JPH03163357A - カテコールアミン分析法およびその分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生体液中のカテコールアミンの分析法に係り
、特にカテコールアミンが安定な状態で処理され得る分
析法に関する。

〔従来の技術〕

カテコールアミンは，ノルエピネフリン（ＮＥ），エビ
ネフリン（Ｅ），ドーパミン（ＤＡ）などの総称で神経
刺激伝達物質や副腎髄質ホルモンとして重要な役割を演
じており、高血圧症，褐色細胞腫，交感神経芽細胞腫な
どの交感神経，副腎髄質の機能を把握する上で、血液，
尿などの生体試料中のこれらのカテコールアミンの量的
，質的変動を知ることは重要な意義がある。カテコール
アミンは高速液体クロマトグラフイーにより測定されて
おり，その検出法としては蛍光法，電気化学検出法があ
る。蛍光法としては、ジフエニルエチレンジアミン（Ｄ
ＰＥ）法，トリヒドロキシインドール（ＴＨＩ）法があ
るが、ＴＨＩ法はＤＡの検出感度が悪く血中レベルの測
定ができないし、電気化学検出法は他の成分の影響を受
けやすいため，ＤＰＥ法が多く用いられている。

また，血清，血漿などの生体試料中には一般にたん白質
が含まれているため、このたん白質成分の影響により、
分析精度や分析力ラムの機能が低下したり，分析力ラム
の寿命が短かくなったりする。そのため、あらかじめ過
塩素酸処理などの除たん白操作によりたん白成分を除い
た試料を用いるのが普通である。しかし、カテコールア
ミンは中性〜アルカリ性領域において極めて不安定で酸
化されやすい。そのため一般にサンプル調製は酸化条件
下，特に過塩素酸を用いた除たん白がよく用いられてお
り，さらに酸化防止剤，例えばＥＤＴＡ　，アスコルビ
ン酸，チオ硫酸ナトリウム，ジチオスレイトール等を添
加している。試料の保存も−２０℃以下で行うことが普
通である。以上のことは，アナリテイ力・キミ力・アク
タ，１６５（１９８４）第１７１頁から第１７６頁（Ａ
ｎａｌｙｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ，　１　６
　５（１　９　８４）ｐ　ｐ　ｌ　７　１　−１７６）
や臨床検査，３２，１２，（１９８８）第１５２２頁か
ら第１５２７頁において論じられている。しかし、ＤＰ
Ｅ法の反応至適ｐＨは，ｐＨ６．０〜８．０、特にｐＨ
７．０　附近であるため高い感度を得るためには、サン
プルとＤＰＥを含んだラベル化剤を混合した反応溶液の
反応ｐ　Ｈを該至適ｐＨ、特にｐＨ７．０　附近に近づ
けねばならない問題があった。

ＤＰＥ法を用いたプレカラム蛍光Ｈ　Ｐ　Ｌ　Ｃ法によ
る血漿力テコールアミンの分析においては、除たん白法
としてたん白或分と目的或分の極性の違いを利用して分
離させるイオン交換力ラム法，酸によりたん白質を変性
させて沈殿分離させる過塩素酸法，分子の大きさの違い
を利用して分離させる限外ろ過法，カテコールアミンと
選択的に吸着しうるカラムを用いたアルミナ力ラム法が
検討されている。しかし、これらの除たん白法の回収率
についてみると，一般回収率が高いイオン交換カラム法
が８５％，過塩素酸法及び限外ろ過法が７０〜８０％，
アルミナ力ラム法が６０〜７０％といずれの方法も９０
％未満と悪い。そのため、再現性に乏しく、高精度の分
析がなされない問題があった。以上のことは、ジャーナ
ル・オブ・クロマトグラフイー，３４４，（１９８５）
第６ｌ頁から第７０頁（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，　３４４（１９８５）ｐｐ６
１−７０）において論じられている。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術は，＃たん白を含むサンプル調製中または
分析中のカテコールアミンの安定性について、さらには
，検出法として上記ＤＰＥ法を用いる場合の反応至適Ｐ
Ｈと、カテコールアミンが安定な領域のｐＨとが著しく
違っているために反応のｐ　Ｈをコントロールするのが
困難である点についての配慮がなされておらず、除たん
白や反応を含めた全体的な回収率が悪い問題があった。

