JPH0820426B2 - 液体クロマトグラフ分析計およびプレラベル反応処理方法 - Google Patents

液体クロマトグラフ分析計およびプレラベル反応処理方法

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JPH0820426B2 JP1271667A JP27166789A JPH0820426B2 JP H0820426 B2 JPH0820426 B2 JP H0820426B2 JP 1271667 A JP1271667 A JP 1271667A JP 27166789 A JP27166789 A JP 27166789A JP H0820426 B2 JPH0820426 B2 JP H0820426B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、液体クロマトグラフイーを適用する分析計
およびその分析計のための試料の処理方法に係り、特に
成分分離する前に試料をラベル化するのに好適な装置お
よび方法に関する。
〔従来の技術〕
液体クロマトグラフは、溶液状態で成分を分離した
後、特定成分を選択的に分析できるのが特徴で、臨床検
査の分野においても重要な分析項目が多い。しかし、一
方において分析手段が複雑で分析に時間がかかるものが
多く、それが臨床検査など多数の検体を限られた時間内
で処理しなければならないルチーンワークの業務におけ
る分析検体数の増加をはばんでおり、この種の自動機の
普及が遅れている原因になつている。
このようなルチーンワークへの適用が遅れている分析
項目としてカテコールアミン類の分析が挙げられる。カ
テコールアミン類は、細胞腫，循環器，脳神経系，内分
泌代謝などの異常やストレスなどの診断に有効性が認め
られ、成人病集団検診の場合の重要項目として注目され
ている。
カテコールアミン類を液体クロマトグラフイーで分離
分析する場合には、試料と蛍光ラベル剤を反応させ、蛍
光光度計によつて測定するのが一般的である。ラベル化
の方法としては、分離カラムによる成分分離の前にラベ
ル剤と反応させるプレラベル法と分離カラムによつて成
分分離した後にラベル剤と反応させるポストラベル法が
知られているが、ポストラベル法では分離カラム溶出後
の成分の拡散が大となるので高感度検出が困難であり、
生体試料中の微量成分を測定する場合にはプレラベル法
が有利である。
カテコールアミン類をプレラベル法によつてラベル化
（誘導体化）し、クロマトグラフイー分析する先行技術
として、特開昭61−88148号および特開昭60−143766号
に記載された方法が知られている。
この内、特開昭61−88148号では、試料にアルミナを
添加してアルミナにカテコールアミンを吸着させ、吸着
中にダンシル・クロリドを反応させてカテコールアミン
を誘導体化している。次いでアルミナから誘導体化され
た試料を脱着させ液を蒸発濃縮する。このようにして準
備された試料を液体クロマトグラフの流路内へ注入して
成分分離し蛍光を検出する。
また、特開昭60−143776号では、血漿や尿などの生体
試料を流路内に注入したあと、その流路内に３種の反応
試薬を次々と導入し反応コイル内を流通させながらカテ
コールアミンをラベル化（誘導体化）している。このよ
うに処理した試料を濃縮カラムで捕捉濃縮した後、分離
カラムへ移送し成分分離して蛍光を検出する。
〔発明が解決しようとする課題〕
上述した特開昭61−88148号による方法では、液体ク
ロマトグラフの流路内に注入すべき試料を準備するため
の操作に時間がかかり、且つ自動化が困難なために臨床
検査などのルチーンワークには不向きである。また、特
開昭60−143766号による方法では、試薬および試料をキ
ヤリヤ液流路内にそれぞれ導入したあと、反応コイル内
で試料を流通させながら試薬を混合させるため、長い反
応コイルを必要とするばかりでなく、試料が十分に誘導
体化されるまでの時間が長くかかるという問題を有す
る。また、これらの先行技術では、導入前の試料の冷却
については配慮されていない。
本発明の目的は、試料の誘導体化反応を確実に行うこ
とができるようにすることにある。
本発明の他の目的は、反応中の試料に対する温度変化
の影響を低減できるように装置を構成することにある。
本発明のもう１つの目的は、多数の試料の取扱いを容
易にすることにある。
〔課題を解決するための手段〕
本発明における解決手段の１つは、非可動部とサンプ
ルラックと吸排ノズル駆動部を有する試料供給装置と、
可動吸排ノズルによって注入された混合液が導入される
計量管と、切換弁を介してこの計量管に接続されており
該計量管からの混合液導入時にラベル化試料成分を内部
に捕捉すると共に不要物を排出するプリカラムと、この
プリカラムから脱離されたラベル化試料成分を分離する
分離カラムと、この分離カラムの下流に配置された検出
