edmonton,Alberta,Canada,1993年6月20-25日））。好ましい製剤は、これらの修飾の存在しない実質的に精製され均質な１１８／１１８ＮＧＦである。
用語、「実質的に精製」は、少なくとも７０％の神経栄養因子、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、９５％または９９％に増大していく、全タンパク質に対する全ＮＧＦの純度を意味する。特に好ましい純度は、少なくとも９５％である。用語、「本質的に精製」は、該組成物が、少なくとも９０％以上の所望の神経栄養因子の純度を有することを意味する。
用語、「ＮＧＦ変異体を実質的に含まない」は、全ＮＧＦ（所望でないＮＧＦ種を含む）に対する所望のＮＧＦ種のパーセントが、少なくとも７０％の所望のＮＧＦ種、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、９３％、９５％または９９％まで増大する組成物を意味する。用語、「本質的に含まない」は、少なくとも９０％以上の所望のＮＧＦを含む組成物を意味する。特に好ましいレベルは、少なくとも９５％の所望の神経栄養因子、例えば正確にホールディング（holding）された完全な１１８／１１８ｒｈＮＧＦ種である。非所望の種または形態は、ミスプロセッシング形態または化学的変異体、例えば発酵または精製方法から生じる荷電変異体、またはここで開示されるような好ましくは全ての外来のものでも良い。例えば、ＮＧＦが、細菌における合成の後インビトロでホールディングされる場合、ＮＧＦ「種」または「変異体」は、ミスホールディングまたは部分的にホールディングされた形態を含むことができる。
用語、「ミスホールディング（misfolding）」変異体は、システイン残基のペア形成によって、若しくは遊離したまたはブロックされた特定のシステイン残基によって、元となるＮＧＦとは異なるＮＧＦの変異体を意味する。ミスホールディング変異体はまた、元となるＮＧＦと同様のシステインペア形成を有するが、ミスホールディングによって生ずる異なる三次元構造を有する。
用語、「化学的」変異体は、例えばカルバミル化、アミド化、または蛋白分解的切断によって、所望の元となるＮＧＦとは化学的に異なる変異体を意味する。
好ましくはここで教示される金属安定化ＮＧＦは、好ましくはマイクロカプセル化によって、好ましくはミクロスフェアのような生分解性ポリマーと共に持続放出のため製剤化される。持続放出調製物の適切な例は、ＮＧＦを含む固体疎水性ポリマーの半透過性物質を含み、該物質は、例えばフィルムまたはマイクロカプセルといった成型された製品の形態で存在する。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル［例えば、Langer等,J.Bioned.Mater.Res.,15:167-277（1981）及びLanger,Chem.Tech.,12:98-105（1982）に記載されているポリ（2-ヒドロキシエチル−メタクリラート）、またはポリ（ビニルアルコール）］、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号、欧州特許出願58,481）、L-グルタミン酸及びガンマエチル-L-グルタミン酸塩のコポリマー（Sidman等,Biopolymers,22:547-556［1983］）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（langer等,上記参照）、Lupron Depot^TMのような分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリド（leuprolide acetate）より成る注射可能ミクロスフェア）、及びポリ-D-（-）-3-ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願EP 133,988）を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日に渡る分子の放出が可能である一方、特定のヒドロゲルは、より短い期間ポリペプチドを放出する。カプセル化ポリペプチドが、長期間体内に存在する場合、それらは、３７℃で湿気にさらされる結果として変性または凝集し、生物学的活性の損失及び免疫原性における変化の可能性を導く。ここで測定されるように、金属とのＮＧＦの予備製剤化は、持続放出の間のＮＧＦの完全性を顕著に維持する。
ＮＧＦまたはＮＧＦ−金属複合体が利点を提供する代わりの持続放出態様は、リポソームに捕獲された金属安定化ＮＧＦを含む。ポリペプチドを含むリポソームは、本質的に周知の方法によって調製される：DE 3,218,121;Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-3692（1985）;Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030-4034（1980）;EP 52,322;EP 36,676;EP 88,046;EP 143,949;EP 142,641;日本国特許出願83-118008;米国特許出願第4,485,045号及び第4,544,545号及びEP 102,324。通常該リポソームは、脂質含有量が約３０モル％コレステロールより大きく、選択された割合が、最適なリガンド類似体治療のために調節される、小さい（約２００−８００オングストローム）単一ラメラ形である。増大した循環時間を有するリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
凍結乾燥形態を含むここでの組成物は、本質的に周知の一般的に利用可能な製薬混合法を使用して、構成成分を混合することによって一般的に調製される。同様に、本分野で周知の標準的な凍結乾燥法及び装置が使用される。
本発明の生分解性ポリマーは、低い水溶性度を有するまたは水不溶性であり、例えば、α−ヒドロキシカルボン酸（例えばグリコール酸、乳酸、2-ヒドロキシ酪酸、バリン酸、ロイシン酸等）、ヒドロキシジカルボン酸（例えばリンゴ酸等）ヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸等）またはそれらの混合物；ポリ-α-シアノアクリル酸エステル、例えばポリ（α−シアノアクリル酸メチル）、ポリ（α−シアノアクリル酸エチル）、ポリ（α−シアノアクリル酸ブチル）等；及びアミノ酸ポリマー、例えばポリ（γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸）等、またはそれらの混合物の一種以上から合成されるホモポリマーまたはコポリマーといった鎖式ポリエステルを含む。これらの生分解性ポリマーに対する重合の態様は、ランダム、ブロックまたはグラフト重合法の何れでも良い。
好ましい生分解性ポリマーは、例えばα−ヒドロキシカルボン酸（例えばグリコール酸、乳酸、2-ヒドロキシ酪酸等）、ヒドロキシジカルボン酸（例えばリンゴ酸等）及びヒドロキシトリカルボン酸（例えばクエン酸等）、またはそれらの混合物の一種以上から合成されるホモポリマーまたはコポリマー等といった鎖式ポリエステルである。
上述の鎖式ポリエステルの中で、α−ヒドロキシカルボン酸の一種以上から合成されるホモポリマー及びコポリマーは、生分解性及び生物学的適合性の観点から好ましい。特に好ましい鎖式ポリエステルは、α−ヒドロキシカルボン酸の二種以上から合成されるコポリマーである。さらに、これらのコポリマーは、混合物として使用することができる。
α−ヒドロキシカルボン酸が骨格となる化合物である場合、それらはD-、L-及びD-、L-構造の何れかで良い。D-／L-構造の比（モル％）が、約７５／２５から約２５／７５の範囲であることが好ましい。D-／L-構造の比（モル％）が、約６０／４０から約３０／７０の範囲であるヒドロキシカルボン酸がより好ましい。
上述のα−ヒドロキシカルボン酸ポリマーの例は、乳酸ポリマー（以下では場合により「ポリ乳酸」という）である。α−ヒドロキシカルボン酸コポリマーは、グリコール酸と、乳酸及び2-ヒドロキシ酪酸のような他のα−ヒドロキシカルボン酸とのコポリマーを含む。好ましいα−ヒドロキシカルボン酸コポリマーは、乳酸−グリコール酸コポリマー、及び2-ヒドロキシ酪酸−グリコール酸コポリマーである。特に好ましいα−ヒドロキシカルボン酸コポリマーは、乳酸−グリコール酸コポリマーである。
ポリ乳酸は、D-構造またはL-構造またはその混合物の何れでも良い；約７５／２５から約２０／８０のD-／L-構造比（モル％）を有するものが好ましい。D-／L-構造の比（モル％）が、約６０／４０から約２５／７５の範囲であるポリ乳酸がより好ましい。D-／L-構造の比が、約５５／４５から約２５／７５の範囲であるポリ乳酸が最も好ましい。
ポリ乳酸は好ましくは、約１，５００から約１０，０００の以下に定義される重量平均分子量を有する。約２，０００から約８，０００の重量平均分子量を有するポリ乳酸がより好ましい。約３，０００から約６，０００の重量平均分子量を有するポリ乳酸が特に好ましい。ポリ乳酸の分散性（重量平均分子量／数平均分子量）は好ましくは、約１．２から約４．０の範囲であり、より好ましくは約１．５から約３．５の範囲である。
ポリ乳酸は、欧州特許出願EP-172636に記載された従来技術の方法によって生産可能である（例えば触媒の非存在下での脱水重縮合による、または無機固体酸触媒の存在下での脱水重縮合による）。好ましいポリ乳酸は、触媒の非存在下での脱水重縮合によって生産される。
乳酸−グリコール酸コポリマー中の組成比（乳酸／グリコール酸、モル％）は、約１００／０（ホモポリマー）から約４０／６０，好ましくは約９０／１０から約４５／５５，より好ましくは約７５／２５から５０／５０，最も好ましくは約６０／４０から約４０／６０である。乳酸−グリコール酸コポリマーの重量平均分子量は好ましくは、約３，０００から約２０，０００，より好ましくは約４，０００から約１５，０００である。乳酸−グリコール酸コポリマーの分散性（重量平均分子量／数平均分子量）は好ましくは、約１．２から４．０，より好ましくは約１．５から約３．５である。本発明において、組成比及び重量平均分子量の異なる乳酸−グリコール酸コポリマーの二種が、何れかの比で混合して使用可能である。典型的な例は、乳酸／グリコール酸の組成比（モル％）が約７５／２５であり、重量平均分子量が約６，０００である乳酸−グリコール酸コポリマーの混合物である。別の例は、乳酸／グリコール酸の組成比（モル％）が約５０／５０であり、重量平均分子量が約４，０００である乳酸−グリコール酸コポリマーである。本混合物の好ましい重量比は、約２５／７５から約７５／２５である。
乳酸−グリコール酸コポリマーは、EP-172636に記載された周知の方法によって生産可能である（例えば触媒の非存在下での脱水重縮合、または無機固体酸触媒の存在下での脱水重縮合）。好ましいコポリマーは、触媒の非存在下での脱水重縮合によって生産されたものである。
2-ヒドロキシ酪酸−グリコール酸コポリマーの組成比は、約１０から約７５モル％のグリコール酸及び残りのモル％の2-ヒドロキシ酪酸、より好ましくは約２０から約７５モル％のグリコール酸、より好ましくは約３０から約７０モル％のグリコール酸である。2-ヒドロキシ酪酸−グリコール酸コポリマーの重量平均分子量は、好ましくは約２，０００から約３０，０００、より好ましくは約３，０００から約２０，０００である。該コポリマーの特に好ましい重量平均分子量は、約４，０００から約１５，０００である。2-ヒドロキシ酪酸−グリコール酸コポリマーの分散性（重量平均分子量／数平均分子量）は、好ましくは約１．２から約４．０，より好ましくは約１．５から約３．５である。
2-ヒドロキシ酪酸−グリコール酸コポリマーは、EP-172636に記載された周知の方法によって生産可能である（例えば触媒の非存在下での脱水重縮合、または無機固体酸触媒の存在下での脱水重縮合）。好ましいコポリマーは、触媒の非存在下での脱水重縮合によって生産されたものである。
グリコール酸コポリマー（例えば乳酸−グリコール酸コポリマー、2-ヒドロキシ酪酸−グリコール酸コポリマー等）は、ポリ乳酸との混合物として使用しても良い。グリコール酸コポリマーがポリ乳酸と組み合わせて使用される場合、グリコール酸コポリマー／ポリ乳酸の比（重量％）は、例えば１０／９０から約９０／１０であり得る。好ましい比は、約２０／８０から約８０／２０であり、最も好ましい比は約３０／７０から約７０／３０である。