本発明の目的は、カテコールアミンが血液等の生体試料
中に存在する他の成分の影響を受けにくくするとともに
、酸化されにくい安定なカテコールアミン分析用のサン
プルの調製法を提供することにある。

本発明の他の目的は、簡単な操作でサンプル調製ができ
，回収率及び精度の高いカテコールアミン分析方法を提
供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、カテコールアミンを含有する生体試料に少な
くとも２個以上の水酸基を有するホウ素化合物を添加し
、カテコールアミンとコンプレックスを形或させ安定化
させるようにしたものである。

また、本発明に基づくカテコールアミンの分析方法は、
（ａ）カテコールアミン及びたん白成分を含有する生体
試料に２個以上の水酸基を有するホウ素化合物を添加し
、カテコールアミンとコンプレツクスを形成させる工ｆ
Ｌ（ｂ）カテコールアミンとたん白成分を分離し、必要
に応じて誘導化試薬を添加しカテコールアミンの誘導体
を生成させる工程、（ｃ）カテコーノレアミンあるいは
力テコールアミン誘導体を分離力ラムに導いて分析する
工程を包含する。

本発明に用いられるホウ素化合物は通常，水酸基，芳香
族基，アルキル基を有する化合物のうち少なくとも１種
が用いられる。例えば、ホウ酸，フエニルボロン酸など
が好適に利用される。また、本発明に用いられるホウ素
化合物添加後の生体試料のＰ　Ｈは、７．０　以上であ
ることが望ましい。

〔作用〕

本発明を適用した方法では、不安定で酸化されやすいカ
テコールアミンに対し、少なくとも２個以上の水酸基を
有するホウ素化合物を添加することによりコンプレック
スが形成され、カテコールアミンの水酸基が保護されて
、カテコールアミンが安定化される。それによって．Ｍ
化領域でしかもＥＤＴＡ，アスコルビン酸などの酸化防
止剤を必要としていたカテコールアミンを含有する生体
試料の複雑な取り扱いが不要となる。そのため、カテコ
ールアミンが酸化されるなどの損失を受けずに精度よく
測定される。

本発明によるカテコールアミン分析装慢は，オーＩ〜サ
ンプラー，分析部、および制御部からなり、分析部は、
プルカラム流路系，分離力ラム流路系、および測定演算
部からなる。オートサンプラーとしてはサンプル調製を
行ったサンプルの分取，分配，試薬添加，反応などの前
処理ができるサンプラーを使用する。プレカラム流路系
ではサンプルインジエクターから導入したサンプルを、
プレカラムに流し，カラムに吸着させ、濃縮と不純物除
去を行なう。分離力ラム流路系ではプレカラムにより濃
縮されたサンプルを溶離液により脱着して、カラム切換
バルブを経由して分離力ラムに送り、サンプルの特定成
分の分離を行なう。測定演算部は例えば蛍光ラベリング
を行なったサンプルの場合は、フローセルを有する蛍光
光度計など、誘導体化したサンプルの物理的または化学
的特性を検出する検出器および測定結果の演算表示装置
からなる。制御部は一連の分析処理の制御を行なう。

以上説明したように本発明は、血清，血漿，尿などの生
体試料中のカテコールアミンの一般的でかつ簡単なサン
プル処理法及び測定方店として利用され得る。

〔実施例〕

以下，本発明によるカテコールアミン分析用サンプル調
製法の実施例について説明する。

災産鮭よ 試料としてはＥＤＴＡ採血を行なった血漿を用いた。ま
ず最初に，ホウ酸を含有するカテコールアミ゛ンサンプ
ル調製液Ａを調整した。調製液八〇組戒を表１に示す。