器とを備えるようにしたものである。これに加えて、非
可動部は、所定温度に加温される反応容器と、計量管に
接続された注入ポートと、廃液を排出するためのドレイ
ンポートと、サンプルラックを受け入れるサンプルラッ
ク収納領域とを設置されたものであり、サンプルラック
は、サンプルラック収納領域に対して着脱可能であっ
て、複数の試料容器装填部とラベル化剤が入った試薬容
器の装填部を有するものであり、吸排ノズル駆動部は、
可動吸排ノズルを非可動部およびサンプルラックの所望
位置に移動および昇降せしめ、試料容器から反応容器へ
の試料の分注動作，試薬容器から反応容器へのラベル化
剤の分注動作、および反応容器から試料とラベル化剤の
混合液を吸排ノズル内に吸入して吸排ノズルを注入ポー
トに移動し吸入していた混合液を注入ポートに注入する
動作を行わせるものである。
本発明における別の観点の解決手段は、試料にプレラ
ベル化処理をしてラベル化された試料を分離カラムで成
分分離し検出する方法において、プレラベル化処理が、
加温される混合用容器とサンプルラツク収納部を有する
ラベル化装置本体に、サンプルラツクが収納されたあ
と、吸排ノズルで上記混合用容器に試料およびラベル剤
を添加してプレラベル化反応を開始する工程と、上記混
合用容器内の試料を吸排ノズルによつて分離カラムを有
する流路への試料注入ポートに移す工程を含むようにし
たものである。
〔作用〕
物理的性質の似た複数成分が共存するカテコールアミ
ン類を含む生体試料では、個々の成分をクロマトグラフ
イーで分離して測定することが有効である。カテコール
アミン類では、エピネフリン，ノルエピネフリン，ドー
パミンなどが共存しているので、これらをクロマトグラ
フイー分離すれば個々の成分濃度を求めることが可能と
なる。
しかし、カテコールアミン類は、そのままの状態では
検出することが困難であるので、本発明ではクロマトグ
ラフイー分離カラムで成分分離する前に、試料にラベル
剤を反応させて誘導体化し、その後検出精度を低下させ
るような夾雑物や過剰の反応試薬などの不要物をプリカ
ラムで除去し、次いで、誘導体化されている試料を分離
カラムに導入して成分分離し、分離カラムからの流出物
を検出器で検出する。例えば誘導体化のために蛍光ラベ
ル剤を用いる場合には、検出器として蛍光検出器を用
い、被検成分が誘導体化によつて得た性質を検出に利用
する。検出器はラベル化の態様によつて吸光光度計や電
導度検出器など種々のものから選択される。
オートサンプラ又はラベル化装置とも称される試料供
給装置は、非可動部およびサンプルラツクを備えてい
る。サンプルラツクは非可動部に対して着脱可能であ
る。非可動部は、ラベル化装置本体又は反応処理部と称
されることもある。この非可動部には、試料注入ポー
ト、混合用容器又は反応容器，ドレインポートなどが配
置される。また、非可動部には、サンプルラツク収容部
又はサンプルステージと称されるサンプルラツク収納領
域が設けられており、通常４〜17℃の範囲内の一定温度
に維持される。
混合用容器内で試料とラベル化試薬が混合されたあ
と、その混合液を直ちに試料注入ポートに移す場合に
は、その混合液は反応維持流路に導かれ、そこで反応が
実質的に完了するまでの所定時間移動しないように留め
られる。この場合、混合用容器は特に昇温する必要がな
く、反応維持流路が所定温度に加温される。
混合用容器内で試料と試薬が混合されたあと、その容
器内で又は他の容器へ混合液を移してラベル化反応を進
行せしめる場合には、その容器が加温される。このとき
の加温温度は40〜50℃の範囲内の一定温度とされる。こ
の場合、混合用容器又は他の容器は、反応容器と称され
る。
サンプルラツク収納領域に着脱可能に収納されるサン
プルラツクには、多数の試料容器装填穴の他にラベル化
試薬用容器収納部が形成される。試料および試薬は収納
領域上で冷却され得る。
試料供給装置は、ノズル移動機構を備えており、吸排
ノズルに多様な動作をさせることができる。例えば、吸
排ノズルは、試料容器から混合用容器への試料の分注，
試薬容器から混合用容器への試薬の分注、混合用容器内
の液の吸入および吐出の繰り返しによる撹拌、混合液の
試料注入ポートへの移送などである。混合用容器には次
々と新しい試料が分注されるから、洗浄が必要となる
が、そのための洗浄液は吸排ノズルを通して混合用容器
へ吐出される。
本発明においては、試料および試薬が同じ混合用容器
内に分注されるので、両者が混合された時点から反応開
始され、反応開始から試料注入ポートへ移すまでの時間
を吸排ノズルの動作タイミングを制御することによつて
正確に規定できる。混合は容器内でなされるので、均一
化が促進される。
試料として生体試料を用いる場合には、試料を冷却し
て変質を防止する。一方、ラベル化反応を促進するため
には、反応容器を加温するのがよいが、この加温温度が
試料側の冷却によつて影響されたのでは反応温度にバラ