本明細書で使用される用語、「重量平均分子量」及び「数平均分子量」は、１２０，０００、５２，０００、２２，０００、９，２００、５，０５０、２，９５０、１，０５０、５８０及び１６２の重量平均分子量を有する９個のポリスチレンスタンダードを使用して、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定された、ポリスチレン平衡平均分子量及び数平均分子量を意味する。これらの測定は、ＧＰＣ Ｃｏｌｕｍｅ ＫＦ８０４Ｌ × ２（Showa Denko K.K.）、ＲＩ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｌ−３３００（Hitachi,Ltd.）、及び移動相としてクロロホルムを使用してなすことが可能である。
本発明において、触媒の非存在下での脱水重縮合反応によって合成された生分解性ポリマーは、末端に遊離カルボキシル基を有する。末端に遊離カルボキシル基を有する上記生分解性ポリマーは、末端基滴定アッセイ（end-group titrimetric assay）によって測定された数平均分子量と、上述の周知の分子量のポリスチレンスタンダードを使用したＧＰＣアッセイによって測定された数平均分子量の間に、高い相関関係が表れる。
末端基アッセイ法によって、数平均分子量は、以下の方法で測定可能である。約１ｇから３ｇの生分解性ポリマーが、アセトン（２５ｍｌ）及びメタノール（５ｍｌ）の混合溶媒中に溶解され、溶液中のカルボキシル基が、室温（約０℃から約３０℃）での攪拌の下で、指標としてフェノールフタレンを用いて、０．０５Ｎアルコールを含む水酸化カリウム溶液を使用して迅速に滴定される。数平均分子量は、以下の式によって計算される：末端基アッセイによる数平均分子量＝２００００（Ａ／Ｂ）、式中、Ａは生分解性ポリマーの重量（ｇ）であり、Ｂは末端基に達するまで加えられた０．０５Ｎアルコールを含むＫＯＨ溶液の量（ｍｌ）である。
触媒の非存在下での脱水重縮合によって、α−ヒドロキシ酸の一種以上から合成された、末端に遊離カルボキシル基を有する生分解性ポリマーの場合、ＧＰＣアッセイによって測定された数平均分子量と、末端基アッセイによって測定された数平均分子量の間に、高い相関関係が見出される。対照的に、触媒を使用した環開裂重縮合によって、α−ヒドロキシ酸の環状ダイマーから生産され、末端に遊離カルボキシル基を本質的に全く有しない生分解性ポリマーの場合、末端基アッセイによって見出される数平均分子量は、ＧＰＣによって見出される数平均分子量よりもかなり高い。この差異のため、末端に遊離カルボキシル基を有する生分解性ポリマーは、末端に遊離カルボキシル基を有しない生分解性ポリマーから容易に区別可能である。
末端基アッセイによって見出された数平均分子量が絶対値である一方で、ＧＰＣアッセイによって見出された数平均分子量は、分析法及び分析条件（例えば移動相及びカラムのタイプ、参考スタンダード、スライド幅の選択、ベースラインの選択等）のような多くの変数に依存した相対値であり、それ故標準化するのが困難である。しかしながら、末端基アッセイから得られた値が、ＧＰＣアッセイによって見出された値の約０．５から約２．０倍の範囲内にあるとき、末端基アッセイによって見出された数平均分子量と、ＧＰＣアッセイによって見出された数平均分子量の間に高い相関関係が存在する。好ましい範囲は、約０．８から約１．５倍である。末端基アッセイによって見出された数平均分子量が、ＧＣＰアッセイによって見出された数平均分子量より「かなり高い」ことは、末端基アッセイによって見出された値が、ＧＰＣアッセイによって見出された値の約２倍以上であることを意味する。
本発明において、好ましいポリマーは、末端基アッセイによって見出された数平均分子量と、ＧＰＣアッセイによって見出された数平均分子量の間に高い相関関係を示すものである。
生分解性ポリマーをその金属塩に変換するために使用される金属塩は、それがインビボで非所望のまたは有害な影響を発揮しないという以外は、特に制限されない。該金属塩は、無機酸または有機酸と、アルカリ金属（例えばナトリウム、カリウム等）ような一価金属、若しくはアルカリ土類金属（例えばカルシウム、マグネシウム等）、または亜鉛（ＩＩ）、鉄（ＩＩ、ＩＩＩ）、銅（ＩＩ）、スズ（ＩＩ、ＩＶ）及びアルミニウム（ＩＩ、ＩＩＩ）のような多価金属とによって形成される塩を含む。
該金属は、好ましくは多価金属、より好ましくはアルカリ土類金属及び亜鉛である。特に好ましい金属は、カルシウム及び亜鉛である。
金属塩形成に使用され得る無機酸は、ハロゲン化水素（例えば塩化水素、臭化水素、ヨウ化水素、フッ化水素）、硫酸、硝酸、チオシアン酸等を含む。
金属塩形成に使用され得る有機酸は、鎖式カルボン酸及び芳香族酸を含む。好ましい鎖式カルボン酸は、Ｃ_1-9鎖式カルボン酸、例えば鎖式モノカルボン酸、鎖式ジカルボン酸、及び鎖式トリカルボン酸である。鎖式カルボン酸は、飽和または不飽和でも良い。
鎖式モノカルボン酸は、Ｃ_1-9の飽和鎖式モノカルボン酸（例えば炭酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、ヘプタン酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、デカン酸等）、及びＣ_2-9の不飽和鎖式モノカルボン酸（例えばアクリル酸、プロピオル酸、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸等）を含む。
鎖式ジカルボン酸は、Ｃ_2-9の飽和鎖式ジカルボン酸（例えばマロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸等）、及びＣ_2-9の不飽和鎖式ジカルボン酸（例えばリンゴ酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸等）を含む。
鎖式トリカルボン酸は、Ｃ_2-9の飽和鎖式トリカルボン酸（例えばトリカルバリル酸（tri-carvallylic acid）、1,2,3-ブタントリカルボン酸等）を含む。
上述の鎖式カルボン酸は、さらに１または２個のヒドロキシル基を有しても良い。説明的な例は、グリコール酸、乳酸、グリセリン酸、タルトロン酸、クエン酸等である。
好ましい鎖式カルボン酸は、鎖式モノカルボン酸である。より好ましい鎖式カルボン酸は、Ｃ_2-9鎖式モノカルボン酸である。Ｃ_2-3の飽和鎖式モノカルボン酸が特に好ましい。最も好ましい鎖式カルボン酸は、酢酸を含む。
金属塩形成に使用され得る芳香族酸は、安息香酸、サリチル酸、及びフェノールスルホン酸を含む。
生分解性ポリマーの金属塩は、上述の多価金属のアセチルアセトナートまたは酸化物を使用して得ることもできる。このタイプの好ましい金属ドナーは、アセチルアセトナト亜鉛及び酸化亜鉛である。
生分解性ポリマーをその金属塩に変換するために使用され得る金属塩は、好ましくは有機または無機酸と多価金属によって形成された塩である（以下では多価金属塩と称する）。
使用され得る多価金属塩は、無機酸を使用した亜鉛の塩、例えばハロゲン化亜鉛（例えば塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、フッ化亜鉛）、硫化亜鉛、硝酸亜鉛、チオシアン酸亜鉛等；有機酸を使用した亜鉛の塩、例えば鎖式カルボン酸亜鉛塩（例えば炭酸亜鉛、酢酸亜鉛、グリコール酸亜鉛、乳酸亜鉛、タルトロン酸亜鉛等）、芳香族亜鉛塩（例えば安息香酸亜鉛、サリチル酸亜鉛、フェノールスルホン酸亜鉛等）；無機酸を使用したカルシウムの塩、例えばハロゲン化カルシウム）例えば塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、フッ化カルシウム等）、硫化カルシウム、硝酸カルシウム、チオシアン酸カルシウム等；有機酸を使用したカルシウムの塩、例えば鎖式カルボン酸カルシウム塩（例えば炭酸カルシウム、酢酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、タルトロン酸カルシウム、乳酸カルシウム、クエン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム等）、及び芳香族カルシウム塩（例えば安息香酸カルシウム、サリチル酸カルシウム等）を含む。好ましい塩は、酢酸亜鉛、炭酸亜鉛、酢酸カルシウム、及び炭酸カルシウムである。より好ましい多価金属塩は、酢酸亜鉛及び酢酸カルシウムを含む。
もし必要であれば、同等なＮＧＦ／金属複合体を形成するために、生成物から生物学的に活性なポリペプチド中で生じる金属を、周知の方法によって該ポリペプチドから除去し、選択された安定化金属を使用して置換しても良い。
本発明において、持続放出調製物中の生分解性ポリマー金属塩以外の添加物は、金属塩を形成しないことが好ましい。
本発明における生分解性ポリマー金属塩は、金属塩を含む生分解性ポリマーの水／油（ｗ／ｏ）または油／水（ｏ／ｗ）エマルション、または有機溶液、または懸濁物を調製するために、生分解性ポリマーの有機溶媒溶液中の金属塩の水溶液または固体形態を乳化及び分散することによって生産可能である。生成した物質を洗浄、乾燥し、または洗浄及び乾燥しながら、水中乾燥法、相分離法、噴霧乾燥法等を受けさせる。この方法において生分解性ポリマーと塩の形成物中で沈降しない金属塩は、好ましくは除去される。
上述の有機溶媒は好ましくは、１２０℃を超えない沸点を有する。上記有機溶媒は、ハロゲン化炭化水素（例えばジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等）、アルコール（例えばエタノール、メタノール等）、アセトニトリル等を含む。これらの溶媒はまた、混合物として使用可能である。好ましい有機溶媒は、ジクロロメタン及びアセトニトリルである。ジクロロメタンが特に好ましい。
生分解性ポリマー金属塩の金属含有量は、好ましくは約０．０１から約１０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは約０．０５から約７％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは約０．１から約５％（ｗ／ｗ）である。生分解性ポリマー金属塩の金属含有量は、原子吸光測定によって測定可能である。
生分解性ポリマー金属塩を生産する方法（例えば水中乾燥法、相分離法及び噴霧乾燥法）は、以下に記載される。
水中乾燥法（水／油／水またはｗ／ｏ／ｗ法）によって生分解性ポリマー金属塩を生産するために、該生分解性ポリマーは、有機溶媒溶液（以下では場合により油相と称する）を調製する目的で、有機溶媒中に初めに溶解される。この有機溶媒溶液中の生分解性ポリマーの濃度は、該ポリマーの分子量、及び使用される有機溶媒の種類に従って適宜選択される。例えば有機溶媒中の生分解性ポリマーの濃度は、約０．０１から約９０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約０．１から約８０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは約１から約７０％（ｗ／ｗ）でも良い。内部の水相のために、金属塩の水溶液を使用する。金属塩の濃度は、約１０から約９０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約２０から約８０％（ｗ／ｗ）でも良い。しかしながら、金属塩の濃度は、水中の金属塩の溶解性に依存する。上述の金属塩水溶液は、ｗ／ｏエマルションを提供するために、該生分解性ポリマーの有機溶媒溶液中で分散及び乳化される。該生分解性ポリマーの有機溶媒溶液中の金属塩の水溶液の容量比は、約１：１，０００から約１：１，好ましくは約１：１００から約１：２，最も好ましくは約１：５０から約１：３である。乳化は、タービンミキサー、ホモジェナイザー等を使用することによるような、簡便な乳化法によって達成可能である。
かくして得られたｗ／ｏエマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを生産するために、水相（外部の水相）に加えられる。次いで油相溶媒を、所望の生分解性ポリマー金属塩を提供するために蒸発させる。外部の水相の容量は、油相の容量の例えば約１から約１０，０００倍の範囲から選択され得る。好ましい範囲は、約２から約５，０００倍、最も好ましい範囲は約５から約２，０００倍である。溶媒の蒸発は、プロペラスターラーまたは磁力スターラー等を使用して攪拌しながら、通常のまたは段階的に減少する圧力下で該溶媒を蒸発する方法、及び回転蒸発器等を使用して真空の度合を調製しながら該溶媒を蒸発する方法を含む、一般に使用される方法によって達成可能である。
