CN117388414A - 一种检测奶粉中水溶性维生素含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测奶粉中水溶性维生素含量的方法，通过配制样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液，首次将三柱二维凝胶色谱‑串联质谱联用技术应用于奶粉中水溶性维生素的快速、高效、灵敏的检测，方法前处理简单，实现在线净化，应用凝胶柱在线净化液相色谱串联质谱成功用于多组分维生素分析，建立了在线净化液相色谱串联质谱法测定奶粉中多种水溶性维生素的含量。建立了一个全新的的快速检测方法，简单易操作的分析过程，使人为干预因素减少，方法的回收率和精密度显著提高，同时该技术还具有有机溶剂消耗小，成本低的特点，大大提高了检测效率。

Description

一种检测奶粉中水溶性维生素含量的方法
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种检测奶粉中水溶性维生素含量的方法。
背景技术
维生素是机体维持其正常生活所必需的一类营养素，也是婴幼儿配方奶粉中必须添加的成分。世界各国对婴幼儿配方粉中添加的维生素种类和含量有严格的规定。然而，婴儿配方粉中维生素的真实含量与实际标签值不符的情况时有发生。由于维生素摄入不足或过量均可导致机体功能障碍，因此对婴幼儿配方粉中的维生素质量进行评价是评判婴幼儿配方粉质量的重要指标。
维生素的种类很多，化学结构各异，通常根据其溶解性分为脂溶性和水溶性两大类，在婴幼儿配方粉中添加的水溶性维生素主要包括维生素B1、B2、B5、B7等，现有的分析技术存在多类不同水溶性维生素同时检测前处理操作繁琐、样品检测周期长、手工预处理的杂质干扰大、重现性难以保证等问题以及多种水溶性维生素同时分析时很难满足所有待测物质均取得很好的定性定量效果的问题，现行标准采用单个化合物单一检测，不能满足不同测定，检测效率低。
发明内容
针对上述问题情况，本发明提供一种检测奶粉中水溶性维生素含量的方法，解决传统水溶性维生素分析技术中前处理方法操作繁琐、样品检测周期长、手工预处理的杂质干扰大、重现性难以保证以及多种物质同时分析时很难满足待测物质均取得很好的定性定量效果等技术问题，为奶粉中水溶性维生素测定提供一个全新的思路。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种检测奶粉中水溶性维生素含量的方法，包括如下步骤：
S1：混合标准品工作溶液的配制；精密称取维生素B1、B2、吡哆胺、吡哆醇、吡哆醛、叶酸、泛酸、生物素标准品各10mg，B1、B2、生物素用甲酸溶解，叶酸用10％氨水溶解，其余用甲醇溶解后，均用甲醇定容至20.0mL，各储备液皆为0.5mg/mL，于-20℃下保存；分别精密移取1.0mL的水溶性维生素储备液用甲醇定容至10mL，制成50μg/mL的混合标准品工作溶液，冷藏备用；再精密移取0.2mL 50μg/mL的混合标准品工作溶液用水定容至10mL，制成1μg/mL的混合标准品工作溶液，临用新配；
S2：同位素内标工作溶液的配制；精密称取维生素B1、B2、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、叶酸、泛酸、生物素内标物各1mg，B1、B2、生物素同位素用甲酸溶解，叶酸同位素用10％氨水溶解，其余用甲醇溶解后，溶解定容于2mL容量瓶，再精密移取0.1mL定容的容量瓶中内标储备液至5mL容量瓶中，用甲醇定容，制得10μg/mL的混合内标工作溶液，冷藏备用。再精密移取1mL定容的容量瓶中内标储备液至10mL容量瓶中，用水定容，制得1μg/mL的内标物工作溶液，临用新配。
S3：线性溶液的制备；精密吸取适量的1000ng/mL混合标准品工作溶液和适量的同位素内标工作溶液，分别加水定容于10mL容量瓶，各加100μL甲酸保持性质稳定，得到水溶性维生素浓度浓度分别为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL，内标浓度为10ng/mL的线性标准溶液，供色谱测定。
S4：空白溶液的制备：精密吸取适量的1000ng/mL适量的同位素内标工作溶液，分别加水定容于10mL容量瓶，各加100μL甲酸保持性质稳定，制得内标浓度为10ng/mL的空白溶液，供色谱测定；
S5:样品溶液的制备；称取0.2g奶粉样品，置于50mL高速离心管中，精密加入200μL，1000ng/mL的混合内标工作溶液，加入4.8mL水，加入15mL现配的10mmol/L乙酸铵溶液完全溶解，置于多通道涡旋混合器涡旋混合2min，加入2mL蛋白沉淀剂，摇床震荡10min，置于高速离心机中5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm有机滤膜得样品溶液备用；
S6：加标回收试验样品溶液的制备：
L组：称取奶粉样品0.2g，加入200μL 1000ng/mL的内标物工作溶液，加入200μL维生素浓度为1000ng/mL的混合标准品工作溶液，加入4.6mL水完全溶解，加入15mL现配的10mmol/L乙酸铵溶液，涡旋混合2min，加入2mL三氯甲烷，摇床震荡10min，置于高速离心机以5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm有机滤膜；