ツキが生じ反応条件が一定に保たれ難い。本発明では、
反応容器がサンプルラツクから離間されており、断熱材
を設けることも容易であるので、安定した反応条件が得
られる。また、サンプルラツクは反応処理部から取り外
すことができるので、分析計による操作を開始する前
に、他の場所でサンプルラツクに試料や試薬を装填して
きて分析計へセツトすることも、分析終了済の試料をラ
ツク毎持ち去ることも容易である。
カテコールアミン類の誘導体化試薬としての蛍光ラベ
ル剤には、例えば1,2−ジフエニルエチレンジアミン（D
PE）を用いることができる。準備される蛍光ラベル剤溶
液には、60mMのDPE,2mMのフエリシアン化カリウム,40％
のアセトニトリルなどが含まれる。またカテコールアミ
ン類を分離するために分離カラムに供給される溶離液
は、例えばアセトニトリルとメタノールと水溶液を5:2:
4の割合で含む液が使用される。この場合水溶液には、5
0mMの硝酸リチウムと10mMのドデシル硫酸ナトリウムが
含有されている。
〔実施例〕
本発明を適用したカテコールアミン自動分析装置の例
を図面を参照して以下に説明する。
第１図は、カテコールアミン自動分析装置の全体構成
を示す概略図である。この装置は、各種容器や分注機構
を備えた試料供給部26と、流路系内で試料の濃縮動作や
分離動作を行う濃縮・分離部44を有する。以下では、試
料供給部26を便宜上オートサンプラと称し、濃縮・分離
部44を分析部と称する。
オートサンプラ26は、非可動部又は反応処理部90およ
び着脱可能なサンプルラツク27を備えている。
オートサンプラ26のサンプルステージ28には、サンプ
ルラツク27が装填される。サンプルラツク27は、血漿試
料を収容した複数の試料容器を保持している。またサン
プルラツク27には、蛍光ラベリング用の反応試薬容器3
0,内部標準液容器31,標準サンプル容器32が配置されて
いる。このオートサンプラ26では、非可動部90のサンプ
ルステージ28に近接した固定位置に、反応容器33,ノズ
ル洗浄槽34,ドレインポート35,注入ポート36が設けられ
ている。
分注ノズル38は、試料や試薬を反応容器33へピペツテ
イングにより分注したり、反応した試料を反応容器33か
ら注入ポート36へ移す働きをする。駆動機構37はXYZの
駆動機能を有し、分注ノズル38を縦横上下自在に駆動し
て、前記サンプラー上の容器やポートの位置に移動させ
ることが出来る。分注ノズル38の上端はプラスチツクチ
ユーブなどの細管39により三方弁40を介して、分注ポン
プ41、および洗浄液槽42に連結されている。分注ポンプ
41はパルスモーターで駆動されるシリンジポンプを使用
している。恒温ブロツク80は反応容器33の温度を所定の
条件に保つために設けられている。またサンプルステー
ジ28にはサンプルラツク27上のサンプルや試薬を、分析
中低温に保つよう冷却装置が組込まれている。
分析部44はサンプルの濃縮と不要物除去を行なうプリ
カラム流路系、サンプル成分の分離を行なう分離カラム
流路系、および測定演算部からなる。プリカラム流路系
では、液槽45の移送・洗浄液がポンプ46により一定流速
で送液され、試料導入弁47を経由してプリカラム48に流
れている。試料導入弁47にはオートサンプルの注入ポー
ト36から注入されたサンプル液を所定量計量して分析部
に導入するための計量管49が設けられている。
分離カラム流路系では溶離液槽50の溶離液がポンプ51
により一定流速で送液され、カラム切換弁52を経由して
単一の分離カラム53に流れている。カラム切換弁52を切
換えることにより溶離液はプリカラム48を経由して流
れ、プリカラム48で処理されたサンプルを分離カラム53
に移送する。測定演算部は分離カラム53から溶出するサ
ンプル成分の蛍光強度を測定する蛍光光度計54および測
定結果の演算処理および表示を行なうためのA/D変換部5
5,制御部56,プリンター57,CRT58などからなり、蛍光光
度計54にはフローセル59を有する。切換弁60,61はポン
プ46,51内の液を必要時にパージ出来るよう設けられて
いる。
本実施例による分析は、 （１）オーサンプラ上でのサンプルの蛍光ラベリング作
業、 （２）プリカラムによる濃縮および不純物除去作業、 （３）分離カラムによるサンプル成分の分離および測
定、 の順序で行われる。第２図のフローチヤートを参照して
次に一連の分析操作を説明する。
反応容器洗浄 ステツプ101の分析動作開示のあと、ステツプ102で反
応容器33が洗浄される。この際、ノズル38を反応容器33
の位置に移動し、ポンプ41を動作させ洗浄液槽42からの
洗浄液を反応容器へ注入する。注入量は反応容器33の容
量より多量に注入し、余剰の洗浄液はオーバーフローさ
せドレインポート35から排出管43の方へ廃出させる。次
いで、ノズル38を反応容器33の底に降下させ容器内の洗