表　　１ 次に、血漿６００μａに調製液Ａ６００μ悲を加えて充
分に混合した後、分画分子量が１０，０００である限外
ろ過膜（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　−　１　０　，アミコン
製）を用いて遠心分離（２，ＯＯＯｇ，２０分）で除た
ん白を行ない、カテコールアミン分析用試料（以下，サ
ンプルと呼ぶ）を得た。カテコールアミンの分析は、カ
ラムスイッチング法及び電気化学検出（ＥＣＤ）法を用
いた第３図に示す流路図に基づいた装置を用いて行なっ
た。測定条件は表２に示す通りである。

オートサンプラー４２には、上述のように調製したサン
プル５００μ党が試料容器４３に収容され配列されてい
る。サンプル５００μａは、ポンプ４４によりノズル４
５から吸引され、試料導入弁４６の計量管４７に導入さ
れる。プレカラム４８には、ポンプ４９により前処理液
５０がバルブ５１，試料導入弁４６，カラム切換弁５２
を経由して流れ，また分離カラム５３には、ボンプ５４
により溶離液５５が、バルブ５６，カラム切換弁５２を
経由して流れている。この状態で試料導入弁４６を切換
えると，計量管４７のサンプルは前処理液５０によりプ
レカラム４８に送られ、プレカラムに吸着され濃縮され
ると共に前処理液の流れにより不純物が除去され廃出管
５７から廃出される。

プレカラムとして陽イオン交換樹脂を用いているため，
カテコールアミンの水酸基はホウ酸とコンプレックスを
形或した安定な状態で、カテコールアミンのアミノ基が
プレカラムに吸着している。

次に、カラム切換弁５２を切換えると溶離液５５がプレ
カラム４８を経由して流れ，サンプルは力ラム恒温槽５
９により４０℃に保たれた分離カラム５３に送られ、電
気化学検出器５８により分離された各成分の濃度測定が
行われる。前処理液及び溶離液の流量は，各々１　ｍ　
Ｑ　／ｗｉｎとした。得られたクロマトグラムを第４図
（ａ）に示す。たて軸は電流値，横軸は保持時間を示し
ている。実施例１で同一試料を用い１０回測定を行って
同時再現性について調べた結果を表３に示す。さらに、
今回測定した血漿に，カテコールアミンの標準サンプル
を添加し，実施例１における添加回収率を測定した結果
を表４に示す。

良較量（従来法） サンプル調製法としては，次のようにした。すなわち、
ＥＤＴＡ採血した血漿６００μ息に１０ｍＭアスコルビ
ン酸５０μＱ及び１　０　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ５０μＱを
添加し．ｐＨ調１１（ｐＨ２．０）を行なった後、分画
分子量１０，０００である限外ろ過膜（Ｃｅｎｔｒｉｃ
ｏｎ　−　１　０　，アミコン製）を用いて遠心分離（
２．ＯＯＯｇ，２０分）で除たん白を行ない，カテコー
ルアミン分析用試料を得た。測定には実施例１と同じ方
法及び装置を用いた。得られたクロマトグラムを第４図
（ｂ）に示す。たて軸は電流値、横軸は保持時間を示す
。また、実施例１と同一の試料を用い、実施例１と同様
に同時再現性を調べた結果を表３に，添加回収率を測定
した結果を表４に示す。

表３及び表４により明らかなように、本発明によるカテ
コールアミン分析用サンプル調製法は、従来法に比べて
精度，回収率共に良好な結果が得られることがわかる。

特にＤＡについては回収率の著しい向上がみられ、その
ために測定精度が他の或分（ＮＥ，Ｅ）と同レベルにま
で改善された。

また、調製液ＡのｐＨを変化させて、添加回収率を測定
した結果を第５図に示す。たて軸は回収率、横軸は調製
液ＡのｐＨを示している。調製液ＡのｐＨを７．０以上
にするとＮＥ，Ｅ，ＤＡの回収率は９５％以上となるが
、これ以下では回収率が低く調製液のｐＨは７．０　以
上にする必要がある。