M组：称取奶粉样品0.2g，加入200μL 1000ng/mL的内标物工作溶液，加入2mL维生素浓度为1000ng/mL的混合标准品工作溶液，加入2.8mL水完全溶解，加入15mL现配的10mmol/L乙酸铵溶液，涡旋混合2min，加入2mL三氯甲烷，摇床震荡10min，置于高速离心机以5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm有机滤膜；
H组：称取奶粉样品0.2g，加入200μL 1000ng/mL的内标物工作溶液，加入5mL维生素浓度为1000ng/mL的混合标准品工作溶液，加入0.8mL水完全溶解，加入15mL现配的10mmol/L乙酸铵溶液，涡旋混合2min，加入2mL三氯甲烷，摇床震荡10min，置于高速离心机以5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm有机滤膜；
S7：用三柱二维液质联用法测定样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液：
a进样过程：由自动进样器分别吸取5μL样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液注入色谱仪中，以三柱二维液质联用法，测定样品溶液中的目标化合物峰面积；线性溶液中目标化合物峰面积；加标回收试验样品溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积，空白溶液在目标化合物出峰处无干扰，标准工作溶液及试样溶液中待测组分的响应值均应在监测器的线性范围之内；
b曲线方程斜率、曲线方程截距的计算
以线性溶液中的目标化合物峰面积定量，得到曲线方程A＝aC+b，式中C为溶液中目标化合物量，单位为ng/mL；A为目标化合物峰面积；a为曲线方程斜率；b为曲线方程截距，根据线性溶液的浓度、测出的线性溶液中目标化合物峰面积，采用拟合法，计算得出a和b；
c结果分析：样品溶液中未知组份的保留时间分别与线性溶液中的目标化合物在同一色谱柱上的保留时间相比较，样品中某组份的两组保留时间与线性溶液中某一维生素的两组保留时间的绝对值在0.05min内，认定为该维生素，样品溶液中的目标化合物量浓度C，其单位为ng/mL，计算公式如下：
C＝(A-b)/a；式中：A为样品溶液中的目标化合物峰面积；a和b由步骤b计算得到；
d结果验证：加标回收试验样品溶液按步骤c计算出实际的目标化合物残留量浓度C，与其理论的目标化合物残留量浓度C相比较，计算其平均回收率，平均回收率为60-120％，证明该检测方法可行。
所述的一种检测奶粉中水溶性维生素含量的方法，所述维生素包括维生素B1、维生素B2、维生素B5、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、维生素B7、维生素B9。
所述的一种检测奶粉中水溶性维生素含量的方法，步骤S5中蛋白质沉淀剂为三氯甲烷。
所述的一种检测奶粉中水溶性维生素含量的方法，三柱二维液质联用法如下：首次利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，小分子的目标化合物在色谱柱上保留时间较长，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰；通过水相凝胶柱将基质干扰物分离后，二维色谱系统进行切换，将目标化合物保留在富集柱上，当目标物完全转移到富集柱后，二维色谱在一次切换至初始状态，同时目标物在第二维色谱柱上进行分离分析，通过在线柱切换液相-质谱联用技术实现维生素的在线检测。
所述的一种检测奶粉中水溶性维生素含量的方法，色谱和质谱条件如下：
1)一维液相色谱条件
色谱柱：凝胶柱Agilent Bio SEC-54.6×150mm，5μm，流动相为pH为7.4的磷酸盐缓冲液；流速为0.35mL·min-1；富集柱：Waters XBridge C8 Direct Connect HP2.1*30mm 10μm；
2)二维液相条件色谱条件
色谱柱：Waters ACOUTITY UPLC HSS柱T32.1×100mm，1.8μm；流动相A相为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸甲醇；梯度洗脱；柱温：35℃；进样量：5μL；
3)质谱条件
质谱仪：三重四级杆串联质谱仪；
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测；
毛细管电压(kV)：3.00；
锥孔电压(V)：50.00；
脱溶剂温度(℃)：350；
源温度(℃)：150；
碰撞气体流速(mL/min)：0.25；
雾化气体压强(Bar)：7.00；
脱溶剂流速(L/hr)：650；
锥孔流速(L/hr)：150。