浄液を吸いあげ、ノズル38をドレインポート35に移動さ
せて吸い上げた液を廃出する。この動作に先だち吸いあ
げた汚れた洗浄液がノズル内の新鮮な洗浄液に拡散しな
いよう予めノズル38の先端に若干量の空気を吸つておく
必要がある。（吸引に先だち、気泡を吸つて境界を作つ
ておく作業は、後のサンプルや試薬を吸いあげる場合に
も必要であるが、説明が繁雑になるので以後の説明では
消略する。）以上の動作を複数回（例えば３回）繰り返
すことにより反応容器33の洗浄が終る。
サンプル分注 ステツプ103では反応容器33への試料（サンプル）の
分注が行われる。ノズル38を内部標準液容器31の位置に
移動し、降下させて所定量吸引し、ついで分析する試料
容器29の位置に移動し、所定量のサンプルを吸引した
後、ノズル38を反応容器33の位置に移動させ、吸引保持
されているサンプルと内部標準液を反応容器33に吐出分
注する。内部標準液は、カラムの回収率の変動などを補
正するために使用される標準液で、本実施例の場合はイ
ソプロテレノールを標準物質として用いている。
ノズル洗浄 ステツプ104では、ノズル38を洗浄する。この場合、
ノズル38をドレインポート35に移動し、洗浄液を吐出し
て、内部標準液およびサンプルによるノズル38の内壁の
汚れを洗い出した後、ノズルを洗浄槽34に移動して槽内
に降下させ、洗浄液を吐出してノズル38の尖端外側を洗
浄する。
試薬分注混合 ステツプ105では反応容器33へ試薬を加える。ノズル3
8を反応試薬の容器30の位置に移動し、ノズル内に誘導
体化試薬を所定量吸引し、反応容器33に注入し先に注入
されているサンプルおよび内部標準液と混合させる。混
合はこの他に、ノズル内に予め空気を吸引しておき、容
器内に挿入して空気を吐出する方法や、外部から機械的
または電気的に容器を振動させる方法などにより行うこ
ともでいるが、混合しやすい液体で且つ吐出量が比較的
多量であれば高速度で吐出するだけで可能な場合もあ
る。
反 応 ステツプ106では、カテコールアミン類に対する蛍光
性物質への誘導体化が行われるように蛍光ラベリング反
応を開始させる。反応容器33内におけるサンプルと誘導
体化試薬との混合液（以下サンプル液と称する）を、一
定温度に保温された反応容器33内で所定時間放置して反
応を進行させ、蛍光ラベリングを行う。
計量管へのサンプル導入 ステツプ107では、反応容器33内の反応液を計量管49
内へ導入する。反応容器33内で実質的に反応の終了した
誘導体化されたサンプル液をノズル38内に吸引し、ノズ
ルを注入ポート36へ移動してその中に挿入し、試料導入
弁47を第１図の如き状態にして試料計量管49へサンプル
液を注入する。計量管49がサンプル液で満たされた後試
料導入弁47を切換えると、切換弁47のポートに接続され
ている計量管49は、流路62と流路63の間に接続され、移
送・洗浄液の流れにより所定量のサンプル液がプリカラ
ム48へ移送される。
濃 縮 ステツプ108では、プリカラム48内への誘導体化され
たカテコールアミン類の捕捉と夾雑物や過剰試薬の除去
が行われ、同時にサンプル液の濃縮が行われる。移送・
洗浄液の流れによりプリカラム48にサンプル液が導入さ
れると、プリカラム48内にはサンプルが吸着捕捉され蓄
積される。このとき測定の妨害となる不要物である夾雑
物や過剰試薬がプリカラムを通過して排出口64を経て排
出される。
サンプル移送 ステツプ109では、不要物を除去されて捕捉されてい
るサンプルをプリカラム48から脱離し、分離カラム53へ
導く。第１図に実線図示の状態から破線の状態にカラム
切換弁52を切換えると、プリカラム48は流路65,66の間
に接続され、溶離液はプリカラム48を経由して流れ、プ
リカラム48に濃縮されたサンプルを解離して分離カラム
53に送り、分離が開始される。全サンプルが流路66に移
動した時点で、カラム切換弁52を再び切換える（図示の
実線状態となる）と溶離液はプリカラム48を経由せず直
接分離カラム53に流れ、プリカラム48には移送・洗浄液
が流れ始める。
分 離 ステツプ110では、引きつづき溶離液を分離カラム53
に流し、カテコールアミン類の成分分離が行われ、ノル
エピネフリン（NE），エピネフリン（Ｅ），ドーパミン
（DA）が成分バンドを形成して分離カラムから溶出され
る。
プリカラム再生 ステツプ110のサンプル成分の分離と並行して、ステ
ツプ111ではプリカラム48に移送・洗浄液を流し、つぎ
のサンプルを受入れられる状態に復元させる。
測 定 ステツプ112では、分離カラム53からの溶出液が蛍光
光度計54によつて観測される。分離カラム53により分離
され溶出したサンプル成分は順次、蛍光光度計54のフロ
ーセル59に流れ、分離された各成分の蛍光強度を検出
し、演算処理して各成分の濃度を求める。
データ表示，出力 ステツプ113では、ステツプ112で得たデータをプリン
