JPH01126544A - 生化学分析方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生化学分析方法及び装置に係り、特に目的成分
を誘導体化した後に各成分ごとに分離して定量する生化
学分析方法及び装置に関する。

〔従来の技術〕

従来、液体クロ、マドグラフィによる生化学成分の分析
においては、目的成分の存在が微量の場合が多いため、
これを感度よく検知する目的でいくつかの方法が講じら
れている。目的成分に種々の試薬を反応させて、より検
知の容易な物質に変換する誘導体化もその一つである。

この液体クロマトグラフィにおける誘導体化の方法は、
分離カラムにおける分離に先立って実施するプレラベル
法と、分離カラムにおいて各成分ごとに分離した後に実
施するポストラベル法とに大別される。誘導体化にあた
ってプレラベル法とポストラベル法とのいずれを選択す
るかは、その反応の状況によって異なる。例えば「ぶん
せきＪ　１９８７年２月号第１００頁乃至第１０５頁に
記載されているように、試薬との反応速度が遅い場合や
温度、圧力を必要とする場合、または気体が発生する場
合や試薬による検出妨害がある場合などは、分析装置と
は別の系で試料の誘導体化を行ない液体クロマトグラフ
ィで分離、定量を実施するプレラベル法が・用いられる
。一方、反応に上述した事柄が伴わない場合には、分析
装置に試料を注入して反応コイル中で誘導体化を行ない
、分離、定量を実施するプレラベル法、あるいは液体ク
ロマトグラフィで分離後、誘導体試薬を導入して反応を
行なうポストラベル法が用いられる。このポストラベル
法によると、溶離液中で反応させるためプレラベル法に
比較して制約は大きいが、自動化が容易なことからアミ
ノ酸分析計やカテコールアミン分析計など、液体クロマ
トグラフィを主体とした生化学分析装置に広く採用され
ている。またプレラベル法は分析装置の条件とは別に反
応条件を設定することもできるため、試料の前処理や濃
縮とも兼ねて利用されている。

このような高感度化の動きとは別に、微粒子充填剤を用
いる超高速液体クロマトグラフィ、あるいはミクロカラ
ムを用いるミクロ液体クロマトグラフィの開発も活発で
あり、このような装置の効果などについては、ｒジャー
ナル　オブ　クロマ１〜グラフイ　ライブラリー　第３
２巻、ザ　サイエンス　オブ　クロマトグラフィＪ（１
９８５年）第４３５頁乃至第４４７頁（Ｊ　、Ｃｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒ。

１ｉｂｒａｌｙ　Ｖｏ　Ｑ　、３２．ｔｈｅ　５ｃｉｅ
ｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（１９８
５）ｐｐ４３５〜ｐｐ４４７）において詳細に論じられ
ているように、超高速、ミクロ液体クロマ１−グラフィ
は今後の液体クロマトグラフィの一つの方向と考えられ
ている。超高速、ミクロ液体クロマトグラフィを応用し
て生化学分析装置を構成する場合に、ポストラベル法を
用いることは、誘導体化の際に目的成分を希釈しピーク
を広げること、あるいは誘導体試薬送液ポンプの原動の
ノイズによる検出感度の低下などにより、超高素、ミク
ロ液体クロマトグラフィの効果を相殺してしまうことに
なる。このような観点からプレラベル法を採用した液体
クロマトグラフィに基づく生化学分析方法及び装置が研
究され、アミン類。

アミノ酸、アルデヒド類などの分析に応用されている。

しかし、これらの方法は前記文献「ぶんせき」に示され
ているように、試料を分析装置に注入後、系内の反応コ
イル中で誘導体化させる方法は少ない。この理由は、液
体クロマトグラフィでの分離、検出に要する時間に比較
して誘導体化反応時間が長く、多検体を処理する場合に
はラベル反応工程を並列処理する方が得策であるからで
ある。このような生化学分析方法として、ジャーナル　
オブ　クロマトグラ°フイ第３４４巻（１９８５）第６
１頁乃至第７０頁（Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　、　
３４４（１９８５）ｐｐ６１〜７０）　に記載された方
法が挙げられる。この方法は従来に比較して高感度でし
かも簡便なカテコールアミン類の分析に関するものであ
るが、誘導体化反応に４０分に長時間を要するため、誘
導体化反応を分析装置系外で行わせるようになっている
。一方、アナリテイ力ルバイオケミストリー第１３３巻
（１９８３年）第３３０頁乃至第３３５頁（Ａｎａｌ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｖ　ｏ　Ｑ　。