所述的一种检测奶粉中水溶性维生素含量的方法，进样过程分析具体如下：在四元泵的作用下，由自动进样器分别吸取5μL样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液向一维色谱柱进样，利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，结果由紫外检测器检测，左切换阀和右切换阀在0-4.0min保持初始状态，即均处于位置2，左切换阀的2号位和3号位相通，基质干扰物等至废液池，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰，右切换阀亦是2号位与3号位相通，切至废液的状态；在4.0-12.0min左切换阀切换至位置1，即2号位与1号位相通，将目标化合物切换至富集柱中进行富集，在12.0min左切换阀5切换至位置2，二元泵将富集柱上的目标化合物反冲至二维色谱柱上进行分离，右切换阀位置不变，利用二元泵流动相将富集柱上的磷酸盐缓冲溶液冲至废液池后，防止磷酸盐对质谱系统造成损伤，在17.5min时右切换阀切换至位置1，即右切换阀的2号位与1号位相通，进入质谱检测器进行分析，获得典型色谱图。
与现有技术相比，本发明技术方案具有如下有益效果：
(1)本课题首次利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，小分子的目标化合物在色谱柱上保留时间较长，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰。
(2)通过水相凝胶柱将基质干扰物分离后，二维色谱系统进行切换，将目标化合物保留在富集柱上，当目标物完全转移到富集柱后，二维色谱再一次切换至初始状态，同时目标物在第二维色谱柱上进行分离分析。通过在线柱切换液相-质谱联用技术实现多种水溶性维生素的在线净化目的，大大提高了检测效率，降低了实验人员的劳动强度。
(3)由于采用水相凝胶色谱，其流动相是水，因此也实现水溶性维生素的绿色环保。经过条件优化，选择合适的复合溶剂实现。
本发明技术方案样品处理方法的选择优化，减少基质干扰；优化在线柱切换液相色谱条件，使用凝胶柱将目标物和基质能尽可能的分离，在线净化，实现快速高效的检测；优化质谱检测条件，使各目标分析物获得灵敏、稳定的质谱信号；实现目标物经过在线净化后，导入质谱进行分析，并应用于奶粉中水溶性维生素的快速检测。
综上，首次将三柱二维凝胶色谱-串联质谱联用技术应用于奶粉中水溶性维生素的快速、高效、灵敏的检测，方法前处理简单，实现在线净化，建立维生素B1、B2、B6等多种水溶性维生素的同时检测技术。它通过制备样品溶液、对照品线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液，利用三柱二维液质联用法检测，利用在线柱切换液相-质谱联用技术，实现奶粉基质的在线净化目的，大大提高了检测效率，降低了实验人员的劳动强度，解决了传统水溶性维生素分析技术中前处理方法操作繁琐、样品检测周期长、手工预处理的杂质干扰大、重现性难以保证以及多种物质同时分析时很难满足待测物质均取得很好的定性定量效果的问题，将实验人员从日益繁重的检测任务解脱出来，方法使用较少的有机试剂，检测周期短，相对于其他方法具有绿色环保，快速、准确等特点。
该项目将凝胶色谱应用于维生素的检测，应用凝胶柱在线净化液相色谱串联质谱成功用于多组分维生素分析，建立了在线净化液相色谱串联质谱法测定奶粉中多种水溶性维生素的含量。建立了一个全新的的快速检测方法，简单易操作的分析过程，使人为干预因素减少，方法的回收率和精密度显著提高，同时该技术还具有有机溶剂消耗小，成本低的特点。通过水相凝胶柱将基质干扰物分离后，二维色谱系统进行切换，将目标化合物保留在富集柱上，当目标物完全转移到富集柱后，二维色谱在一次切换至初始状态，同时目标物在第二维色谱柱上进行分离分析。可有效监测和应对多种水溶性维生素检测突发事件。同时，作为一种新的快速检测技术，不仅减少了有毒有害化学试剂的接触，降低了实验的成本，也有利于实验人员的自身健康和安全，达到绿色检测的目的。通过针对多种维生素检测的二维液质联用法的项目研究，能提升维生素的检测能力，为政府行政部门的分析决策提供先进技术支撑。
附图说明
图1为本发明的三柱二维液质联用工作原理图；
图2为本发明水溶性维生素标准品典型色谱图；
图3为本发明水溶性维生素样品色谱图；
图4为本发明采用不同流动相时的一维色谱图(图4-1为采用10％甲醇作为流动相；图4-2为采用5％甲醇作为流动相；图4-3为采用5％甲醇(含0.2％甲酸)作为流动相；图4-4为采用纯水作为流动相；图4-5采用10％pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液作为流动相时的一维色谱图；图4-6为采用pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液作为流动相；图4-7为采用pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液作为流动相时的奶粉基质一维色谱图)；
图5为凝胶色谱原理图；
图6为试剂空白和基质空白的进行184(磷脂类分子)子离子扫描(经过凝胶柱)；
图7为对试剂空白和基质空白的进行184(磷脂类分子)子离子扫描(不经过凝胶柱)
图8-图10为各品牌一段奶粉中维生素B1、维生素B2、维生素B5含量柱状图；
图11为测得的国产奶粉和国外奶粉维生素B1的总含量柱状对比图；