ター57,CRT58などにより表示出力する。ステツプ114で
は、オートサンプラ26上の試料がすべて処理されたかど
うかが判断され、まだ残つていればステツプ102に戻
り、すべて処理されていればステツプ115に進んで装置
の分析動作が終了する。
以上一検体についての分析手順を説明したが、つづい
て多数検体連続処理の手順について説明する。第３図Ａ
および第３図Ｂにその分析プログラムの一例を示す。
図の縦軸は、先に説明した分析フローチヤートの作業
内容を工程1,2,3に区分して示している。第１工程は主
としてサンプルを誘導体化するためのオートサンプラ上
での作業、第２工程はプリカラムによるサンプルの濃縮
作業、第３工程は分離カラムによるサンプル成分の分離
および測定の作業であり、各工程の境界区分はそれぞれ
の工程の時間配分がプログラム上適当になるよう区分さ
れている。横軸は進行する分析プログラムのサイクル数
と経過時間を示す。プログラムは１サイクル内で第1,2,
3各工程の作業がそれぞれ一巡するよう組まれている。
第３図Ａはｎ番目の検体の分析する状態を中心に示し
たものである。実線太線がその状態を示す。実線細線は
（ｎ＋１）番目と（ｎ−１）番目の検体、鎖線は（ｎ−
２）番目と（ｎ＋２）番目の検体の状態を示している。
第３図Ｂには切換弁の動作を示している。試料導入弁47
の「計量」状態ａはサンプル液を注入ポート36から計量
管49に注入出来る状態すなわち、第１図に図示された状
態、「移送」状態ｂは弁が切換わり計量管49がプリカラ
ム流路に接続された状態を示す。また、カラム切換弁52
の「接続」状態ｃはプリカラム48が分離カラム流路に接
続された状態、「並行処理」状態ｄは切離されて移送・
洗浄液が流れている状態すなわち第１図実線で図示され
た状態を示す。各切換弁の動作を１サイクル毎に繰り返
し動作を行なう。
分析操作は、第１検体（１番目に分析する検体）の分
析を第１サイクルで開始し、つづいて１サイクル毎に順
次オートサンプラ上のサンプルの分析を開始させること
により進行する。第３図Ａは第ｎサイクルから第（ｎ＋
２）サイクルにおける作業状態を示している。すなわち
第ｎサイクルに第ｎ検体（ｎ番目に分析する検体）の分
析が開始し、第１工程の作業が行われる。これと並行し
て先に分析を開始している第（ｎ−１）検体の第２工程
の作業、および第（ｎ−２）検体の第３工程の作業が進
んでいる。ついで第（ｎ＋１）サイクルにおいては、第
ｎ検体は第２工程の作業に進み、つぎの第（ｎ＋１）検
体の第１工程の作業が開始される。これと並行して第
（ｎ＋１）検体の第３工程の作業が行われている。さら
に第（ｎ＋２）サイクルにおいては第ｎ検体の第３工程
の作業、第（ｎ＋１）検体の第２工程の作業が行われ、
つぎの第（ｎ＋２）検体の第１工程の作業が開始され
る。
以上説明した分析手順により、本装置の分析処理時間
は、一検体のみ分析する場合には第1,第2,第３工程の合
計時間すなわち３サイクルの時間が必要であるが、複数
の検体を連続して分析する場合は１サイクル毎に１検体
ずつ分析が出来る。本実施例では１サイクルの時間が５
分であるため、一検体当りの処理時間は５分となる。
カテコールアミン類のクロマトグラフイーにおいて
は、１時間に10検体以上の処理能力を持つことが望まし
いので、１サイクルの時間は、６分以内とされる。
第４図は、第１図の実施例のオートサンプラ26の平面
図である。サンプルステージ28上に着脱可能なサンプル
ラツク27には、試料容器挿入口70が横10個，縦５列の計
50個所マトリツクス状に設けられており、これに分析す
べきサンプルを収容した試料容器が装填されて配列され
る。サンプルラツク27上には、また反応試薬30,内部標
準液31,標準サンプル32の置き場があり、さらに分析中
緊急割込測定が出来るよう、緊急検体容器挿入口71a,71
b,71cが設けられている。またサンプルラツク27の側方
には反応容器33,ノズル洗浄槽34,ドレインポート35,計
量管49への注入ポート36がそれぞれ固定の位置に設けら
れている。分注ノズル38は移動体３の軸４上を滑動し得
る保持部５に保持されており、駆動機構37により縦，
横，上下のX,Y,Z方向に自在に駆動され、上記各容器あ
るいはポートの位置に随時位置づけられ、必要な作業を
行なう。非可動部90とラツク27の間には断熱部材92が配
置されている。
分析操作は、上記分析すべきサンプルや試薬を配置し
たサンプルラツク27をオートサンプラ26のサンプルステ
ージ28に装着し、オペレータが操作パネル77の分析スタ
ートスイツチを押すことにより開始される。
第５図は、反応容器33,ノズル洗浄槽34,ドレインポー
ト35の断面図である。反応容器33は毎検体毎に洗浄する
必要があるので、この場合はオーバーフロー方式によ
り、反応容器の底からノズル先より洗浄液を吐出させ、
上側より自動的に廃出するようになつている。このよう
