KR20190092629A - 감수성 화합물을 안정화시키는 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

세포 배양 배지와 같은 조성물들에서, 에탄올아민, 성장인자, 및 비타민 등과 같은 불안정 성분들의 안정성을 증가시키거나, 보호하는 방법들이 제공된다. 불안정 화합물의 안정성은 불안정 화합물의 화학물질들로의 유도체화 (derivatization)에 의해, 또는 불안정 화합물의 격리화 (sequestering)에 의해 증가된다. 격리화는 미세캡슐 내의 피막화에 의해, 또는 격리화 제제들의 사용에 의해 시행될 수 있다. 피막화는 미세캡슐 내에서 감수성 화합물들의 덴드리머 복합체들의 피막화를 포함하고, 이에 의해 보호되었던 감수성 (susceptible) 화합물의 조절된 방출을 제공한다. 이들 방법들은 불안정 화합물들을 포함하는 조성물들의 저장 조건을 개선하고 연장하며, 저온이 아닌 실온에서 건조 배지 제형물들과 같은 불안정 화합물들을 포함하는 조성물들의 운반 및 취급을 개선할 수 있고, 이로 인해 운반 비용을 감소시킨다. 건조 형식 배지와 같은 조성물들에서 불안정 화합물들의 안정화는 녹색 기술학에 대한 기여로서 전망될 수 있다.

Description

감수성 화합물을 안정화시키는 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR STABILIZING SUSCEPTIBLE COMPOUNDS}

본 출원은 2011년 2월 7일자로 제출된 미국 가특허 출원 제 61/440,237호의 유익을 주장하고, 이의 발명은 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있다.

일정 화학물질들은 수분의 존재 시, 또는 제형물 내의 다른 성분들과의 점진적 상호작용으로 인해, 심지어 그들이 건조 제형물들로 있을 때라도 시간 경과 시 분해되는 것으로 알려져 있다. 이것은 약제학적 산업, 식품 산업, 및 심지어 세포 배양 배지 산업에서도 공통적으로 관찰되고, 이것이 제품의 더 짧은 보관 기간 (shelf-life)에 기여하게 된다. 예를 들어, 에탄올아민은 세포 배양 배지에서 감수성 화합물이고 시간 경과 시 분해되어, 세포 배양 배지의 더 짧은 보관 기간에 기여한다. 2-아미노에탄올 또는 모노에탄올아민으로도 역시 알려져 있는 에탄올아민은 아민기 및 하이드록실기 둘 다의 존재를 특징으로 하는 알칸올아민이고, 다음의 화학적 구조를 가진다:

에탄올아민은 화학 산업에서 세제, 약제, 및 화장품에서의 성분으로서 공통적으로 사용되고 있다. 예를 들어, 이것은 용해도, 환원도, 색소 분산, 및 pH 안정성을 증진하도록 수계 및 용매계 코팅들 둘 다에 사용된다. 에탄올아민은 금속 성분들의 부식을 방지하도록 수 처리 산업에서도, 보다 상세하게는 발전소들의 증기 순환들에서 역시 사용된다. 이것은 천연 및 정련 기체 공정들에서 기체 증기들로부터 황화수소 및 이산화탄소와 같은 산성 성분들을 세정하거나 제거하는 데도 역시 사용된다. 에탄올아민은 암모니아와 에틸렌 산화물의 반응에 의해 디에탄올아민 및 트리에탄올아민의 추가적인 이차적 산물들과 함께 생산된다.

세포 배양 배지들은 조절되는, 인위적인 또한 시험관내 환경에서 세포들을 유지하고 성장시키는 데 필요한 영양분들을 공급한다. 배지 제형물들은 박테리아 세포들, 또한 동물 및 식물들 등과 같은 진핵 세포들을 포함하는 많은 세포 유형들을 배양하는 데 사용되어 왔다. 에탄올아민은 진핵세포 배양 배지들의 유용한 성분이고, 감수성 성분이기 때문에 일반적으로 나중에 보충된다. 에탄올아민은 그의 낮은 안정성 때문에 소정의 조성물들에서 문제가 될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지들에서, 아미노산의 존재 시 에탄올아민은 신속하게 분해된다. 이러한 불안정성은 건조 분말 세포 배양 배지들을 제조하는 공정 동안 만나게 되는 것 같은 따뜻한 환경들에서 증가하고, 에탄올아민 분해 및 세포 배양 배지들의 감소된 보관 기간을 유도한다. 유사하게, 비타민, 인슐린 같은 성장인자, 및 사이토카인 등과 같은 많은 세포 배양 성분들은 배지 제형물들에서도, 특히 아미노산을 포함하는 다양화된 반응성을 갖는 60 내지 100개 서로 다른 화학물질들을 포함할 수 있는 단일 성분 건조-형식 배지 제형물들에서 역시 불안정할 수 있다.

세포 배양 배지 제형물들, 특히 단일 성분 세포 배양 배지 제형물들, 건조-형식 배지 제형물들 등에서 존재하는 불안정 (labile) 성분들을 안정화하고/거나 보호하기 위한 필요성이 존재한다.

본 발명은, 이에 제한되는 것은 아니지만 세포 배양 배지, 세포 배양 보충물, 약제, 영양제들, 식품 보충물들, 비타민 강화된 제형물들, 화장품, 세제 등을 포함하는, 조성물에서 불안정 화합물 또는 성분, 민감성 또는 감수성 성분 또는 화합물 (이들 용어들은 상호교환적으로 사용될 수 있음)의 안정성을 증가시키거나 보호하는 방법들을 제공한다.

따라서, 한 가지 구현예에서, 본 발명은 보호된 불안정 분자를 포함하는, 세포 배양 조성물 같은 조성물에 관한 것이고, 보호된 불안정 분자는 세포 배양 조성물에서 세포 배양 성분과의 유해 반응이 방지된다. 소정의 구현예들에서, 세포 배양 조성물은 건조-형식 세포 배양 분말일 수 있는 한편, 다른 예에서 이것은 액체 세포 배양 배지일 수 있다. 좀 더 나아간 구현예에서, 보호된 불안정 분자는 에탄올아민, 성장인자, 비타민, 사이토카인 등 같은 분자들로 이루어진 그룹 중의 임의의 불안정 분자로부터 선택될 수 있다. 일정 구현예들에서, 불안정 분자는 불안정 분자의 유도체화 (derivatization)에 의해 또는 불안정 분자의 격리화 (sequesteration)에 의해 보호될 수 있다. 본 구현예의 한 가지 관점에서, 불안정 분자는 에탄올아민이다. 본 구현예의 또 다른 관점에서, 보호된 불안정 분자는 인슐린 같은 성장인자, 또는 B12 같은 비타민, 또는 티아민 등일 수 있다.

'불안정 (labile) 분자, 성분 또는 화합물', 또는 '감수성 (susceptible) 분자, 성분 또는 화합물'이란, 분해 또는 동일한 조성물에서 다른 성분들과 유해한 상호작용의 경향이 있는 것, 예를 들어 배양 배지, 보충물, 약제, 영양제들, 식품 보충물들, 비타민 강화된 제형물들, 화장품, 세제 등과 같은 조성물들에서 에탄올아민 같은 폴리아민, 비타민, 성장인자 등을 의미하고, 이들 성분들은 동일한 조성물 내의 다른 화학물질들과 유해한 상호작용들로 인해 신속하게 또는 저장 동안의 시간 경과에 따라 분해된다.

상기 구현예의 좀 더 나아간 관점에서, 세포 배양 조성물은 보호된 불안정 분자를 포함하고, 상기 보호된 불안정 분자는 세포 배양 조성물에서 증진된 안정성을 나타내고, 상기 불안정 분자는 에탄올아민이다. 좀 더 나아간 구현예에서, 세포 배양 조성물은 건조-형식 세포 배양 분말 또는 액체 세포 배양 배지일 수 있다.

바람직한 구현예에서, 에탄올아민은 유도체화 (derivatization)에 의해 또는 격리화 (sequesteration)에 의해 보호된다. 유도체화는 당 알코올, 또는 아미노 당, 또는 유론산, 또는 인산화된 당과의 반응에 의할 수 있다.

좀 더 나아간 구현예에서, 당 알코올은 알리톨, 알트리톨, 프럭티톨, 갈락티톨, 글루시톨, 굴리톨, 이디톨, 만니톨, 소르비톨, 탈리톨, 타가티톨, 아라비니톨, 리비톨, 리불리톨, 자일리톨, 자일루리톨, 라이지톨, 에리트루리톨, 에리트리톨, 및 트레이톨로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

보다 또 다른 구현예에서, 아미노 당은 알로사민, 알트로사민, 프럭토사민, 갈락토사민, 글루코사민, 굴로사민, 이도사민, 만노사민, 소르보사민, 탈로사민, 타가토사민, 아라비노사민, 리보사민, 리불로사민, 자일로사민, 자일룰로사민, 라이조사민, 에리트룰로사민, 에리트로사민, 및 트레오사민으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 유론산은 알루론산, 알트루론산, 프럭투론산, 갈락투론산, 글루쿠론산, 굴루론산, 이듀론산, 만누론산, 소르부론산, 탈루론산, 타가투론산, 아라비누론산, 리부론산, 리부루론산, 자일루론산, 자일룰루론산, 라이주론산, 에리트룰루론산, 에리트루론산, 및 트레우론산으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

보다 또 다른 구현예에서, 인산화된 당은 글리세르알데하이드 3-포스페이트 및 디하이드록시아세톤 포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

한 가지 관점에서, 불안정 분자, 예를 들어 에탄올아민의 격리화는 용해성 기질 내의 불안정 분자의 피막화에 의해, 또는 불용성 기질 내의 불안정 분자의 피막화에 의해 시행될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 피막화되는 불안정 분자는 에탄올아민이다. 다른 구현예들에서, 피막화되는 불안정 성분들은 비타민, 성장인자, 사이토카인 등이다.

또 다른 관점에서, 불안정 분자는 피막화 이전에 덴드리머 (dendrimer)와 복합된다. 다른 관점들에서, 불안정 분자는 덴드리머와 복합되지 않고도 직접적으로 피막화된다.

한 가지 관점에서, 피막화를 위한 용해성 기질 또는 불용성 기질은 보호작용 코팅으로 추가로 코팅될 수 있다. 좀 더 나아간 관점에서, 보호작용 코팅은 폴리-L-라이신 또는 폴리오르니틴으로 만들어질 수 있다.

한 가지 구현예에서, 불용성 기질은 알기네이트, 폴리-L-락트산, 키토산, 아가로스, 젤라틴, 하이알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 헤파란 설페이트, 젤란검, 잔탄검, 구아르검, 수용성 셀룰로스 유도체, 폴리-글리콜산, PLGA (폴리-락트-co-글리콜산), 콜라겐, 폴리하이드록시알카노에이트 (PHA), 폴리-ε-카프로락톤, 폴리-오르토 에스테르, 폴리-안하이드라이드, 폴리-포스파젠, 폴리-아미노산, 폴리디메틸실록산, 폴리우레트란, 폴리-테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리설폰, 폴리-메틸 메타크릴레이트, 폴리-2-하이드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아마이드, 폴리프로필렌, 폴리-염화비닐, 폴리스티렌, 폴리-비닐 피롤리돈 및 카라지난으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 좀 더 나아간 구현예에서, 미세피막화 (microencapsulation)가, 이에 제한되는 것은 아니지만 폴리-글리콜산, PLGA (폴리-락트-co-글리콜산), 콜라겐, 폴리하이드록시알카노에이트 (PHA), 폴리-ε-카프로락톤, 폴리-오르토 에스테르, 폴리-안하이드라이드, 폴리-포스파젠, 폴리-아미노산, 폴리디메틸실록산, 폴리우레트란, 폴리-테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리설폰, 폴리-메틸 메타크릴레이트, 폴리-2-하이드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아마이드, 폴리프로필렌, 폴리-염화비닐, 폴리스티렌, 폴리-비닐 피롤리돈 등을 포함하는 스캐폴딩 기질로 시행될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 용해성 기질은 알코올, 케톤 또는 알데하이드를 포함하는 분자일 수 있다. 좀 더 나아간 구현예에서, 용해성 기질은 포도당, 만노스, 과당, 말토덱스트린 및 갈락토스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 육탄당 (hexose sugar)일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 육탄당은 말토덱스트린일 수 있다.

한 가지 관점에서, 에탄올아민 유도체는 다음의 화학식을 가지고:

여기에서 R은 아세틸기 또는 아미노산이다. 바람직한 구현예에서, 에탄올아민 유도체는 N-아세틸에탄올아민 (NAE)이다.

소정의 구현예에서, 본 발명에서 기술된 조성물들은 세포 배양 배지, 세포 배양 보충물, 피드 (feed), 및 세포 배양 배지 농축물로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 a) 하나 이상의 불안정 분자들을 유도체화하고/거나 격리화하여 하나 이상의 보호된 불안정 분자들을 생산하는 단계; b) 상기 하나 이상의 보호된 불안정 분자들을 하나 이상의 세포 배양 성분들과 혼합하여 세포 배양 조성물을 만드는 단계를 포함하고,

상기 하나 이상의 보호된 불안정 분자들은 비보호된 불안정 분자와 대비하여 하나 이상의 세포 배양 성분들과의 유해 반응이 방지되고, 상기 보호된 불안정 분자의 적어도 하나는 에탄올아민인, 하나 이상의 보호된 불안정 분자들을 포함하는 세포 배양 조성물을 제조하는 방법을 기술하고 있다.

소정의 구현예에서, 불안정 분자의 유도체화는 당 알코올, 또는 아미노 당, 또는 유론산, 또는 인산화된 당으로 될 수 있다.

한 가지 관점에서, 당 알코올은 알리톨, 알트리톨, 프럭티톨, 갈락티톨, 글루시톨, 굴리톨, 이디톨, 만니톨, 소르비톨, 탈리톨, 타가티톨, 아라비니톨, 리비톨, 리불리톨, 자일리톨, 자일루리톨, 라이지톨, 에리트루리톨, 에리트리톨, 및 트레이톨로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 관점에서, 아미노 당은 알로사민, 알트로사민, 프럭토사민, 갈락토사민, 글루코사민, 굴로사민, 이도사민, 만노사민, 소르보사민, 탈로사민, 타가토사민, 아라비노사민, 리보사민, 리불로사민, 자일로사민, 자일룰로사민, 라이조사민, 에리트룰로사민, 에리트로사민, 및 트레오사민으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 세 번째 관점에서, 유론산은 알루론산, 알트루론산, 프럭투론산, 갈락투론산, 글루쿠론산, 굴루론산, 이듀론산, 만누론산, 소르부론산, 탈루론산, 타가투론산, 아라비누론산, 리부론산, 리부루론산, 자일루론산, 자일룰루론산, 라이주론산, 에리트룰루론산, 에리트루론산, 및 트레우론산으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 네 번째 관점에서, 인산화된 당은 글리세르알데하이드 3-포스페이트 및 디하이드록시아세톤 포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

한 가지 구현예에서, 불안정 분자의 격리화는 용해성 기질 내의 피막화에 의해, 또는 불용성 기질 내의 불안정 분자의 피막화에 의해 시행될 수 있다. 한 가지 관점에서, 용해성 기질 또는 불용성 기질은 보호작용 코팅으로 추가로 코팅될 수 있는 한편, 또 다른 관점에서 용해성 기질 또는 불용성 기질은 보호작용 코팅으로 추가로 코팅되지 않을 수 있다. 좀 더 나아간 관점에서, 보호작용 코팅은 폴리-L-라이신 또는 폴리오르니틴으로 만들어진다.

또 다른 관점에서, 용해성 기질은 알코올, 케톤 또는 알데하이드를 포함하는 분자로 만들어지고, 이는 말토덱스트린과 같은 당일 수 있다.

보다 또 다른 관점에서, 불용성 기질은 알기네이트, 폴리-L-락트산, 키토산, 아가로스, 젤라틴, 하이알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 헤파란 설페이트, 젤란검, 잔탄검, 구아르검, 수용성 셀룰로스 유도체, 폴리-글리콜산, PLGA (폴리-락트-co-글리콜산), 콜라겐, 폴리하이드록시알카노에이트 (PHA), 폴리-ε-카프로락톤, 폴리-오르토 에스테르, 폴리-안하이드라이드, 폴리-포스파젠, 폴리-아미노산, 폴리디메틸실록산, 폴리우레트란, 폴리-테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리설폰, 폴리-메틸 메타크릴레이트, 폴리-2-하이드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아마이드, 폴리프로필렌, 폴리-염화비닐, 폴리스티렌, 폴리-비닐 피롤리돈 및 카라지난으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

한 가지 관점에서, 본 발명은 a) 임의적으로, 불안정 화합물을 덴드리머와 반응시켜 덴드리머-불안정 화합물 복합체를 생산하는 단계; b) 상기 단계 a)의 덴드리머-불안정 화합물 복합체, 또는 불안정 화합물을 격리화 제제 내에 피막화하여 피막화된 덴드리머-불안정 화합물 복합체 또는 피막화된 불안정 화합물을 생산하는 단계; 또한 c) 상기 단계 b)의 피막화된 덴드리머-불안정 화합물 복합체 또는 피막화된 불안정 화합물을 조성물에서 하나 이상의 성분들과 혼합하는 단계를 포함하는, 조성물 내에서 유해 반응으로부터 보호를 위해 불안정 화합물을 피막화하거나 미세피막화하는 (상호교환적으로 사용됨) 방법을 제공한다. 불안정 화합물은 에탄올아민, 성장인자, 비타민 및 사이토카인으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

좀 더 나아간 관점에서, 본 조성물의 미세피막화 또는 피막화 방법은, 어느 것이라도 건조 배지 형식으로 될 수 있는 세포 배양 배지, 세포 배양 보충물 또는 세포 배양 피드를 제조하는 데 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 건조 배지는 응집된 (agglomerated) 배지이다. 다양한 관점들에서, 본 방법은 용해성 기질 내에서 또는 불용성 기질 내에서 피막화에 의한 불안정 분자의 격리화에 의해 획득되는 불안정 분자들 또는 화합물들을 포함하였던 배지들을 사용할 것이다. 본 방법의 한 가지 관점에서, 용해성 기질 또는 불용성 기질은 보호작용 코팅으로 추가로 코팅될 수 있는 한편, 또 다른 관점에서 용해성 기질 또는 불용성 기질은 보호작용 코팅으로 추가로 코팅되지 않을 수 있다. 본 방법의 좀 더 나아간 관점에서, 보호작용 코팅은 폴리-L-라이신 또는 폴리오르니틴으로 만들어진다. 본 방법의 또 다른 관점에서, 용해성 기질은 알코올, 케톤 또는 알데하이드를 포함하는 분자로 만들어질 수 있고, 이는 말토덱스트린과 같은 당일 수 있다.