图中：1、四元泵；2、自动进样器；3、一维色谱柱；4、紫外检测器；5、左切换阀；6、右切换阀；7、二维色谱柱；8、富集柱；9、二元泵；10、质谱检测器。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明所用到的实验仪器和实验试剂如下表1和表2所示：
表1实验仪器
表2实验试剂
如图1-4所示，一种检测奶粉中水溶性维生素含量的方法，具体包括如下步骤：
S1：混合标准工作溶液的配制；精密称取维生素B1、B2、吡哆胺、吡哆醇、吡哆醛、叶酸、泛酸、生物素标准品各10mg(精确至0.01mg)，B1、B2、生物素用甲酸溶解，叶酸用10％氨水溶解，其余用甲醇溶解后，均用甲醇定容至20.0mL，各储备液皆为0.5mg/mL，于-20℃下保存。分别精密移取1.0mL的水溶性维生素储备液用甲醇定容至10mL，制成50μg/mL的混合标准品工作溶液，冷藏备用。再精密移取0.2mL 50μg/mL的混合标准品工作溶液用水定容至10mL，制成1μg/mL的混合标准品工作溶液，临用新配。
S2：同位素内标工作溶液的配制；精密称取维生素B1、B2、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、叶酸、泛酸、生物素内标物各1mg，B1、B2、生物素同位素用甲酸溶解，叶酸同位素用10％氨水溶解，其余用甲醇溶解后，溶解定容于2mL容量瓶，再精密移取0.1mL定容的容量瓶中内标储备液至5mL容量瓶中，用甲醇定容，制得10μg/mL的混合内标工作溶液，冷藏备用。再精密移取1mL定容的容量瓶中内标储备液至10mL容量瓶中，用水定容，制得1μg/mL的内标物工作溶液，临用新配。
S3：线性溶液的制备；精密吸取适量的1000ng/mL混合标准品工作溶液和适量的同位素内标工作溶液，分别加水定容于10mL容量瓶，各加100μL甲酸保持性质稳定，得到水溶性维生素浓度浓度分别为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL，内标浓度为10ng/mL的线性标准溶液，供色谱测定。
S4：空白溶液的制备：精密吸取适量的1000ng/mL适量的同位素内标工作溶液，分别加水定容于10mL容量瓶，各加100μL甲酸保持性质稳定，制得内标浓度为10ng/mL的空白溶液，供色谱测定；
S5:样品溶液的制备；称取0.2g奶粉样品，置于50mL高速离心管中，精密加入200μL，1000ng/mL的混合内标工作溶液，加入4.8mL水，加入15mL现配的10mmol/L乙酸铵溶液完全溶解，置于多通道涡旋混合器涡旋混合2min，加入2mL蛋白沉淀剂，摇床震荡10min，置于高速离心机中5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm有机滤膜得样品溶液备用。
该步骤中对样品前处理条件进行了优化，本发明实验中选用了不同的蛋白沉淀剂，具体如下表3：
表3蛋白沉淀剂选择
实验选用4种蛋白沉淀剂进行进样试验，用高效液相色谱分析。95％乙醇组：称取0.2g奶粉样品，置于50mL高速离心管中，精密加入2mL，1000ng/mL的混合标准工作溶液，加入200μL 1000ng/mL的内标物工作溶液，加入0.8mL水，加入7mL 95％乙醇完全溶解，摇床震荡10min，置于离心机中5000rpm离心10min，取0.5mL上清液加入0.5mL现配的10mmol/L乙酸铵溶液过0.22μm有机滤膜，取0.5mL进样分析。其他3组试样制备参照95％乙醇组的制备工艺。
通过对比实验数据，甲醇的蛋白沉淀效果并不理想，乙腈基质效应明显，95％乙醇组部分水溶性维生素的谱图峰形较差，因此本发明选用三氯甲烷作为蛋白沉淀剂。
S6：用三柱二维液质联用法测定样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液，本发明采用三柱二维液质联用法如下：首次利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，小分子的目标化合物在色谱柱上保留时间较长，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰；通过水相凝胶柱将基质干扰物分离后，二维色谱系统进行切换，将目标化合物保留在富集柱上，当目标物完全转移到富集柱后，二维色谱在一次切换至初始状态，同时目标物在第二维色谱柱上进行分离分析，通过在线柱切换液相-质谱联用技术实现磺胺类药物残留的在线净化，具体过程如下：
a进样过程：由自动进样器分别吸取5μL样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液注入色谱仪中，以三柱二维液质联用法，测定样品溶液中的目标化合物峰面积；线性溶液中目标化合物峰面积；加标回收试验样品溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积，空白溶液在目标化合物出峰处无干扰，标准工作溶液及试样溶液中待测组分的响应值均应在监测器的线性范围之内；
b曲线方程斜率、曲线方程截距的计算
以线性溶液中的目标化合物峰面积定量，得到曲线方程A＝aC+b，式中C为溶液中目标化合物量，单位为ng/mL；A为目标化合物峰面积；a为曲线方程斜率；b为曲线方程截距，根据线性溶液的浓度、测出的线性溶液中目标化合物峰面积，采用拟合法，计算得出a和b；