に一方向からの流れを作ることによつて、より洗浄効果
を上げている。恒温ブロツク80はヒータ94を備えてい
る。また、この反応容器33は同時に混合容器としての役
目を果たしている。さらにこの反応容器33は、恒温ブロ
ック80により、40〜50℃の範囲の温度で恒温され、（例
えば45℃）、反応を促進している。
恒温にするのは、反応条件の再現性向上がねらいであ
る。すなわち、夏や冬でも、又は夜や昼でも反応条件を
一定化し、いつのデータも同一条件で比較できるように
するためである。40℃〜50℃に維持する理由を述べる。
まず、40℃以上にするのは、この装置を設置する室温条
件を15℃〜35℃と仮定しているため、それより装置内温
度が上昇することを考慮し、安定に制御するためであ
る。また、50℃以下にするのは、温度が高ければ反応が
促進されるが逆に50℃以上では試料の変成が起こるので
それを防止するためと、オペレータが万一触れることが
あつても火傷しない程度に保つためである。
第４図に示すように、サンプルラツク27は外形が角形
であり、横方向に10個の試料容器挿入穴70が形成されて
いるが、これはオペレータが試料数を数えやすくするた
めである。このような10個からなる穴の列が、第４図の
例では５列形成されている。特定の穴の列と隣の穴の列
との間の穴中心間隔ｙは、15〜25mmにされている。この
間隔はオペレータが試料容器をサンプルラツク27に出し
入れするときに掴みやすいようにオペレータの指が入る
ように設計されたことによる。一方、サンプルラツク27
はできるだけ小さい方が好ましいが、これを充足するた
め、横方向の同じ穴の列における隣の穴との中心間隔ｘ
は、ｙよりも小さく、例えば12mm以下にされている。
第６図および第７図は、第１図の実施例装置の全体の
構成外観と各部の配置関係を表している。このカテコー
ルアミン分析計は縦形で分析に必要な各ユニツトを全部
組込んだ構成となつている。
装置は二段に仕切られ、上段にはオートサンプラ26,
蛍光光度計54,カラムパネル72が配置されており、カラ
ムパネル72にはプリカラム48,分離カラム53,試料導入弁
47、およびカラム切換弁52が配置されている。分離カラ
ム53は分析中の温度状態を一定に保つため、恒温ブロツ
ク73により温度制御されている。オートサンプラ26への
サンプルラツク27の装着，取出しはカバー75を開閉して
行なう。蛍光光度計54の上部には、測定データを記憶し
ておくためのフロツピーデイスク75が組込まれている。
装置下段には、洗浄液槽42,移送・洗浄液槽45,溶離液
槽50,分注ポンプ41,移送・洗浄液送液用のポンプ46,溶
離液送液用のポンプ51が配置され、ここから装置上段の
分析ユニツトに必要な液体の送液が行われる。なお装置
の下段後部には電源や基板類などの電気系76が収められ
ている。装置上面にはプリンタ57,CRT58および本装置に
よる分析のための入力操作を行なうための操作パネル77
が配置されている。
第８図に本実施例の制御系統図を示す。前記した本実
施例の装置による分析制御は、操作パネル77からの入力
により制御部56を中心に行われる。先ずパワースイツチ
をONすると温度制御装置78が動作すると共に、蛍光光度
計54の光源が点燈する。つぎに分析標準のスイツチをON
するとポンプ46,ポンプ51が送液を開始する。オートサ
ンプラ26にサンプルラツク27を装着した後、分析開始ス
イツチをONにすると、オートサンプラ26,試料導入弁47,
カラム切換弁52が動作開始し、第２図および第３図で説
明した分析手順に従つて分析操作が行われる。測定結果
は蛍光光度計54からの信号をA/D変換器55を経由して制
御部内でデーター処理され、プリンタ57に打出すと共に
CRT58に表示される。
第９図に本実施例の装置によるカテコールアミン類の
分析結果の一例を示す。各ピークに打出されている数値
は、リテンシヨンタイムすなわち分離開始してから分離
された各成分が検知器に到達するまでの時間を示す。本
装置においては分離開始はカラム切換弁52を切換え、プ
リカラム48内に濃縮されたサンプルの分離カラム53への
移送を開始した時点からであり、最初の0.48秒のピーク
はプリカラムに満されていた移送液が分離され溶出され
るサンプルに先立つて検知器を通過するために検出され
るピークである。つづいて、ノルエピネフリン（NE），
エピネフリン（Ｅ），ドーパミン（DA）の順序で分離カ
ラム53により分離されたサンプル成分が溶出し、最後に
内部標準液として添加された、内標準物質のイソプロテ
レノールが溶出して検出される。各成分の濃度は、それ
ぞれのピーク面積から求める。
本分析例の場合は分離開始すなわちカラム切換弁52の
切換後約４分強で目的の分離が終了している。すなわ
ち、この分析例によると先に説明した５分１サイクル内
での分離が可能である。
本装置ではルチーンワークで使用する場合の出力は検