乳化剤が、外部の水相に加えられても良い。乳化剤は、安定なｗ／ｏ／ｗエマルションを提供可能な何れかの物質であり得る。上記乳化剤の例は、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレン−ヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レクチン、ヒアルロン酸等を含む。好ましい乳化剤は、ポリビニルアルコールである。複数の乳化剤を、外部の水相における使用のため組み合わせて使用しても良い。外部の水相に基づく乳化剤の濃度は、約０．００１から約２０％（ｗ／ｗ）の範囲から選択され得る。好ましい範囲は、約０．０１から約１０％（ｗ／ｗ）であり、さらに好ましい範囲は約０．０５から約５％（ｗ／ｗ）である。
内部の水相に含まれる金属塩と同じまたは異なる金属塩が、外部の水相に加えられても良い。上記の場合、外部の水相中の金属塩の濃度が、約０．０１から２０％（ｗ／ｗ）、または好ましくは約０．１から１０％（ｗ／ｗ）の量となるように、好ましくは脂肪酸金属塩が加えられる。外部の水相中の金属塩の濃度の注意深い選択によって、外部の水相中に、生分解性ポリマーから内部の油相中で使用される金属塩の転移が避けられ得る。
かくして生産された生分解性ポリマー金属塩は、遠心分離または濾過によって回収され、塩表面から乳化剤及び他の沈着物を除去するために数回蒸留水を使用して洗浄され、次いで蒸留水中で再分散され、凍結乾燥される。
水中乾燥法（油／水法）によって生分解性ポリマー金属塩を生産するために、有機溶媒中の生分解性ポリマーの溶液は、方法（Ａ）のように初めに調製される。次いで金属塩が加えられ、生分解性ポリマーの有機溶媒溶液中で分散または溶解される。生分解性ポリマーに対する金属塩の比（重量による）は、約５：１から約１：１００，好ましくは約２：１から約１：５０，より好ましくは約１：１から約１：１０である。次いで、かくして得られた有機溶媒溶液を、水相内に注ぎ、ｏ／ｗエマルションが好ましくはタービンミキサー等を使用することによって調製される。次いで油相溶媒が、生分解性ポリマー金属塩を生産するために、方法（Ａ）のように蒸発される。水相の容量は、油相の容量に基づき、例えば油相の容量の約１から約１０，０００倍、好ましくは約２から約５，０００倍の範囲から選択される。最も好ましい範囲は、約５から約２，０００倍である。
方法（Ａ）のように、乳化剤が、この水相中に加えられても良い。
油相内に加えられ、分散または溶解した金属塩と同じまたは異なる金属塩が、水相内に加えられても良い。
かくして生産された生分解性ポリマー金属塩が、方法（Ａ）のようにを分離、洗浄、凍結乾燥される。
相分離法（コアセルベーション法）によって生分解性ポリマー金属塩を生産するために、コアセルベーション化剤が、生分解性ポリマー金属塩を沈降及び固化する目的で、方法（Ａ）で使用された水／油エマルション、または方法（Ｂ）で使用された金属塩を含む生分解性ポリマーの有機溶媒溶液中に、攪拌しながら加えられる。使用されるコアセルベーション化剤の量は、生分解性ポリマーのｗ／ｏエマルションまたは有機溶媒溶液の容量に基づく。使用される容量は、生分解性ポリマーのＷ／Ｏエマルションまたは有機溶媒の容量の約０．０１から約１，０００倍、好ましくは約０．０５から約５００倍、より好ましくは約０．１から約２００倍である。
コアセルベーション化剤は、ポリマー、鉱油または植物油の何れかのカテゴリーに属する物質でも良く、それは生分解性ポリマーを溶解するために使用される有機溶媒と混合できるが、生分解性ポリマーはほとんど溶解できないものである。典型例は、シリコーン油、ゴマ油、ダイズ油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、亜麻油、鉱油、n-ヘキサン、n-ヘプタン等である。コアセルベーション化剤は、２種以上の混合物として使用可能である。
かくして生産された生分解性ポリマー金属塩は、濾過によって回収され、コアセルベーション化剤を除去するためヘプタン等を使用して繰り返し洗浄される。次いで該塩が、方法（Ａ）のように洗浄され、凍結乾燥される。
水中乾燥法またはコアセルベーション法による生分解性ポリマー金属塩の生産において、該粒子の凝集化を防止するために、抗凝集剤（antiflocculant）が加えられても良い。使用され得る抗凝集剤は、マンニトール、乳糖、グルコース及びデンプン（例えばコーンスターチ）のような水溶性ポリサッカリド、ヒアルロン酸及びそのアルカリ金属塩、グリシン、フィブリンのようなタンパク質、コラーゲン、及び塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸塩のような無機酸等を含む。
噴霧乾燥法によって生分解性ポリマー金属塩を生産するために、金属塩の水溶液及び水分解性ポリマーの有機溶媒溶液から調製された水／油エマルション、若しくは金属塩を含む生分解性ポリマーの有機溶媒溶液または懸濁物の何れかが、大変短い時間で均一な小滴中で有機溶媒を揮発するために、噴霧乾燥機の乾燥室内にノズルを経て噴霧され、均一な生分解性ポリマー塩が生産される。上述のノズルの例は、二対液体ノズル（binary-fluid nozzle）、加圧ノズル（pressure nozzle）及び回転ディスクノズル（rotary disk nozzle）である。上述の抗凝集剤の水溶液もまた、金属塩を含む生分解性ポリマーのｗ／ｏエマルションまたは有機溶媒溶液または懸濁物と、生分解性ポリマー金属塩の凝集を防止するために、別のノズルを経て噴霧されても良い。かくして生産された生分解性ポリマー金属塩は、方法（Ａ）のように洗浄され、もし必要であれば、さらに加熱及び減圧下で水及び有機溶媒の除去を受ける。
本発明の持続放出調製物は、生分解性ポリマー金属塩を含む有機溶媒中にＮＧＦを分散し、精製した分散物を製剤化することによって製造され得る。本発明の製造法は、上述の（Ａ）水中乾燥法（ｗ／ｏ／ｗ法）、（Ｂ）水中乾燥法（ｏ／ｗ法）、（Ｃ）相分離法（コアセルベーション法）、（Ｄ）噴霧乾燥法、またはそれらの何れかの修飾法を使用することができる。有機溶媒溶液中の有機溶媒は、好ましくは１２０℃以下の沸点を有する溶媒である。上記有機溶媒は、ハロゲン化炭化水素（例えばジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等）、アルコール（例えばエタノール、メタノール、1,4-ブタンジオール、1,5-ペンタンジオール等）、及びとりわけアセトニトリルを含む。何れかの溶媒が、混合物として共に使用可能である。単一の有機溶媒が使用される場合、ジクロロメタンまたはアセトニトリルが特に好ましい。有機溶媒の混合物が使用される場合、アセトニトリルまたはアルコール（例えばメタノール、エタノール等）と、ハロゲン化炭化水素（例えばジクロロメタン）の組み合わせが好ましい。アセトニトリルとジクロロメタンの組み合わせが、多くの例において特に好ましい。アセトニトリルまたはアルコールの何れかに対するハロゲン化炭化水素の比（容量による）は、約４０：１から約１：１，好ましくは約２０：１から約１：１である。
持続放出調製物の製造法は、例としてミクロスフェアを使用してここで記載される。
水中乾燥法（ｗ／ｏ／ｗ法）を使用して持続または制御放出ミクロスフェア調製物を生産するために、生分解性ポリマー金属塩の有機溶媒溶液は、初めに上述の方法（Ａ）と同じ方法で調製される。有機溶媒溶液中の生分解性ポリマー金属塩の濃度は、該生分解性ポリマー金属塩のタイプ及び分子量、並びに有機溶媒のタイプに依存する。例えば、有機溶媒に対する生分解性ポリマー金属塩の比が、約０．０１から約８０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約０．１から約７０％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは約１から約６０％（ｗ／ｗ）であり得る。内部の水相に対して、ＮＧＦの水溶液が使用される。水溶液中のＮＧＦの濃度は、例えば約０．１％（ｗ／ｖ）から約５００％（ｗ／ｖ）、好ましくは約１％（ｗ／ｖ）から約４００％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約１０％（ｗ／ｖ）から約３００％（ｗ／ｖ）であり得る。この水溶液に対して、ｐＨ調節剤（例えば酢酸、塩酸、水酸化ナトリウム等）、安定剤（例えば血清アルブミン、ゼラチン等）、及び／または防腐剤（例えばp-ヒドロキシ安息香酸エステル等）が加えられ得る。かくして得られた水溶液は、ｗ／ｏエマルションを生産するために、生分解性ポリマー金属塩の有機溶媒溶液中で分散される。
生分解性ポリマー金属塩の有機溶媒溶液に対するＮＧＦ（ダイマー形態）の水溶液の比（ｖ／ｖ）は、約１：１，０００から約１：１，好ましくは約１：１００から約１：５，より好ましくは約１：５０から約１：５，さらにより好ましくは約１：５０から約１：１０，最も好ましくは約１：５０から約１：２０である。１：４から１：５０，１：６から１：２０及び１：８から１：１４の範囲が有用な実施態様であり、１：５０から１：２０が特に好ましい。いくつかの有用な比の実施態様は、１：１０、１：１５、１：２０及び１：２５である。かくして得られたｗ／ｏエマルションは次いで、ｗ／ｏ／ｗエマルションを生産するために水溶液（外部の水相）に注がれ、油相中の溶媒は、ミクロスフェアを生産するために蒸発される。乳化剤が、外部の水相に加えられても良い。乳化剤は、一般的に安定なｗ／ｏ／ｗエマルションを提供可能な何れかの物質である。特に、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレン−ヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レクチン、ゼラチン、ヒアルロン酸等が使用され得る。好ましい乳化剤は、ポリビニルアルコールである。２種以上の乳化剤が組み合わせて使用され得る。外部の水相に基づく乳化剤の濃度は、約０．００１％（ｗ／ｗ）から約２０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約０．０１％（ｗ／ｗ）から約１０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは約０．０５％（ｗ／ｗ）から約５％（ｗ／ｗ）の範囲から選択される。内部の水相に加えられたものと同じ塩または異なる塩の何れであれ、金属塩が、外部の水相に加えられ得る。この方法において、外部の水相の金属塩の濃度が、約０．０１％から約２０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約０．１％から約１０％（ｗ／ｗ）となるように、好ましくは脂肪酸金属塩が加えられる。外部の水相の金属塩の濃度を変化することによって、内部の水相で使用される金属塩が、外部の水相内に生分解性ポリマーから移動することを防止できる。
かくして生産されたミクロスフェアは、遠心分離または濾過によって回収され、カプセル表面から乳化剤及び他の沈着物を除去するために蒸留水を使用して繰り返し洗浄され、次いで蒸留水等中で再分散され、凍結乾燥される。次いでもし必要であれば、ミクロスフェア中の残余の水分または有機溶媒を、減圧下で加熱することによってさらに除去する。ミクロスフェアは、生分解性ポリマーのガラス転移温度より低く、ミクロスフェアの凝集を引き起こすほど高くない温度で加熱される。加熱温度は、好ましくは生分解性ポリマーのガラス転移温度から、生分解性ポリマーのガラス転移温度より約３０℃高い温度までの範囲で選択される。ここでガラス転移温度とは、分当たり１０または２０℃の速度で加熱の間に示差走査熱量計を使用して測定された中間ガラス転移温度として定義される。