表 ４ 本発明によるカテコールアミン分析用サンプル調製法の
他の実施例について説明する。試料としてはＥＤＴＡ採
血を行なった血漿を用いた。まず最初に、フエニルボロ
ン酸をアセトニトリルに溶解してカテコールアミン分析
用サンプル調製液Ｂを調製した。該調製液Ｂの組或を表
１に示す。次に、血漿４００μ氾にサンプル調製液Ｂ４
００μ党を加え充分にｄ合した後、遠心分離（５＊００
０ｇ＋２０分）を用いてアセトニトリルにより変性した
たん白を沈殿分離させ、その上清５００μ氾をカテコー
ルアミン分析用試料とした。測定は実施例１と同じ方向
で行なった。今回測定した血漿にカテコールアミンの標
準サンプルを添加し、添加回収率を測定した結果を表４
に示す。ＮＥ，Ｅ，ＤＡの各々の添加回収率は９８％以
上と良好な結果が得られ、従来法に比べて著しく回収率
が向上していることがわかる。ここでは、有機溶媒とし
てアセトニトリルを用いたが、一般に有機溶媒による除
たん白法に用いられる有機溶媒、例えばエタノール，メ
タノール，アセトン等であれば問題ない。

スＬ集４工 本発明によるカテコールアミン分析用サンプル調製法の
さら番；他の実施例について説明する。試料としてはＥ
ＤＴＡ採血を行なった血漿を用いた。

該血漿６００μｋに６％過塩素酸３００μ歳を加え充分
に混合した後、遠心分ｔｌ（５，０　０　０　ｇ，２０
分）を用いて過塩素酸により変性したたん白を沈殿分離
させ，その上清４００μＱを２ＮＮａＯＨを用いてｐＨ
７．０以上に調整し、さらに↓ＯｍＭメチルボロン酸溶
液５ｏμΩを添加し、カテコールアミン分析用試料とし
た。測定は実施例１と同し方法で行なった。今回測定し
た血漿にカテコールアミンの標準サンプルを添加し、添
加回収率を測定した結果を表４に示す。ＮＥ，Ｅ，ＤＡ
の各各の添加回収率は９８％と良好な結果が得られ、従
来法に比べて著しく回収率が向上していることがわかる
。

尖凰盟土 本実施例によるカテコールアミン分析用サンプル調製法
のさらに他の実施例について説明する。

試料としてはＰＨ１〜２に蓄尿したものを用いた。

まず最初に、カテコールアミン分析用サンプル調製液Ｃ
（以下，希釈液Ｃと呼ぶ）を調製した。該希釈液Ｃの組
或を表５に示す。該蓄尿２０μＱを希釈液Ｃで１００倍
に希釈したものをカテコールアミン分析用試料とした。

測定は実施例１と同じ方法で行なった。今回測定した蓄
尿にカテコールアミンのＪｊＭ＄サンプルを添加し、添
加回収率を測定した結果を表６に示す。さらに、カテコ
ールアミンとコンプレックスを形成することができるフ
エニルボロン酸及びエチルボロン酸を各々含有するカテ
コールアミン分析用サンプル調製液Ｄ及びＥ（以下、希
釈液Ｄ及びＥと呼ぶ）を調整した。

該希釈液Ｄ及びＥの組成を表５に示す。また、希釈液Ｄ
及びＥを用いて調製した試料を用いた添加回収率の測定
結果を表６に示す。表６に示すようにＮＥ，Ｅ，ＯＡの
各々の添加回収率は、希釈液Ｃ，Ｄ．Ｅを用いたいずれ
の場合も９５％以上と良好な結果が得られた。以上のこ
とから、調製液に添加するホウ素化合物はホウ酸バツフ
ァーに限るものでなく，カテコーノレアミンとコンプレ
ックスを形成し得る２つ以上の水酸基を有するホウ素化
合物、例えばフエニルボロン酸，エチルボロン酸等でも
同様の効果が得られることが明らかとなった。