１３３　（１９８３）ｐｐ３３０〜３３５）に論じられ
ているプレラベルの方法もあるが、この場合には、除蛋
白などの試料前処理が必要なうえ、試料中の目的成分と
誘導体化試薬との均一な混合が困難である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記従来技術は、誘導体化反応も含めた分析時間の短縮
及び分析精度の向上については配慮がされておらず、検
体処理数を増やす目的で誘導体化反応を並列処理した場
合には、反応から検出までの時間が各検体で異なり、分
析精度が低下するという問題があった。

本発明の目的は、超高速、ミクロ液体クロマトグラフィ
の特長を損うことなく、高感度でしかも精度の高い生化
学分析を実現するにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は上記目的を達成するために、検体を調整して試
料を作成する第１の工程と、吸着剤が充填された吸着カ
ラムに前記試料を導入通過させて目的成分を該吸着カラ
ムに吸着させる第２の工程と、該吸着カラムに試薬を導
入して前記目的成分の誘導体を生成する第３の工程と、
該吸着カラムに脱着液を導入して該吸着カラム内に保持
されている誘導体化された前記目的成分を脱着する第４
の工程と、脱着された該誘導化目的成分を分離カラムに
導入して各成分ごとに分離する第５の工程と、分離され
た該各成分の濃度の変化を検出してこの検出信号を出力
する第６の工程とによって生化学分析を行なうようにし
たものである。

また、上記目的を達成するために、試料を送液するポン
プと、該試料中から目的成分を分離する分離カラムと、
該分離カラムから排出される溶出液の各成分の濃度の変
化を検出する検出器とを具備してなる生化学分析装置に
おいて、前記ポンプと前記分離カラムとを連結する流路
中に流路切換弁を設け、該流路切換弁を介して吸着剤が
充填された吸着カラムを接続して生化学分析装置を構成
したものである。

〔作用〕

上記の方法によると、吸着剤が充填された吸着カラムに
試料を導入通過させることにより、この吸着カラムに目
的成分を保持させ、さらにこの状態で誘導体試薬を作用
させるようにしたので、目的成分は１分子ごとに吸着剤
表面に保持され、ここを通過する過剰の誘導体試薬と均
一に反応するようになり、液相による反応よりも時間が
短縮できる。

また上記装置によると、高速液体クロマトグラフィを利
用してその分離カラムの前に流路切換弁を介して吸着剤
が充填された吸着カラムを設けたので、試料や誘導体試
薬などが連続的に吸着カラムに運ばれ、さらに誘導体化
目的成分は流路切換弁を介して流入する脱着液によって
脱着され、同様に流路切換弁を介して分離カラムに運ば
れる。

このため目的成分の誘導体化試薬による希釈がなくなる
とともに分析の完全自動化が容易となる。

〔実施例〕 以下１本発明の一実施例を第１図乃至第５図を参照して
説明する。

本実施例では試料としてカテコールアミン類が含有され
た試料を用いる場合について説明するが、試料は上記の
ものに限定されるものではない。

第１図に（ａ）で示す第１の工程において、血清や尿な
どの検体はｐＨ調整、標準液との混合を経て試料化され
る。次に（ｂ）で示す第２の工程において、この試料は
吸着剤が充填された吸着カラムに導入されこの吸着カラ
ムを通過する。このとき吸着剤の種類及び検体を吸着カ
ラムに導くキャリア溶液の液性やイオン強度を適当に選
択することにより、検体中のカテコールアミン類のみを
吸着剤に吸着させる。次に（Ｑ）で示す第３の工程にお
いて、カテコールアミン類が吸着剤に吸着された状態を
保持したまま、誘導体試薬を吸着カラムに導入して作用
させ、ラベル反応を行なって目的成分の誘導体を生成す
る。次に（ｄ）で示す第４の工程において、所定のラベ
ル反応時間が経過した後、必要があれば吸着カラム内の
未反応成分あるいは分解成分などを洗い流し、誘導体化
された目的成分を脱着液によって吸着カラムから脱着す
る。次に（ｅ）で示す第５の工程において、液体クロマ
トグラフィ（ＨＰＬＣ）に設けられた分離カラムに、前
記脱着された目的成分を導入して、目的成分を各成分ご
とに分離する。次に（ｆ）で示す第６の工程において、
分離カラムにおいて分離された各成分の濃度の変化を前
記ＨＰＬＣによって検出し、この検出信号を出力する。