본 방법의 일정 구현예들에서, 불용성 기질은 알기네이트, 폴리-L-락트산, 키토산, 아가로스, 젤라틴, 하이알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 헤파란 설페이트, 젤란검, 잔탄검, 구아르검, 수용성 셀룰로스 유도체, 폴리-글리콜산, PLGA (폴리-락트-co-글리콜산), 콜라겐, 폴리하이드록시알카노에이트 (PHA), 폴리-ε-카프로락톤, 폴리-오르토 에스테르, 폴리-안하이드라이드, 폴리-포스파젠, 폴리-아미노산, 폴리디메틸실록산, 폴리우레트란, 폴리-테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리설폰, 폴리-메틸 메타크릴레이트, 폴리-2-하이드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아마이드, 폴리프로필렌, 폴리-염화비닐, 폴리스티렌, 폴리-비닐 피롤리돈 및 카라지난으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

본 방법의 다른 구현예들에서, 불안정 화합물과 복합되는 데 사용되는 덴드리머는 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머, 폴리프로필렌이민 (PPI) 덴드리머, 인산화된 덴드리머, 폴리라이신 덴드리머, 폴리에틸렌이민 덴드리머, 이프티센 덴드리머, 지방족 폴리(에테르) 덴드리머, 방향족 폴리에테르 덴드리머, 및 폴리프로필아민 (POPAM) 덴드리머로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

소정의 관점들에서, 본 발명은 세포 배양 배지, 세포 배양 보충물, 또는 세포 배양 피드의 제조를 위한, 상기 기술된 조성물들의 용도에 관한 것이다. 한 가지 관점에서, 세포 배양 배지, 세포 배양 보충물, 또는 세포 배양 피드는 적합한 조건 하에서 세포의 배양을 위해 사용된다. 본 세포는 원하는 산물을 생산하는 포유동물 세포, 재조합 세포, 재조합 포유동물 세포일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포이고, 또한 좀 더 나아간 관점에서, CHO 세포는 이익이 되거나 상업적인 가치가 있는 재조합 단백질을 발현한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 불안정 성분을 안정한 형태로 유도체화하거나, 이에 제한되는 것은 아니지만 피막화를 포함하는 방법들에 의해 불안정 성분을 격리화하는 둘 중 하나에 의해, 불안정 성분들의 안정성을 증가시키는 방법들을 제공한다. 따라서, 본 발명은 저온이 아닌 실온에서 연장된 기간 동안, 에탄올아민, 비타민, 성장인자 등 같은 불안정 성분들을 포함하는, 예를 들어 건조-형식 배지들의 안정성을 증가시키는 방법들을 제공한다. 본 발명은 드라이아이스에 대한 필요성이 없이도, 또는 냉장 보관이 없이도, 상온 또는 실온에서 운반될 수 있는 에탄올아민, 비타민, 성장인자 등 같은 불안정 성분들을 포함하는, 예를 들어 건조-형식 배지의 안정성을 증가시키는 방법들을 제공한다. 본 발명은 분해-감수성 화합물의 안정화된 등가물을 포함하는 조성물들, 예를 들어 안정화된 폴리아민, 또는 안정화된 비타민 등을 포함하는 조성물들을 제공한다. 본 조성물은 반-고체 페이스트, 반-건조, 또는 건조 형식들인 것을 포함하여 어떤 형태로도 있을 수 있다. 건조 제형물들 또는 건조 형식 배지들에서 배지들 및 배지 보충물은 다음 중 임의의 것일 수 있다: 건조 분말 배지들 (DPM), 응집된 건조 형식 (AGT) 또는 진보된 분말 배지들 (APM). 세포 배양 배지는 건조-형식 세포 배양 배지 또는 액체 배지일 수 있다. 추가적으로, 세포 배양 배지는 하나의 단일 성분 배지일 수 있거나, 하나 초과의 성분, 예를 들어 두 개 또는 세 개의 성분 배지일 수 있다. 건조-형식 배지는 세포 배양액의 배양을 위해 준비된 세포 배양 배지를 생성하도록 용매와 재구성될 수 있는, 단일 성분 배지 제형물, 또는 복수의 성분 배지 제형물일 수 있다. 일정 구현예들에서, 재구성된 제형물은 사전에 자가-pH 조절되고, 사전에 자가-삽투도 조절될 수 있다. 이것이 의미하는 바, 산/염기 또는 삼투도를 조절하는 추가의 성분들이 용매로의 재구성 과정 동안 배지에 첨가될 필요가 없고, 이로 인해 최종 사용자를 위해 재구성을 단순한 단계로 만든다.

본 발명은 또한, 이에 제한되는 것은 아니지만 세포 배양 배지, 제약 산업, 미용 산업, 효소 산업에 사용되는 에탄올아민과 같은 불안정 분자를 포함하는 화학적 조성물이라면 모두, 식품 산업, 세척제들과 같은 산업적 적용들, (부식을 조절하도록) 물을 처리하는 방법들, 페인트 산업, 기체로부터 산을 제거하는 세제에서 완충액들을 포함하는, 적용이라면 모두에서 에탄올아민 또는 기타 불안정 성분들을 안정화하는 것에 관한 것이다. 본 명세서에서 기재된 방법들 및 조성물들은 분해-경향성 화합물들을 보호하는 어떠한 분야에서라도 사용될 수 있고, 당업자라면 본 발명에 기재된 불안정 성분들을 안정화하는 방법들을 기타 어떠한 적용에도 적응시킬 수 있다. 화합물들의 미세피막화는 당해 기술분야에 숙지되어 있는 한편, 본 발명은 덴드리머-불안정 성분 복합체를 피막화하는 새로운 방법들을 제공하고, 덴드리머는 이에 제한되는 것은 아니지만 폴리아미도아민 덴드리머, 폴리프로필렌이민 덴드리머, 또는 폴리프로필아민 (POPAM) 덴드리머 등을 포함한다. 본 방법에서, 덴드리머는 에탄올아민 또는 인슐린 등과 같은 민감성 화합물과 복합체를 형성하고, 다음으로 덴드리머-화합물 복합체는 피막화된다. 피막화된 덴드리머-불안정 화합물 복합체는 세포 배양 배지들 같은 안정화된 조성물들의 제조를 위해 사용된다. 따라서, 본 발명은 피막화된 덴드리머-불안정 화합물 복합체들을 포함하는 세포 배양 배지들 같은 개선된 조성물들을 만드는 방법들을 제공하고, 이는 세포 배양 배지 저장, 상온에서 배지의 운반을 개선하고, 또한 피막화된 복합체로부터 불안정 성분의 조절된 방출을 장기간 동안 허용할 수 있다.

불안정 화합물을 유도체화하고/거나 격리화하는 단계 (피막화, 및/또는 불안정 분자-덴드리머 피막화에서와 같음)와 같은 본 발명에 기술된 방법들을 사용하여, 불안정 화합물은 예를 들어 세포 배양 배지들과 같은 조성물이라면 모두에서 보호되고/거나 안정화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법들을 사용하여, 보호된 화합물들은 유사한 조성물에서 비교가능한 비보호된 또는 불안정 분자보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%로 더욱 안정할 수 있다. 안정성 백분율 (%)의 측정들은 많은 방법들에 의해 측정 또는 추론될 수 있다: 예를 들어 세포 배양액의 생존 세포 밀도에 의한 측정 또는 LCMS 분광분석법을 사용한 조성물에서 변형된 에탄올아민처럼 변형된 화합물의 측정으로서 세포 성장을 허용하는 보호된/비보호된 분자의 능력 (보호된 에탄올아민 대비 비보호된 에탄올아민)에 의해, 또는 조성물 등에서 에탄올아민의 분해%를 측정하는 것에 의함. 안정성은 보호된 분자가 증가된 또는 감소된 온도, 방사선 조사에 대한 노출 (예로, UV, 햇볕 등), 습기에 대한 노출, 젖음, 극도의 건조, 기계적 파괴 (운반과정 동안) 등과 같은 파괴적인 요인들을 유사한 조건에 노출된 비보호된 분자와 대비하여 견딜 수 있는 경우라면 증진된 것으로서 역시 고려될 수 있다. 안정성은 상기에 기술된 하나 이상의 비교 검정법들 (세포 배양액의 생존 세포 밀도, 또는 LCMS 분광분석법을 사용한 조성물에서 변형된 에탄올아민처럼 변형된 화합물의 측정, 또는 분해%를 측정하는 것에 의해)이라면 모두에서, 유사한 조건에 노출된 비보호된 분자보다 1.5X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 10X, 15X, 20X, 25X, 3X, 35X, 40X, 4X, 50X, 55X, 60X, 65X, 70X, 75X, 100X까지 더욱 안정한 것으로서 표현될 수 있다.

본 발명의 한 가지 관점에서, 감수성 화합물의 안정성은 화합물의 아미노 분체에서 아마이드 결합을 형성하여, 예를 들어 아미노기에서 화합물을 아세틸화하여 증가된다. 예를 들어, 에탄올아민 안정성은 아세틸 유도체, 에탄올아민 아민기에서 공유 결합 (covalent linkage)을 사용하여 증가된다. 한 가지 구현예에서, 공유 결합은 아마이드 결합이다. 에탄올아민 유도체는 다음의 화학식을 가지고:

여기에서 R은 아세틸기 또는 아미노산이다.

한 가지 관점에서, 감수성 화합물의 안정성은 감수성 화합물을 보호하도록 격리화 제제를 사용하여 증가될 수 있다. 본 과정은 상호교환적으로 피막화 또는 포매화 (embedding)라고 말할 수 있다. 격리화 제제는 감수성 화합물을 점차적으로 분해시키는 원소 또는 화합물이라면 모두로부터 이를 '보호하고' 또는 '분리하고' 또는 '피막화하고' 또는 '포매하는' 제제라면 모두일 수 있다. 예를 들어, 에탄올아민은 유해 반응으로부터 에탄올아민을 보호하는 격리화 제제 내에 에탄올을 피막화하여 안정화될 수 있다. 본 격리화 제제는 용해성 피막화 기질 또는 불용성 피막화 기질일 수 있다.

한 가지 구현예에서, 격리화 제제는 이에 제한되는 것은 아니지만 당 (예로, 포도당), 또는 그의 유도체, 또는 케토산을 포함하는 케톤-포함 화합물, 또는 알데하이드-포함 화합물과 같은 용해성 피막화 기질일 수 있다. 예를 들어, 격리화 제제는 재구성 시 수계 배지에서 용해될 수 있는, 말토덱스트린 등과 같은 당으로 만들어진 용해성, 결정성 기질일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 피막화 기질은 불안정 화합물을 피막화할 수 있는 불용성 기질, 예를 들어 알기네이트 등일 수 있다. 불용성 기질 또는 비드들은 물 또는 완충액 같은 용매들과 재구성 시 피막화된 불안정 물질을 용액으로 바로 방출하고, 예를 들어 여과를 통해 재구성된 배지들을 위해 배출될 수 있다. 불용성 기질 피막화 제제들의 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 알기네이트, 키토산, PEG 기질, 폴리-락트-co-글리콜산 (PLGA), 젤라틴 및 그의 유도체들, 콜라겐 및 그의 유도체들, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET), 선택투과성 물질, 막, 레진, 검, 아라비노갈락탄, 말토덱스트린, 기타 올리고- 또는 다당류 기질, 지질, 왁스, 파라핀, 오일 등을 포함한다. 좀 더 나아간 구현예에서, 알기네이트와 같은 피막화 기질은 덴드리머 화합물과 불안정 화합물의 복합체를 피막화할 수 있다. 불안정 화합물-덴드리머 복합체에서, 덴드리머는 분해-경향성, 불안정 물질 주변에 스캐폴드를 형성한다. 용해성/불용성 기질에 의한 불안정 화합물-덴드리머 복합체의 추가의 피막화는 추가적인 보호층을 제공한다. 또한, 덴드리머-불안정 화합물 복합체는 용매와의 재구성 시 불안정 화합물의 느린 방출을 유도할 수 있고, 이는 소정의 경우들에서 바람직할 수 있다.

캡슐들 또는 비드들의 형성: 알기네이트는 교차결합된 하이드로겔이고, 이는 소위 에탄올아민 (또는 감수성 물질이라면 모두)으로 용해되고, 다음으로 이로부터 나온 용액은 칼슘 용액 내로 점적되어 캡슐들을 형성한다 (주사기 바늘 방법). 비드들을 형성하는 대안의 방법은 안개-분무 방법에 의한다. 비드들이 수집되고, 과다한 칼슘을 제거하도록 세척되고, 건조된다. 알기네이트는 건조될 때, DPM, APM 또는 AGT와 같은 건조 분말 배지들과 혼합될 수 있는 경질의 굴절성 비드를 형성하고, 에탄올아민은 보호된다. 한 가지 구현예에서, 에탄올아민을 피막화하는 데 사용되는 알기네이트는 주사기 바늘 방법에 의해, 또는 다른 예에서 안개 분무 방법에 의해 비드들로 형성된다. 안개 분무 방법은 더 작은 비드들을 유도한다. 에탄올아민을 포함하는 덴드리머가 알기네이트에서 유사하게 피막화되어, 배지가 용매와 재구성될 때 알기네이트 및 덴드리머는 용액 내로 피막화된 물질을 바로 방출한다. 캡슐들은 배지로부터 여과로 배출될 수 있다.

한 가지 관점에서, 증가된 에탄올아민 안정성을 가진 조성물은 화장품 또는 약제이다. 한 가지 구현예에서, 화장품 또는 약제 조성물은 분말화된 조성물이다. 또 다른 구현예에서, 화장품 또는 약제 조성물은 용액이다.

또 다른 관점에서, 증가된 에탄올아민 안정성을 가진 조성물은 세포 배양 배지이다. 한 가지 구현예에서, 세포 배양 배지는 분말화된 세포 배양 배지이다. 또 다른 구현예에서, 세포 배양 배지는 용액이다. 본 관점은 분말화된 또는 액체 세포 배양 배지, 뿐만 아니라 이러한 방법들에 의해 생산되는 분말화된 또는 액체 세포 배양 배지에서 에탄올아민의 안정성을 증가시키는 방법을 포함한다.

한 가지 구현예는 분말화된 세포 배양 배지에서 에탄올아민 안정성을 증가시키는 방법에 관한 것이고, 본 방법은 에탄올아민 유도체 또는 격리화 제제와 복합되었던 에탄올아민 ("격리화된 에탄올아민")을 하나 이상의 아미노산을 포함하는 분말화된 세포 배양 배지와 조합하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 아미노산 및 에탄올아민 유도체 또는 격리화된 에탄올아민을 포함하는 분말화된 세포 배양 배지는 증가된 에탄올아민 안정성을 나타낸다. 소정의 구현예들에서, 본 방법은 좀 더 나아가 상기 조합 단계 이전에, 격리화된 에탄올아민을 생산하도록 에탄올아민을 격리화 제제와 복합하는 단계를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 에탄올아민 유도체 또는 격리화 제제와 복합되었던 에탄올아민 ("격리화된 에탄올아민")과 조합하여 수성 세포 배양 배지를 제조하는 방법을 제공한다. 한 가지 구현예에서, 본 수성 세포 배양 배지를 제조하는 방법은 에탄올아민 유도체 또는 격리화 제제와 복합되었던 에탄올아민 ("격리화된 에탄올아민")을 하나 이상의 아미노산을 포함하는 세포 배양 배지와 조합하는 단계를 포함한다. 본 방법에 따라 제조된 수성 세포 배양 배지는 에탄올아민 유도체 또는 격리화된 에탄올아민을 포함하는 분말화된 세포 배양 배지를 생산하도록 선택적으로 건조될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 아미노산 및 에탄올아민 유도체 또는 격리화 제제와 복합되었던 에탄올아민 ("격리화된 에탄올아민")을 포함하는 분말화된 세포 배양 배지와 물과 같은 용매를 조합하여 수성 세포 배양 배지를 제조하는 방법을 제공한다.

유사하게, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 방법들에 따라 제조된 분말화된 세포 배양 배지를 제공한다. 한 가지 구현예에서, 분말화된 세포 배양 배지는 에탄올아민 유도체 또는 격리화 제제와 복합되었던 에탄올아민 ("격리화된 에탄올아민") 및 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 분말화된 세포 배양 배지는 선택적으로 탄수화물 (예로, 포도당)과 같은 기타 성분들을 포함한다.

소정의 구현예들에서, 세포 배양 배지는 다음과 같은 하나 이상의 불안정 화합물들을 포함하는 단일 성분 배지이다: 에탄올아민, 성장인자, 사이토카인 등. 한 가지 구현예에서, 세포 배양 배지는 단백질이 없다. 또 다른 구현예에서, 세포 배양 배지는 단백질이 없고, 지질, 가수분해물, 또는 성장인자를 포함하지 않는다. 일정 구현예들에서, 세포 배양 배지는 박테리아 세포, 효모 세포, 식물 세포, 조류 세포, 또는 곤충 세포 (예로, 초파리 (Drosophila) 세포들, 스포도프테라 (Spodoptera) 세포들 또는 트리코플러시아 (Trichoplusia) 세포들), 선충 세포 (예로, C. 엘리강스 (C. elegans) 세포들) 또는 포유동물 세포 (예로, CHO 세포들, COS 세포들, VERO 세포들, BHK 세포들, AE-1 세포들, SP2/0 세포들, L5.1 세포들, PerC6, 하이브리도마 세포들 또는 기타 인간 세포들)과 같은 동물 세포를 배양하는 데 적합할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 세포의 배양을 지원하는 조건 하에서 에탄올아민 유도체, 격리화된 에탄올아민, 격리화된 성장인자, 격리화된 사이토카인 등과 같은 불안정 화합물들 하나 이상을 포함하는 세포 배양 배지와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 일정 구현예들에서, 세포는 부모 세포일 수 있는 한편, 다른 구현예들에서 세포는 관심 있는 유전자를 보유하는 재조합 세포, 또는 암세포와 같은 병든 세포일 수 있다. 어떠한 세포라도 본 발명의 방법들에 따라 배양될 수 있고, 예를 들어 박테리아 세포들, 효모 세포들, 또는 조류 세포들, 또는 식물 세포들과 같은 진핵 세포들, 상세하게는 동물 세포들이다. 한 가지 구현예에서, 동물 세포는 포유동물 세포이다. 일정 구현예들에서, 배지는 이에 제한되는 것은 아니지만 CHO (중국 햄스터 난소) 세포들, COS 세포들, VERO 세포들, BHK 세포들, AE-1 세포들, SP2/0 세포들, L5.1 세포들, PerC6, 하이브리도마 세포들을 포함하는, 인간 세포들 및/또는 조직들을 포함하는 포유동물 세포 또는 기타 포유동물 세포, 이에 제한되는 것은 아니지만 초파리 세포들, 스포도프테라 세포들 또는 트리코플러시아 세포들 등을 포함하는 곤충 세포, 이에 제한되는 것은 아니지만 C. 엘리강스 세포들 등을 포함하는 선충 세포를 배양하는 데 사용된다.