表 ５ 表 ６ 本発明によるカテコールアミン分析装置を第１図により
説明する。

第ｌ図の流路系統図において、 オートサンプラーｌには、サンプルラツク２を装着でき
るようにサンプルステージ３が設けられている。サンプ
ルラツク２には、分析すべきサンプルを収容した試料容
器４を配列すると共に、蛍光ラベリング用の反応試薬５
，内部標準液６，標準サンプル７が各々の容器に収容さ
れている。サンプルは、血漿や尿などを本発明のカテコ
ールアミン分析用サンプル調製法に従ったものを使用す
る。

また、サンプルステージ３に近接して反応容器８，ノズ
ル洗浄槽９，ドレインポート１０，注入ポート１ｌが各
々固定の位置に設けられている。駆動機構２は、ＸＹｚ
の騙動機能を有し，分注ノズル１３を縦横上下自動自在
に駆動して、前記サンプラー上の容器やポートの位置に
移動させることが出来る。分注ノズルｌ３の上端は、テ
フロンチューブなどの細管１４により三方弁１５を介し
て、分注ポンプ１６及び洗浄槽１７に連結されている。

分注ポンプ１６は、パルスモーターで駆動するシリンジ
ポンプを使用している。恒温ブロック１８は、反応容器
８の温度を所定の条件に保つために設けられている。ま
た，サンプルステージ３には、サンプルラツク２上のサ
ンプルや試薬を分析中低温に保つように冷却装置が組み
込まれている。

分析部１９は、サンプルの濃縮と不純物除去を行なうプ
レカラム流路系，サンプル成分の分離を行なう分離力ラ
ム流路系、及び測定演算部からなる。プレカラム流路系
では、前処理液槽２０の前処理液が、ボンプ２１により
一定流速で送液され、試料導入弁２２を経由してプレカ
ラム２３に流れている。試料導入弁２２は，オートサン
プラーの注入ボートｌ１から注入されたポンプ液を所定
量計量して分析部に導入するための計量管２４が設けら
れている。分離力ラム流路系では、溶離液槽２５の溶離
液がボンプ２６により一定流速で送液され、カラム切換
弁２７を経由して分離力ラム２８に流れている。カラム
切換弁２７を切換えることにより溶離液はプレカラム２
３を経由して流れ、プレカラムで処理されたサンプルを
分離力ラム２８に移送する。測定演算部は，分離力ラム
２８から溶出するサンプル戒分の蛍光強度を測定する蛍
光光度計２９及び測定結果の演算処理及び表示を行なう
ためのＡ／Ｄ変換部３０，制御部３１，プリンタ３２，
ＣＲＴ３３などからなり、蛍光光度計２９にはブローセ
ル３４を有する。尚，切換コック３５．３６は，ポンプ
２１．２６内の液を必要時にパージ出来るように設けら
れている。

次に、本実施例による分析装置を用いる場合の各動作に
ついて説明する。

この場合には、オートサンプラー上で上述したカテコー
ルアミン分析用調製法に従って調製したサンプルの蛍光
ラベリング，プレカラムによる濃縮及び不純物除去，分
離力ラムによるサンプル成分の分離及び測定、の順で各
サンプルの処理が行われる。第２図のそのフローチャー
トを示す。装置の動作は次のステップで行われる。

（１）反応容器洗浄 ノズル１３を反応容器８の位置に移動し、分注ポンプ１
６を動作させ洗浄液槽↓７の洗浄液を注入する。注入量
は，反応容器の容量より多量に注入し、余剰の洗浄液は
オーバーフローさせドレインボート１０から廃出させる
。次に，ノズルを反応容器の底に降下させ容器内の洗浄
液を吸いあげ、ノズルをドレインポートに移動させて吸
い上げた液を廃出する。この動作に先だち吸い上げた汚
れた洗浄液が、ノズル内のきれいな洗浄液に拡散しない
ようにあらかじめノズルの先端に若干量の気泡を吸って
おくこともできる。尚、吸引に先だち気泡を吸って境界
を作っておく作業は，後のサンプルや試薬を吸い上げる
場合にも必要となることもあるが、以降の説明には省略
する。以上の動作を複数回，例えば３回繰り返すことに
より反応容器の洗浄が終る。