第２図に本実施例の特徴を明確にするために、従来例の
一つとしてジャーナル　オブ　クロマトグラフィ、第２
１８巻（１９８１年）第６３１頁乃至６３７頁（Ｊ、Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒ、、　２１８　（１９８１）ｐｐ６
３１〜６３７）に記載された方法を示す。

この従来例は第１の工程から第３の工程までは第１図に
示す本実施例と同様であるが、第４の工程で液体クロマ
トグラフィによる分離を行なった後で、第５の工程でカ
テコールアミン類を蛍光体に変換するために各種試薬を
混合し、第６の工程で各成分の濃度変化を検出するよう
になっている。

第１図より明らかなように、本実施例によれば、目的成
分の希釈、ピーク幅の拡がり、試薬送液ポンプ脈動によ
るノイズ、試薬の混合比率の微小な差などに起因する測
定精度の低下が防止できるという効果がある。さらに本
実施例では、第２の工程と第３の工程を同一の吸着カラ
ムで行なうため、ラベル反応時間の短縮、測定精度の向
上などの効果がある。

第３図に本発明による生化学分析装置の一実施例を示す
。図において、高速液体クロマトグラフィは脱着液１が
充填された容器２と、分離カラム３と、これらの容器２
と分離カラム３とを接続する流路４と、この流路４に設
けられた送液ポンプ５と、検出器６とにより構成されて
いる。さらにこの分離カラム３には前記流路切換弁７を
介して、ターンテーブル９．計量管１０．流路切換弁１
１で構成されて試料を送り出すオートサンプラと、調整
液１２が充填された容器１３とが流路１４を介して接続
されており、この流路１４の流路切換弁１１と容器１３
との間には調整液１２の送液ポンプ１５が設けられてい
る。送液ポンプ１５と前記分離カラム３の間には、流路
切換弁７を介して、吸着剤が充填された吸着カラム８が
接続され、そして前記分離カラム３と吸着カラム８とは
同一のオーブン１６内に収納されている。また流路切換
弁７，１１．送液ポンプ５，１５．カラムオーブン１６
．検出器６はそれぞれ制御器１７に接続されており、こ
の制御器１７によって流路切換弁７゜１１の切換タイミ
ング、送液流量、温度、波長及び感度が制御されるよう
になっている。なお脱着液１は例えばアセトニトリル５
．エタノール２゜水［０，０１Ｍリン酸バッファ（ｐ　
Ｈ７，０）と０、ＩＭ　ドデシル硫酸ナトリウム含有コ
３とからなっており、調整液１２は例えば０．ＯＩＭ　
リン酸バッファ（ｐＨ５，８）から成っている。また前
述の各構成要素は次のものを用いた。

吸着カラム８・・・三菱化成　ＣＱＫ　３０５４０ｍｍ
１．Ｄ、Ｘ１０ｎｙｎ 流路切換弁７，１１・・・レオダイング１２５．６００
０フクチユエータ駆動装置付 分離カラム３・・・日立ゲル　３３０５７４ｍｍ１．Ｄ
、Ｘ１５０ａｎ オーブン１６・・・自製 送液ポンプ５，１５・・・日立Ｌ６０００検出器６・・
・日立Ｆ−１０００，Ｅｘ３５０ｎｍ。