水中乾燥法（ｏ／ｗ法）を使用して持続または制御放出ミクロスフェア調製物を生産するために、生分解性ポリマー金属塩の有機溶媒を、方法（Ａ）と同様に初めに調製する。有機溶媒中の生分解性ポリマー金属塩の濃度は、方法（ｉ）で記載されたものと同じであり得る。かくして得られた生分解性ポリマー金属塩の有機溶媒溶液中に、生分解性ポリマー金属塩及びＮＧＦを含む有機溶媒溶液または懸濁物を調製するために、ＮＧＦを加え、溶解または分散させる。生分解性ポリマー金属塩に対するＮＧＦの重量比は、例えば約１：１０００から約１：１，好ましくは約１：２００から約１：５，より好ましくは約１：１００から約１：５，さらに好ましくは約１：５０から約１：５，さらにより好ましくは約１：５０から約１：１０，最も好ましくは約１：５０から約１：２０であり得る。１：４から１：５０，１：６から１：２０及び１：８から１：１４が有用な実施態様であり、１：５０から１：２０が特に好ましい。いくつかの有用な比の実施態様は、１：１０、１：１５、１：２０及び１：２５である。
生分解性ポリマー金属塩及びＮＧＦを含むこの有機溶媒溶液は、油／水エマルションを調製するために水相に注がれる。次いで油相中の溶媒が、ミクロスフェアを生産するために蒸発される。
かくして得られたミクロスフェアを回収し、方法（ｉ）と同様に洗浄し凍結乾燥する。その後、ミクロスフェアは、方法（ｉ）と同様に残余の水分及び有機溶媒を除去するために減圧下で加熱される。
相分離法を使用して持続または制御放出ミクロスフェアを生産するために、コアセルベーション化剤が、沈降し固化したミクロスフェアを生産する目的で、方法（ｉ）で使用されたものと同じｗ／ｏエマルション、または方法（ｉｉ）で使用されたものと同じ生分解性ポリマー金属塩及びＮＧＦの有機溶媒に、方法（Ｃ）と同じ態様で攪拌しながら段階的に加えられる。かくして生産されたミクロスフェアが回収され、方法（Ｃ）のようにコアセルベーション化剤及び遊離ＮＧＦを除去するために洗浄される。次いで、もし必要であれば、ミクロスフェア内の残余の水分及び有機溶媒を、方法（Ｃ）と同じ態様で減圧下で加熱することによって除去する。
水中乾燥法または相分離法によるミクロスフェアの生産において、方法（Ｃ）のように粒子の凝集を防止するために、抗凝集剤を加えても良い。
噴霧乾燥法を使用して持続または制御放出ミクロスフェア調製物を生産するために、方法（ｉ）で使用されたものと同じｗ／ｏエマルション、または方法（ｉｉ）で使用されたものと同じ生分解性ポリマー金属塩及びＮＧＦを含む有機溶媒溶液が、ミクロスフェアを提供する目的で、方法（Ｄ）と同じ態様でノズルを経て噴霧される。もし必要であれば、かくして得られたミクロスフェアは、方法（ｉ）のように残余の水分及び有機溶媒を除去するために減圧下で加熱される。
好ましい実施態様として、ＮＧＦは、ミクロスフェアを形成する生分解性ポリマー等を他の放出調製剤と共にさらに製剤化する前に、酢酸亜鉛または炭酸亜鉛のような亜鉛といったＮＧＦを結合する金属（塩形態）と、水溶液中で製剤化される。ＮＧＦ−金属水溶液緩衝液は、金属をＮＧＦと結合させるために十分に非酸性である。好ましいｐＨは、６．５から８．５，より好ましくは７から８，さらにより好ましくは７．２から７．６である。ＮＧＦ結合金属が、放出ＮＧＦを安定化し、同様にミクロスフェアからの初期放出速度を減少する手段を提供するために、凍結乾燥の前に水性ＮＧＦ−金属溶液に対してトレハロースのような安定化ポリオールを加えることが任意になされる。
凍結乾燥ＮＧＦ−亜鉛粉末は、好ましくは実施例１で論じたように、ここで教示される制御放出ミクロスフェアに加工される。金属がＮＧＦ水溶液に加えられたため、生分解性ポリマーとの混合の前にまたはそれと同時に、乾燥粉末に対して放出調節剤として金属を加えることが任意になされる。しかしながら、ここで開示されるようなアルカリ金属、アルカリ土類金属、または多価金属、より好ましくは亜鉛といった、好ましくはＮＧＦを結合する金属といった金属イオンの塩という放出調節剤が存在する場合、該放出調節剤は、１から１０重量％、より好ましくは３から６重量％で存在する。
ＮＧＦを使用した水性製剤化のために使用され得る金属塩は、ＮＧＦを結合し、ミクロスフェアからの放出に際してそれを安定化するものである。該塩は、インビボでの非所望のまたは有害な影響を発揮しない限り特に限定されない。該金属塩は、無機酸または有機酸と、アルカリ金属（例えばナトリウム、カリウム等）ような一価金属、またはアルカリ土類金属（例えばカルシウム、マグネシウム等）、若しくは亜鉛（ＩＩ）、鉄（ＩＩ、ＩＩＩ）、銅（ＩＩ）、スズ（ＩＩ、ＩＶ）及びアルミニウム（ＩＩ、ＩＩＩ）のような多価金属とによって形成される塩を含む。該金属は、好ましくは多価金属、より好ましくはアルカリ土類金属及び亜鉛である。特に好ましい金属は、カルシウム及び亜鉛である。金属塩形成に使用され得る無機酸は、ハロゲン化水素（例えば塩化水素、臭化水素、ヨウ化水素、フッ化水素）、硫酸等を含む。金属塩形成に使用され得る有機酸は、鎖式カルボン酸及び芳香族酸を含む。好ましい鎖式カルボン酸は、Ｃ_1-9鎖式カルボン酸、例えば鎖式モノカルボン酸、鎖式ジカルボン酸、及び鎖式トリカルボン酸である。鎖式カルボン酸は、飽和または不飽和でも良い。鎖式モノカルボン酸は、Ｃ_1-9の飽和鎖式モノカルボン酸（例えば炭酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、ヘプタン酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、デカン酸等）、及びＣ_2-9の不飽和鎖式モノカルボン酸（例えばアクリル酸、プロピオル酸、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸等）を含む。鎖式ジカルボン酸は、Ｃ_2-9の飽和鎖式ジカルボン酸（例えばマロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸等）、及びＣ_2-9の不飽和鎖式ジカルボン酸（例えばリンゴ酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸等）を含む。鎖式トリカルボン酸は、Ｃ_2-9の飽和鎖式トリカルボン酸（例えばトリカルバリル酸（tri-carvallylic acid）、1,2,3-ブタントリカルボン酸等）を含む。上述の鎖式カルボン酸は、さらに１または２個のヒドロキシル基を有しても良い。説明的な例は、グリコール酸、乳酸、グリセリン酸、タルトロン酸、クエン酸等である。好ましい鎖式カルボン酸は、鎖式モノカルボン酸である。より好ましい鎖式カルボン酸は、Ｃ_2-9鎖式モノカルボン酸である。Ｃ_2-3の飽和鎖式モノカルボン酸が特に好ましい。最も好ましい鎖式カルボン酸は、酢酸を含む。金属塩形成に使用され得る芳香族酸は、安息香酸、サリチル酸、及びフェノールスルホン酸を含む。ＮＧＦを使用した水性製剤化のための金属塩は、好ましくは有機または無機酸を使用した多価金属によって形成される塩である（以下では多価金属塩と称する）。
使用され得る多価金属塩は、無機酸を使用した亜鉛の塩、例えばハロゲン化亜鉛（例えば塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、フッ化亜鉛）、硫化亜鉛、硝酸亜鉛、チオシアン酸亜鉛等；有機酸を使用した亜鉛の塩、例えば鎖式カルボン酸亜鉛塩（例えば炭酸亜鉛、酢酸亜鉛、グリコール酸亜鉛、乳酸亜鉛、タルトロン酸亜鉛等）、芳香族亜鉛塩（例えば安息香酸亜鉛、サリチル酸亜鉛、フェノールスルホン酸亜鉛等）；無機酸を使用したカルシウムの塩、例えばハロゲン化カルシウム）例えば塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、フッ化カルシウム等）、硫化カルシウム、硝酸カルシウム、チオシアン酸カルシウム等；有機酸を使用したカルシウムの塩、例えば鎖式カルボン酸カルシウム塩（例えば炭酸カルシウム、酢酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、タルトロン酸カルシウム、乳酸カルシウム、クエン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム等）、及び芳香族カルシウム塩（例えば安息香酸カルシウム、サリチル酸カルシウム等）を含む。好ましい塩は、酢酸亜鉛、炭酸亜鉛、酢酸カルシウム、及び炭酸カルシウムである。より好ましい多価金属塩は、酢酸亜鉛及び酢酸カルシウムを含む。
金属に対するＮＧＦのモル比は、ＮＧＦ−ミクロスフェアが投与される患者または細胞培養物において、望ましくない害または副作用を引き起こさない、ミクロスフェアからの放出に際してＮＧＦを安定化するものである。金属イオン：ＮＧＦの溶液中のモル比は、４：１から５０：１、より好ましくは６：１から２０：１、さらにより好ましくは８：１から１４：１の範囲であり得る。
もし必要であれば、同等なＮＧＦ／金属複合体を形成するために、生成物からＮＧＦにおいて生ずる何れかの金属を、周知の方法によって該ポリペプチドから除去し、選択された安定化金属を使用して置換しても良い。
マイクロカプセル化法で使用される有機溶媒による変性に対してＮＧＦを安定化するため、及び／またはＮＧＦの濃度を最適にするための何れかに有用な賦形剤が、ＮＧＦ及び金属塩混合物中に適宜存在する。典型的な賦形剤は、約７０，０００ｋＤより小さい分子量のポリオールであろう。使用されるポリオールの例は、トレハロース、マンニトール及びポリエチレングリコールを含む。典型的には、ポリペプチドに対するトレハロースの重量比は、１００：１から１：１、好ましくは１：１から１：１０，より好ましくは１：３から１：４である。典型的には、ポリペプチドに対するＰＥＧの重量比は、１００：１から１：１００、好ましくは１：１から１：１０である。最適な比は、該ポリペプチドの安定性を最大化し、該ポリペプチドの変性を最小化する賦形剤の濃度に基づいて選択される。
本発明において、生分解性ポリマー内にＮＧＦをカプセル化する効率は、５０％以上であるのが好ましい。より好ましくは、それは８０％以上、最も好ましくは９０％以上である。
本発明における持続放出調製物に積み込まれた生物学的に活性なＮＧＦの濃度は、該ミクロスフェアの０．００１から５０重量％、好ましくは約０．０１から約３０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは２から２０％、さらにより好ましくは５から１５％の範囲であり得る。約１０％（ｗ／ｗ）の積み込み量が典型的である。ＮＧＦの積み込み量は、水中におけるＮＧＦの溶解性及び有機溶媒中の該ポリマーに加えられ得る水性ＮＧＦの容量によって制限される。ポリマーのグラム当たり０．５ｍＬより大きいＮＧＦの容量は典型的に、該ミクロスフェアからの大きな初期破裂を引き起こす。これらの困難性を避けるために、固体の薬剤製剤が、水性薬剤溶液の代わりに使用され得る。それ故、水中油中固体法が、高い薬剤積み込み量（１０％より大きい）を有するが、初期破裂を抑えるほど低いものであるミクロスフェアを生産するために好ましい。マイクロカプセル化のために使用される固体薬剤製剤は、有機溶媒中で安定であり、薬剤の高い積み込み量及び低い破裂を可能にするために、最終の所望のミクロスフェア（１０−１００μｍ）に対して小さいサイズ（１−５μｍ）を有しなければならない。タンパク質製剤のために、小さい乾燥固体を得る一つの方法は、噴霧乾燥である。Mummenthaler等（Pharm.Res.11（1）:12-20（1994））は、噴霧乾燥ｒｈＧＨ製剤を記載する。ｒｈＧＨは、気体−液体界面のような表面界面によって容易に変性されるため、ｒｈＧＨの噴霧乾燥は、ｒｈＧＨ製剤中で界面活性剤と共に実施されなければならない。驚くべきことに、ここで教示されるような金属の存在は、界面活性剤の必要なく凍結乾燥の間でＮＧＦを安定化することが可能であると見出された。
持続放出調製物は、ミクロスフェアの形態で、または非経口調製物（例えば筋肉内、皮下、または内臓の注射、若しくは内在性の調製物；鼻、直腸、または子宮−粘膜透過調製物）、または経口調製物（例えば硬カプセル及び軟カプセルのようなカプセル、顆粒及び粉末のような固体調製物、懸濁物のような液体調製物）といった各種の投与形態で投与しても良い。