（２）サンプル分注 ノズル１３を内部標準液６の位置に移動し、降下させて
所定量吸引し、次に分析する試料容器４の位置に移動し
、所定量のサンプルを吸引した後、ノズルを反応容器の
位置に移動させ、吸引したサンプルと内部標準液を反応
容器８に分注する。内部標準溶液は、システム全体、特
にカラムによる回収率の変動などを補正するために使用
される標準液で、本実施例の場合はインプレテレノール
を標準物質として用いている。

（３）ノズル洗浄 ノズル１３をドレインポート１０に移動し、洗浄液を吐
出して、内部標準液及びサンプルによるノズルの内壁の
汚れを洗い出した後、ノズル洗浄槽９に移動して槽内に
降下させ、洗浄液を吐出してノズルの尖端外側を洗浄す
る。

（４）試薬分注混合 ノズル１３を反応試薬５の容器の位置に移動し、試薬を
所定量吸引し、反応容器８に注入し先に注入したサンプ
ル及び内部標準液と混和させる。混和の方法としては、
ノズル内にあらかしめ空気を吸引しておき、容器内に挿
入して空気を吐出する方法や外部から機械的または電気
的に容器を振動させる方法などがあるが，混合しやすい
液体で、かつ吐出量が比較的多量であれば、高速で吐出
することにより可能な場合もある。

（５）反応 上記サンプルと試薬の混合液（以下、サンプル液と呼ぶ
）を反応容器内で所定時間放置し、反応させ蛍光ラベリ
ングを行なう。

（６）サンプル導入 反応の終了したサンプル液をノズル１３で吸引し、ノズ
ルｌ３を洗浄ポート１１に挿入して試料導入弁２２の計
量管２４に注入する。次に試料導入弁２２を切換えると
計量管２４は、流路３７と３８の間に接続され前処理液
の流れによりサンプル液はプレカラムに送られる。

（７［３縮 前処理液の流れにより、サンプル液をプレカラム２３に
流しプレカラム内にサンプルを吸着させ諧縮させると共
に、分析の妨害となる不純物をサンプルから除去し，廃
液口３９から廃出する。

（８）サンプル移送 カラム切換弁２７を切換えるとプレカラム２３は、流路
４０，４１の間に接続され、溶離液は、プレカラム２３
を経由して流れ、プレカラムに濃縮されたサンプルを解
離して分離力ラム２８に送り分離が開始される。全サン
プルが流路４１に移動した時点で、カラム切換弁２７を
再び切換える（図示の状態となる）と溶離液はプレカラ
ム２３を経由せず直接分離力ラム２８に流れ，プレカラ
ム２３には前処理液が流れる． （９）分離 引きっづき溶離液を分離力ラム２８に流し．目的或分を
分離する． （１０）ブレカラム再生 上記サンプル或分の分離と平行して、プレカラム２３に
前処理液を流し、つぎのサンプルを受入れられる状態に
復元させる。

（ｌ１）測定 分離力ラム２８により分離され溶出したサンプル威分は
、順次蛍光光度計２９のフローセル３４に流れ、蛍光強
度を検出し、演算処理して各成分の濃度を求める。