또 다른 관점은 에탄올아민 유도체, 격리화된 에탄올아민, 격리화된 성장인자, 격리화된 사이토카인 등과 같은 불안정 화합물들 하나 이상을 포함하는 세포 배양 배지 및 상기 기술된 바와 같은 적어도 하나의 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 가지 구현예에서, 세포는 포유동물 세포이다. 한 가지 바람직한 구현예에서, 포유동물 세포는 CHO 세포이다. 보다 또 다른 바람직한 구현예에서, CHO 세포는 관심 있는 유전자를 보유하는 CHO 세포이다.

보다 또 다른 관점은 세포의 배양에서의 사용을 위한 키트에 관한 것이다. 본 키트는 에탄올아민 유도체, 격리화된 에탄올아민, 격리화된 성장인자, 격리화된 사이토카인 등과 같은 불안정 화합물들 하나 이상, 선택적으로 하나 이상의 아미노산을 포함하는 세포 배양 배지 및 하나 이상의 세포들 또는 세포 유형들을 포함하는 하나 이상의 용기들 (containers)을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 선택적으로 적어도 하나의 성장인자, 적어도 하나의 배양 배지 보충물, 적어도 하나의 동물 조직 추출물, 적어도 하나의 동물 기관 추출물, 적어도 하나의 동물 샘 추출물, 적어도 하나의 효소, 적어도 하나의 단백질, 적어도 하나의 비타민, 적어도 하나의 사이토카인, 적어도 하나의 지질, 적어도 하나의 미량 원소, 적어도 하나의 세포외 기질 성분, 적어도 하나의 완충액, 적어도 하나의 항생제, 및 적어도 하나의 바이러스성 저해제로부터 선택되는 적어도 하나의 추가적인 성분을 포함할 수 있다.

또 다른 관점은 본 명세서에서 기술된 배지들을 사용하여 바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다. 상세하게, 본 발명은 본 방법은 (a) 세포 (예로, 포유동물 세포)를 바이러스에 의한 세포의 감염을 촉진하는 데 적합한 조건 하에서 바이러스와 접촉시키는 단계; 또한 (b) 에탄올아민 유도체, 격리화된 에탄올아민, 격리화된 성장인자, 격리화된 사이토카인 등과 같은 불안정 화합물들 하나 이상을 포함하는 세포 배양 배지에서 바이러스, 바이러스성 입자 (VLP) 또는 백신의 생산을 촉진하는 데 적합한 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 한 가지 구현예에서, 세포는 CHO 세포와 같은 포유동물 세포일 수 있다.

보다 또 다른 관점에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 배지들을 사용하여 폴리펩타이드를 생산하는 방법들을 제공한다. 상세하게, 본 방법은 에탄올아민 유도체, 격리화된 에탄올아민, 격리화된 성장인자, 격리화된 사이토카인 등과 같은 불안정 화합물들 하나 이상을 포함하는 세포 배양 배지에서 세포에 의한 폴리펩타이드의 발현에 적합한 조건 하에서 폴리펩타이드를 생산하도록 유전적으로 조작되었던 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 한 가지 구현예에서, 세포는 CHO 세포와 같은 포유동물 세포이다.

미세피막화 (microencapsulation)는 에탄올아민, 비타민, 성장인자 등 같은 민감성 화합물들의 저장 조건을 연장할 수 있고, 이는 저온 (예를 들어, 냉장 또는 드라이아이스)이 아닌 운반 비용을 감소시킬 수 있는 상온에서 AGT^TM 등 같은 건조 배지 제형물들의 운반 및 취급의 효과를 긍정적으로 줄 수 있다. 따라서, 건조 형식의 배지들에서 불안정 화합물들의 미세피막화는 건조 형식 세포 배양 배지들의 더욱 저렴한 비용의 취급 및 보관에 의해, 녹색 기술학에 대한 기여로서 전망될 수 있다.

도 1A 및 1B는 세포 배양 효능을 위해 테스트된, 포스포릴에탄올아민 (PE), 트리에탄올아민 (TE), 디에탄올아민 (DE), 모노메틸에탄올아민 (MME), 디메틸에탄올아민 (DME), 및 N-아세틸에탄올아민 (NAE)을 포함하는 광범위한 에탄올아민 유도체들을 포함하는 배지들에서 성장된 세포들 (DG44-EPO)의 생존 세포 밀도 (VCD)를 나타낸 것이다 (x-축). NAE 및 PE는 배지들에서 안정하고 바람직한 유도체화된 에탄올아민들이었다. 자세한 사항들은 실시예 2를 참조하라.
도 2A는 유도체화된 에탄올아민인 N-아세틸에탄올아민 (NAE)이 약 16 내지 20X의 에탄올아민 몰 당량에서 에탄올아민과 비교가능한 에탄올아민-민감성 계열을 보완할 수 있는 세포 성장 적정 검정법을 나타낸 것이다. 도 2B는 N-아세틸에탄올아민 (NAE)이 주어진 시료라면 모두, 소위 세포 배양 배지에서 LC-질량 분광분석법에 의해 측정될 수 있는 점을 나타낸 것이다. 그래프는 LC-질량 분광분석법에 의한 분석적 등급의 순수 NAE 검출을 위한 농도 곡선을 보여준다.
도 3A는 미세피막화를 위해 CaCl₂를 사용한 알기네이트 마이크로비드의 제조를 나타낸 것이다. 이는 두 개의 절차들을 사용하여 성공적으로 형성되었다: (i) 바늘 및 주사기 방법, 및 (ii) 안개 분무 방법을 벤치 규모로 사용함. 규모 확장을 위해, 다음의 기법들이 테스트되었다: 하이드로캡슐 피막화 기계, 제트커터, 이노테크사 진동 노즐, 정전기 발생기 또는 액적형성 (coacervation) 혼합. 도 3B는 서로 다른 미세피막화 설정 매개변수들 하에서 생성된 알기네이트 비드들의 특징들을 나타낸 것이다. 최적의 CaCl₂ 및 알기네이트 농도들이 확인되었다. 테스트된 균질도는 AGT^TM 건조 형식에서 미세캡슐들의 비-분리를 제시하였다. 1000X로 로딩된 마이크로비드는 허용가능한 비드 특징들을 수득하였다. 도 3C는 비타민 B12를 불안정 물질로서 사용한 연구들을 나타낸 것이다. 표준 및 감소된 비드들은 최상의 결과들을 보여주었고 심화 실험들을 위해 사용되었다.
도 4A는 최적의 비드 크기의 추가 개선을 측정한 것이다. 피막화된 에탄올아민 (2% 이내의 알기네이트 마이크로비드)의 가속된 보관기간 안정성 연구들이 7일째 수행되었다. 결과들 (% 분해)은 PLL로 코팅되거나 코딩되지 않은 캡슐들을 보여주었다. 알기네이트 비드들로 에탄올아민의 미세피막화는 연장된 보관 기간 안정도 연구들 (7일)에서 온도 4℃ 및 30℃에서 에탄올아민 단독을 가진 대조군과 대비하여 에탄올아민의 더 적은 분해, 또한 비드들이 PLL 코팅되었을 때는 보다 더 적은 분해 (0으로 떨어진 분해)를 현저하게 보여주었다. 더 작은 비드들로의 보호작용 (분무-건조됨)은 표준 및 감소된 마이크로비드와 대비하여 덜 바람직하였다. 결과들은 미세피막화가 에탄올아민을 보호할 수 있는 점을 보여주고 있다.
도 4B는 미세피막화가 에탄올아민을 실온에서 3주 넘게 (2개월까지 테스트됨) 보호하는 점을 안정성 연구들로 나타낸 것이다. 도 4C는 에탄올아민의 미세피막화를 입증하도록 심화 테스트를 시행하여 나타낸 것이다. 가속화된 보관 기간 연구들은 7일까지 관찰된 2% 이내의 알기네이트 마이크로비드에서 에탄올아민의 안정성을 보여주었다. 대조군 에탄올아민은 프롤린과 혼합되었다. 이들 결과들은 에탄올아민과 같은 불안정 화합물들의 미세피막화가 보관 기간을 개선하고 운반 비용을 감소시킬 수 있는 점을 제시하고 있다. 현재 AGT^TM과 같은 소정의 건조 배지 제형물들은 국제적으로 드라이아이스 상에, 또는 미국 내에서는 냉장으로 운반된다. 개선된 보관 및 취급 조건은 포장 폐기물을 감소시키고 (녹색 포장), 운반 비용을 감소시킬 수 있다 (적은 무게 - 녹색 기술학).
도 5는 DG44-EPO 세포 성장이 미세피막화된 에탄올아민에 의해 전적으로 지원되는 점을 나타낸 것이다. 비어있는 마이크로비드는 세포 성장을 저해하지 않았다. 좀 더 나아가, 미세피막화된 에탄올아민도 EPO 단백질을 발현하는 재조합 CHO-DG44 세포에서 관찰된 바와 같이 세포 성장을 저해하지 않았다.
도 6은 미세피막화된 덴드리머 성분 전달 시스템을 나타낸 것이다. 본 도면은 미세피막화된 덴드리머가 작용하는 방식을 보여주고 있다. 알기네이트는 재구성 시 덴드리머를 보호하고, 민감성 물질을 가진 덴드리머를 방출한다. 알기네이트는 여과 동안 막 필터 상에서 보유된다. 한 가지 구현예에서, 노출된 덴드리머는 덴드리머 상에 존재하는 세포 인식 부위들의 존재로 인해 에탄올아민, 또는 기타 다른 분자와 같은 불안정 물질을 세포로 표적화할 수 있고, 이로 인해 성장하는 세포로의 성장인자, 비타민 등과 같은 민감성 또는 저농도 물질들의 사용가능성을 개선시킨다.
도 7A에서 덴드리머 (테스트 물질 인슐린을 포함함)의 미세피막화는 미피막화된 덴드리머 (인슐린을 가짐), 또는 인슐린 단독과 대비하여 실온에서 실질적으로 증진된 안정성을 가진다. 덴드리머에서 인슐린의 효능은 4℃에서 인슐린 단독의 효능과 비교가능하다.
도 7B는 HeLa 세포의 성장 시 인슐린-덴드리머-RGD 공유 결합체의 미세피막화의 효과를 나타낸 것이다. 연구들은 세 개의 조건 모두, 미세피막화된 덴드리머 비드 (인슐린을 가짐), 미피막화된 덴드리머 (인슐린을 가짐), 및 인슐린 단독 모두가 HeLa 세포들의 동등한 효능 및 성장 특징들을 나타냄을 보여주었다. 주석: 미세피막화된 덴드리머 비드 (인슐린을 가짐)는 세포 성장을 저해하지 않았다.
도 8은 실시간 상온 보관 동안 마이크로비드 보호작용 연구들을 나타낸 것이다. 미피막화된 에탄올아민 활성은 상온 조건 하에서 AGT^TM 배지에서 신속하게 강하되지만, 미세피막화될 때는 많은 개월 수 동안 더 길게 효능을 유지한다.
도 9는 미세피막화가 비타민 안정성도 역시 개선하는 점을 나타낸 것이다.
도 10은 미세피막화가 인슐린 안정성을 개선하였던 점을 나타낸 것이다. 따라서, 건조-형식 배지에는 생체분자 보호작용을 위한 잠재력이 존재한다.

지금은 다양한 대표적인 구현예들에 대한 기준이 자세하게 작성될 것이다. 다음의 상술된 기술내용은 독자에게 소정의 구현예들, 특징들, 및 본 발명의 관점들의 자세한 사항들의 더 완벽한 이해를 주도록 제공되는 것으로 이해되고, 본 발명의 범위의 제한으로서 해석되어서는 안 된다.

1. 정의

본 발명은 더 잘 이해될 수 있기 위하여, 소정의 용어들이 먼저 정의된다. 추가적인 정의들이 상술된 기술내용 전체를 통하여 설명된다.

용어 "진보된 과립화 기술학 (advanced granulation technology)" 또는 AGT는 본 출원에서 사용되는 바, 공기 현탁된 연마된 분말화된 배지 성분들 상에 농축된 배지 성분들의 수용액들의 분무 및 물의 신속한 증발이 관여하는 세포 배양 배지를 제조하는 방법을 말하고, 그 결과로 얻은 과립화된 분말이라고 불리는 응집된 과립들을 통틀어 성분들의 균질한 분포를 유도하고, 이는 큰 과립 크기 및 적은 살포 (dusting)의 전형적인 특징을 가진다. Fike et al., Cytotechnology, 2006, 36: 33-39를 참조하고, 이는 본 명세서에 의해 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있다. 용어, "진보된 분말 배지 (advanced powder media)" 또는 APM은 입자 크기가 DPM 분말만큼 미세하지 않은 유익한 특성들을 가진 건조 분말 배지 형식을 말한다. 이것은 AGT의 여러 유익한 특성들을 가진다.

용어 "감수성 화합물 (susceptible compound)" 또는 "민감성 화합물 (sensitive compound)" 또는 "불안정 화합물 (labile compound)"은 본 출원에서 사용되는 바, 본 발명에서의 방법들을 사용하여: 즉 피막화 (격리화)에 의해 또는 화학물질을 포함하는 아민-분체와 N-아세틸 결합을 형성하는 단계에 의해 보호될 물질, 화학물질 또는 화합물을 말한다. 세포 배양 배지들에서 이러한 화합물들의 예들로는: 비타민, 사이토카인, 성장인자, 펩타이드, 및 호르몬이다.

용어 "에탄올아민 유도체 (ethanolamine derivative)"는 본 출원에서 사용되는 바, 에탄올아민의 아민기가 아마이드 결합과 같은 공유 결합에 의해 안정화되는 에탄올아민 화합물을 말한다.

용어 "격리화 제제 (sequestering agent)"는 본 출원에서 사용되는 바, 분해를 증진하는 조건으로부터, 또는 아미노산과 같은 기타 화학물질들; 망간, 구리 등과 같은 미량 원소들; 소듐 바이카보네이트 및 기타 소듐 포스페이트와 같은 무기 완충액들; 및 MOPS, HEPES, PIPES 등과 같은 유기 완충액들 (이들은 감수성 화합물과 느리게 반응하면서, 이로 인해 시간 경과 시 그들의 바람직한 특성들을 상실하게 됨)로부터 감수성 화학물질들 또는 화합물들의 보호, 분리, 피막화 또는 격리화를 말한다. 용어들 "보호하다 (protect)" 또는 "분리하다 (separate)" 또는 "격리하다 (sequester)" 또는 "피막화하다 (encapsulate)"는 본 발명에서 상호교환적으로 사용되었을 수 있고, 분해 조건 또는 화학물질들로부터 감수성 화학물질 또는 화합물을 보호하는 개념을 전달한다. "용해성 격리화 제제 (soluble sequestering agent)" 자체는 수성 배지와의 재구성 시 용해성일 수 있는 한편, 이것은 "민감성 (sensitive)" 피막화된 물질을 방출한다. 또는, "불용성 격리화 제제 (insoluble sequestering agent)"는 수성 배지와의 재구성 시 불용성일 수 있는 한편, "민감성" 피막화된 물질을 방출한 이후에, 이것은 여과, 경사분리 등과 같은 수단에 의해 재구성된 최종 산물로부터 제거될 수 있다. 불용성 격리화 제제들의 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 알기네이트, 폴리-L-락트산 (PLL), 키토산, 아가로스, 젤라틴, 하이알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 헤파란 설페이트, 젤란검, 잔탄검, 구아르검, 수용성 셀룰로스 유도체, 및 카라지난 등을 포함한다. 미세피막화를 위해 사용될 수 있는 기타 스캐폴딩 기질로는 폴리-글리콜산, PLGA (폴리-락트-co-글리콜산), 콜라겐, 폴리하이드록시알카노에이트 (PHA), 폴리-ε-카프로락톤, 폴리-오르토 에스테르, 폴리-안하이드라이드, 폴리-포스파젠, 폴리-아미노산, 폴리디메틸실록산, 폴리우레트란, 폴리-테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리설폰, 폴리-메틸 메타크릴레이트, 폴리-2-하이드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아마이드, 폴리프로필렌, 폴리-염화비닐, 폴리스티렌, 폴리-비닐 피롤리돈 등을 포함한다.

용해성 격리화 제제들의 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 포도당, 만노스, 갈락토스, 과당, 설탕과 같은 이당류들, 기타 용해성 올리고당류들, 및 용해성 다당류들을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 본 조성물은 하나 이상의 아미노산 및 에탄올아민을 포함하는 세포 배양 배지이다. 세포 배양 배지는 바람직하게 분말화된 세포 배양 배지이다. 한 가지 구현예에서, 분말화된 세포 배양 배지는 진보된 과립화 기술학 (AGT) 세포 배양 배지이다. 본 배지는 적용가능한 경우, 농축된 피드 보충물들, 농축된 배지들, 및 일정 경우들에서 액체 배지들도 역시 말한다.

용어들 "세포 배양 (cell culture)" 또는 "배양 (culture)"은 본 출원에서 사용되는 바, 인위적인 (예로, 시험관내) 환경에서 세포들의 유지를 말한다. 그러나 용어 "세포 배양"은 일반적인 용어이고, 개별 원핵세포 (예로, 박테리아) 또는 진핵세포 (예로, 동물, 식물 및 곰팡이) 뿐만 아니라, 조직들, 기관들, 기관 체계들 또는 생물들 전체의 배양을 포괄하는 데 사용될 수 있는 것으로 이해되고, 따라서 용어들 "조직 배양 (tissue culture)", "기관 배양 (organ culture)", "기관 체계 배양 (organ system culture)" 또는 "기관유형적 배양 (organotypic culture)"은 때로 용어 "세포 배양"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.