特に好ましい持続放出調製物は注射によるものである。上記のように得られるミクロスフェアを使用する注射物を調製するために、該ミクロスフェアは、粘性の生理学的に許容可能な溶液を使用して製剤化され得る。水性懸濁物を提供するために、分散剤（例えばＴｗｅｅｎ８０、ＨＣＯ−６０のような界面活性剤；カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウムのようなポリサッカリド；ポリエチレングリコール４００等）、防腐剤（例えばメチルパラベン、プロピルパラベン等）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、グルコース、デキストラン等）、及び局所的麻薬剤（例えばキシロカイン塩酸（xylocaine hydrochloride）、クロロブタノール等）が使用され、若しくは油性懸濁物を提供するために、植物油（例えばゴマ油、コーン油等）またはリン脂質（例えばレクチン）あるいは媒体−鎖式脂肪酸トリグリセリド（例えばMigriol 812）とのそれらの混合物を使用して分散される。
持続放出調製物がミクロスフェアである場合、該ミクロスフェアは好ましくは均一な粒子である。注射懸濁物のためのミクロスフェアのサイズは、分散の程度及び注射のために使用される針を通過することの必要性を満足する範囲から選択され得る。例えば、マイクロカプセル粒径は、約０．１から約３００μｍ、好ましくは約１から約１５０μｍ、より好ましくは約２から約１００μｍ、最も好ましくは約２０から約９０μｍの範囲内であり得る。
滅菌調製物としてミクロスフェアを調製する方法は、全生産法が無菌的である方法、ガンマ線を滅菌剤として使用する方法、及び殺菌剤を生産法の間で加える方法を、制限することなく含む。
持続放出調製物は、低毒性を有し、哺乳動物（例えばヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、、ウサギ等）において安全に使用することが可能である。本発明の目的として用語、「患者」は、ヒト及び他の哺乳動物の両者を含む。それ故該方法は、ヒトの治療及び獣医学的応用の両者に適用可能である。
本発明の持続放出調製物は、ニューロンの損傷を予防または治療するために有用である。神経成長因子は、末梢神経系の感覚及び交感ニューロンに顕著な効果を有する。ＮＧＦは、ニューロンの生存を助長し、ニューロンの成長を促進し、及び神経化学的分化を増大するように、応答性ニューロン上の特異的な細胞表面レセプターを経て機能する。ＮＧＦの機能は、ニューロン膜、ニューロンタンパク質のリン酸化の状態、ニューロンの分化及び機能において役割を演じると思われる特定のｍＲＮＡ及びタンパク質の富化の改変によって達成される（Connolly等,J.Cell.Biol.90:176-180（1981）;Skaper及びVaron,Brain Res.197:379-389（1980）;Yu等,J.Biol.Chem.255:10481-10492（1980）;Haleqoua及びPatrick,Cell 22:571-581（1980）;Tiercy及びShooter,J.Cell.Biol.103:2367-2378（1986））。前脳コリン作用性ニューロンもまたＮＧＦに応答し、栄養的助長のためＮＧＦを必要とすると思われる（Hefti,J.Neurosci.,6:2155（1986））。実際、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＮＧＦ及びそのレセプターの配置及び発生は、ＮＧＦが基底の前脳コリン作用性ニューロンに対する標的由来神経栄養因子として機能することを示唆する（Korsching,TINS,pp570-573（Nov/Dec 1986））。
従って、本発明のＮＧＦ製剤は、中枢（脳及び脊髄）、末梢（交感、副交感、感覚、及び腸のニューロン）、及び運動ニューロンを含む、インビボでのニューロンの発達、維持、または再生を促進するために有用であると解される。本発明のＮＧＦ製剤は、各種のニューロン性の疾患及び疾病の治療法において有用である。ここでの用語、「ニューロン性の疾患」は、ニューロンの変性または損傷と関連する中枢及び／または末梢神経系の疾患を意味する。ニューロン性疾患の特別な例は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハイティントン舞踏病、発作、ＡＬＳ、末梢神経障害、及び中枢、末梢または運動ニューロンの何れであれ、ニューロンの壊死または損失によって特徴付けされる他の疾患を制限することなく含み、さらに外傷、火傷、腎機能不全、傷害、並びにガン及びＡＩＤＳを治療するために使用される化学療法薬の毒性効果によって、損傷されたニューロンを治療することを含む。例えば、糖尿病、ＡＩＤＳ、または化学療法薬と関連する神経障害のような、特定の疾患と関連する末梢神経障害が、本発明の製剤を使用して治療され得る。それはまた、インビトロまたはエクスビボでの神経細胞の培養における使用のため、培養培地の構成成分としても有用である。
本発明の各種の実施態様において、ＮＧＦ製剤は、ニューロンの生存または増殖を促進するために、外傷、手術、発作、虚血、感染、代謝疾患、栄養不全、悪性腫瘍、または毒性試薬によって神経系が損傷された患者に投与され、その場合何れかの疾患は、ＮＧＦを使用して治療可能であることが見出されている。例えば、本発明のＮＧＦ製剤は、外傷または手術によって損傷された運動ニューロンの生存または増殖を促進するために使用することができる。また、本発明のＮＧＦ製剤は、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリグ病）、ベル麻痺、及び棘筋萎縮症または麻痺を含む各種の疾患のような、運動ニューロンを治療するために使用可能である。本発明のＮＧＦ製剤は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、ハンティントン舞踏病、ダウン症候群、神経性難聴、及びメニエール病のような、ヒト神経変性疾患を治療するために使用可能である。本発明のＮＧＦ製剤は、特に痴呆または外傷において認識を促進するために、認識エンハンサーとして使用可能である。National Institutes of Agingによって高齢者の痴呆の５０％より多くを数えるものと同定されているアルツハイマー病は、６５歳以上のアメリカ人の死亡の第四位または第五位の高順位の原因でもある。８５歳以上のアメリカ人（それは米国人口の最も加速して増加する部分である）の４０％である４百万人のアメリカ人が、アルツハイマー病に罹患している。パーキンソン病を有する全ての患者の２５パーセントもまた、アルツハイマー病様の痴呆に苦しんでいる。痴呆を有する患者の約１５％は、アルツハイマー病と多発脳梗塞性痴呆の合併症を有する。アルツハイマー病及び血管性痴呆に次ぐ第３位の一般的な痴呆の原因は、アルコール中毒に直接関連する器質脳症候群による認識障害であり、それはアルコール中毒者の約１０％で生じている。しかしながら、アルツハイマー病、同様に血管性痴呆及びアルコール中毒に関連する器質脳症候群による認識障害に対する最も一致した異常は、基質前脳（ＢＦ）からコデックス（codex）及び海馬の両者までに渡るコリン作用性系の変性である（Bigl等,in Brain Cholinergic System,M.Steriade及びD.Biesold編,Oxford University Press,Oxford,pp.364-386（1990））。アルツハイマー病によって影響される数多くの神経伝達系が存在する（Davies,Med.Res.Rev.3:221（1983））。しかしながら、例えばコリン作用性神経伝達系の変性に関連する認識障害は、痴呆に苦しんでいる患者に制限されない。健康な高齢の成人及びラットにおいても見出されている。高齢のラットにおける減少した皮質大脳血液流の程度と、認識障害の程度を比較した研究は、一致した相関関係を示す（Berman等,Neurobiol.ASging 9:691（1988））。慢性アルコール中毒患者においては、アルツハイマー病及び正常な老化と同様の生じた器質脳症候群もまた、コリン作用性ニューロンが存在し（基質前脳）及びそれらが展開している（大脳皮質）脳の領域において、皮質大脳血液流の拡散した減少によって特徴付けされる（Lofti等,Cerebrovasc.and Brain Metab.Rev 1:2（1989））。上記痴呆は、本発明のＮＧＦ製剤の投与によって治療可能である。
さらに、本発明のＮＧＦ製剤は、好ましくは神経障害、特に末梢神経障害を治療するために使用される。用語、「末梢神経障害」は、運動、感覚、感覚運動、または自律神経機能不全の一つまたは組み合わせとしてしばしば表される末梢神経系に影響する疾患を指す。末梢神経障害によって示される広範囲の形態が、等しく広範囲の原因に独自にそれぞれ寄与され得る。例えば末梢神経障害は、一般的に後天的であり、全身性疾患によって引き起こされ、または毒性試薬によって誘導され得る。例としては、糖尿病性末梢神経障害、末梢感覚運動神経障害、ＡＩＤＳ関連神経障害、若しくは胃腸の減少した運動または膀胱アトニーのような自律神経障害を制限することなく含む。全身性疾患と関連する神経障害の例は、ポリオ後症候群を含む；遺伝性神経障害の例は、シャルコー-マリー-ツース病、レフサム病、無β-リポ蛋白血症、タンジアー病、クラッベ病、異染性白質萎縮症、ファブリー病、及びドゥジュリーヌ-ソッタ病を含む；さらに、毒性試薬によって引き起こされる神経障害の例は、ビンクリスチン、シスプラチン、メトトレキサート、または3’-アジド-3’-デオキシチミジンのような化学療法試薬を使用した治療によって引き起こされるものを含む。
ＮＧＦ製剤の治療上の有効投与量が、患者に対して投与される。ここでの用語、「治療上の有効投与量」は、それが投与されるものに対して効果を提供する投与量、または特に投与摂生において治療上の効果を提供する投与量を意味する。持続放出調製物の投与量は、治療される特定の患者に対して、インビボでＮＧＦの効果的な濃度を達成するのに必要なものであるが、投与量は、ＮＧＦ変異体のタイプ、所望の放出継続時間、標的の疾患、治療される動物の種類、及び患者の体調のような他の因子に従って変化する。正確な投与量は、治療される疾患に依存し、周知の方法を使用して当業者によって特定可能であろう。現在、ｒｈＮＧＦは、第ＩＩＩ相に進行中であり、糖尿病性またはＡＩＤＳ関連末梢神経障害を有する患者に対して皮下で投与されている。これらの臨床上の研究において使用される毎週の投与量は、臨床医が本発明のマイクロカプセル化ＮＧＦの投与に対する投与量を決定するために、適切な開始点を提供する。一般的に、本発明のＮＧＦ製剤は、約０．０１μｇＮＧＦ／体重のｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．０２から１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０３から５００μｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．５μｇ／ｋｇから１００μｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施態様においては、０．０３から１．０μｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１から０．３μｇ／ｋｇの投与量で与えられる。さらに本分野で周知なように、年齢、同様に体重、通常の健康状態、性別、食事摂生、投与時間、薬剤の相互作用、及び疾患の重篤性に対する調節が必要であり、当業者によって通常の実験で特定可能であろう。典型的に、臨床医は、ニューロンの機能を修復、維持、及び任意に再構成する投与量に到達するまで、本発明のＮＧＦ製剤を投与するであろう。この治療の進行は、簡便なアッセイによって容易にモニターされる。
第ＩＩ相の臨床試験の結果は、末梢神経障害疾患を有する患者が、一週間に３回の投与でそれぞれ０．３または０．１μｇ／ｋｇでｒｈＮＧＦを必要とすることを示唆する。これは、ｒｈＮＧＦの投与量当たり２１または７μｇのみが、体重７０ｋｇの平均的な患者に対して必要とされることを意味する。現在のｒｈＮＧＦの液体製剤は、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、１４２ｍＭ ＮａＣｌ中に２ｍｇ／ｍｌである。この投与情報は、ＮＧＦミクロスフェア製剤を使用した投与の開始点を提供する。
持続放出調製物が、一週間の長さの機能製剤である場合、ＮＧＦの投与量は、成人当たり約０．０００１から約１０ｍｇ／体重のｋｇの範囲から選択され得る。より好ましい投与量は、約０．００５から約１ｍｇ／体重のｋｇの範囲から適宜選択され得る。持続放出調製物の好ましい投与頻度は、ＮＧＦポリペプチドのタイプ、投与形態、放出の継続時間、標的の疾患、患者の動物種及び他の因子に依存して、一週間に一度から二週間に一度まで適宜選択され得る。