（１２）データ表示・出力 上記データをプリンター３２，ＣＲＴ３３などにより表
示出力する。

失凰舊旦 本発明によるカテコールアミン分析法の実施例について
説明する。第１図に示した流路図に基づくカテコールア
ミン分析装置を用いて測定した。

試料としては，ＥＤＴＡ採血を行なった血漿を用いた。

サンプル調製法は、実施例１と同様に行なって、カテコ
ールアミン分析用試料５００μ悲を得た。該カテコール
アミン分析用試料５００μＱを試料容器４に入れ、蛍光
ラベリング用の反応試薬５及び内部標準溶液６，標準サ
ンプル゛７をサンプルラツク２に装填した．測定条件は
表７に示す通りである。分析手順は、第２図に示すフロ
ーチャ−１・に基づいて行なった。反応容器内での反応
は、サンプル５００μ党及び蛍光ラベリング用反応試薬
４５０μ悲，及び内部標準溶液５０μ氾を混合し，反応
温度４５℃，反応時間３分で行なった。反応後の計量管
２４への注入量は５００μａとした。また，前処理液及
び溶離液の流量は、各各１　ｍ　Ｑ　／ｒＢｉｎとした
。得られたクロマトグラフを第６図に示す。たて軸は誘
導化されたカテコールアミンの蛍光強度、横軸は保持時
間を示す。同一試料を用いた同時再現性及び添加回収率
の測定結果を表８に示す。このカテコールアミン分析装
置を用いた測定結果において、Ｃ．Ｖ．値が３％以下、
添加回収率がＮＥ，Ｅ，ＤＡ各々９８％以上と良好な結
果が得られた。また、実施例２及び３に基づいて調製し
たサンプルを用いた測定においても、精度，回収率共に
同様に良好な結果が得られた。

表 ８ 本発明によるカテコールアミン分析法の他の実施例につ
いて説明する。試料としては、Ｅ　ＤＴＡ採血を行なっ
た血漿を用いた。サンプル調製法は本発明に基づく実施
例１と同様に行なった。測定に使用した装置は、第１図
に示した流路図に基づく本発明のカテコールアミン分析
装置である。分析手順は、第２図に示すフローチャート
に基づいて行なった。本実施例では分離能を向上させる
ために、分離力ラムとして、４．６　ｎｗｎｌ．Ｄ．Ｘ
８０Ｉｍ＋（シリカＯＤＳ．粒径３μｍ）を用いた。ま
た、分析時間を３分以内に抑えるために、内部標準物質
は添加しない。定量法としては．ＮＥ，Ｅ，ＤＡ各々↓
ｐｍｏＱ／ｍＱを含有する標準サンプルの測定値を用い
て濃度計算を行なう外部標準法を用いた。他の測定条件
は表７に示すとおりである。

本実施例７の濃度計算法として外部標準法を用いた測定
結果は、Ｃ．Ｖ．値が４％以下添加回収率がＮＥ，Ｅ，
ＤＡ各々９６％以上であり、実施例６の内部標準法の場
合と同様に精度及び回収率共に良好な結果が得られた。

また得られたクロマトグラムを第７図に示す。たて軸は
蛍光強度，横軸は保持時間を示す。第７図においてＮＥ
のピークは、第６図におけるＮＥのピークより分離が良
いことがわかる。

速１む生生 本発明によるカテコールアミン分析法の実施例について
説明する。試料としては．ｐＨ１〜２に蓄尿したものを
用いた。サンプル調製法は、本発明に基づく実施例４と
同様に行なった。分析装置として、第１図に示した流路
図に基づくカテコールアミン分析装置を用いた。分析手
順は、第２図に示すフローチャートに基づいて行なった
。分析時間を２．５　分以内に行なうために、分離力ラ
ムとして、４．０ｍｍＩ．Ｄ．Ｘ５０ｎ＋ｍ　（シリカ
○ＤＳ，粒径２．５μｍ）を用いた６定量法としては．
ＮＥ，Ｅ，ＤＡ各々ｌｐｍｏｆｌ／ｍｌ２を含有する標
準サンプルを用いて濃度計算を行なう外部標準法を用い
た。他の測定条件は表７に示すとおりである。得られた
クロマトグラムを第８図に示す。たて軸は蛍光強度、横
軸は保持時間を示している。第８図の如く、尿中カテコ
ールアミン３成分（ＮＥ，Ｅ，ＤＡ）が，２．５分以内
で分析できる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、血漿・尿などの生体試料中ｅカテコー
ルアミンをホウ酸等のように２つ以上Ｃ水酸基を有する
ホウ素化合物とコンプレックスを形或させて安定化し、
生体成分中の他の物質による酸化などの影響を受けにく
くできるので，カテコールアミンを高回収率，高精度で
測定できる置果がある。