体番号と分析した三成分の記号と濃度をプリンタ57に打
出し、第９図のようなクロマトグラムは必要によりCRT
表示やプリンター出力が出来るようになつている。
また本実施例ではプリカラムは１本となつているが、
複数のカラムを使用する場合もある。たとえば２本直列
に使用し、水溶性不純物の除去と疎水性不純物の除去を
分業させる方法などがある。
第10,11,12図に誘導体化の具体的な反応の変形例を示
す。
第10図に示す第１の変形例は反応容器を２個設ける方
法である。すなわちオートサンプラ上に２個の反応容器
79a,79bを設け、各容器は恒温ブロツク80により恒温に
され、また洗浄の際にオーバーフローする洗浄液はドレ
インポート81に流れる構造となつている。この方式は反
応に時間がかかるなどの理由により、オートサンプラ上
の誘導体化の作業、すなわち前記第一工程が、１サイク
ルの時間よりも長くかかる場合に用いられる。すなわち
１サイクルの時間間隔で２個の反応容器に交互にサンプ
ルと試薬を分注し反応を進行させることにより、１サイ
クル毎に一検体ずつの処理を終らせることが出来る。た
だし作業時間が１サイクルの２倍以上になれば、さらに
反応容器の数を増加させる必がある。いずれにしてもこ
れ等反応容器は周期的に繰返して使用することになる。
第１の変形例はもう１つの利用方法がある。それは反
応容器の２個の内１個79aを混合容器として使用し、混
合が終つたら毎回混合液を反応容器79bに移し変える方
法である。この方法の長所は混合条件，反応温度を含め
た反応条件など動作シーケンスが一定化することで反応
再現性を良好に保つことができる。
第11図に示す第２の変形例は、試料導入弁の計量管内
で反応を進める例である。オートサンプラ上の容器82は
サンプルと試薬を混合させる混合容器として使用し、混
合によつて反応開始された反応液を分注ノズル38を用い
て注入ポート36から計量管83に注入し、ここで液が流通
しない状態で一定時間放置し反応させる。この場合、計
量管83は恒温ブロツク84により所定の温度に保持され、
また反応中、液が移動しないよう、出口流路に停止弁85
が設けてある。この方式は反応時間が試料導入弁47の動
作間隔により決まるので、長時間の反応には採用できな
いが、計量管83が合成樹脂チユーブなどをコイル状に巻
いて作られているので、温度制御がしやすく、また場所
的にも自由度があり、例えば分離カラムの恒温ブロツク
と一体化出来るなどの利点がある。
第13図Ａおよび第13図Ｂは、第11図の第２変形例にお
けるプログラム例である。工程１は誘導体のためのオー
トサンプラ上での作業、工程２はプリカラムによる濃縮
作業、工程３は分離カラムによる分離、測定の作業に大
別されているのは前記実施例の第３図のプログラムと同
じであるが、各工程の区分の境界は多少異なつている。
すなわち本プログラムでは、サンプル液を試料導入弁47
の計量管83に注入するまでが第１工程となつており、計
量管内での反応開始から第２工程となり、また、プリカ
ラムによるサンプルの濃縮で第２工程が終り、分離カラ
ムのサンプルの移送から第３工程が始まるようプログラ
ムが組まれている。このように、第11図の例でも分析作
業を、オートサンプラ，プリカラム，分離カラムの作業
に大別し、繰り返しプログラムにより連続して分析する
検体についてそれぞれの作業を並行して行わせることが
できる。
第12図に示す第３の変形例は、試料注入ポート36から
試料導入弁47に到る流路に反応コイル87を設け、ここに
サンプル液を注入して反応させた後、試料導入弁を切換
えて計量管49に送り、再び弁47を切換えて分析部に導入
する方式である。この方式は、前記の変形例に比し、反
応時間に自由度があるが、サンプル液を二段に移送しな
ければならないので作業が複雑になる。
以上本発明の実施例としてカテコールアミン自動分析
装置の例につき説明したが、本発明の適用範囲は必ずし
もこの実施例の範囲内に限られるものでない。すなわち
分析対象は、カテコールアミン以外にも例えばアミノ
酸，胆汁酸，グアニジンなど、各種の物質の分析に適用
出来る。また誘導体化の方法と使用する検出器について
も必ずしも蛍光光度法に限らず、酵素活性やUV活性法に
より紫外あるいは可視の光度計を用いて測定する方法な
ども適用できる。さらに誘導体化を行わしめる具体的な
方法すなわち、反応場所や作業手順、およびプログラム
の構成なども各種の変形例が考えられる。
〔発明の効果〕
本発明では、流路系の計量管に接続されている注入ポ
ートを試料供給装置の非可動部に設けると共に、繰り返
し使用される反応容器（又は混合用容器）を非可動部に
設け、複数試料容器を試料供給装置のサンプルラック上
に載置しておくことにより可動部分を少なくし、可動吸
排ノズルを運動させるだけで、試料とラベル化剤との混
合および混合液の流路系への注入ができる。また、計量