ここでの組成物は、懸濁形態において、０．０７から２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０８から１５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０９から１０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．１から２ｍｇ／ｍｌのＮＧＦ濃度を生産するために、ＮＧＦミクロスフェアの量を含むように調製される。好ましい実施態様として、ＮＧＦ濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌである。別の好ましい実施態様として、ＮＧＦ濃度は２．０ｍｇ／ｍｌである。末梢神経障害に苦しんでいるヒト患者に対する投与におけるこれらの組成物の使用のために、例えばこれらの組成物は、上記治療のために現在企図されている投与割合に相当する、約０．１ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌのＮＧＦを含んで良い。ＮＧＦは非常に抗毒性であり、臨床医によって決定されるように、もし必要であればより高い投与量が投与され得る。
持続放出調製物は、好ましくは室温または冷蔵して乾燥状態で貯蔵される。より好ましくは、持続放出調製物は、冷蔵して貯蔵される。用語、「室温」は、１５℃から２５℃を意味し、「冷蔵」は、１５℃より低い温度を意味する。
治療上のＮＧＦ組成物は一般的に、例えば皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈溶液バッグまたはバイアルといった滅菌出入口を有する容器内に入れられる。
本発明の別の実施態様として、好ましくは金属、より好ましくは亜鉛と複合体化した製薬学的有効量の神経成長因子を含む、本発明の持続放出製剤を含むバイアルまたは容器を含む、ＮＧＦ投与のためのキットが提供される。任意に、ミクロスフェアを再懸濁するための滅菌した、粘性の、生理学的に許容可能な溶液が提供される。例えば、０．３μｇ／ｋｇまたは０．１μｇ／ｋｇの投与量が使用される場合、１．５ｍｌの容量が簡便である。
ＮＧＦは任意に、ＮＴ−４／５，ＮＴ−３、及び／またはＢＤＮＦを含む他の神経栄養因子と組み合わされ、またはそれらと共に投与され、神経疾患のための他の一般的な治療薬と共に使用される。
ＮＧＦを含むミクロスフェアの有効量が、皮下、筋肉内、腹腔内、及び心房内の注射によって、粘膜（鼻腔内のような、または座剤によって）への投与によって、またはインシトゥ（in situ）の輸送によって、各種の医療上の疾患のＮＧＦを使用した治療のための周知のパラメーターに基づいて所望のＮＧＦの投与量を提供するために、患者に対して投与される。従って、本発明の製剤の投与は、皮下、静脈内、脳内、鼻腔内、皮膚浸透、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、直腸内、心室内、動脈内、または経眼を制限することなく含む、各種の方法において達成可能である。該製剤は、ＣＮＳの液体レザーバー内への点滴によって継続的に投与し得るが、ポンプ、レザーバーまたは移植のような本分野で周知の方法を使用して、丸薬注射も許容可能である。シリンジ、Ommaya（登録商標）レザーバー、Alzetポンプ等による、ｒｈＮＧＦの大脳室内（ＩＣＶ）投与が特に好ましい。傷の治療における例として例えば、該製剤は、溶液または噴霧として直接適用され得る。該ミクロスフェアはまた、移植のための所望の形態のペレットに圧縮しても良い。
注射可能なために、該ミクロスフェアは、好ましくは２０から９０ミクロンのサイズに篩別される。大量の篩別されたミクロスフェアは、懸濁物及び注射物のために適した量で小分けされる。該ミクロスフェアの懸濁物は、再懸濁攪拌、投与中止、及び注射の間に固化することを避けるために、注射が容易な一方で該粒子の懸濁物のまま維持される滅菌溶液として作製される。適切な粘度は、５％デキストラン−７０溶液と同じものである。皮下の注射のため、該ミクロスフェアは、任意に０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を使用して生理食塩水（９％ＮａＣｌ）中に５％デキストラン−７０において再懸濁され得る。
一般的に、主題となる発明の製剤は、安定な形態の調製物から減じることがない量で、有効で安全な製薬学的投与に適した量で、他の構成成分を含むことができる。例えば、当業者に周知である他の製薬学的に許容可能な賦形剤は、主題となる組成物の一部を形成し得る。これらは例えば、各種の膨張剤、さらなる緩衝剤、キレート化剤、抗酸化剤、共溶媒等を含む；これらの特別な例は、トリヒドロキシメチルアミン塩（「Ｔｒｉｓ緩衝液」）及び二ナトリウムＥＤＴＡを含むことができる。任意に、ＮＧＦの製剤は、生理学的に許容可能な担体、防腐剤、緩衝液、賦形剤、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、さらにトレハロースまたはマンニトールのような複数の賦形剤、またはＴｗｅｅｎ（登録商標）界面活性剤のような非イオン性界面活性剤、または安定剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences）を含むことができる。許容可能な担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、ここで教示される製剤においてＮＧＦの安定性を顕著には減少しないであろう。上記化合物は、アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基より小さい）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、ヒスチジン、メチオニン、グリシン、グルタミン、アルパラギン、アルギニン、またはリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストランを含むモノサッカリド、ジサッカリドまたは他の炭化水素；ＥＤＴＡのようなキレート化試薬；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成カウンターイオン；及び／またはポリソルバート２０または８０（Ｔｗｅｅｎ）のようなポリソルバート、ポロキサマー１８４または１８８のようなポロキサマー、Pluronic（登録商標）ポリオール、及び他のＰＥＧのようなエチレン／ポリプロピレンブロックポリマー等を含む。しかしながら、ここで報告されているように、界面活性剤は、ミクロスフェアからのＮＧＦの放出、及び３７℃でのＮＧＦの安定性を一般的には改良しない。任意に存在する場合、製薬学的に許容可能な界面活性剤は、好ましくはＴｗｅｅｎ２０またはプルロン酸（Ｆ８６）である。使用される量は、通常約０．００１％（ｗ／ｖ）から約３０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００５から０．０２％の範囲である。界面活性剤についての好ましい濃度は、０．０１％である。緩衝液は、炭酸塩、酢酸塩、リン酸塩、Ｔｒｉｓ、クエン酸塩、コハク酸塩、またはヒスチジン緩衝液を含む。存在する場合、緩衝液は最も利便的には、約２ｍＭから約１００ｍＭの範囲である。典型的には、乾燥ミクロスフェア製剤は、緩衝を必要としない。任意に、もし該製剤が製薬学的に許容可能な塩を含むならば、該塩は好ましくは塩化ナトリウムであり、好ましくはほぼ生理学的な濃度である。
該製剤は典型的に乾燥形態で提供されるため、防腐剤は典型的に必要ではない。しかしながら、ミクロスフェア懸濁物が、ポンプを使用するように、延長された時間で使用される場合、防腐剤が有用であろう。任意に本発明の懸濁製剤は、生理学的に許容可能な防腐剤を含み得る。いくつかの実施態様として、防腐剤の濃度は、０．１から２．０％、典型的にｖ／ｖの範囲である。適切な防腐剤は、製薬学の分野で周知なものを含む。ベンジルアルコール、フェノール、m-クレゾール、メチルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム（benzethonium chloride）、及びプロピルパラベンが好ましい防腐剤である。より好ましい防腐剤は、０．２−０．４％（ｗ／ｖ）フェノール及び０．７−１．５％（ｗ／ｖ）ベンジルアルコールである。防腐剤のタイプ及び濃度の範囲が重要ではない一方で、ベンジルアルコールは溶液中でのＮＧＦの安定性を増大することが報告されている。特に好ましいベンジルアルコールの濃度は、０．７から１．２％（ｘ／ｖ）、より好ましくは０．８から１．０％、特に好ましい濃度は０．９％である。
持続、制御放出ＮＧＦミクロスフェアは、特に末梢神経障害の治療について、ＮＧＦの丸薬注射に対していくつかの利点を提供する。特にこの製剤は、一週間当たり３回から１ヶ月当たり１または２回に、注射の数を減少するであろう。さらに低い破裂及び遅い毎日の放出（即ち低い初期放出）は、より低いＣｍａｘレベルを引き起こし、それ故局所的な炎症または痛覚過敏のような副作用を減少するであろう。さらに、神経損傷のような他の徴候の形成（脊髄または骨の損傷）は、ミクロスフェアを経たＮＧＦの局所的な輸送から利益を得るであろう。神経栄養因子は、ニューロンの生存を促進し、ニューロンの成長を促進することが観察されており、そのことが末梢神経障害の治療に有益であり、アルツハイマー病及びパーキンソン病のような脳の疾患の治療において有用性を有する。ＮＧＦの全身性の投与形態は血液脳障壁に浸透せず、ＮＧＦの毎日の注射は末梢神経障害を治療するために必要である一方で、本発明のミクロスフェア製剤を使用したＮＧＦの局所的または標的化輸送は、これらの疾患のより効率的な治療を許容する。末梢または大脳ニューロンに対するＮＧＦの局所的な輸送は、所望の機能部位でＮＧＦを継続的に放出する、本発明の生分解性ミクロスフェアを使用することで達成可能である。ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェアを使用する実施態様は安全であり、皮下空間または脳内の注射部位で効率的に局在化し、またはそこに制限され、それ故ＮＧＦの継続的な局所的供給をニューロンに輸送することが可能である。
以下の実施例は、説明のために提供され、制限のためではない。本明細書中の全ての引用文献の開示は、参考としてここで完全に取り込まれる。
実施例
実施例Ｉ
組換えヒトＮＧＦに対する長期機能的製剤の形成のために、ＮＧＦの持続放出のための生分解ポリマーマトリックスの使用を調べた。この応用のために使用されるポリマーは、ポリ（乳酸／グリコール酸）またはＰＬＧＡと称される、乳酸とグリコール酸のコポリマーであった。このポリマー内にＮＧＦを取り込むために、ＰＬＧＡを水と混和しない溶媒に溶解しなければならない。ＰＬＧＡの溶解のために一般的に使用される溶媒は、水への非混和性及びＰＬＧＡの溶解性の両者を提供する塩化メチレンである。しかしながら、酢酸エチルが好ましい。一般的に、ＮＧＦ−ＰＬＧＡミクロスフェアの生産のために、任意にポリオール安定剤及び／または界面活性剤の存在する水性緩衝溶液中にＮＧＦを混合し、凍結乾燥した。凍結乾燥化ＮＧＦ粉末に対して、任意に炭酸亜鉛のような放出調節剤を加えた。次いでＮＧＦ粉末を、ＰＬＧＡを含む酢酸エチルの溶液に加えた。初期の研究において、該ポリペプチドは、製粉化凍結乾燥粉末の形態で加えられた。ポリペプチドを加えた後、次いで酢酸エチル溶液を、簡単にホモジェナイズした。一つの方法として、該溶液を乳化容器に加え、それによってＮＧＦを含むＰＬＧＡミクロスフェアの共存形成物を有する塩化メチレンの抽出を引き起こした。好ましい方法として、該溶液を霧状にし、霧状化水滴を凍結させる。酢酸エチルを該ミクロスフェアから抽出し、次いで該ミクロスフェアを微量の抽出溶媒を除去するために乾燥させる。篩別は、該ミクロスフェアをサイズ分類するために使用可能である。次いでこれらのミクロスフェアから放出されたポリペプチドを、該ミクロスフェアからの放出ＮＧＦの完全性を測定するために研究した。放出ＮＧＦの評価を、分析的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、同様に他の方法によって実施した。
物質