Ｅｍ４８５ｎｍ。

コントローラ１７・・・日立Ｌ５０００次に本実施例に
よる生化学分析装置の動作について説明する。調整液１
２を送液ポンプ１５により流路１４を介して１ｍＱ／ｍ
ｉｎで吸着カラム８に送給しておき、オートサンプラか
ら血清などの検体を試料として調整液にのせて吸着カラ
ム８に注入する。このとき、吸着カラム８の吸着剤は負
に、血清中のカテコールアミン類は正に荷電するため、
両者間で吸着が起こる。一方、血清中のアルブミン及び
グロブリンは負に荷電しているためカラム外に排出され
る。カテコールアミン類が吸着カラム８に吸着されてい
る状態で、ターンテーブル９．計量管１０及び流路切換
弁１１で構成されるオートサンプラより誘導体化試薬を
注入し、吸着カラム８内のカテコールアミン類に作用さ
せる。この時、反応時間を加減するために送液ポンプ１
５を止めたり、送液流量を変えることもできる。所定の
時間が経過したら調整液１２で吸着カラム８を洗浄し、
流路切換弁７を切換え、脱着液１が吸着カラム８を通る
ようにする。誘導体化カテコールアミン類は吸着カラム
８から脱着され、分離カラム３に入り、ここで各成分ご
とに分離され、これらの各成分の濃度の変化が検出器６
で検出される。

第４図は血清を注入してから検出されるまでのクロマト
グラムであり、チャートスピード１０ｍｍ／ｍｉｎ、蛍
光モニタの感度×１０．レンジ１０ｍＶで測定したもの
である。ここで、 ピーク１：エピネフリン ！Ｉ　２：ノルエピネフリン 〃　３：ドーパミン ！Ｉ　４：イソプロテレノール をそれぞれ示している。例えばこの測定結果によれば、
カテコールアミン類が高感度に検出されたことがわかる
。

次に本実施例による生化学分析方法及び装置による実験
例を２例示す。

実験例］ モデル血清中にカテコールアミンを添加した試料を用い
、吸着カラム８にカテコールアミン類がそれぞれ５Ｐｇ
になるように吸着させ、検出したときのクロマトグラム
を第５図に示す。条件は前記実施例の場合と同様である
。

実験例２ 試料として、エピネフリン９０　ｐ　ｇ／ｍ　Ｑ　、ノ
ルエピネフリン３４０ｐｇ／ｍｆｆ、　ドーパミン５０
ｐｇ／ｍｕと、正常血液中の濃度に近いモデル血清を用
い、測定再現性を調べた。その結果を下記の第１表に示
す。なおこの表には比較のために第２図に示す従来例の
方法によって得られた値も示した。

第　　１　　表 上記第１表に示す値は吸着カラムによる濃縮操作に起因
する変動も含んだものである。この表により、本実施例
による場合は従来例よりも測定精度が高いことがわかる
。

〔発明の効果〕

上述したように、本発明によれば、目的成分を吸着カラ
ムに吸着させた後に誘導体試薬を作用させることかでき
るので、誘導体反応時間の短縮。

正確な制御、不純物及び未反応成分の洗浄による分析精
度向上の効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る生化学分析方法の一実施例を示す
フローチャート、第２図は同じ〈従来の生化学分析方法
の一例を示すフローチャート、第３図は本発明に係る生
化学分析装置の一実施例を示す構成図、第４図及び第５
図は第３図に示す本実施例による装置により得られたク
ロマトグラムである。 ３・・・分離カラム、５，１５・・・送液ポンプ、６・
・・検出器、７，１１・・・流路切換弁、８・・・吸着
カラム。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、検体を調整して試料を作成する第１の工程と、吸着
   剤が充填された吸着カラムに前記試料を導入通過させて
   目的成分を該吸着カラムに吸着させる第２の工程と、該
   吸着カラムに試薬を導入して前記目的成分の誘導体を生
   成する第３の工程と、該吸着カラムに脱着液を導入して
   該吸着カラム内に保持されている誘導体化された前記目
   的成分を脱着する第４の工程と、脱着された該誘導化目
   的成分を分離カラムに導入して各成分ごとに分離する第
   ５の工程と、分離された該各成分の濃度の変化を検出し
   てこの検出信号を出力する第６の工程とからなることを
   特徴とする生化学分析方法。 ２、吸着カラムの温度を変えて該吸着カラム内における
   目的成分の誘導体化反応の速度を制御するようにしたこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載された生化
   学分析方法。 ３、試料を送液するポンプと、該試料中から目的成分を
   分離する分離カラムと、該分離カラムから排出される溶
   出液の各成分の濃度の変化を検出する検出器とを具備し
   てなる生化学分析装置において、前記ポンプと前記分離
   カラムとを連結する流路中に流路切換弁を設け、該流路
   切換弁を介して吸着剤が充填された吸着カラムを接続し
   たことを特徴とする生化学分析装置。