용어 "배양 (cultivation)"은 본 출원에서 사용되는 바, 활성 또는 정지 상태에서 세포들의 성장, 분화, 또는 계속된 생존을 선호하는 조건 하의 인위적인 환경에서 세포들의 유지를 말한다. 따라서, "배양"은 "세포 배양" 또는 상기 기술된 그의 동의어들이라면 모두와 상호교환적으로 사용될 수 있다.

용어들 "세포 배양 배지 (cell culture medium)", "배양 배지 (culture medium)", 또는 "배지 (medium)" (및 각 경우에 다수의 배지들)는 본 출원에서 사용되는 바, 세포들의 배양 및/또는 성장을 지원하는 영양적 조성물을 말한다. 본 세포 배양 배지는 완전한 제형물, 즉, 세포들을 배양하도록 보충물을 전혀 요구하지 않는 세포 배양 배지일 수 있거나, 불완전한 제형물, 즉, 보충물을 요구하는 세포 배양 배지일 수 있거나, 불완전한 제형물을 보충할 수 있는 배지일 수 있거나, 완전한 제형물의 경우에는 배양 또는 배양 결과들을 개선할 수 있다. 용어들 "세포 배양 배지", "배양 배지" 또는 "배지" (및 각 경우에 다수의 배지들)는 문맥 상으로 달리 표시되지 않은 경우라면 세포들과 인큐베이션된 적이 없었던 조건화되지 않은 세포 배양 배지를 말한다. 이와 같이, "세포 배양 배지", "배양 배지" 또는 "배지" (및 각 경우에 다수의 배지들)는 배지의 많은 고유의 성분들, 뿐만 아니라 다양한 세포성 대사물들 및 분비된 단백질을 포함할 수 있는, "사용된 (spent)" 또는 "조건화된 (conditioned)" 배지와는 구별된다.

용어 "추출물 (extract)"은 본 출원에서 사용되는 바, 전형적으로 기계적으로 (예로, 압력 처리에 의해) 또는 화학적으로 (예로, 증류, 침전, 효소적 작용 또는 높은 염 처리에 의해) 물질의 처리에 의해 형성되는, 물질의 성분을 포함하는 조성물 또는 물질의 소그룹들의 농축된 제조물을 말한다.

용어 "증가된 에탄올아민 안정성 (increased ethanolamine stability)"은 본 출원에서 사용되는 바, 비-유도체 또는 미격리화된 형태로 에탄올아민을 포함하는 대조군 조성물과 대비하여 에탄올아민의 더 적은 분해를 말한다. 예를 들어, 분말화된 세포 배양 배지의 맥락으로 사용된 바, 용어 "증가된 에탄올아민 안정성"은 대조군 배지에서 에탄올아민이 비-유도체 또는 미격리화된 형태로 존재하는 점을 제외하고는 동일한 성분들을 가지는 대조군 ("대조군 배지"라고도 역시 말함)과 대비하여 에탄올아민의 더 적은 분해를 말한다. 대조군 배지는 분산제로 사용되는 프롤린과 같은 하나 이상의 추가적인 성분들도 역시 포함할 수 있다. 세포 배양 배지가 증가된 안정성을 가지는지 여부를 측정할 목적으로, 본 출원에서 사용되는 바, 에탄올아민의 분해는 분말화된 세포 배양 배지를 서로 다른 온도에서 (예로, 4℃ 및 실온) 7일 동안 보관하고, 상기 분말화된 세포 배양 배지를 주입용 물 (WFI)과 재구성하고, 상기 재구성된 세포 배양 배지에서 에탄올아민의 농도 (mg/L)를 측정한 이후에 측정된다. 서로 다른 온도에서 보관된 배양 배지에서 에탄올아민 농도에서의 더 작은 차이%는 에탄올아민의 더 적은 분해, 따라서 증가된 안정성을 가리킨다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 및 에탄올아민 유도체 또는 안정화된 에탄올아민을 포함하는 분말화된 세포 배양 배지가 에탄올아민 농도에서 강하를 4℃에서 100 mg/L로부터 실온에서 95 mg/L까지 나타내고 (5% 차이), 대조군 배지는 에탄올아민에서 강하를 4℃에서 50 mg/L로부터 실온에서 25 mg/L까지 나타내는 (50% 차이) 경우라면, 하나 이상의 아미노산 및 안정화된 에탄올아민을 포함하는 분말화된 세포 배양 배지는 대조군 배지보다 에탄올아민의 더 적은 분해를 나타내기 때문에 (더 작은 차이%) 증가된 에탄올아민 안정성을 가지게 되는 것이다. 어떠한 차이가 있는지 여부를 관찰하도록 둘 다의 온도에서 NAE를 측정할 것이다. NAE는 에탄올아민과는 다른 분석적 판정기준을 사용하여 검출된다. 도 2A 및 2B 또한 실시예를 참조하라.

용어 "성분 (ingredient)"은 본 출원에서 사용되는 바, 세포들의 성장 또는 증식을 유지하거나 촉진하도록 세포 배양 배지에서 사용될 수 있는, 화학적 또는 생물학적 기원 여부와는 상관없는 화합물이라면 모두를 말한다. 용어들 "성분 (component)", "영양분 (nutrient)" 및 "성분 (ingredient)"은 상호교환적으로 사용될 수 있고 모두 이러한 화합물들을 말하는 것으로 의미된다. 세포 배양 배지에서 사용될 수 있는 전형적인 성분들은 아미노산, 염, 금속, 당, 탄수화물, 지질, 핵산, 호르몬, 비타민, 지방산, 및 단백질 등을 포함한다. 세포들의 배양을 생체외에서 촉진하거나 유지하는 기타 성분들은 특정한 필요에 따라 당업자들에 의해 선택될 수 있다.

용어 "분말 (powder)" 또는 "분말화된 (powdered)"은 본 출원에서 사용되는 바, 과립 형태로 존재하는 조성물을 말하고, 이는 물 또는 혈청과 같은 용매와 복합 또는 응집될 수 있거나 될 수 없다. 용어 "건조 분말 (dry powder)"은 용어 "분말 (powder)"과 상호교환적으로 사용될 수 있지만, "건조 분말"은 본 명세서에서 사용되는 바 과립화된 물질의 전체적인 모양을 단순하게 말하고, 달리 표시되지 않는 경우라면 복합 또는 응집된 용매가 물질에 완전하게 없는 것을 의미하는 것으로 의도되지는 않는다.

용어 "격리화 제제 (sequestering agent)"는 본 출원에서 사용되는 바, 에탄올아민을 보호하고, 또는 다른 경우라면 증가된 에탄올아민 안정성을 부여하는 제제를 말한다. 추가적으로, 피막화는 조절된 방출도 역시 제공한다.

용어 "안정화된 에탄올아민 (stabilized ethanolamine)"은 본 출원에서 사용되는 바, 격리화 제제와 복합되었던 에탄올아민을 말한다.

"1X 제형물 (1X formulation)"은 작동 농도들로 세포 배양 배지에서 확인되는 일정 또는 모든 성분들을 포함하는 수용액이라면 모두를 말한다. "1X 제형물"은, 예를 들어 세포 배양 배지 또는 본 세포 배양 배지를 위한 성분들의 소그룹이라면 모두를 말할 수 있다. 1X 용액에서 성분의 농도는 시험관내에서 세포들을 유지하거나 배양하는 데 사용되는 세포 배양 제형물에서 확인되는 본 성분의 농도와 거의 동일하다. 세포들의 시험관내 배양을 위해 사용되는 세포 배양 배지는 정의에 의해 1X 제형물이다. 많은 성분들이 존재할 때, 1X 제형물에 있는 각 성분은 세포 배양 배지에 있는 이들 성분들의 농도와 거의 동등한 농도를 가진다. 예를 들어, RPMI-1640 배양 배지는 다른 성분들보다도, 0.2 g/L의 L-아르기닌, 0.05 g/L의 L-아스파라진, 및 0.02 g/L의 L-아스파트산을 포함한다. 이들 아미노산의 "1X 제형물"은 용액에서 이들 성분들의 거의 동일한 농도를 포함한다. 따라서, "1X 제형물"을 말할 때, 용액에 있는 각 성분은 기술되고 있는 세포 배양 배지에서 확인되는 것과 동일 또는 거의 동일한 농도를 가지는 것이 의도된다. 세포 배양 배지의 1X 제형물에서 성분들의 농도들은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 약제학적 및 세포-기초 요법들을 위한 세포 배양 기술학 (Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, 42-50; Sadettin Ozturk and Wei-Shou Hu eds., Taylor and Francis Group 2006)을 참조하고, 이는 본 명세서에서 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있다. 그러나, 삽투압 및/또는 pH는, 특히 더 적은 성분들이 1X 제형물에 포함될 때, 배양 배지와 대비하여 1X 제형물에서 서로 달라질 수 있다.

"10X 제형물 (10X formulation)"은 본 용액에 있는 각 성분이 세포 배양 배지에서 동일한 성분보다 약 10배 더 농축된 용액을 말한다. 예를 들어, RPMI-1640 배양 배지의 10X 제형물은 다른 성분들보다도, 2.0 g/L의 L-아르기닌, 0.5 g/L의 L-아스파라진, 및 0.2 g/L의 L-아스파트산을 포함할 수 있다 (상기 1X 제형물과 비교하라). "10X 제형물"은 1X 배양 배지에서 확인되는 약 10배의 농도로 많은 추가적인 성분들을 포함할 수 있다. 바로 자명할 바와 같이, "5X 제형물", "25X 제형물", "50X 제형물", "100X 제형물", "500X 제형물", 및 "1000X 제형물"은 1X 세포 배양 배지와 대비하여 각각 약 5-, 25-, 50-, 100-, 500-, 또는 1000배 농도들로 성분들을 포함하는 용액들을 말한다. 다시, 배지 제형물 및 농축된 용액의 삽투압 및 pH는 변화할 수 있다. 제형물은 구성성분들 (components) 또는 성분들을 특정한 세포 배양 프로토콜의 측면에서 1X로, 그러나 다른 배양 프로토콜 또는 다른 베이스 배지의 측면에서는 예를 들어 2, 2.5, 5, 6.7, 9, 12X 등의 농도로 포함할 수 있다.

본 발명은 건조 및 액체 형태에서 에탄올아민의 안정화에 관한 것이다. 한 가지 관점은 세포 배양 배지, 상세하게는 건조 형식 (또는 분말화된) 세포 배양 배지에서 에탄올아민의 안정성을 증가시키는 방법들에 관한 것이다. 에탄올아민은 건조 형식에서는 액체 형식에서보다 덜 안정하다. 건조 형식에서, 에탄올아민을 탄수화물 (예로, 포도당) 단독 (아미노산 없이)과 조합하는 것은 에탄올아민 분해가 거의 없거나 전혀 없는 결과를 가져온다. 그러나, 아미노산의 존재 시, 유의한 에탄올아민 분해가 특히 승온 (예로, 30℃)에서 신속하게 일어난다.

출원인들은 에탄올아민 분해를 감소시키는 방법들을 발견하였다. 이들 방법들이 세포 배양 배지의 맥락에서 일차적으로 예시되고 있더라도, 증가된 에탄올아민 안정성이 건조 또는 반-건조 형식에서 바람직한 것이라는 어떠한 맥락에서도 그들이 적용될 수 있는 것으로 이해된다. 에탄올아민은 세제, 약제, 및 화장품과 같은 기타 분야들에서, 뿐만 아니라 물을 처리하고 (부식을 조절하도록) 기체로부터 산들을 제거하는 방법들에서 사용되기 때문에 당업자라면 이들 기타 적용들에서 에탄올아민을 안정화하도록 본 출원에 기술된 방법들을 유사하게 적응시킬 수 있다.

한 가지 관점은 에탄올아민 아민기에서 공유 결합을 가지는 에탄올아민 유도체들을 사용하여 에탄올아민 안정성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

에탄올아민 안정성을 증가시키는 또 다른 방법은 에탄올아민 및 격리화 제제 간의 복합체를 형성하는 단계가 관여한다. 한 가지 구현예에서, 격리화 제제는 당 (예로, 포도당), 또는 그의 유도체, 또는 케토산과 같은 케톤- 또는 알데하이드-포함 분자이다. 또 다른 구현예에서, 에탄올아민은 격리화 제제 내에 포매 또는 피막화된다.

1. 아민기의 공유 결합

상기에서 주목된 바와 같이, 에탄올아민의 안정성을 증가시키는 한 가지 방식은 에탄올아민의 아민기가 아마이드 (또는 펩타이드) 결합과 같은 공유 결합에 의해 안정화되는 에탄올아민 유도체를 사용하는 것이다. 아마이드 결합은 한 분자의 카르복실기가 다른 분자의 아민기와 반응할 때 두 개 분자들 간에 형성되는 공유 결합이고, 이에 의해 한 분자의 물을 방출한다. 한 가지 구현예에서, 에탄올아민 유도체는 다음의 화학식을 가지고:

여기에서 R은 아세틸기 또는 아미노산이다.

R이 아세틸기일 때, 에탄올아민 유도체는 N-아세틸에탄올아민 (NAE)이 되고 다음의 구조를 가진다:

본 명세서에서 예시된 에탄올아민과 유사하게, 아민들을 포함하고 때로 소정의 조건에서 민감성일 수 있는 다른 물질들로는 알칸올아민, 또는 스퍼민 (spermine), 스퍼미딘 (spermidine), 퓨트레신 (putrescine), 카다버린 (cadaverine), 아난다미드 (anandamide), 폴리라이신 (polylysine), 트리라이신 (trilysine), 디알릴 디메틸 염화암모니움, 폴리알릴아민 (polyallylamine), 폴리비닐아민, 폴리에틸아민, 폴리부틸아민, 폴리이소부틸아민, 폴리프로필아민 헥사메틸렌 디아민, 에틸렌디아민, N-에틸에틸렌디아민, N,N'-디에틸에틸렌디아민, N-에틸에탄올아민, 트리에틸렌디아민, N-메틸몰포린, 펜타메틸 디에틸렌트리아민, 디메틸시클로헥실아민, 테트라메틸에틸렌디아민, 1-메틸-4-디메틸아미노에틸-피페라진, 3-메톡시-N-디메틸-프로필아민, N-에틸몰포린, 디에틸에탄올아민, N-코코몰포린 (N-cocomorpholine), N,N-디메틸-N',N'-디메틸이소프로필-프로필렌 디아민, N,N-디에틸-3-디에틸 아미노프로필아민, 디메틸-벤질 아민 등과 같은 폴리아민을 포함할 수 있고, 또한 본 명세서에서 기술된 안정화를 위한 아세틸화 방법이 마찬가지로 이들 화합물들에 적용될 수 있다.

또한, R은 이에 제한되는 것은 아니지만 알라닌, 아르기닌, 아스파라진, 아스파트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 라이신, 메티오닌. 페닐알라닌, 프롤린, 하이드록시프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 및 발린을 포함하는 아미노산이라면 모두일 수 있다. 한 가지 구현예에서, 아미노산은 비극성 측쇄를 가진다. 또 다른 구현예에서, 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 또는 이소루이신이다.

또 다른 구현예에서, 에탄올아민 유도체는 1,3,5-트리스(2-하이드록시에틸)-s-트리아진 (그로탄)이다. 그로탄은 에탄올아민을 포름알데하이드와 반응시켜서 형성될 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 가지 관점은 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 에탄올아민을 소위 아세틸 화합물과 조합하는 단계를 포함하고, N-아세틸에탄올아민이 증가된 안정성을 나타내는, 조성물에서 에탄올아민의 안정성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 또 다른 관점은 증가된 에탄올아민 안정성을 나타내는, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 에탄올아민 유도체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 가지 구현예에서, 본 조성물은 하나 이상의 아미노산을 포함하는 세포 배양 배지이다.

2. 케톤- 또는 알데하이드-포함 분자와의 상호작용

에탄올아민을 피막화 또는 격리화 제제와의 상호작용을 통하여 안정화하는 것도 역시 가능하고, 여기에서 격리화 제제는 당, 케톤- 또는 알데하이드-포함 분자, 상세하게는 당 또는 케토산과 같이 대사적 경로에 관여하는 것이다. 본 유형의 격리화는 미세캡슐이 재구성 시 용질과 함께 용해되거나 실질적으로 용해되고, 캡슐에서 당, 케토 또는 알데하이드의 농축이 최종 배지 사용을 위해 고려되는 보호작용 또는 피막화의 유형을 가져올 수 있다. 이론이라면 모두에 얽매이지 않더라도, 케톤- 또는 알데하이드-포함 또는 당 분자는 에탄올아민과 조합될 때 에탄올아민 주변에서 결정 구조를 형성하고, 상기 결정 구조는 상세하게 에탄올아민이 건조 형식으로 있을 때 분해로부터 에탄올아민을 보호하도록 돕는 것으로 보인다.

한 가지 구현예에서, 격리화 제제는 당이다. 한 가지 구현예에서, 당은 알로스, 알트로스, 과당, 갈락토스, 포도당, 굴로스, 이도스, 만노스, 소보스, 탈로스, 또는 타가토스와 같은 육탄당, 또는 당 알코올, 아미노 당, 유론산, 또는 인산화된 당과 같은 그의 유도체이다. 또 다른 구현예에서, 당은 아라비노스, 리보스, 리불로스, 자일로스, 자일루로스, 또는 라이조스와 같은 오탄당, 또는 당 알코올, 아미노 당, 유론산, 또는 인산화된 당과 같은 그의 유도체이다. 또 다른 구현예에서, 당은 에리트룰로스, 에리트로스, 또는 트레오스와 같은 사탄당, 또는 당 알코올, 아미노 당, 유론산, 또는 인산화된 당과 같은 그의 유도체이다. 또 다른 구현예에서, 당은 글리세르알데하이드 또는 디하이드록시아세톤과 같은 삼탄당, 또는 당 알코올, 아미노 당, 유론산, 또는 인산화된 당과 같은 그의 유도체이다.