c结果分析：样品溶液中未知组份的保留时间分别与线性溶液中的目标化合物在同一色谱柱上的保留时间相比较，样品中某组份的两组保留时间与线性溶液中某一维生素的两组保留时间的绝对值在0.05min内，认定为该维生素，样品溶液中的目标化合物量浓度C，其单位为ng/mL，计算公式如下：
C＝(A-b)/a；式中：A为样品溶液中的目标化合物峰面积；a和b由步骤b计算得到；
d结果验证：加标回收试验样品溶液按步骤c计算出实际的目标化合物残留量浓度C，与其理论的目标化合物残留量浓度C相比较，计算其平均回收率，平均回收率为60-120％，证明该检测方法可行。
如图1所示，进样分析具体过程如下：在四元泵1的作用下，由自动进样器2分别吸取5μL样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液向一维色谱柱3进样，利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，结果由紫外检测器4检测，左切换阀5和右切换阀6在0-4.0min保持初始状态，即均处于位置2，左切换阀5的2号位和3号位相通，基质干扰物等至废液池，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰，右切换阀亦是2号位与3号位相通，切至废液的状态；在4.0-12.0min左切换阀5切换至位置1，即2号位与1号位相通，将目标化合物切换至富集柱8中进行富集，在12.0min左切换阀5切换至位置2，二元泵9将富集柱8上的目标化合物反冲至二维色谱柱7上进行分离，右切换阀6位置不变，利用二元泵9流动相将富集柱8上的磷酸盐缓冲溶液冲至废液池后，防止磷酸盐对质谱系统造成损伤，在17.5min时右切换阀6切换至位置1，即右切换阀6的2号位与1号位相通，进入质谱检测器10进行分析，获得典型色谱图。图2和图3为水溶性维生素标准品典型色谱图和水溶性维生素样品色谱图。
色谱和质谱条件如下：
1)一维液相色谱条件
色谱柱：凝胶柱Agilent Bio SEC-54.6×150mm，5μm，流动相为pH为7.4的磷酸盐缓冲液；流速为0.35mL·min-1；富集柱：Waters XBridge C8 Direct Connect HP2.1*30mm 10μm；
本发明在该步骤对一维液相色谱流动相选择进行优化，具体如下：
样品溶液制备
称取0.2g奶粉样品，置于50mL高速离心管中，加入200μL 1000ng/mL的内标物工作溶液，加入4.8mL水，加入15mL现配的10mmol/L乙酸铵溶液全溶解，置于多通道涡旋混合器涡旋混合2min，加入2mL三氯甲烷作为蛋白沉淀剂，摇床震荡10min，置于高速离心机中5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm有机滤膜，进样分析。
一维液相色谱流动相选择
本实验选择了10％甲醇、5％甲醇、5％甲醇+0.2％甲酸、纯水、10％pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液、pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液六种流动相进行实验。
通过实验，发现采用10％甲醇作为流动相时，目标物分型不佳，在5-12min处出峰，如图4-1。降低流动相中有机相甲醇的比例后，峰型改善，但是目标化合物出峰时间延长，仍然不集中，如图4-2。在流动相中加入甲酸后，目标化合物没有得到相应的改善，如图4-3。采用纯水作为流动相时，虽然没有了有机相，但是出现不出峰现象，如图4-4。采用10％pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液为流动相时各目标物出峰时间集中在4-8min之间，出峰明显集中，如图4-5。采用pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液为流动相时各目标物出峰时间集中在5-9min之间，基质干扰在3min左右出峰，如图4-6，与目标物有了较好的分离(图4-7)，同时色谱峰良好，有利于二维色谱柱切换入质谱的时间选择，故选用pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液为本实验一维色谱流动相。
2)二维液相条件色谱条件
色谱柱：Waters ACOUTITY UPLC HSS柱T32.1×100mm，1.8μm；流动相A相为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸甲醇；梯度洗脱程序见表4；柱温：35℃；进样量：5μL；
表4梯度洗脱过程表
左切换阀位置1：1～2，3～4，5～6；左切换阀位置2：2～3，4～5，6～1；右切换阀位置1：1～2；右切换阀位置2：2～3(图1)，二维液相阀切换时间表：见表5。
表5左切换阀、右切换阀切换过程表
本步骤中对二维液相色谱流动相进行了优化选择
选择以下表6中的流动相进行优化
表6液相色谱流动相选择