組換えヒト神経成長因子（ＮＧＦ）を、チャイニーズハムスター卵巣細胞において生産し、以前に記載されたように逆相（ＲＰ−ＨＰＬＣ）及びイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）によって精製した（Schmelzer等（J.Neurochem.59:1675-1683（1992））。ＨＰＬＣ勾配はアセトニトリルを使用し、ＴＦＡをＰＲ−ＨＰＬＣのために使用した。全ての他の化学物質は、ＵＳＰグレードであった。滅菌タイプＩ、クリアガラス、２ｃｃバイアルを、Wheatonから購入し、シリコーン化、テフロン処理、ブチルゴム栓を使用した。
分析方法
ＵＶ分析。ｒｈＮＧＦ濃度を、ＨＰ ８４５２Ａ ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を使用して、２４０から３６０ｎｍでスキャンすることによって定量した。製剤化緩衝液を、該装置のブランクにするために参考として使用し、ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を、（Ａ２７８−３２０）／１．５から計算し、式中１．５はｍＬ（ｍｇ．ｃｍ．）でのｒｈＮＧＦの吸光係数である。
ｒｈＮＧＦを使用したＢＣＡ（バイシンコニニックアッセイ（bicinchoninic assay））を、インビトロで該ミクロスフェアから放出されたＮＧＦのＮＧＦタンパク質濃度を測定するために実施した。
ＨＰＬＣ分析：
サイズ排除クロマトグラフィー。サイズ排除ＨＰＬＣを、ｒｈＮＧＦ製剤中の凝集形成物を検出及び定量するために使用した。この方法を使用して、ｒｈＮＧＦは、８．６分の抽出時間でダイマー（主ピーク）として溶出する。ダイマー主ピーク上のリーディングショルダー（leading shoulder）の出現は、より高い分子量の凝集物の存在を示す。サイズ排除ＨＰＬＣ（「ＳＥＣ−ＨＰＬＣ」）を、Perkin Elmer LC 90 Spectrophotometric UV Detector及びTosohas TSK 2000 SWXL、５μｍ（７．８×３００ｍｍ）カラムを備えたPerkin Elmer Series 410 Bio LC Pumpを使用して実施した。このＳＥＣカラムを、０．２Ｍリン酸カリウム、０．４５Ｍ塩化カリウム移動相、ｐＨ７．０を使用して０．５ｍｌ／分で稼働した。ＳＥＣのために、ＵＶ検出を２８０ｎｍで実施した；ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＩＥＣのために２１４ｎｍで実施した。
ＥＬＩＳＡ。このアッセイは、０．３９−６．２５ｎｇ／ｍＬの範囲を有する。各ｒｈＮＧＦサンプルを、５及び２．５ｎｇ／ｍＬの二つの標的濃度にアッセイ希釈液で希釈し、各希釈物を三重にアッセイした。ｍｇ／ｍＬでのタンパク質濃度を、同じアッセイにかける−７０℃の中間参考スタンダードに標準化した。
ラジオレセプターアッセイ（ＲＲＡ）。このアッセイは、ＰＣ−１２細胞上へのレセプター結合に対する１２５Ｉ−ｒｈＮＧＦと競合する非ラベル化ｒｈＮＧＦの能力を測定する。各ｒｈＮＧＦサンプルを、２５及び１２．５ｎｇ／ｍＬの二つの標的濃度にアッセイ希釈液で希釈し、各希釈物を三重に分析した。ｍｇ／ｍＬでのタンパク質濃度を、同じアッセイにかける−７０℃の中間参考スタンダードに標準化した。
ＰＣ−１２細胞生存バイオアッセイ。このアッセイは、血清を含まない培養条件の下で、レセプターに結合し、ＰＣ−１２細胞の生存を引き起こす細胞間シグナルを生産するｒｈＮＧＦの能力を測定する。ｍｇ／ｍＬでの活性なタンパク質濃度を、同じアッセイにかける−７０℃の中間参考スタンダードに標準化した。
ニューロン成長アッセイ。ＮＧＦの生物学的活性を、Greeneによって開発されたＰＣ１２アッセイを使用して測定した（クローン化褐色細胞腫細胞系を使用した神経成長因子活性のための定量的バイオアッセイ。Brain Res.133:350-353（1977）及びSchmelzer等,（J.Neurochem.59:1675-1683（1992）に記載されたように修飾した）。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。サンプルを、NovexトリシンＳＤＳサンプル緩衝液内で希釈し、５０℃で１時間インキュベーションした。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、１０％アクリルアミドを含むNovexトリシンゲル上で実施し、引き続きクマシーブルー染色を実施した。分子量を、Bio-Rad低分子量マーカーを使用して見積もった。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、モノマーは１３．５ｋＤａであり、ダイマーは約２６ｋＤでバンドを形成した。
３７℃でのＮＧＦの安定性を、ＮＧＦの凝集物の程度によって部分的に評価した。ネズミＮＧＦに対するダイマー／モノマー平衡定数は、ｐＨ４−７で１０−１３Ｍより小さい（Bothwell等,J.Biol.Chem.258:8532-8536（1977）;Timm等,Biochem.33:4667-4676（1994）;Moore等,Neurobiol.5:369-381（1975）;Timm等,Prot.Sci.1:236-244（1992））。それ故、ＮＧＦは、中性のｐＨのＳＥＣにおいてダイマーとして主にアッセイした。少量の凝集ＮＧＦが、分子量スタンダードに基づいてテトラマーとして同定可能である。このピークのリーディングショルダーは、より大きい凝集物を示す。
該ミクロスフェアからのＮＧＦのインビトロ放出を、放出緩衝液：１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１３６ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ ポリソルバート２０、０．０２％ アジ化ナトリウム、ｐＨ５．５におけるインキュベーションによって測定した。「初期放出」期間は、１時間として定義した。
方法
ＮＧＦタンパク質は、ｐＨ５．５で最大の物理化学的安定性を有することが観察され、それ故５ｍＭヒスチジン、ｐＨ５．５において製剤化された（De Young等,Biophys.J.66:A401（1994））。各種の賦形剤を、この製剤緩衝液に加え、次いで該製剤を以前に記載されたように酢酸エチルを使用して処理した（Cleland,J.L.&Jones,A.J.S.Pharm.Res.13:1464-1475（1996））。試験された製剤の最も安定なものを、液体窒素内で超音波ノズルを経て該溶液を送り出し、凍結小滴を凍結乾燥することによって噴霧凍結乾燥した。図１参照。
最終のタンパク質粉末を、酢酸エチル中の５０：５０ラクチド：グリコリドＰＬＧＡ（０．２ｄＬ／ｇの粘度、親水性末端基を有する、Boehringer Ingelheim,RG502H）の溶液中でホモジェナイズした。ｒｈＮＧＦの放出に対する亜鉛の効果を、ポリマー−有機溶媒溶液に対する固体炭酸亜鉛（＜５μｍ粒子）の異なる量を加えることによって分析した。懸濁物を、液体窒素および凍結エタノールを含む容器内に超音波ノズルを経て送り出した（Johnson等,Nature Medicine,2:795-799（1996））。−７０℃に温めた後、エタノールを２−３日かけて該ミクロスフェアから酢酸エチルと抽出した。次いで該ミクロスフェアを、エタノールを除去するために濾過し、乾燥させた。
該ミクロスフェアの分析を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１３６ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５、または１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４で、両者の緩衝液中に０．０２％ポリソルベート２０及び０．０２％アジ化ナトリウムを有するものの中で、インキュベーションによってインビトロで実施した。放出の研究を、以前に記載されているように実施した（Cleland等,Pharm.Res.13:1464-1475（1996））。ＰＬＧＡミクロスフェア中のｒｈＮＧＦの積み込み量を、１Ｎ ＮａＯＨ中での溶解及び２８４ｎｍでの吸光度で測定した（Ｅ＝１．５４５）ｍｇ／ｍｌ）−１ｃｍ−１）。
結果
完全な天然のｒｈＮＧＦの放出を評価するために、トレハロース、ショ糖、マンニトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、３３５０Ｄａ）及びプルロン酸Ｆ６８（ＰＦ６８）を、酢酸エチル中でのｒｈＮＧＦを安定化する能力に対してスクリーニングした。安定化試験の結果が、図２及び３に表されている。最も安定な製剤は、５ｍｇ／ｍＬ ｒｈＮＧＦ及び５ｍｇ／ｍＬトレハロースより成る。この製剤を、生理的条件でのインキュベーションの間、ｒｈＮＧＦの凝集を防ぐのに必要である界面活性剤の存在下または非存在下で使用した。ＰＬＧＡミクロスフェアを、表１に示されるような安定なｒｈＮＧＦ製剤及び異なる量の炭酸亜鉛を使用して生産した。

固体炭酸亜鉛を加えることは、該ミクロスフェアからの初期放出（１時間のインキュベーション）を大きく減少した。この結果は、可逆的非共有凝集物を形成するために、亜鉛に対するｒｈＮＧＦの結合（モノマー当たり一つの亜鉛の結合）によって引き起こされ得る（Holland等,J.Mol.Biol.239,385-400（1994））。同様の結果が、別の亜鉛結合タンパク質、ヒト成長ホルモンの放出を調節するために炭酸亜鉛の使用について報告された。亜鉛を含むｒｈＮＧＦ ＰＬＧＡ製剤はまた、図４に示されるようにより遅い全体の放出速度を有した。これらのミクロスフェアは、１４日内にカプセル化ｒｈＮＧＦの全てを放出する一方で、亜鉛を含まないミクロスフェアは、７日以内にほとんどのｒｈＮＧＦを放出した。放出速度は、タンパク質製剤に対する界面活性剤の添加によって影響されなかった（図５）。
別の重要な考慮事由は、３７℃での該ミクロスフェアからの放出の間のｒｈＮＧＦの安定性であった。該ミクロスフェアから最初に放出されたｒｈＮＧＦはわずかに凝集し（９４％天然のダイマー）、タンパク質製剤に対する界面活性剤の添加は、天然のダイマーの量を顕著には増大しなかった（図６参照）。レセプターを結合するｒｈＮＧＦの能力もまた減少した。該ミクロスフェアから放出される天然のダイマーの分画におけるさらなる減少が、３７℃で７−１０日間のインキュベーションの後に観察され、ｒｈＮＧＦが低いｐＨの放出緩衝液（ｐＨ５．５）の場合でさえ、これらの条件の下では安定ではないことを示唆した。
この実施例におけるＰＬＧＡミクロスフェア製剤は、７から１４日に渡るｒｈＮＧＦの継続的な放出を提供した。放出の速度は、ポリマー相に固体亜鉛を加えることによって調節された。亜鉛及びｒｈＮＧＦは、ＰＬＧＡミクロスフェアから遅れて解離する安定な複合体を形成し得る。界面活性剤の存在下および非存在下でのトレハロース製剤が、スクリーニング研究において良好な安定性を提供するように見えた一方で、それは放出の期間に渡る天然のｒｈＮＧＦの放出を引き起こさなかった。これらの研究は、ミクロスフェアにおけるＮＧＦの制御放出を示す一方で、放出の期間を通じた天然のダイマーの放出を確保するために、ＮＧＦの安定性を維持する製剤における改良が、ここに提示される。
実施例ＩＩ
実施例Ｉにおけるインビトロ放出研究は、カプセル化ｒｈＮＧＦが凝集を経て分解されたことを示したため（３７℃で、該ミクロスフェアから放出されたｒｈＮＧＦは、ＳＥＣによって測定したところ、１０日間のインキュベーションの後、凝集した−−８５％の天然のダイマー）、新規の予備製剤化を使用した。この新規の予備製剤化において、金属イオンは、生分解性ポリマーと混合する前に、ｒｈＮＧＦに対して複合体化された。驚くべきことに、該ミクロスフェアからの放出ＮＧＦの安定性（完全性）における顕著な改良が観察された。