에탄올아민을 안정화하는 데 사용될 수 있는 당 알코올들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 알리톨, 알트리톨, 프럭티톨, 갈락티톨, 글루시톨, 굴리톨, 이디톨, 만니톨, 소르비톨, 탈리톨, 타가티톨, 아라비니톨, 리비톨, 리불리톨, 자일리톨, 자일루리톨, 라이지톨, 에리트루리톨, 에리트리톨, 또는 트레이톨을 포함한다. 에탄올아민을 안정화하는 데 사용될 수 있는 아미노 당은, 이에 제한되는 것은 아니지만 알로사민, 알트로사민, 프럭토사민, 갈락토사민, 글루코사민, 굴로사민, 이도사민, 만노사민, 소르보사민, 탈로사민, 타가토사민, 아라비노사민, 리보사민, 리불로사민, 자일로사민, 자일룰로사민, 라이조사민, 에리트룰로사민, 에리트로사민, 또는 트레오사민을 포함한다. 에탄올아민을 안정화하는 데 사용될 수 있는 유론산들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 알루론산, 알트루론산, 프럭투론산, 갈락투론산, 글루쿠론산, 굴루론산, 이듀론산, 만누론산, 소르부론산, 탈루론산, 타가투론산, 아라비누론산, 리부론산, 리부루론산, 자일루론산, 자일룰루론산, 라이주론산, 에리트룰루론산, 에리트루론산, 또는 트레우론산을 포함한다. 에탄올아민을 안정화하는 데 사용될 수 있는 인산화된 당은, 이에 제한되는 것은 아니지만 글리세르알데하이드 3-포스페이트 및 디하이드록시아세톤 포스페이트를 포함한다.

다른 구현예들에서, 당은 말토스, 락토스, 락투로스, 트레할로스, 셀로바이오스, 또는 설탕과 같은 이당류이다. 또 다른 구현예에서, 격리화 제제는 이에 제한되는 것은 아니지만 1) 포도당, 만노스 등 처럼 육탄당과 같은 당, 2) 아세토아세트산과 같은 베타-케토산, 3) 레불린산과 같은 감마-케토산, 4) 피루브산, 옥살로아세트산, 글리콜산, 또는 케토글루타르산과 같은 알파-케토산, 또는 5) 말토덱스트린들, 기타 올리고당 또는 다당류들, 검들, 아라비노갈락탄 등 같은 당-유사 유도체들을 포함하는, 케토산, 또는 당이다.

에탄올아민 및 케토- 또는 알데하이드-포함 분자 간의 복합체는 물에 에탄올아민을 용해시킨 다음 주어진 무게의 케톤- 또는 알데하이드-포함 분자에 추가하여 형성될 수 있다. 에탄올아민/케톤 또는 알데하이드/당/당 유도체/물 혼합물은 페이스트-유사 점도를 형성할 때까지 스파출라와 같은 기기로 반죽된다. 페이스트는 편평하게 도말되고 후드 하에서 밤샘 건조되며, 선택적으로 건조기로 최종 건조 과정이 이어진다. 건조된 혼합물은 분말화된 세포 배양 배지와 같은 다른 조성물과 이를 혼합하기 이전에 원하는 특정된 크기들로 분말화된다 (fitzmilled). 포도당 같은 당이 피막화 기질의 일부일 때, 포도당 농도는 조정되어 포도당의 일부만이 기질을 제조하는 데 사용되고 배지의 재구성 시 포도당의 최종 농도는 이상적인 수치로 유지된다.

한 가지 관점에서, 본 발명은 격리화 제제와 복합된 에탄올아민 ("격리화된 에탄올아민")을 조성물과 조합하는 단계를 포함하는, 상기 격리화된 에탄올아민을 포함하는 조성물은 증가된 에탄올아민 안정성을 나타내고, 상기 격리화 제제는 본 명세서에서 기술된 바와 같이 케톤- 또는 알데하이드-포함 분자를 포함하는, 조성물에서 에탄올아민의 안정성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 선택적으로 상기 조합하는 단계 이전에 격리화된 에탄올아민을 생산하도록 에탄올아민을 케톤- 또는 알데하이드-포함 분자와 복합하는 단계를 좀 더 포함한다. 한 가지 구현예에서, 케톤- 또는 알데하이드-포함 분자는 당, 또는 그의 유도체, 또는 케토산이다. 한 가지 구현예에서, 상기 조성물은 하나 이상의 아미노산을 포함하는 세포 배양 배지이다. 상기 세포 배양 배지는 바람직하게 분말화된 세포 배양 배지이다. 한 가지 구현예에서, 분말화된 세포 배양 배지는 진보된 과립화 기술학 세포 배양 배지이다. 에탄올아민 안정성을 증가시키는 케톤- 또는 알데하이드-포함 분자의 능력은 본 출원에서 기재된 방법들을 포함하는, 당해 기술분야에 알려져 있는 기법들을 사용하여 평가될 수 있다.

또 다른 관점은 증가된 에탄올아민 안정성을 나타내는, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 케톤- 또는 알데하이드-포함 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 가지 구현예에서, 케톤- 또는 알데하이드-포함 분자는 당, 또는 그의 유도체, 또는 케토산이다. 한 가지 구현예에서, 상기 조성물은 하나 이상의 아미노산을 포함하는 세포 배양 배지이다. 한 가지 구현예에서, 세포 배양 배지는 좀 더 나아가 탄수화물을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 세포 배양 배지는 단백질이 없다. 바람직하게 세포 배양 배지는 분말화된 세포 배양 배지이다. 한 가지 구현예에서,분말화된 세포 배양 배지는 진보된 과립화 기술학 세포 배양 배지이다.

3. 피막화

에탄올아민 또는 기타 불안정한 배지 화합물들을 안정화하는 또 다른 방식은 격리화 제제 내에 그들을 피막화 또는 포매하는 것이다. 이론이라면 모두에 얽매이지 않더라도, 에탄올아민과 같은 민감성 성분들을 또 다른 분자 내에 피막화 또는 포매하는 단계는 에탄올아민의 분해를 촉진하거나, 그의 안정성을 감소시키는 다른 성분들 또는 조건과 에탄올아민의 직접적인 접촉을 감소시키는 것으로 보인다. 자동화된 또는 통제가능한 시스템들이 피막화 공정을 위해 마찬가지로 사용가능하고, 예를 들어 하이드로캡슐 피막화 기계를 사용하는 공동-압출, 정전기적 비드 생성기, 진동 노즐 기법 (이노테크사), 제트커터 (Jetcutter) 기술학 등이다. 비드의 기능적 특성들에 영향을 미칠 수 있는 매개변수들로는 미세캡슐 농도, CaCl₂%, 알기네이트%, 방출 속도, 용해도, 건조 프로토콜, 마이크로비드 크기, 균질도, 에탄올아민 보호작용, 및 코팅 절차 (PLL 등) 등을 포함할 수 있다.

출원인들은 미세피막화 방법에 의해 에탄올아민 분해를 감소시키는 방법들을 발견하였다. 이들 방법들이 에탄올아민 안정화의 맥락 내에서 일차적으로 예시되고 있더라도, 이것은 안정화되는 것이 필요한 감수성 화학물질 또는 화합물이라면 모두를 안정화하는 데 사용될 수 있다. 상세하게는, 세포 배양 배지에서 안정성을 위한 맥락이 본 경우에서 또한 실시예들에서 언급되어 왔다. 그러나, 미세피막화 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만 비타민, 불안정한 아미노산, 사이토카인, 성장인자, 민감성 및 가치있는 단백질 또는 펩타이드 등을 포함하는 감수성 화합물이라면 모두를 안정화하는 데 또한 안정화된 화합물의 증진된 전달을 위해 사용될 수 있고, 세포 배양 배지 개발을 넘어서는 분야들에 적용될 수 있다. 예를 들어, 덴드리머의 피막화는 산업적 적용들, 약제 (약물 전달), 영양제들, 식품 보충물들, 비타민 강화된 제형물들, 미용 산업, 효소 산업, 식품 산업에서와 같은 완충액들, 세제 등에서 적용가능할 수 있다. 이들 방법들 및 조성물들은 다른 분야들에서 사용될 수 있기 때문에, 당업자라면 다른 적용들에서 다른 감수성 또는 분해-경향성 화합물들을 안정화하도록 본 출원에서 기술된 방법들을 유사하게 적응할 수 있다.

한 가지 구현예에서, 알기네이트 같은 격리화 제제가 에탄올아민-덴드리머 복합체를 피막화 또는 포매하는 데 사용된다. 덴드리머는 정의된 구조적 및 분자량 특징들을 그들에게 주도록 조절된 연속적 공정들을 사용하여 만들어질 수 있는 과다-분지된 합성 거대분자들이다. Astruc et al., Chem. Rev. 2010, 110:1857-1959에 검토되어 있고, 이는 본 명세서에 의해 그의 전부가 참고문헌으로 통합된다. 덴드리머는 중앙의 코아, 반복된 분지들, 및 표면 기능기들을 가진다. 반복된 분지들은 세대 (generations)라고도 부르는 일련의 동심원적 층들로 조직화된다. 덴드리머의 표면 기능기들의 수, 분자량 및 크기는 중합체의 세대 (층들의 수)의 함수로서 지수적으로 증가하고, 합성 동안 조절될 수 있다. 서로 다른 유형들의 덴드리머는 중합화 과정을 개시하는 코아 구조를 기초로 하여 합성될 수 있다. 본 발명의 미세피막화된 덴드리머는 도 6에 기술되어 있다. 한 가지 구현예에서, 덴드리머는 캡슐 내, 예를 들어 알기네이트 내에 피막화된다. 알기네이트는 덴드리머를 보호하고, 재구성 시 민감성 물질과 함께 덴드리머를 방출한다. 알기네이트는 여과 동안 막 필터 상에서 보유된다. 노출된 덴드리머는 덴드리머 상에 존재하는 세포 인식 부위들의 존재로 인해 불안정 물질을 세포로 표적화할 수 있고, 이로 인해 세포로의 성장인자, 비타민 등과 같은 민감성 또는 저농도 물질들의 사용가능성을 개선시킨다. 당업자라면 숙지하고 있을 바와 같이, 알기네이트를 이외에도 피막화 제제라면 모두가 덴드리머, 예를 들어 알기네이트, 폴리-L-락트산 (PLL), 키토산, 아가로스, 젤라틴, 하이알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 헤파란 설페이트, 젤란검, 잔탄검, 구아르검, 수용성 셀룰로스 유도체, 및 카라지난 등을 보호하도록 사용될 수 있다. 미세피막화를 위해 사용될 수 있는 기타 스캐폴딩 기질로는 폴리-글리콜산, PLGA (폴리-락트-co-글리콜산), 콜라겐, 폴리하이드록시알카노에이트 (PHA), 폴리-ε-카프로락톤, 폴리-오르토 에스테르, 폴리-안하이드라이드, 폴리-포스파젠, 폴리-아미노산, 폴리디메틸실록산, 폴리우레트란, 폴리-테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리설폰, 폴리-메틸 메타크릴레이트, 폴리-2-하이드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아마이드, 폴리프로필렌, 폴리-염화비닐, 폴리스티렌, 폴리-비닐 피롤리돈 등을 포함한다.

덴드리머 코아 구조들은 전반적인 형태, 밀도 및 표면 기능성과 같은 분자의 여러 특징들을 말해준다 (Tomalia et al., Chem. Int. Ed. Engl., 1990, 29: 5305). 구형의 덴드리머는 일반적으로 삼가 (trivalent) 개시인자 코아로서 암모니아를, 또는 사가 (tetravalent) 개시인자 코아로서 에틴렌디아민 (EDA)을 가진다. 최근에 기술된 막대-모양의 덴드리머는 (Yin et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120: 2678) 다양한 길이들의 폴리에틸렌이민 선형의 코아들을 사용하고 있고; 코아가 더 길어질수록 막대도 더 길어진다. 덴드리머 거대분자들은 킬로그램 양들로 시판되고 있으며, 소정의 생체공학 적용들을 위해 현재의 의약품 제조관리 공정들 (GMP) 하에서 생산될 수 있다.

덴드리머는 일반적으로 수렴적 (convergent) 또는 분지적 경로들에 의해 합성된다. 분지적 경로에서, 조립은 중앙의 코아로 시작하고 일련의 반응에 의해 외부로 연장된다. 각각의 추가적인 일련의 반응은 더 고차 세대 덴드리머를 유도한다. 수렴적 경로에서, 조립은 말단에서 시작하고 궁극적으로 코아에 부착되는 분지들로 내부에 세워진다. 덴드리머는 디엘-알더 반응, 티올-엔 반응, 및 아자이드-알킨 반응을 사용하는 클릭 화학 (click chemistry)을 통해 (예로, 미국 특허출원 공고번호 제 20050222427호 및 국제특허출원 제 PCT/US03/17311호를 참조하고, 이들 둘 다는 본 명세서에 의해 그들의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있다) 합성될 수 있다. Franc et al., Chem. Eur. J., 2009, 15(23): 5631-39; Killops et al., J Am. Chem. Soc., 2008, 130(15): 5062-64; Franc et al., Chem. Comm., 2008, 5267-76; 및 Carlmark et al., Chem. Soc. Rev., 2009, 38: 352-62을 참조하고, 이들 모두는 본 명세서에 의해 그들의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있다.

덴드리머는 초분자화학, 전기화학, 광화학, 나노입자 합성 오염관리, 염색 채색, 단일분자 막들의 제조, 에폭시 레진들의 경화, 촉매작용, 약물 전달, 및 유전자 형질전환을 포함하는, 많은 분야들에서 사용되어 왔다. Cheng, et al., J. Pharm. Sciences, 2008, 97: 123-43. 덴드리머는 치료요법적 분자들과 같은 화합물들을 피막화하는 데 사용될 수 있는 비어있는 내부 공간들 또는 열린 입체구조들을 가진다 (낮은 세대 덴드리머의 경우). 표면 기능기들의 존재도 역시 피막화된 화합물들의 용해도를 증진하도록 돕는다.

수많은 미국 특허들이 덴드리머를 생산하는 방법들 및 이를 위한 조성물들을 기술하고 있다. 일정의 대표적인 특허들이 본 출원에 기술된 방법들 및 조성물들에서 유용할 수 있는 덴드리머 조성물들의 예들로서 하기에 제공된다. 이들 특허들은 단지 설명적 예들이고, 수많은 기타 유사한 덴드리머 조성물들이 본 출원에서 기술된 방법들 및 조성물들에서 사용될 수 있을 것이다.

모두가 본 명세서에 의해 그들의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는, 미국 특허 제 4,507,466호, 미국 특허 제 4,558,120호, 미국 특허 제 4,568,737호, 및 미국 특허 제 4,587,329호는 통상적인 별모양 중합체들보다 더 큰 말단 밀도들을 가진 조밀한 별 중합체들을 제조하는 방법들을 기술하고 있다. 이들 중합체들은 통상적인 별 중합체들보다 더 크고/ 더욱 일정한 반응성을 가진다, 예로 제 3세대 조밀한 별 중합체들이다. 이들 특허들은 좀 더 나아가 아미노아민 덴드리머의 성질 및 덴드리머의 3차원 분자적 반경을 기술하고 있다.

본 명세서에 의해 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는, 미국 특허 제 4,631,337호는 가수분해적으로 안정한 중합체들을 기술하고 있다. 본 명세서에 의해 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는, 미국 특허 제 4,694,064호는 막대-모양의 덴드리머를 기술하고 있다. 본 명세서에 의해 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는, 미국 특허 제 4,713,975호는 조밀한 별 중합체들 또한 바이러스들, 박테리아들 및 효소들을 포함하는 단백질의 표면들을 특성 분석하는 그들의 용도를 기재하고 있다. 연결된 조밀한 별 중합체는 본 명세서에 의해 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는, 미국 특허 제 4,737,550호에 기술되고 있다. 본 명세서에 의해 그들의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는, 미국 특허 제 4,857,599호 및 미국 특허 제 4,871,779호는 이온-교환 레진들, 킬레이트화 레진들로서 유용한 고정된 코아들 상의 조밀한 별 중합체들 및 이러한 중합체들을 제조하는 방법들을 기술하고 있다.

본 명세서에 의해 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는, 미국 특허 제 5,338,532호는 보유된 농업적, 약제학적 또는 기타 물질의 적어도 하나의 단위와 연관하여, 덴드리머(들)의 별폭발 (starburst) 결합체에 관한 것이다. 본 특허는 단위 중합체 당 보유된 물질들의 높은 농도들의 운반, 조절된 운반, 표적화된 운반의 수단 및/또는, 예로 약물들, 항생제들, 일반적 및 특이적 독소들, 금속 이온들, 방사성핵종들, 신호 생성자들, 항체들, 인터루킨들, 호르몬, 인터페론들, 바이러스들, 바이러스성 단편들, 살충제들, 및 항미생물제와 같은 복수의 종들을 제공하는 덴드리머의 용도를 기술하고 있다.

기타 유용한 덴드리머 유형의 조성물들은 조밀한 별 중합체들이 소수성 외부 껍질을 제공할 수 있는 소수성 그룹으로 캡 형성에 의해 변형되는, 미국 특허 제 5,387,617호, 미국 특허 제 5,393,797호, 및 미국 특허 제 5,393,795호에 기술되고, 이들은 본 명세서에 의해 그들의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있다. 본 명세서에 의해 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는, 미국 특허 제 5,527,524호는 항체 결합체들에서 아미노 말단화된 덴드리머의 용도를 기재하고 있다.

금속 이온 운반체들로서 덴드리머의 용도는 본 명세서에 의해 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는, 미국 특허 제 5,560,929호에 기술되고 있다. 본 명세서에 의해 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는, 미국 특허 제 5,773,527호는 빗-폭발 입체형태를 가지는 교차결합되지 않은 다중분지된 중합체들 및 이들을 제조하는 방법들을 기재하고 있다. 본 명세서에 의해 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는, 미국 특허 제 5,631,329호는 분지화로부터 보호된 분지된 중합체들의 첫 번째 집합을 형성하고; 코아로 이식하고; 분지된 중합체의 첫 번째 집합을 탈보호하고; 다음으로 분지화로부터 보호된 분지된 중합체의 두 번째 집합을 형성하고; 또한 분지된 중합체들의 첫 번째 집합을 가진 코아로 이식하는 단계에 의해, 고분자량의 다중분지된 중합체를 생산하는 방법을 기술하고 있다.

본 명세서에 의해 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는, 미국 특허 제 5,902,863호는 친유성 오가노실리콘 및 친수성 폴리아니클로아민 (polyanicloamine) 나노범위 (nanscopic) 도메인들을 포함하는 덴드리머 연결망들을 기술하고 있다. 연결망들은 PAMAM (친수성) 또는 폴리프로필렌이민 내부들 및 오가노실리콘 외부층들을 가지는 공중합덴드리머 전구체들로부터 제조된다.