また、従来高速液体クロマトグラフィーを用いて精度よ
く測定することが困難であったカテコールアミンを正確
に測定することができるので、例えば病院における集団
検診や日常検査などのルーチンワークにも使用できるカ
テコールアミン分析装置を提供できる効果もある。

【図面の簡単な説明】

第ｌ図は本発明の一実施例のカテコールアミン分析装置
の流路系統図、第２図は第ｌ図の実施例の分析フローチ
ャート、第３図は本発明の他の実施例の分析装置の流路
系統図，第４図（ａ），第６図，第７図及び第８図は本
発明の実施例で得られたクロマトグラム，第４図（ｂ）
は従来法で得られたクロマトグラム、第５図は本発明の
実施例に用いたサンプル調製液のｐＨと回収率の関係を
示す図である。 ｌ・・・オートサンプラー、２・・・サンプルラック，
４・・試料容器．５・・・ラベル化反応試薬、８・・・
反応容器、９・・・ノズル洗浄槽、１０・・・ドレイン
ポート、１１・・・注入ポート、１３・・・分注ノズル
、２０・・・前処理液槽，２１・・・送液ボンプ、２２
・・・試料導入弁．２３・・・プレカラム，２４・・・
計量管、２５・・・溶離液槽、２６・・・送液ポンプ、
２７・・・カラム切換弁、２８・・・分離カラム、２９
・・・蛍光光度計、３１・・・制第 １ 図 第 ２ 図 第 ３ 図 第 ４ 図 保持時間（分） 保持時間（分） （ａ） （ｂ） 第 ５ 図 １）Ｈ 第 ６ 図 保持時間（分） 第 ７ 図 ０１２３ 保持時間（分） 第 ８ 図 Ｏ　１　　２　　３ 保持時間（分）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生体液中のカテコールアミンを分析する方法におい
   て、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、Ｒ：水酸基、芳香族基、アルキル基）の構造
   式を有するホウ素化合物をサンプルと混合しカテコール
   アミンのコンプレックスを形成することを特徴とするカ
   テコールアミン分析法。 ２、請求項第１項記載の方法において、上記ホウ素化合
   物を含有したサンプルのｐＨが、７．０以上であること
   を特徴とするカテコールアミン分析法。 ３、請求項第１項記載の方法において、上記ホウ素化合
   物を含有したサンプルを限外ろ過膜を用いて除蛋白を行
   なうことを特徴とするカテコールアミン分析法。 ４、請求項第１項記載の方法において、上記ホウ素化合
   物を含有したサンプルを有機溶媒を用いて除蛋白を行な
   うことを特徴とするカテコールアミン分析法。 ５、請求項第１項記載の方法において、上記ホウ素化合
   物を、あらかじめ除蛋白したサンプルに添加することを
   特徴とするカテコールアミン分析法。 ６、▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、Ｒ：水酸基、芳香族基、アルキル基）上記構
   造式を有するホウ素化合物を含有する溶液のｐＨを７．
   ０以上に調製したことを特徴とするカテコールアミン分
   析用サンプル調製液。 ７、ホウ素化合物を添加したサンプルを、検体の前処理
   機能付オートサンプラ、分離カラム、溶離液、送液ポン
   プ、検出器及びデータ処理装置で構成される液体クロマ
   トグラフに基づく分析装置で分析することを特徴とする
   カテコールアミン分析法。 ８、ホウ素化合物を添加したサンプルを液体クロマトグ
   ラフに導入するための検体の前処理機能付オートサンプ
   ラ、分離カラム、溶離液、送液ポンプ、検出器及びデー
   タ処理装置で構成することを特徴とするカテコールアミ
   ン分析装置。