本发明选择了三组流动相进行实验。通过实验，发现采用0.1％甲酸水溶液与甲醇组、0.1％甲酸5mmol/L甲酸铵水溶液与0.1％甲酸5mmol/L甲酸铵甲醇溶液组在质谱的维生素B5、B7、吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛各有离子通道相应不佳，而0.1％甲酸10mmol/L甲酸铵水溶液与0.1％甲酸10mmol/L甲酸铵甲醇溶液组分离效果良好，母离子子离子都有检测到，因此选择后者作为流动相。
4)质谱条件
质谱仪：三重四级杆串联质谱仪；
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测；
毛细管电压(kV)：3.00
锥孔电压(V)：50.00
脱溶剂温度(℃)：350；
源温度(℃)：150；
碰撞气体流速(mL/min)：0.25；
雾化气体压强(Bar)：7.00；
脱溶剂流速(L/hr)：650；
锥孔流速(L/hr)：150。
检测得到的维生素的质谱参数如下表7所示
表7维生素的质谱参数
二维液质联用基质效应
分子排阻色谱法也称为空间排阻色谱(SEC)和凝胶色谱法。在本专利中，多孔凝胶作为固定相的独特性是用于分离基质干扰和目标化合物。第一维色谱用凝胶色谱法使分子的大小进行分离，大分子基质分子先出来，之后目标化合物出来(图5)。与其他色谱模式不同，SEC凝胶色谱不依赖分析物之间的化学作用，可以依靠分子量的大小进行分离，排除多种蛋白质、磷脂等的干扰。
采用全扫描法对试剂空白和基质空白的分子量为500-1500基质干扰物质进行全扫描对比，来评估整个体系的净化效果。结果显示试剂空白(水)的全扫描图和样品基质的全扫描图的离子响应基本一致，说明净化效果很好。
对试剂空白和基质空白的进行184(磷脂类分子)子离子扫描，经过凝胶柱进行对比评估整个体系的净化效果。结果显示试剂空白(水)的子离子扫描图和样品基质的子离子扫描图的离子响应基本一致。说明净化效果很好。见图6。
对试剂空白和基质空白的进行184(磷脂类分子)子离子扫描，不经过凝胶柱，进行对比评估整个体系的净化效果。结果显示试剂空白(水)的子离子扫描图明显响应低于样品基质的子离子扫描图的离子响应。说明凝胶柱的净化效果很好，杂质净化率达到95％以上。见图7。
方法学验证
某市面常见品牌的罐装婴幼儿配方奶粉，低温保存。
设置2组空白，3组L组，3组M组，3组H组，共11组做方法学验证。
加标回收试验样品溶液制备如下：
样品组：称取奶粉样品0.2g，加入200μL 1000ng/mL的内标物工作溶液，加入4.8mL水完全溶解，加入15mL现配的10mmol/L乙酸铵溶液，涡旋混合2min，加入2mL三氯甲烷，摇床震荡10min，置于高速离心机以5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm有机滤膜。
L组：称取奶粉样品0.2g，加入200μL 1000ng/mL的内标物工作溶液，加入200μL维生素浓度为1000ng/mL的混合标准品工作溶液，加入4.6mL水完全溶解，加入15mL现配的10mmol/L乙酸铵溶液，涡旋混合2min，加入2mL三氯甲烷，摇床震荡10min，置于高速离心机以5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm有机滤膜。
M组：称取奶粉样品0.2g，加入200μL 1000ng/mL的内标物工作溶液，加入2mL维生素浓度为1000ng/mL的混合标准品工作溶液，加入2.8mL水完全溶解，加入15mL现配的10mmol/L乙酸铵溶液，涡旋混合2min，加入2mL三氯甲烷，摇床震荡10min，置于高速离心机以5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm有机滤膜。
H组：称取奶粉样品0.2g，加入200μL 1000ng/mL的内标物工作溶液，加入5mL维生素浓度为1000ng/mL的混合标准品工作溶液，加入0.8mL水完全溶解，加入15mL现配的10mmol/L乙酸铵溶液，涡旋混合2min，加入2mL三氯甲烷，摇床震荡10min，置于高速离心机以5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm有机滤膜。
方法的回收率和精密度
采用空白样品进行加标回收试验，加入相应浓度的对照品，按照前述步骤进行前处理，并进行仪器检测。分别考察L组，M组，H组浓度回收率，根据检测到的化合物含量与实际添加量计算回收率，结果见表8。
表8方法的回收率和精密度
由各组的RSD可知，本方法具有良好的重现性。
将十七种奶粉样品(信息见表9)的一段、二段、三段按照试验方法进行测定。
表9样品信息表
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通过比较样品与对照品图谱的保留时间以及监测离子通道的丰度比，判定样品中的各类水溶性维生素的含量，并与各品牌奶粉包装上的成分表比较。为更好与国标要求比较，将实验所得结果μg/100g经过标签标识的能量转换为μg/kJ，并且用柱状图的形式，更加直观地表示结果。图8-图10为各品牌一段奶粉中维生素B1、维生素B2、维生素B5含量柱状图；其他段数和维生素的检测柱状图暂省略，可采用同样方法测得。