본 명세서에 의해 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는, 미국 특허 제5,795,582호는 인플루엔자 항원을 위한 아쥬반트들 (adjutants)로서 덴드리머의 용도를 기술하고 있다. 본 명세서에 의해 그들의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는, 미국 특허 제 5,898,005호 및 미국 특허 제 5,861,319호는 분석질의 농도를 결정하는 특이적 면역결합 검정법들을 기술하고 있다. 본 명세서에 의해 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는, 미국 특허 제 5,661,025호는 표적 부위에 뉴클레오타이드들의 전달을 돕도록 덴드리머 다중양이온을 포함하는 자가-조립 폴리뉴클레오타이드 전달 시스템의 자세한 점들을 제공한다.

본 명세서에 의해 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는, 미국 특허 제6,471,968호는 각각이 특이적 기능성을 가진 둘 이상의 덴드리머의 조합, 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머 및 폴리프로필아민 (POPAM) 덴드리머를 포함하는 덴드리머 복합체와 같은 덴드리머 단일 복합체를 기술하고 있다.

한 가지 구현예에서, 본 출원에 기술된 방법들에서 사용된 덴드리머는 폴리아미도아민이다. 폴리아미도아민, 또는 PAMAM은 생물학적 분야에서 가장 공통적으로 사용되는 덴드리머의 하나이고, Starburst^TM PAMAM 덴드리머를 판매하는 덴드리테크 나노테크놀로지사 (Dendritech Nanotechnologies Inc.)를 포함하는 복수의 공급원을 통해 시판된다. 본 출원에 기술된 방법들에서 사용될 수 있는 기타 덴드리머는, 이에 제한되는 것은 아니지만 폴리프로필렌이민 (PPI) 덴드리머, 인 덴드리머, 폴리라이신 덴드리머, 폴리프로필아민 덴드리머 (POPAM), 폴리에틸렌이민 덴드리머, 이프티센 덴드리머, 지방족 폴리(에테르) 덴드리머, 또는 방향족 폴리에테르 덴드리머를 포함한다. 에탄올아민 안정성을 증가시키는 덴드리머의 능력은 본 출원에 기재된 방법들을 포함하는, 당해 기술분야에 알려져 있는 기법들을 사용하여 평가될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 에탄올아민을 피막화 또는 포매하는 데 사용되는 격리화 제제는 미세캡슐, 예를 들어 알기네이트이다. 미세캡슐들은 약물 전달 및 세포 성장 및 생존도를 증진하도록 세포 배양에서 성장하는 세포들의 고정화를 포함하는 많은 목적들을 위해 사용되어 왔다. 예로, Serp et al., Biotechnology and Bioengineering, 2000, 70(1): 41-53; Breguet et. al., Cytotechnology, 2007, 53: 81-93; Chayosumrit et al., Biomaterials, 2010, 31: 505-14; 미국 특허 제 7,482,152호; 및 미국 특허 제 7,740,861호를 참조하고, 이들 모두는 본 명세서에 의해 그들의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있다.

한 가지 구현예에서, 미세캡슐은 알기네이트, 폴리-L-락트산, 키토산, 아가로스, 젤라틴, 하이알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 헤파란 설페이트, 젤란검, 잔탄검, 구아르검, 수용성 셀룰로스 유도체 및 카라지난으로부터 선택되는 물질로 구성된다. 미세캡슐은 전형적으로 2 mm 이하의 반경, 보통 0.05 내지 1.5 mm의 반경 범위를 가지는 구형의 입자들이다. 에탄올아민 안정성을 증가시키는 미세캡슐의 능력은 본 출원에 기재된 방법들을 포함하는, 당해 기술분야에 알려져 있는 기법들을 사용하여 평가될 수 있다.

미세피막화된 에탄올아민을 형성한 이후에, 다양한 용액들이 미세캡슐들에 추가적인 층들을 제공하도록 적용될 수 있다. 예를 들어, 미세피막화된 에탄올아민은 폴리-L 라이신 또는 폴리오르니틴으로 코팅될 수 있고, 선택적으로 알기네이트, 폴리-L-락트산, 키토산, 아가로스, 젤라틴, 하이알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 헤파란 설페이트, 젤란검, 잔탄검, 구아르검, 수용성 셀룰로스 유도체 및 카라지난으로부터 선택되는 물질로 외부 코팅 단계가 이어진다.

한 가지 구현예에서, 미세캡슐은 알기네이트를 포함한다. 전형적으로, 알기네이트 미세캡슐들은 다중음이온 알기네이트 및 염화칼슘과 같은 이가 또는 삼가의 다가 양이온 간의 교차결합에 의해 형성된다. 염화마그네슘, 염화바륨, 및 황화 알루미늄과 같은 이가 또는 삼가 양이온들을 가지는 기타 염이 사용될 수 있다, 한 가지 구현예에서, 알기네이트 미세캡슐은 폴리-L 라이신 또는 폴리오르니틴과 같은 코팅을 추가로 포함한다.

한 가지 관점에서, 본 발명은 격리화 제제와 복합된 에탄올아민 ("격리화된 에탄올아민")을 조성물과 조합하는 단계를 포함하고, 상기 격리화된 에탄올아민을 포함하는 조성물은 증가된 에탄올아민 안정성을 나타내고, 상기 격리화 제제는 본 명세서에서 기술된 바와 같이 덴드리머 또는 미세캡슐을 포함하는, 조성물에서 에탄올아민의 안정성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 선택적으로 상기 조합하는 단계 이전에 격리화된 에탄올아민을 생산하도록 에탄올아민을 덴드리머 또는 미세캡슐과 복합하는 단계를 좀 더 포함한다.

한 가지 구현예에서, 미세캡슐은 알기네이트, 폴리-L-락트산, 키토산, 아가로스, 젤라틴, 하이알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 헤파란 설페이트, 젤란검, 잔탄검, 구아르검, 수용성 셀룰로스 유도체 및 카라지난으로부터 선택되는 물질로 구성된다. 미세캡슐은 선택적으로, 예를 들어 폴리-L 라이신 또는 폴리오르니틴으로 코팅된다. 또 다른 구현예에서, 덴드리머는 폴리아미도아민 덴드리머, 폴리프로필렌이민 덴드리머, 또는 폴리프로필아민 (POPAM) 덴드리머이다. 한 가지 구현예에서, 본 조성물은 하나 이상의 아미노산을 포함하는 세포 배양 배지이다. 바람직하게 세포 배양 배지는 분말화된 세포 배양 배지이다. 한 가지 구현예에서, 분말화된 세포 배양 배지는 진보된 과립화 기술학 세포 배양 배지이다. 에탄올아민 안정성을 증가시키는 덴드리머 또는 미세캡슐의 능력은 본 출원에 기재된 방법들을 포함하는, 당해 기술분야에 알려져 있는 기법들을 사용하여 평가될 수 있다.

본 발명은 불안정 물질이라면 모두 예를 들어 에탄올아민을 보호하는, 민감성 성분 또는 성분들을 포함하는 미세캡슐 또는 덴드리머-불안정 성분 또는 성분들 복합체를 포함하는 미세캡슐을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이들 미세캡슐들 또는 미세캡슐/덴드리머 조성물들은 건조되고, 건조 형식 조성물들이라면 모두와 혼합되어 상온 등에서 보관 기간을 증가시키고, 저장을 증가시키고, 불안정 물질을 보존할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 미세캡슐 및/또는 덴드리머 조성물은 증가된 에탄올아민 안정성을 나타내고, 또한 건조되고 AGT, DMP, APM 등과 같은 건조 형식 배지 조성물들이라면 모두와 혼합되어 상온 등에서 건조 분말 배지들로 보관 기간을 증가시키고, 저장 취급을 증가시키고, 에탄올아민을 보존한다. 한 가지 구현예에서, 본 건조 배지 조성물은 마찬가지로 하나 이상의 아미노산을 배지 피드들 또는 배지 보충물에서 더 높은 농도로 포함한다. 한 가지 구현예에서, 덴드리머성 조성물들을 추가로 포함하는 세포 배양 배지는 특이적으로 세포들을 향해 소정의 불안정 물질들을 또는 세포 표적화된 물질들을 효과적으로 전달할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 불안정 물질 또는 표적화된 물질은 그것이 표적하는 세포에 영향을 준다. 한 가지 구현예에서, 본 효과는 세포 성장, 증가된 단백질 생산, 증가된 삼투-내성, 또는 세포 표적화 또는 불안정 물질을 요구하는 기타 다른 원하는 특징일 수 있다.

안정화된 에탄올아민 (불안정 물질)의 검출: NAE를 위해 LS-질량 분광분석법 (LS-MS) (도 2B)를 통해, 체로 분리 (sifting) 또는 기타 다른 수단에 의해 건조 캡슐들 또는 비드들의 분리, 다음으로 용매로 비드들을 용해하여 시행될 수 있다. 비드들이 불용성인 경우라면, 그들은 여과되어 배출될 수 있는 한편, 비드들이 용해성인 경우라면 막 필터 상에 아무 것도 존재하지 않지만, 둘 다의 경우들에서 불안정 물질, 예를 들어 에탄올아민은 상청액에서 LS-MS를 통해 검출될 수 있다.

세포 배양 배지

세포 배양 배지는 많은 성분들로 구성되고, 이들 성분들은 한 배양 배지로부터 또 다른 배지까지 다양화된다. 세포 배양 배지는 완전한 제형물, 예로 세포들을 배양하도록 보충물을 전혀 요구하지 않는 세포 배양 배지일 수 있거나, 불완전한 제형물, 예로 보충물을 요구하는 세포 배양 배지일 수 있거나, 불완전한 제형물을 보완하는 데 사용되는 보충물일 수 있거나, 완전한 제형물의 경우에는 배양 또는 배양 결과들을 개선할 수 있다.

일반적으로, 재구성 시 세포 배양 배지는 용매에 용해된 용질들을 가질 것이다. 용질은 세포막 (또는 벽)을 거쳐서 삽투압을 맞추도록 삼투력을 제공한다. 추가적으로, 용질들은 세포를 위해 영양분들을 제공할 것이다. 일정 영양분들은 세포성 작동들을 위한 화학적 연료일 것이다: 일정 영양분들은 세포가 이화작용에 사용하는 미가공 물질들일 수 있다; 일정 영양분들은 효소들 또는 세포성 대사를 용이하게 하는 운반체들과 같은 기작일 수 있다; 일정 영양분들은 세포 사용을 위한 성분들을 결합하고 완충하는 또는 해로운 세포 산물들을 결합하거나 격리하는 결합 제제들일 수 있다.

세포 및 세포의 의도된 용도에 의존하여, 세포 배양 배지의 성분들은 세포 배양 성적을 최적화하도록 맞추어진 농도들로 최적으로 존재할 것이다. 성적은 하나 이상의 원하는 특징들, 예를 들어 세포 수, 세포 질량, 세포 밀도, O₂ 소모, 포도당 또는 뉴클레오타이드와 같은 배양 성분의 소비, 생체분자의 생산, 생체분자의 분비, 폐기 산물 또는 부산물, 예로 대사물의 형성, 지시인자 또는 신호 분자 상의 활성 등에 의해 측정될 것이다. 따라서 각각의 성분들 또는 그들의 선택은 바람직하게 의도된 목적을 위한 작동 농도에 최적화될 것이다.

기본 배지는 전형적으로 세포 배양의 유지를 위해 사용되고, 아미노산, 비타민, 유기 및 무기염, 당 및 기타 성분들을 포함하는 많은 성분들을 포함할 수 있고, 각 성분은 시험관내에서 세포의 배양을 지원하는 양으로 존재한다.

안정화된 에탄올아민을 포함하는 본 명세서에서 기술된 배지는 1X 제형물일 수 있거나, 예를 들어 5X, 10X, 20X, 50X, 500X, 또는 1000X 배지 제형물로서 농축될 수 있다. 개별적 배지 성분들이 별도의 농축된 용액들로서 제조되는 경우라면, 각 농축물의 적절한 (충분한) 양이 1X 배지 제형물을 생산하도록 희석제와 조합된다. 전형적으로, 사용되는 희석제는 물이지만, 수성 완충액들, 수성 식염수 용액, 또는 기타 수용액들을 포함하는 기타 용액들이 사용될 수 있다. 배지는 추가적인 성분들이 첨가되는 것이 필요한 기본 배지, 또는 추가적인 첨가물들을 전혀 요구하지 않고 일단 재구성 시 세포들을 성장시킬 수 있는 완전한 배지일 수 있다.

안정화된 에탄올아민을 포함하는 본 명세서에서 기술된 배지는 건조 분말 배지 (DPM)와 같은 서로 다른 형식들로, 또는 물, 비타민 용액, 염 용액, 지질 용액과 같은 용매, 또는 하나 이상의 배지 성분들, 또는 심지어 혈청 및/또는 성장인자를 포함하는 용매라면 모두와 복합되거나 응집된 진보된 과립화된 제조물 (AGT)로서, 본 명세서에 의해 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는, 미국 특허 제 6,383,810호에서 기술된 바와 같이 액체-베드 (fluid-bed) 장치를 통하여 또는 달리 진보된 과립화 기술학 - AGT^TM (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 역시 제조될 수 있다. Fike et al., Cytotechnoloy, 2006, 36: 33-39를 참조하고, 이는 본 명세서에 의해 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있다. 이것은 진보된 분말 배지 (APM, Life Technologies, CA) 형식으로도 역시 제조될 수 있다. APM은 소듐 바이카보네이트와 같은 첨가들이 전혀 요구되지 않고 pH 조절이 자동적이고 요구되지도 않는 점에서 AGT (응집된 배지들: 진보된 과립화된 기술학)의 일정 유익한 특성들을 가진 건조 분말 형식이다. 본 배지는 적용가능한, 농축된 피드 보충물들, 농축된 배지들, 및 일정 경우들에서 액체 배지들도 역시 말한다.

한 가지 구현예에서, 안정화된 에탄올아민을 포함하는 건조 분말로부터 나온 재구성된 배지들은 안정화된 에탄올아민을 포함하는 자가-pH 및/또는 자가-삽투도 배지를 가져오고, 이것은 추가적인 pH 또는 염 농도 조절이 없이도 소정의 세포 유형의 성장에 적합한 원하는 pH 및 삼투도를 자동적으로 달성하는 데 기여하는 균형잡힌 완충액 농도들 및/또는 염 농도들을 가진다.

또 다른 구현예에서, 또는 좀 더 나아간 구현예에서, 안정화된 에탄올아민을 포함하는 건조 분말로부터 나온 재구성 배지들은 화학적으로 정의된 세포 배양 배지를 가져온다. 배지 단백질의 존재는 재조합 단백질의 정제를 어렵고, 시간을 소모하고, 값비싸게 만들고, 감소된 산물 수율들 및/또는 순도도 역시 유도할 수 있다. 따라서, 한 가지 구현예에서, 세포 배양 배지는 보다 완전한, 무-혈청, 무-단백질일 것이고, 이는 특정한 세포 유형의 성장을 지원할 수 있다. 임의적으로, 건조 분말로부터 나온 재구성 배지들은 무-혈청일 수 있지만, 여전히 식물들, 효모, 조류, 곰팡이와 같은 하나 이상의 비-동물 유래된 공급원 (비동물 기원 - AOF), 또는 박테리아, 곰팡이, 식물, 효모, 조류 등과 같은 재조합 공급원으로부터 유래된 단백질을 가수분해물의 형태로, 또는 정제된 단백질 또는 가수분해물 분획의 형태로 포함한다. 다른 경우들에서, 무-혈청 배지들은 알부민, 피투인 (fetuin), 다양한 호르몬 및 기타 단백질을 포함하는, 다양한 동물-유래 성분들을 하나 이상 여전히 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 배지 또는 배지 보충물은 단백질이 없고, 좀 더 나아가 지질, 가수분해물, 또는 성장인자를 포함하지 않는다.

본 발명의 안정화된 에탄올아민, 또는 피막화된 에탄올아민, 또는 피막화된 덴드리머성 에탄올아민과 같은 보호된 불안정 분자들을 포함하는 배지들 또는 보충물들은 그들이 세포들의 성장에 독성을 띠지 않기 때문에 세포들의 유가식 배양을 위해 사용될 수 있다 (실시예들을 참조하라). 세포들의 유가식 배양은 전형적으로 단백질과 같은 생체분자들의 산업적인 생산을 위해 사용되어, 세포 농도를 증가시키고 높은 산물 농도 및 부피측정 생산도를 위해 배양 수명을 연장한다. 유가식 배양들은 기본 배지에 포도당과 같은 하나 이상의 영양분들, 또는 피드들의 조절된 첨가가 관여한다. 사용된 영양분들 또는 피드들은 본 발명에서, 상기 기술된 보호된, 불안정 분자들을 포함할 수 있다. 영양분(들)은 영양분 고갈 또는 축적, 및 부산물 축적을 방지하고, 이에 의해 삼투도 및 CO₂ 농도와 같은 중요한 매개변수들을 최적의 산물 발현을 위해 세포 성장을 촉진하거나 세포 사망을 최소화하는 수준들 이내에서 유지하여 세포 배양의 성장을 조절하도록 도울 수 있다.

세포들 및 바이러스들

본 명세서에서 기술된 바와 같이 에탄올아민 유도체 또는 격리화 제제로 보호된 에탄올아민을 포함하는 배지들은 다양한 세포들을 배양하는 데도 역시 사용될 수 있다. 한 가지 구현예에서, 배지들은 포유동물 세포들, 물고기 세포들, 곤충 세포들, 조류 세포들, 양서류 세포들 또는 조류(avian) 세포들과 같은 식물 또는 동물 세포들을 포함하는, 진핵 세포들을 배양하는 데 또는 바이러스들, 바이러스-유사 입자들을 생산하는 데 사용된다.