酢酸亜鉛を、４ｍＭ ＮａＣｌにｐＨ７．４で製剤化されたｒｈＮＧＦの溶液に加えた。酢酸亜鉛の濃度を増大すると、ＳＥＣによって測定したところ、凝集形成物の量が減少した（図７）。図７は、カプセル化の前の凍結乾燥前後の亜鉛含有ＮＧＦ溶液のモノマーパーセントとして完全性を表す。５及び３７℃で液体としてインキュベーションされた亜鉛含有ｒｈＮＧＦ溶液は、貯蔵の４週間後に乳白色であった。対照的に、同じ貯蔵条件の下で、凍結乾燥サンプルは、再構成の後沈降物を形成した。ｒｈＮＧＦ−Ｚｎ複合体の形成のために必要とされる最小の亜鉛の量を決定するために、各種の亜鉛に対するタンパク質のモル比を有する凍結乾燥ｒｈＮＧＦサンプルの沈降物を、遠心分離によって除去し、上清に残存しているタンパク質濃度（亜鉛複合体を含まない）をＵＶによって測定した。図８に示されているように、凍結乾燥ｒｈＮＧＦの８０％より多くが、５℃で１：６及び１：８（ｒｈＮＧＦ：酢酸亜鉛）のモル比で酢酸亜鉛と複合体形成した。かくして、図８に表されているように、完全性の別の指標は、亜鉛と複合体形成し、カプセル化の前に凍結乾燥前後で溶液中に残存しているＮＧＦの量である。観察されるように、３７℃で４週間後、カプセル化の前にＮＧＦ溶液に加えられた金属イオンは、ＮＧＦダイマーの完全性を維持するのに役立つ。これらの発見は、溶液を乾燥し、さらなる放出調節剤またはバイオポリマーと混合する前に、ＮＧＦを結合する金属イオンを使用してＮＧＦの水溶液において予備製剤化することが、ミクロスフェア平衡化方法の間、及びその後のインビトロでの放出の間、カプセル化ｒｈＮＧＦの安定性を改良し確保する手段を提供する。かくして、本実施例は、ｒｈＮＧＦが、カプセル化の前に溶液中の酢酸亜鉛を使用して該タンパク質を複合体化することによって安定化し得ることを示す。
この予備製剤化をさらに特徴付けした。ＣＨＯ細胞中で生産された精製ｒｈＮＧＦを、４ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ７．４中で５．５ｍｇ／ｍＬで液体として製剤化した。酢酸亜鉛を１：１０（ｒｈＮＧＦ：酢酸亜鉛）のモル比でｒｈＮＧＦ溶液中に加えた。全ての例を通じて、ｒｈＮＧＦの１モルは、活性なダイマー形態の１モルを意味する。亜鉛含有ｒｈＮＧＦ溶液を、液体窒素中で噴霧凍結乾燥し、マイクロエマルションに対する固体ｒｈＮＧＦを生産するために凍結乾燥した。次いで、この固体タンパク質（１０％ｗ／ｗ）を、懸濁物を生産するために、酢酸亜鉛中に溶解されたＰＬＧＡ（ＲＧ５０２Ｈ、５０：５０，非ブロック化、１２ｋＤａ）を使用してホモジェナイズした。炭酸亜鉛（６％ｗ／ｗ）もまた、該ポリマー溶液に加え、固体ｒｈＮＧＦを加える前にホモジェナイズした。ホモジェナイゼーションの後、タンパク質−ポリマー懸濁物を、ｒｈＮＧＦ／ＰＬＧＡミクロスフェアを生産するために、液体窒素及び冷蔵エタノール中で噴霧凍結乾燥した。
インビトロ放出研究を、遠心分離限界濾過装置を使用して実施した。１０ｍｇのミクロスフェアを、該装置の除去可能レザーバーに加え、放出緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）の３００ＦＬを使用して混合した。該装置を３７ＥＣでインキュベーションした。放出タンパク質を遠心分離によってサンプル化した後、該装置を放出緩衝液を使用して再び補充した。放出ｒｈＮＧＦのタンパク質濃度を、バイシンコニニック酸（Bicinchoninic acid）（ＢＣＡ）測定を使用して測定した。天然のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、再構成固体及び放出ｒｈＮＧＦの完全性（凝集していないパーセント）を測定するために使用した。
ｒｈＮＧＦの安定化に対する亜鉛の効果を、実施例Ｉに記載されたようなタンパク質製剤（５ｍＭヒスチジン緩衝液、ｐＨ５．０）における酢酸亜鉛を添加しないで調製されたミクロスフェアを使用して、放出プロフィールと放出ｒｈＮＧＦの完全性を比較することによって調べた。この特別な実施例において、好ましいモル比である１：１０（ｒｈＮＧＦ：酢酸亜鉛）が選択され、それは該懸濁物を３７℃で貯蔵した場合、この最小の比で該タンパク質の凝集を顕著に減少することが観察された。タンパク質製剤に対する酢酸亜鉛の添加は、図９に示されるように全体のインビトロでの放出プロフィールに影響しなかった。タンパク質相に対する酢酸亜鉛の存在及び不存在のｒｈＮＧＦ／ＰＬＧＡ製剤の両者は、約１％の低い初期破裂を有した。両製剤から調製されたミクロスフェアは、１４日以内で全てのカプセル化ｒｈＮＧＦを放出した。
３７℃での該ミクロスフェアからの放出の間のｒｈＮＧＦの安定性に対する酢酸亜鉛の効果もまた研究した。図１０に示されるように、酢酸亜鉛を含むｒｈＮＧＦ／ＰＬＧＡ製剤の放出タンパク質は、１０日間で３７℃でのインキュベーションの後９３％の天然のダイマーを有した一方、酢酸亜鉛を含まない放出タンパク質製剤は、８５％の天然のダイマーを有した。実際、酢酸亜鉛を含まないＰＬＧＡ製剤から初期に放出されたｒｈＮＧＦは、わずかに凝集した（９４％の天然のダイマー）。
この実施例の結果は、タンパク質製剤に対する酢酸亜鉛の添加が、ｒｈＮＧＦの凝集を顕著に減少し、かくしてカプセル化及び該ミクロスフェアからの後の放出の間で該タンパク質を安定化することを示す。該安定化は、安定な凝集物を形成するために、亜鉛を使用したｒｈＮＧＦの複合体化によって引き起こされるであろう。固体の亜鉛（６％ｗ／ｗ炭酸亜鉛）もまた、カプセル化ｒｈＮＧＦの初期破裂を減少するために、カプセル化の間でポリマー相に加えられたが、それは該タンパク質の安定化を助長しなかった。さらに、Ｚｎ：ｒｈＮＧＦ複合体は、高いｐＨ（ｐＨ７．４）でのみ形成され、低いｐＨ（ｐＨ５．５）では解離する。３７℃で、酢酸亜鉛を含む重炭酸製剤（ｐＨ７．４）におけるｒｈＮＧＦは、図１０に示されるように酢酸亜鉛を含まないコントロール液体製剤（５ｍＭヒスチジン、ｐＨ５．５）におけるタンパク質と同程度に安定であった。以前の研究（データは示さず）は、ｒｈＮＧＦが亜鉛を含まないｐＨ７．４では安定でないことを示した。これは、ｒｈＮＧＦが亜鉛（金属イオン）複合体を形成することによって安定化され、金属イオンの非存在下では、ｒｈＮＧＦは高いｐＨのような場合急速に分解することを示す。結論として、ここで教示されるように、酢酸亜鉛を加えたｐＨ７．４での４ｍＭ重炭酸ナトリウムにおいて製剤化されたｒｈＮＧＦは、カプセル化および３７℃（生理的温度）での放出の間、該タンパク質の安定性を改良した。この製剤におけるｒｈＮＧＦは、亜鉛複合体の形成によって安定化された。
典型的に、ＮＧＦ−金属溶液は、好ましくは液体窒素内に該溶液を製粉化することによって噴霧凍結乾燥され、約７０℃以下の温度に凍結小滴を配置し、その後窒素を除去し、典型的には約５ミクロンより小さい非常に均一な粒子のＮＧＦ−金属塩粉末を形成するために、凍結小滴または結晶の凍結乾燥を実施する。ＮＧＦ−亜鉛粉末は、好ましくは実施例Ｉに記載されたように、ここで教示される制御放出ミクロスフェアに加工される。該ミクロスフェア内に積み込まれたＮＧＦの量は、典型的に１０％（ｗ／ｗ）である。
注射可能とするために、該ミクロスフェアは好ましくは２０から９０ミクロンのサイズに製粉化される。大量の製粉化ミクロスフェアは、再懸濁及び注射に適した量でバイアルに入れられる。皮下の注射のため、該ミクロスフェアは、任意に０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水（９％ ＮａＣｌ）中の５％デキストラン−７０において再懸濁される。代わりに、ｒｈＮＧＦ／亜鉛／ＰＬＧＡミクロスフェアを再懸濁し、３−４週間に渡るｒｈＮＧＦの継続的な放出のため脳内に移植Ommayaレザーバー（等）内で注射する。

Claims (27)

1. 減少したＮＧＦ凝集特性を有するＮＧＦの制御持続放出のためのミクロスフェア製剤の製造方法であって、ＮＧＦを結合して制御持続放出が可能な金属のＮＧＦ安定化金属塩と溶液中のＮＧＦを混合することを含み、ここでＮＧＦ：金属のモル比が１：４ないし１：５０であり、並びにＮＧＦ及びＮＧＦを結合して制御持続放出が可能な金属を含むミクロスフェアを形成するために、ＮＧＦ−金属混合物をマイクロカプセル化することを含み、前記金属が亜鉛であることを特徴とする製造方法。
2. 溶液中のＮＧＦ：金属のモル比が、１：６から１：２０であることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 溶液中のＮＧＦ：金属のモル比が、１：８から１：１４であることを特徴とする請求項２記載の方法。
4. 該金属が、鎖式カルボン酸塩形態であることを特徴とする請求項１記載の方法。
5. 該塩が炭酸塩又は酢酸塩であることを特徴とする請求項４記載の方法。
6. 該金属塩が、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、フッ化亜鉛、硫化亜鉛、硝酸亜鉛、チオシアン酸亜鉛、炭酸亜鉛、酢酸亜鉛、グリコール酸亜鉛、乳酸亜鉛、タルトロン酸亜鉛、安息香酸亜鉛、サリチル酸亜鉛、またはフェノールスルホン酸亜鉛であることを特徴とする請求項１記載の方法。
7. 該金属塩が、酢酸亜鉛または炭酸亜鉛であることを特徴とする請求項６記載の方法。
8. 該ＮＧＦがヒト１１８ＮＧＦであることを特徴とする請求項１記載の方法。
9. 該ＮＧＦがチャイニーズハムスター卵巣細胞から分泌されることを特徴とする請求項１記載の方法。
10. 該混合物がｐＨ６から８であることを特徴とする請求項１記載の方法。
11. さらに７０，０００ｋＤより小さい分子量を有するポリオール安定剤を混合することを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
12. 該ポリオールが糖アルコールであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
13. 該糖がトレハロース、マンニトール、またはショ糖であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
14. マイクロカプセル化が、ＮＧＦ−金属混合物と生分解性ポリマーを混合し、該混合物をポリマー性ミクロスフェア内に製剤化することを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
15. さらに、生分解性ポリマーと混合する前に、ＮＧＦ−金属溶液を乾燥することを含むことを特徴とする請求項１４記載の方法。
16. さらに、乾燥ＮＧＦ−金属混合物、またはＮＧＦ−生分解性ポリマー混合物内に、放出安定剤を混合することを含むことを特徴とする請求項１４記載の方法。
17. 該マイクロカプセル化が、ＮＧＦ−金属溶液を乾燥し、有機溶媒中に生分解性ポリマーを分散させ、該生分解性ポリマー有機溶媒混合物と乾燥ＮＧＦ混合物を混合し、小滴を形成するためにＮＧＦ−生分解性ポリマー混合物をスプレーし、ＮＧＦを含むミクロスフェアを形成するために該小滴から有機溶媒を除去することを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
18. さらに、乾燥ＮＧＦ−金属混合物と放出調節剤を混合することを含むことを特徴とする請求項１７記載の方法。
19. 有機溶媒が酢酸エチルまたは塩化メチレンであることを特徴とする請求項１７記載の方法。
20. 該ミクロスフェアが１から１０００ミクロンであることを特徴とする請求項１記載の方法。
21. 該ＮＧＦがミクロスフェアにおいて５から２０重量％であることを特徴とする請求項１記載の方法。
22. 該生分解性ポリマーが、ポリラクチドまたはポリ（ラクチド−コ−グリコリド）であることを特徴とする請求項１記載の方法。
23. さらに、ペレットを形成するために該ミクロスフェアを圧縮することを含む請求項１記載の方法。
24. 一日を上回る期間に渡る放出によるＮＧＦの治療上の有効量の投与用の、３００ミクロンより小さい直径を有し、亜鉛である金属が複合化している０．１から５０重量％のＮＧＦを含む生分解性ポリマー状ミクロスフェア医薬の製造のためのＮＧＦの使用。
25. 生分解性ポリマー状ミクロスフェア医薬が末梢神経障害の治療のためのものであることを特徴とする請求項２４記載の使用。
26. ＮＧＦの持続制御放出のための１０００ミクロンより小さい直径を有するポリマー状ミクロスフェア製剤であって、ＮＧＦを結合するＮＧＦ安定化金属と複合体化した０．１から５０重量％のＮＧＦを含む生分解性ポリマー状ミクロスフェアを含み、一日を上回る期間に渡りＮＧＦを放出可能であり、前記金属が亜鉛であることを特徴とする製剤。
27. 活性物質としてＮＧＦを含むマイクロカプセル化組成物中でＮＧＦの安定性を増大する方法であって、マイクロカプセル化のための溶液を乾燥する前に、ＮＧＦ水溶液内にＮＧＦ安定化および結合金属を取り込ませることを含み、前記金属が亜鉛であることを特徴とする方法。

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