结果显示：一二三段奶粉不论进口还是国产，均在国标要求的限度之内，所含含量基本均大于标示值。
此外，汇总含量结果，从图11可看出(其他维生素的检测含量柱状对比图暂省略，可采用同样方法测得)，国产奶粉的含量均值(除二段维生素B2外)大于进口奶粉。目前，我国婴幼儿配方乳粉行业加工技术装备达到国际水平，产品质量安全保障水平稳步提高。在消费者对质量高度敏感、对进口产品依然存在偏好的情况下，自给率目标的实现只能建立在品质提升的基础上。此结论可以作为选择奶粉的一个依据。
由于维生素品种繁多，且基质复杂多变，各药物在富集柱上的保留时间有所区别，加之时间有限，本专利只研究了8种水溶性维生素的含量分析，主要是建立了在线净化分析水溶性维生素的方法研究，各种物质化学性质各异，对各类化学性质的维生素如何选择恰当的净化柱、分析柱以及流动相还需进一步探索研究。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种检测奶粉中水溶性维生素含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：混合标准品工作溶液的配制；精密称取维生素B1、B2、吡哆胺、吡哆醇、吡哆醛、叶酸、泛酸、生物素标准品各10mg，B1、B2、生物素用甲酸溶解，叶酸用10％氨水溶解，其余用甲醇溶解后，均用甲醇定容至20.0mL，各储备液皆为0.5mg/mL，于-20℃下保存；分别精密移取1.0mL的水溶性维生素储备液用甲醇定容至10mL，制成50μg/mL的混合标准品工作溶液，冷藏备用；再精密移取0.2mL 50μg/mL的混合标准品工作溶液用水定容至10mL，制成1μg/mL的混合标准品工作溶液，临用新配；
S2：同位素内标工作溶液的配制；精密称取维生素B1、B2、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、叶酸、泛酸、生物素内标物各1mg，B1、B2、生物素同位素用甲酸溶解，叶酸同位素用10％氨水溶解，其余用甲醇溶解后，溶解定容于2mL容量瓶，再精密移取0.1mL定容的容量瓶中内标储备液至5mL容量瓶中，用甲醇定容，制得10μg/mL的混合内标工作溶液，冷藏备用。再精密移取1mL定容的容量瓶中内标储备液至10mL容量瓶中，用水定容，制得1μg/mL的内标物工作溶液，临用新配。
S3：线性溶液的制备；精密吸取适量的1000ng/mL混合标准品工作溶液和适量的同位素内标工作溶液，分别加水定容于10mL容量瓶，各加100μL甲酸保持性质稳定，得到水溶性维生素浓度浓度分别为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL，内标浓度为10ng/mL的线性标准溶液，供色谱测定。
S4：空白溶液的制备：精密吸取适量的1000ng/mL适量的同位素内标工作溶液，分别加水定容于10mL容量瓶，各加100μL甲酸保持性质稳定，制得内标浓度为10ng/mL的空白溶液，供色谱测定；
S5:样品溶液的制备：称取0.2g奶粉样品，置于50mL高速离心管中，精密加入200μL，1000ng/mL的混合内标工作溶液，加入4.8mL水，加入15mL现配的10mmol/L乙酸铵溶液完全溶解，置于多通道涡旋混合器涡旋混合2min，加入2mL蛋白沉淀剂，摇床震荡10min，置于高速离心机中5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm有机滤膜得样品溶液备用；
S6：加标回收试验样品溶液的制备：
L组：称取奶粉样品0.2g，加入200μL 1000ng/mL的内标物工作溶液，加入200μL维生素浓度为1000ng/mL的混合标准品工作溶液，加入4.6mL水完全溶解，加入15mL现配的10mmol/L乙酸铵溶液，涡旋混合2min，加入2mL三氯甲烷，摇床震荡10min，置于高速离心机以5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm有机滤膜；
M组：称取奶粉样品0.2g，加入200μL 1000ng/mL的内标物工作溶液，加入2mL维生素浓度为1000ng/mL的混合标准品工作溶液，加入2.8mL水完全溶解，加入15mL现配的10mmol/L乙酸铵溶液，涡旋混合2min，加入2mL三氯甲烷，摇床震荡10min，置于高速离心机以5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm有机滤膜；
H组：称取奶粉样品0.2g，加入200μL 1000ng/mL的内标物工作溶液，加入5mL维生素浓度为1000ng/mL的混合标准品工作溶液，加入0.8mL水完全溶解，加入15mL现配的10mmol/L乙酸铵溶液，涡旋混合2min，加入2mL三氯甲烷，摇床震荡10min，置于高速离心机以5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm有机滤膜；
S7：用三柱二维液质联用法测定样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液：