본 명세서에서 기술된 배지들로 배양될 수 있는 포유동물 세포들로는 일차 상피 세포들 (예로, 각질세포들, 자궁경부 상피 세포들, 기관지 상피 세포들, 기관 상피 세포들, 신장 상피 세포들 및 망막 상피 세포들), 확립된 세포주들 및 그들의 품종들 (예로, 293 배아 신장 세포들, BHK 세포들, HeLa 자궁경부 상피세포들 및 PER-C6 망막 세포들, MDBK (NBL-1) 세포들, 911 세포들, CRFK 세포들, MDCK 세포들, CHO 세포들, BeWo 세포들, Chang 세포들, 디트로이트 562 세포들, HeLa 229 세포들, HeLa S3 세포들, Hep-2 세포들, KB 세포들, LS180 세포들, LS174T 세포들, NCI-H-548 세포들, RPMI 2650 세포들, SW-13 세포들, T24 세포들, WI-28 VA13, 2RA 세포들, WISH 세포들, BS-C-I 세포들, LLC-MK2 세포들, 클론 M-3 세포들, 1-10 세포들, RAG 세포들, TCMK-1 세포들, Y-1 세포들, LLC-PK1 세포들, PK(15) 세포들, GH1 세포들, GH3 세포들, L2 세포들, LLC-RC 256 세포들, MH1C1 세포들, XC 세포들, MDOK 세포들, VSW 세포들, 및 TH-I, B1 세포들, 또는 그들의 유도체들), 조직 또는 기관이라면 모두 (이에 제한되는 것은 아니지만, 심장, 간, 신장, 결장, 소장, 식도, 위장, 신경원 조직 (뇌, 척수), 폐, 혈관 조직 (동맥, 정맥, 모세관), 림프조직 (림프샘, 부신, 편도, 골수, 및 혈액) 및 비장을 포함함)로부터 나온 섬유모세포들, 또한 섬유모세포 및 섬유모세포-유사 세포주들 (예로, CHO 세포들, TRG-2 세포들, IMR-33 세포들, Don 세포들, GHK-21 세포들, 시트룰린혈증 세포들, Dempsey 세포들, 디트로이트 551 세포들, 디트로이트 510 세포들, 디트로이트 525 세포들, 디트로이트 529 세포들, 디트로이트 532 세포들, 디트로이트 539 세포들, 디트로이트 548 세포들, 디트로이트 573 세포들, HEL 299 세포들, IMR-90 세포들, MRC-5 세포들, WI-38 세포들, WI-26 세포들, MiCl1 세포들, CHO 세포들, CV-1 세포들, COS-1 세포들, COS-3 세포들, COS-7 세포들, Vero 세포들, DBS-FrhL-2 세포들, BALB/3T3 세포들, F9 세포들, SV-T2 세포들, M-MSV-BALB/3T3 세포들, K-BALB 세포들, BLO-11 세포들, NOR-10 세포들, C3H/IOTI/2 세포들, HSDM1C3 세포들, KLN2O5 세포들, McCoy 세포들, 마우스 L 세포들, 품종 2071 (마우스 L) 세포들, L-M 품종 (마우스 L) 세포들, L-MTK- (마우스 L) 세포들, NCTC 클론들 2472 및 2555, SCC-PSA1 세포들, Swiss/3T3 세포들, 인디언 먼트잭 세포들, SIRC 세포들, CⅡ 세포들, 및 얀센 세포들, 또는 그들의 유도체들)을 포함한다.

조류 세포들을 포함하는 진핵 세포들은 성장 및 생물연료 생산을 위해 적합한 조건 하에서 생물연료들을 생산하도록 본 발명의 안정화된 에탄올아민을 포함하는 배지 조성물들에서도 역시 배양될 수 있다.

본 명세서에서 기술된 배양 배지에 의해 지원되는 세포들은 동물이라면 모두, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 마우스 또는 인간으로부터도 역시 유래될 수 있다.

본 명세서에서 기술된 방법들에 따라 배양된 세포들은 정상 세포들, 병든 세포들, 형질전환된 세포들, 돌연변이 세포들, 체세포들, 생식 세포들, 줄기 세포들, 전구체 세포들 또는 배아 세포들일 수 있고, 이들이라면 모두는 확립된 또는 형질전환된 세포주들이거나 천연의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 세포들은 실험적 목적들을 위해 또는 유용한 성분들의 생산을 위해 사용될 수 있다.

한 가지 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 배지는 재조합 CHO 세포들 또는 CHOS, CHOK1, DG44, RevO 등 같은 CHO-유래 세포주들을 포함하는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포들을 배양하는 데 사용될 수 있다. 용어 CHO 세포는 재조합 CHO 세포들 및 기술된 모든 CHO-유래 세포주들에 대한 언급을 포함한다. CHO 세포들은 중국 햄스터 난소로부터 유래한 상피 세포들 및 섬유모세포들 둘 다로서 분류되어 왔다. 중국 햄스터 난소 (CHO-K1)로부터 시작된 세포주는 (Kao, F. T. And Puck, T. T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60: 1275-1281 (1968) 많은 해 동안 배양되어 왔지만, 그의 정체는 여전히 검증되지 않는다. 대부분 생물제약사들은 현재 CHO 세포들에서, 세포주가 인간-유사 당화 양상들과 같은 정확한 해독후 변형 및 인간 바이러스들의 전파의 낮은 위험도를 가지는 많은 장점들 때문에 단백질을 생산하고 있다.

세포들의 배양

본 명세서에서 기술된 배양 배지에 의해 지원되는 세포들은 본 연구자에 의해 결정된 실험적 조건에 따라 배양될 수 있다. 최적의 도말 과정 및 주어진 동물세포 유형을 위한 배양 조건이 단지 일상적 실험법을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있는 것으로 이해된다. 본 명세서에서 기술된 세포 배양 배지들을 사용하는 일상적 단일층 배양 조건을 위해, 세포들은 부착 인자들 없이도 배양 용기들의 표면 상에 도말될 수 있다. 임의적으로, 용기들은 예를 들어 라이프 테크놀로지사 (Carlsbad, CA), R & D 시스템사 (Rochester, Minnesota), 젠자임사 (Genzyme, Cambridge, Massachusetts) 및 시그마사 (St. Louis, Missouri)로부터 시판되고 있는, 천연, 재조합 또는 합성 부착 인자들 또는 펩타이드 단편들 (예로, 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 및 라미닌 등, 또는 그들의 천연 또는 합성 단편들)로 미리 코팅될 수 있다. 세포들은 미리 형성된 콜라겐 젤 또는 합성 생체중합체 물질과 같은 천연 또는 합성 삼차원적 지지 기질 내로 또는 그 위에도 역시 접종될 수 있다. 현탁 배양을 위해, 세포들은 전형적으로 본 명세서에서 기술된 배양 배지들에서 현탁되어 회전 플라스크, 관류 장치, 또는 생물반응기와 같은 현탁액으로 세포들의 배양을 용이하게 하는 배양 용기 내로 도입된다. 이상적으로는, 배지들 및 현탁된 세포들의 교반은 배양과정 동안 배지 성분들의 변성 및 세포들의 전단 (shearing)을 피하도록 최소화될 것이다.

각 실험적 조건을 위한 세포 접종 밀도들은 사용되는 특이적 배양 조건을 위해 최적화될 수 있다. 플라스틱 배양 용기들에서 일상적 단일층 배양을 위해, 1 내지 5 x 10⁵개 세포들/cm²의 초기 접종 밀도가 바람직한 한편, 현탁 배양을 위해서는 더 높은 접종 밀도 (예로, 5 내지 20 x 10⁵개 세포들/cm²)가 사용될 수 있다.

포유동물 세포들은 전형적으로 약 37℃에서 세포 배양기로 배양된다. 배양기 환경은 습도가 유지되어야 하고, 소정의 세포주들의 배양은 최적의 결과들을 위해 공기 내에 20% 정도의 이산화탄소를 요구할 수 있더라도, 공기 내에 약 3 내지 10%의 이산화탄소, 더욱 바람직하게는 공기 내에 약 8 내지 10%의 이산화탄소, 가장 바람직하게는 공기 내에 약 8%의 이산화탄소를 포함해야 한다. 배양 배지 pH는 일반적으로 약 6.2 내지 7.8, 바람직하게는 약 7.1 내지 7.4, 가장 바람직하게는 약 7.1 내지 7.3의 범위이어야 한다. 세포들은 단백질 생산을 증진하도록 서로 다른 조건 (pH, 온도 및/또는 이산화탄소) 하에서 배양될 수 있다.

폐쇄 또는 회분식 배양에서 세포들은 약 1.5 내지 2.0 x 10⁶개 세포들/mL의 밀도에 도달할 때 완전한 배지 교환을 거쳐야 한다 (예로, 사용된 배지를 신선한 배지로 교체함). 관류 배양에서 (예로 생물반응기들 또는 발효기들에서) 세포들은 연속적인 재순환을 기초로 하여 신선한 배지를 받을 것이다.

바이러스 생산

현탁 배양들에서 또는 단일층 배양들에서 세포들의 배양에 추가하여, 본 배지들은 포유동물 세포들로부터 바이러스들을 생산하는 방법들에 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 (a) 바이러스에 의한 세포의 감염을 촉진하는 데 적합한 조건 하에서 세포 (예로, 포유동물 세포)를 바이러스와 접촉시키는 단계; 또한 (b) 상기 세포를 본 명세서에서 기술된 배양 배지로 세포에 의한 바이러스의 생산을 촉진하는 데 적합한 조건 하에서 배양하는 단계를 포함한다. 세포는 배양 배지에서 세포의 배양 이전에, 과정 동안 또는 이후에 바이러스와 접촉될 수 있다. 포유동물 세포를 바이러스로 감염시키는 최적의 방법들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 당업자에게라면 친숙할 것이다. 본 명세서에서 기술된 배양 배지들에서 배양된 바이러스-감염된 포유동물 세포들은 본 명세서에서 기술된 세포 배양 배지가 아닌 세포 배양 배지에서 배양된 세포들보다 더 높은 바이러스 역가들 (예로, 2-, 3-, 5-, 10-, 20-, 25-, 50-, 100-, 250-, 500-, 또는 1000배 이상의 역가들)을 생산하도록 기대될 수 있다.

이들 방법들은 다양한 포유동물 바이러스들 또한, 이에 제한되는 것은 아니지만 아데노바이러스들, 아데노-관련 바이러스들, 및 레트로바이러스들 등을 포함하는 바이러스성 벡터들을 생산하는 데 사용될 수 있고, 가장 바람직하게는 아데노바이러스들 또는 아데노-관련 바이러스들을 생산하는 데 사용된다. 본 명세서에서 기술된 배양 배지로 감염된 세포들의 배양에 이어서, 바이러스들, 바이러스성 벡터들, 바이러스성 입자들 또는 그들의 성분들 (단백질 및/또는 핵산 (DNA 및/또는 RNA))을 포함하는, 사용된 배양 배지는 백신 생산, 세포 형질전환 또는 유전자 치료법에서의 사용을 위한 바이러스성 벡터들의 생산, 동물들 또는 세포 배양액들의 감염, 바이러스성 단백질 및/또는 핵산의 연구 등을 포함하는 다양한 목적들을 위해 사용될 수 있다. 임의적으로, 바이러스들, 바이러스성 벡터들, 바이러스성 입자들 또는 그들의 성분들은 당업자에게라면 친숙할 단백질 및/또는 핵산 분리를 위한 기법들에 따라 사용된 배양 배지로부터 선택적으로 분리될 수 있다.

재조합 단백질 생산

본 발명에서 기술된 조성물들 및 방법들은 세포 배양 배지를 만드는 데 사용될 수 있고, 이는 다음으로 재조합 세포들로부터 펩타이드 및/또는 단백질과 같은 재조합 산물들의 생산을 위해 사용될 수 있다. 세포들은 현탁액에서 성장될 수 있는, 진핵 세포들을 포함한다. 바람직하게, 재조합 세포들은 포유동물 세포들이고, 상세하게 포유동물 세포들은 현탁액에서 성장된다. 따라서, 본 명세서에서 기술된 조성물들 및 방법들, 또는 생산된 그의 배지는 본 명세서에서 기술된 조성물들 및 방법들을 사용하여 제조된 배양 배지들에서 폴리펩타이드를 생산하도록 유전적으로 조작되었던 세포 (예로, 포유동물 세포)를 배양하는 데 유용하다. 관심 있는 폴리펩타이드를 발현하도록 포유동물 세포를 유전적으로 조작하는 최적의 방법들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 따라서 당업자에게라면 친숙할 것이다. 세포들은 본 발명의 배지들에서 배양과정 이전에 유전적으로 조작될 수 있거나, 배지들에서의 배양에 놓이기 이전에 하나 이상의 외인성 핵산 분자들로 형질전환될 수 있다. 유전적으로 조작된 세포들은 단일층 배양들로서, 또는 더욱 바람직하게는 현탁 배양들로서 본 발명의 배양 배지들에서 배양될 수 있다. 세포들의 배양과정에 이어서, 관심있는 폴리펩타이드가 선택적으로 세포들, 및/또는 사용된 배양 배지로부터 당업자에게라면 친숙할 단백질 분리를 위한 기법들에 따라 정제될 수 있다.

<실시예>

실시예 1: 아미노산의 존재 시 에탄올아민 분해

에탄올아민은 포도당 단독의 존재 시 안정하지만 포도당 및 아미노산 조합의 존재 시 특히 승온에서 (예를 들어, > 30℃) 신속하게 불안정한 점이 관찰되었다. 세 가지의 건조 분말 세포 배양 배지 시료들이 테스트되었다. 첫 번째는 에탄올아민 및 포도당을 포함하였지만 아미노산은 전혀 없었다. 두 번째는 에탄올아민, 포도당, 및 아미노산의 조합을 포함하였다. 세 번째는 에탄올아민, 포도당, 아미노산, 추가적으로 염화콜린, 질산칼슘·4H₂O 및 이염기의 인산나트륨을 포함하였다. 시료들은 0℃ 및 37℃에서 7일 동안 보관되었고 다음으로 주입용 물 (WFI)로 재구성되었고, 0.22 μ 필터들을 통해 여과되었고, 에탄올아민의 농도 (mg/L)를 측정하도록 HPLC에 의해 분석되었다. 표 1에서 나타난 바와 같이, 에탄올아민 및 포도당을 포함하는 (아미노산 없음) 건조 배지는 0℃로부터 37℃까지 에탄올아민에서 작은 감소를 나타내었던 한편 (약 3%), 건조 배지들에 아미노산의 첨가는 약 90%의 에탄올아민에서 감소를 가져온다.

<표 1>

아미노산의 존재 시 에탄올아민의 신속한 분해

실시예 2: 에탄올아민 유도체들의 세포 배양 효능

세포 배양 효능에 대해, 포스포릴에탄올아민 (PE), 트리에탄올아민 (TE), 디에탄올아민 (DE), 모노메틸에탄올아민 (MME), 디메틸에탄올아민 (DME), 및 N-아세틸에탄올아민 (NAE)을 포함하는, 광범위한 에탄올아민 유도체들을 테스트하였다. 처음에, 모든 화합물들을 에탄올아민의 몰 당량에서 테스트하였고, 에탄올아민과 비교가능한 수준들에서 세포 성장을 지원하였던 유도체들을 전혀 관찰하지 못하였다. 사용된 세포주는 좋은 성장을 위해 에탄올아민을 요구하는 DG44-EPO, 재조합 에리트로포이에틴을 발현하는 CHO 세포주이었다. 세포들은 3 x 10⁵개/mL로 접종되었고, 검정을 시작하기 이전에 각 조건에서 2주마다 3번의 계대배양들을 위해 배양되었다. 본 검정도 역시 3 x 10⁵개/mL로 접종되었지만 이후 ViCell 세포 계수기로부터 생존 세포 밀도에 대해 8일 동안 이어졌다.

다음에, 64X의 몰 당량까지 화합물들을 적정하였다. 포스포릴에탄올아민 및 NAE 둘 다는 약 16X의 몰 당량으로 에탄올아민에 대한 유사한 성장 잠재력을 수득하였다. 도 1A 및 1B를 참조하라. 또 다른 한 벌의 실험들에서, 약 16X의 몰 당량에서 NAE는 에탄올아민-민감성 계열뿐만 아니라 에탄올아민을 보완할 수 있는 것으로 다시 확인되었다. 이들 후자의 실험들은 24-웰 배양 접시들에서 수행되었다. 세포들은 1 x 10⁵개/mL로 접종되었고 시료들이 12일째 수확되었다. NAE에서 질소 원자가 아마이드 구조 내에 포함되어 있기 때문에, NAE는 안정하고 세포 배양 배지에서 에탄올아민을 대신하여 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 2A에서, 결과는 N-아세틸에탄올아민 (NAE)이 더 높은 농도 (8 내지 12배)에서일지라도, 에탄올아민과 비교가능한 세포 성장 검정법에서 성적을 달성할 수 있는 점을 보여준다. 이 경우에, NAE의 몰 당량은 에탄올아민의 경우와 동일한 성장 성적을 제공할 수는 없다. 그럼에도 불구하고, 에탄올아민 없는 조건이 더 낮은 성장을 보여주기 때문에 NAE는 소정의 새로운 제형물들로 사용될 수 있다. 도 2B는 LC-MS에 의한 NAE에 대한 검출 검정법을 보여주고, 이에 의해 NAE는 배지 제형물들을 포함하는 제형물이라면 모두에서 검출될 수 있다. LC-MS 크로마토그램은 분석 등급의 NAE를 사용하는 N-아세틸에탄올아민의 표준 시료가 NAE 농도 다양성들을 검출하는 점을 보여주고 있다. 음성 대조군은 에탄올아민이 없는 것이다. 나머지 초과의 곡선은 무시되어야 하고, 이는 CD CHO 카탈로그 대조군으로 본 검정법에 적절하지 않다.

도 2B: 분석 등급의 NAE를 사용하는 N-아세틸 에탄올아민에 대한 검출 검정법. NAE의 검출은 배지 농도 범위들 이내인 19 내지 20,000 μg/mL 사이의 범위이다.

실시예 3: 에탄올아민/포도당 복합체

건조 분말 세포 배양 배지에서 에탄올아민 분해를 감소시키는 한 가지 방식은 에탄올아민 및 포도당과 같은 당 간의 복합체를 형성하는 것이다. 복합체 또는 결정성 페이스트를 형성하기 위하여, 에탄올아민은 WFI에 특정된 양으로 용해된 다음 주어진 무게의 포도당 위로 첨가된다. 바로 스파출라가 에탄올아민-포도당-WFI 혼합물을 페이스트 점도를 형성할 때까지 반죽하는 데 사용된다. 다음으로 페이스트성 혼합물은 편평하게 도말되고 후드 하에서 밤샘 건조되며, 건조기로 최종 건조 과정이 이어진다. 건조된 혼합물은 특정된 크기들로 분말화되고 건조 분말 세포 배양 배지와 혼합된다. 에탄올아민을 포도당과 복합하는 대표적인 프로토콜은 다음과 같다:

1) 진보된 과립화 기술학 - AGT^TM 세포 배양 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA)의 2000 g 로트의 경우 AGT^TM 전제 무게에 대비 5% w/w의 결정성 재료 (entity)를 사용함: 결정성 재료를 형성하도록 100 g의 포도당을 사용함 (AGT^TM (Invitrogen, Carlsbad, CA) 공정에서 남아있는 포도당으로부터 100 g을 공제함).