a进样过程：由自动进样器分别吸取5μL样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液注入色谱仪中，以三柱二维液质联用法，测定样品溶液中的目标化合物峰面积；线性溶液中目标化合物峰面积；加标回收试验样品溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积，空白溶液在目标化合物出峰处无干扰，标准工作溶液及试样溶液中待测组分的响应值均应在监测器的线性范围之内；
b曲线方程斜率、曲线方程截距的计算
以线性溶液中的目标化合物峰面积定量，得到曲线方程A＝aC+b，式中C为溶液中目标化合物量，单位为ng/mL；A为目标化合物峰面积；a为曲线方程斜率；b为曲线方程截距，根据线性溶液的浓度、测出的线性溶液中目标化合物峰面积，采用拟合法，计算得出a和b；
c结果分析：样品溶液中未知组份的保留时间分别与线性溶液中的目标化合物在同一色谱柱上的保留时间相比较，样品中某组份的两组保留时间与线性溶液中某一维生素的两组保留时间的绝对值在0.05min内，认定为该维生素，样品溶液中的目标化合物量浓度C，其单位为ng/mL，计算公式如下：
C＝(A-b)/a；式中：A为样品溶液中的目标化合物峰面积；a和b由步骤b计算得到；
d结果验证：加标回收试验样品溶液按步骤c计算出实际的目标化合物量浓度C，与其理论的目标化合物量浓度C相比较，计算其平均回收率，平均回收率为60-120％，证明该检测方法可行。
2.根据权利要求1所述的一种检测奶粉中水溶性维生素含量的方法，其特征在于，所述维生素包括维生素B1、维生素B2、维生素B5、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、维生素B7、维生素B9。
3.根据权利要求1所述的一种检测奶粉中水溶性维生素含量的方法，其特征在于，步骤S5中蛋白质沉淀剂为三氯甲烷。
4.根据权利要求1所述的一种检测奶粉中水溶性维生素含量的方法，其特征在于，三柱二维液质联用法如下：首次利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，小分子的目标化合物在色谱柱上保留时间较长，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰；通过水相凝胶柱将基质干扰物分离后，二维色谱系统进行切换，将目标化合物保留在富集柱上，当目标物完全转移到富集柱后，二维色谱在一次切换至初始状态，同时目标物在第二维色谱柱上进行分离分析，通过在线柱切换液相-质谱联用技术实现维生素的在线检测。
5.根据权利要求1所述的一种检测奶粉中水溶性维生素含量的方法，其特征在于，色谱和质谱条件如下：
1)一维液相色谱条件
色谱柱：凝胶柱Agilent Bio SEC-54.6×150mm，5μm，流动相为pH为7.4的磷酸盐缓冲液；流速为0.35mL·min-1；富集柱：Waters XBridge C8 Direct Connect HP2.1*30mm 10μm；
2)二维液相条件色谱条件
色谱柱：Waters ACOUTITY UPLC HSS柱T32.1×100mm，1.8μm；流动相A相为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸甲醇；梯度洗脱；柱温：35℃；进样量：5μL；
3)质谱条件
质谱仪：三重四级杆串联质谱仪；
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测；
毛细管电压(kV)：3.00；
锥孔电压(V)：50.00；
脱溶剂温度(℃)：350；
源温度(℃)：150；
碰撞气体流速(mL/min)：0.25；
雾化气体压强(Bar)：7.00；
脱溶剂流速(L/hr)：650；
锥孔流速(L/hr)：150。
6.根据权利要求1所述的一种检测奶粉中水溶性维生素含量的方法，其特征在于，进样过程分析具体如下：在四元泵(1)的作用下，由自动进样器(2)分别吸取5μL样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液向一维色谱柱(3)进样，利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，结果由紫外检测器(4)检测，左切换阀(5)和右切换阀(6)在0-4.0min保持初始状态，即均处于位置2，左切换阀(5)的2号位和3号位相通，基质干扰物等至废液池，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰，右切换阀(6)亦是2号位与3号位相通，切至废液的状态；在4.0-12.0min左切换阀(5)切换至位置1，即2号位与1号位相通，将目标化合物切换至富集柱(8)中进行富集，在12.0min左切换阀5切换至位置2，二元泵(9)将富集柱(8)上的目标化合物反冲至二维色谱柱(7)上进行分离，右切换阀(6)位置不变，利用二元泵(9)流动相将富集柱(8)上的磷酸盐缓冲溶液冲至废液池后，防止磷酸盐对质谱系统造成损伤，在17.5min时右切换阀(6)切换至位置1，即右切换阀(6)的2号位与1号位相通，进入质谱检测器(10)进行分析，获得典型色谱图。
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