2) 각 15 g의 포도당의 경우 8 mL의 WFI를 사용하고, WFI의 양을 계산하여 결정성 재료를 만든다. 따라서, 53.33 mL의 WFI가 100 g의 포도당을 위해 사용된다.

3) 결정성 재료를 만들기 이전에 2.086 g의 에탄올아민을 WFI에 첨가하고 약 pH 7.0까지 교반하여 용해한다.

4) 결정성 재료를 만들기 위하여:

a. 포도당을 낮은 측면들을 가진 편평한, 비-반응성 팬에 둔다;

b. WFI-에탄올아민 용액 전부를 첨가한다;

c. 포도당 내로 액체를 반죽하거나, 퍼내거나, 휘젓거나, 분쇄하도록 금속 스파출라를 신속하게 사용한다. 수 분 동안 혼합 및 분쇄를 계속한다. 포도당 믹스는 모래 같은 분말로부터 부드러운 퍼티-유사 상태까지 포도당이 물리적 형태를 변화하면서 점도에서 변화할 것이다. 혼합물이 균질해질 때까지 혼합 및 반죽을 계속한다. 다음으로 균질한 혼합물을 얇은 층으로 도말하고 스파출라로 더 작은 조각들로 잘라서 어둡게 또는 낮은 조명으로 연기 후드 하에 하룻밤 동안 놓아둔다.

d. 약 12시간 이후에, 결정성 재료를 수집하고 AGT^TM (Invitrogen, Carlsbad, CA) 크기 결정 매개변수들을 사용하여 (예로, 1000 rpm으로 분말화하고, 포워드 칼 0.050" 스크린) 파쇄한다.

5) 과립화 단계 이후에 결정성 재료를 AGT^TM (Invitrogen, Carlsbad, CA) 대용량 내로 혼합한다.

신속하게 보관기간을 추정하는 한 가지 방식은 가속된 보관기간 연구를 수행하는 것에 의한다. 가속된 보관기간을 수행하는 연구는 테스트 물질을 7일 동안 같은 단축된 기간 동안 저온 및 승온 둘 다에서 배양하는 것이다. 관심있는 성분의 안정도는 저온 및 승온 둘 다에서 7일 이후에 성분의 농도를 측정하고 성분의 농도에서 차이%를 계산하여 결정된다.

상기 기술된 방법론을 사용하여, 시료들이 둘 다 아미노산을 포함하는 두 가지의 서로 다른 시판되는 AGT^TM (Invitrogen, Carlsbad, CA) 세포 배양 배지인 EfficientFeed^TM A (Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 EfficientFeed^TM C (Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 에탄올아민 안정성에 미치는 포도당 결정화의 효과를 측정하도록 제조되었다. 표 2 및 표 3을 참조하라. 에탄올아민을 포함하는 테스트 시료들이 제조되었고, AGT^TM (Invitrogen, Carlsbad, CA) 대용량 세포 배양 배지에 첨가되었다. 에탄올아민-포함 테스트 시료들은 적어도 1) 포도당과 복합된 에탄올아민; 2) 건조 마쇄 에탄올아민 및 포도당 (포도당과 복합되지 않은 에탄올아민); 또한 3) 양성 대조군으로서 프롤린을 가진 건조 마쇄 에탄올아민을 포함하였다. 테스트 시료들을 AGT 대용량 배지들에 첨가한 이후에, 시료들은 4℃, 실온, 및 30℃에서 7일 동안 배양되었다. 배양을 이어서, 시료들이 WFI로 재구성되었고 에탄올아민의 농도 (mg/L)가 상기 기술된 바와 같이 HPLC를 사용하여 측정되었다. 세포 배양 배지들 둘 다의 경우, 에탄올아민을 포도당과 복합하는 단계는 에탄올아민의 분해를 감소시켰다 (대조군 시료와 대비하여 더 작은 차이%). 하기 표 2 및 표 3을 참조하라. 계속되는 결과들에서, 포도당 결정화 방법은 지금까지 9개월의 보관 기간을 보여주었다.

<표 2>

에탄올아민을 안정화하는 포도당의 사용 (배지 #1)

<표 3>

에탄올아민을 안정화하는 포도당의 사용 (배지 #2)

실시예 4: 알기네이트 미세캡슐들에서 에탄올아민의 격리화

미세피막화는, 상세하게 분말화된 세포 배양 배지에서 아미노산로부터 에탄올아민을 물리적으로 분리하거나 격리화하거나 보호하는 또 다른 기작을 제공한다. 예로서, 알기네이트는 미세피막화를 위해 사용될 수 있다.

알기네이트-에탄올아민 미세캡슐들을 제조하기 위하여, 에탄올아민은 물 (WFI)에 녹인 2% 알기네이트 용액에 용해되었고, 바늘 또는 주사기를 사용하여 또는 에어로졸 분무 (분무 안개를 형성함)에 의해 칼슘 수조 내에 (13.32g/L 염화칼슘) 점적으로 첨가되었고, 여기에서 알기네이트는 칼슘에 의해 교차-결합되어 하이드로겔을 형성한다. 비드들의 "1000X" 농도가 사용되었고, 1 mL의 알기네이트 용액은 1000 mL의 배지에 있는 에탄올아민의 양을 포함하는 것을 의미한다 (예로, 즉 1 L의 Efficient Feed A에 있는 0.068 g의 에탄올아민). 에탄올아민은 작은 비드들 또는 미세캡슐들을 형성하도록 알기네이트 하이드로겔 내에 포획된다. 다음에, 에탄올아민-포함 비드들 또는 미세캡슐들이, 에어플로우 하에 하룻밤 동안 놓아둔 다음 여러 시간 동안 적용된 진공으로 선반 아래 CaSO₄를 가진 건조기 내에 그들을 두어서 건조되었다. 미세캡슐 형성의 방법에 의존하여 (점적 vs 안개 분무), 본 공정은 AGT 또는 APM 배지들을 포함하는 건조 분말 배지들이라면 모두와 직접 혼합될 수 있는 부서지기 쉬운, 경질의, 더 작은 구형의 비드를 생산한다.

소정의 경우들에서, 폴리-L-라이신이 에탄올아민 안정화를 증진하도록 첨가되었다. 폴리-L-라이신 (PLL) 코팅이 Breguet et al., Cytotechnology, 2007, 53: 81-93에서의 기법을 사용하여 미세캡슐들에 첨가되었다. 간략하게, 1 mL의 0.15% PLL이 1 L-당량의 비드가 든 각 비이커에 첨가되고, 모든 비드들이 코팅되도록 가끔 회전하면서 ~ 15분 동안 인큐베이션된다. 15분 이후에, 과다 PLL을 피펫으로 흡입하여 버린다. 비드들은 건조되고 이전에 기술된 바와 같이 말린다.

에탄올아민-포함 알기네이트 미세캡슐들을 AGT 대용량 배지에 첨가한 이후에, 시료들은 4℃, 실온, 및 30℃에서 7일 동안 배양되었다. 인큐베이션에 이어서, 시료들이 WFI로 재구성되었고 에탄올아민의 농도들 (mg/L)이 상기 기술된 바와 같이 HPLC를 사용하여 측정되었다. 표 4에서 데이타는 소수 성분들 (본 경우에 에탄올아민)을 위한 분산제로서 사용되었던 아미노산, 프롤린을 가진 에탄올아민을 포함하는 대조군 시료와 대비하여, 알기네이트 미세캡슐들과 복합될 때 에탄올아민의 유의하게 더 적은 분해를 보여주고 있다. 도 3A 및 3B, 도 4A 및 4B 또한 도 5도 역시 참조하라.

<표 4>

에탄올아민을 안정화하는 알기네이트 미세캡슐의 사용

미세캡슐들 (PLL 존재 또는 부재)을 AGT^TM (Invitrogen, Carlsbad, CA) 대용량 배지들에 첨가한 이후에, 시료들은 4℃, 실온, 및 30℃에서 7일 동안 배양되었다. 인큐베이션에 이어서, 시료들이 WFI로 재구성되었고 에탄올아민의 농도들 (mg/L)이 상기 기술된 바와 같이 HPLC를 사용하여 측정되었다. 표 5에서 데이타는 PLL을 가진 알기네이트 미세캡슐들을 코팅하는 단계가 에탄올아민 분해를 방지하였던 점을 보여주고 있다. 도 3A 및 3B, 또한 도 4A 및 4B를 참조하라.

<표 5>

에탄올아민 안정화를 증진하는 폴리-L-라이신의 사용

실시예 5: 덴드리머-감수성 테스트 화합물 복합체의 피막화

한 가지 실시예에서, 알기네이트 같은 격리화 제제가 덴드리머-에탄올아민 복합체를 피막화하거나 포매하는 데 사용되었다. 덴드리머는 그들에게 정의된 구조적 및 분자량 특징들을 주는 조절된 연속적 공정들을 사용하여 제조될 수 있는 과다-분지된 합성 거대분자들이다. 그들은 민감성 물질들을 보호할 뿐만 아니라 주로 주어진 배지 내에 포매된 성분들의 시기 적절한 방출을 개선하는 데 유용한 것으로 보고되어 있다. 좀 더 나아가, 세포 인식 또는 세포 부착 분체들이 덴드리머 내로 통합될 때, 덴드리머는 세포에 특이적으로 부착되고 그의 내용물들을 전달한다. 이것은 가치있는 물질, 또는 극도로 불안정 물질, 또는 매우 민감한 세포 조절 분자들의 표적화된 전달에 매우 유용하다. 본 연구는 덴드리머-불안정 분자 복합체의 미세피막화가 분자를 분해로부터 안정화하는지, 또한 좀 더 나아가 불안정 물질이 건조 상태에서 덴드리머와 연관되어 실온 같은 주변 조건 하에서 장기간 동안 저장될 수 있는지 여부를 관찰하도록 시행되었다. 덴드리머를 형성하는 절차는 본 명세서에 의해 그의 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는 Astruc et al., Chem. Rev. 2010, 110: 1857-1959에 기술된 바와 같이 시행되었다. 간략하게, 서로 다른 유형들의 덴드리머가 중합화 공정을 개시하는 코아 구조를 기초로 하여 합성될 수 있다. 본 발명의 미세피막화된 덴드리머는 도 6에 도시되어 있다. 한 가지 구현예에서, 덴드리머는 알기네이트의 캡슐 내에 피막화되었다. 알기네이트는 덴드리머를 보호하고, 재구성시 민감성 물질을 가진 덴드리머를 방출한다. 알기네이트는 여과 동안 막 필터 상에 보유된다. 노출된 덴드리머는 덴드리머 상에 존재하는 세포 인식 부위들의 존재로 인해 민감성 물질을 세포로 표적화할 수 있고, 이로 인해 세포로의 성장인자, 비타민 등과 같은 민감성 또는 저농도 물질들의 사용가능성을 개선시킨다. 결과들은 도 6, 도 7a, 도 7b, 도 8, 도 9 및 도 10에 나타나 있다.

도 8에서, 비보호된 에탄올아민 효능은 주변의 조건 하로 AGT^TM에서 신속하게 강하되었던 한편 피막화 (마이크로비드)에 의해 보호될 때는 많은 개월 수 동안 효능을 유지한다. 미세피막화된 에탄올아민은 계속하여 10개월까지 또한 상온 초과 온도에서도 효능에서 변화를 보이지 않았다 (도 8을 참조하라).

에탄올아민이 아닌 불안정 화합물들을 미세피막화하는 심화 실시예들이 하기에 관찰된다. 알기네이트 같은 격리화 제제가 덴드리머-인슐린 복합체를 피막화하거나 포매하는 데 사용되었다. 불안정 화합물 인슐린이 PAMAM 덴드리머와 중합되었고, 좀 더 나아가 PLL의 존재 또는 부재 시 알기네이트 마이크로비들로 미세피막화되었다. 간략하게, 덴드리머 세대를 위해 PAMAM 2.5 (카복실레이트 표면기들)가 사용되었다. 인슐린은 RGD 서열들도 역시 세포 표면을 표적하도록 첨가된 덴드리머 상에 결합되었다. 본 복합체에서 성분들의 비율들은 덴드리머 : RGD : 인슐린 = 1 : 7 : 12이었다.

덴드리머 결합을 위한 프로토콜

결합체 및 알기네이트의 농도는 부착 시 조절되었다. 다음에, 결합체가 알기네이트에 첨가되었고 고르게 분포하도록 수분 동안 혼합되었다. 이것은 염화칼슘 수조 내로 1 mL 주사기를 사용하는 26게이지 바늘을 통하여 적셔졌다 (13.32g/L). 이것은 미세캡슐들을 고체화하도록 30분 동안 방치하여 인큐베이션되었다. 다음으로 미세캡슐로부터 성분의 소실을 방지하도록 덴드리머 결합체도 포함하는 1X 용액으로 헹구었다. 다음으로 건조기 위에 진공으로 밤샘 건조되었다. 다음으로 로딩된 마이크로비드는 AGT 건조-형식 배지에 첨가되거나 액체 배지 내로 직접 첨가하여 사용되었다.

인슐린-덴드리머-RGD 희석 프로토콜

덴드리머-인슐린-RGD 결합체의 인슐린 농도는 ~ 2 mg/mL (pg 165/168)으로 추정되었다. 이것은 ~ 1 mg/mL (1000 μg/mL)까지 도달하도록 반씩 희석되는 것이 필요하였다.

검정들을 위한 스톡 r-인슐린은 10 μg/mL 농도의 100배인 1000 μg/mL로 설정되었다. 이것은 1 μg/mL 농도의 1000배와 동등하고, 이는 96-웰 검정법 (pg. 160)으로 적정가능한 인슐린 농도 범위 이내이었다. 따라서 미세피막화를 위해 사용되는 인슐린의 유효 희석은 (a, pg 168) 1 : 1000X이다. 또한, 1:1000은 미세피막화 등가성을 위해 설정한 것이었다 (1 mL의 알기네이트 비드들이 1000 mL의 배지를 위해 사용되었다). 유진사 (Eugene) 결합체 대조군도 역시 먼저 1:1 (상기) 희석되었고 다음으로 1:1000 희석에서 사용된다.

최종 2% 알기네이트를 수득하도록 덴드리머-인슐린-RGD 결합체 (액체)를 3% 알기네이트에 첨가하는 것이 필요하였다. (1 + 0.5). 본 희석은 모든 덴드리머가 비드들 내로, 궁극적으로 특정된 배지로 갈 것이기 때문에 덴드리머-인슐린-RGD 결합체 양에 영향을 주지 않았다. 실시예: 0.1 mL의 덴드리머-인슐린-RGD 결합체가 100 mL의 최종 배지 부피를 위해 사용되었다 (1:1000). 본 0.1 mL의 덴드리머-인슐린-RGD 결합체를 2% 알기네이트를 맞추도록 0.2 mL의 3% 알기네이트에 첨가되었다. 이 모두를 칼슘 수조 내에 적시고 pg. 167로서 가공하고, 100 mL 배지에 첨가하여 사용되었다. 유사하게, 양성 인슐린 대조군 (b, pg. 168)은 10 μg/mL까지가 아닌 1:1000X로 희석되었다.

도 7A에 나타난 바와 같이, 덴드리머의 미세피막화는 인슐린을 가진 미피막화된 덴드리머, 또는 인슐린 단독 (덴드리머 없음, 알기네이트로의 피막화 없음)과 대비하여 실온에서 실질적으로 증가된 안정성을 보여주었다. 덴드리머에서 인슐린의 효능은 4℃에서 인슐린 단독의 효능과 비교가능하였다. 또한, 인슐린 단독 (대조군), 덴드리머 포함 - 마이크로비드 (테스트), 또는 덴드리머 없는 마이크로비드로의 포유동물 HeLa 세포주에 관한 세포 성장 연구들 모두는 HeLa 세포들의 동등한 효능 및 성장 특징들을 보여주었고, 덴드리머 또는 알기네이트 둘 다는 HeLa 세포들의 생존도 또는 성장과 개입하지 않았고, 미세피막화 절차가 세포들에게 독성이 아닌 점을 보여준다 (도 7B). 가속화된 보관기관 연구들은 미세피막화 (마이크로비드)가 일주일 동안까지 37℃에서 건조 형식 배지에서 인슐린 안정성을 개선하였던 점을 보여주었다 (도 10).

심화 실시예에서, 비타민 (예를 들어, 티아민, 비타민 B12 등)은 미세피막화및 건조 형식 배지에 첨가를 위한 테스트 불안정 화합물들로서 사용되었다 (도 9). 알기네이트 같은 피막화 제제는 피막화된 인슐린에 대해 상기 기술된 바와 같이 덴드리머-비타민 복합체를 피막화하거나 포매하는 데 사용되었다. 도 9에서 나타난 바와 같이 가속된 보관기간 연구들은 미세피막화가 37℃에서 2주 동안 비타민 안정성을 크게 개선하는 점을 보여주었다.

미세피막화는 에탄올아민, 비타민, 성장인자 등 같은 민감성 화합물들의 저장 조건을 연장할 수 있고, 이는 저온 (예를 들어, 냉장 또는 드라이아이스)이 아닌 운반 비용을 감소시킬 수 있는 상온에서 AGT^TM 등 같은 건조 배지 제형물들의 운반 및 취급의 효과를 긍정적으로 줄 수 있다. 따라서, 건조 형식의 배지들에서 불안정 화합물들의 미세피막화는 건조 형식 세포 배양 배지들의 더욱 저렴한 비용의 취급 및 보관에 의해, 녹색 기술학에 대한 기여로서 전망될 수 있다.

달리 정의되지 않는 경우라면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 당업자에 의해 공통적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 모순의 경우에, 정의들을 포함하는 본 명세서가 통제할 것이다. 기타 적합한 변형들 및 본 명세서에서 기술된 방법들 및 적용들에 대한 적응들은 자명하고 본 발명의 또는 그의 구현예라면 모두의 범위를 벗어나지 않고도 만들어질 수 있는 점이 당업자에게라면 바로 명확할 것이다. 또한, 재료들, 방법들, 및 실시예들은 단지 설명적인 것이고 제한되도록 의도되지 않는다. 본 명세서에서 인용된 모든 특허들, 특허 출원들, 및 공개된 참고문헌들은 그들의 전부가 본 명세서에서 의해 참고문헌으로 통합되어 있다.

Claims (1)

1. 보호된 불안정 분자는 세포 배양 조성물에서 증진된 안정성을 나타내고, 상기 불안정 분자는 에탄올아민인, 보호된 불안정 분자를 포함하는 세포 배양 조성물의 용도.

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