管によって計量された混合液を切換弁を介してプリカラ
ムに導入し、そのプリカラムでラベル化試料成分を捕捉
した不要物を除去することにより、プリカラムに混合液
の全量を供給せずに済むので、ラベル化試料成分の捕捉
処理時間を短くできる。しかも、同じ反応容器を試料と
ラベル化剤の混合に用いるので、反応容器を一定温度に
保つことが容易であるばかりでなく、測定されるべき試
料が次々と変ってもラベル化反応の反応条件を一定に保
つことができる。さらに、分離カラムによる成分分離行
程と、プリカラムによる成分捕捉行程と、試料供給装置
による試料とラベル化剤の混合行程とを、それぞれ異な
る試料に対して並行して進めることにより、多数の試料
の処理効率を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の一実施例装置の概略構成を示す図、第
２図は第１図の装置における分析操作のフローを示す
図、第３図Ａおよび第３図Ｂは第１図の装置における各
部の動作タイミングを示す図、第４図は第１図の装置に
おけるオートサンプラの平面図、第５図は第４図におけ
るドレインポート付近の縦断面図、第６図は第１図の装
置の正面外観図、第７図は第６図の側方からの配置概念
図、第８図は第１図の装置の制御系統図、第９図はカテ
コールアミン類の分析例を示す図、第10図は第１の変形
例の要部概略構成図、第11図は第２の変形例の要部概略
構成図、第12図は第３の変形例の要部概略構成図、第13
図Ａおよび第13図Ｂは第11図の変形例を適用した分析計
における各部の動作タイミングを示す図である。 26……オートサンプラ、21……サンプルラツク、28……
サンプルステージ、29……試料容器、30……反応試薬容
器、33,79a,79b……反応容器、35,81……ドレインポー
ト、36……試料注入ポート、38……分注ノズル、47……
試料導入弁、48……プリカラム、49,83……計量管、52
……カラム切換弁、53……分離カラム、54……蛍光光度
計、56……制御部、82……混合容器、85……停止弁、90
……非可動部。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐竹 尋志 茨城県勝田市市毛882番地 株式会社日立 製作所那珂工場内 (72)発明者 伊藤 正人 茨城県勝田市市毛882番地 株式会社日立 製作所那珂工場内 (56)参考文献 特開 昭60−131464（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−38651（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−142250（ＪＰ，Ａ)

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】非可動部とサンプルラックと吸排ノズル駆
    動部を有する試料供給装置と、可動吸排ノズルによって
    注入された混合液が導入される計量管と、切換弁を介し
    て上記計量管に接続されており上記計量管からの混合液
    導入時にラベル化試料成分を内部に捕捉すると共に不要
    物を排出するプリカラムと、このプリカラムから脱離さ
    れたラベル化試料成分を分離する分離カラムと、この分
    離カラムの下流に配置された検出器とを備えた液体クロ
    マトグラフ分析計であって、上記非可動部は、所定温度
    に加温される反応容器と、上記計量管に接続された注入
    ポートと、廃液を排出するためのドレインポートと、上
    記サンプルラックを受け入れるサンプルラック収納領域
    とが設置されたものであり、上記サンプルラックは、上
    記サンプルラック収納領域に対して着脱可能であって、
    複数の試料容器装填部とラベル化剤が入った試薬容器の
    装填部を有するものであり、上記吸排ノズル駆動部は、
    上記吸排ノズルを上記非可動部および上記サンプルラッ
    クの所望位置に移動および昇降せしめ、試料容器から上
    記反応容器への試料の分注動作，上記試薬容器から上記
    反応容器へのラベル化剤の分注動作、および上記反応容
    器から試料とラベル化剤との混合液を上記吸排ノズル内
    に吸入して上記吸排ノズルを上記注入ポートに移動し吸
    入していた混合液を上記注入ポートに注入する動作を行
    わせるものである、ことを特徴とする液体クロマトグラ
    フ分析計。
  2. 【請求項２】請求項第１項記載の分析計において、上記
    反応容器は40〜50℃の範囲内の所定温度に加温されるこ
    とを特徴とする液体クロマトグラフ分析計。
  3. 【請求項３】請求項第１項又は第２項記載の分析計にお
    いて、上記サンプルラック収納領域は４〜17℃の範囲内
    の所定温度に維持されることを特徴とする液体クロマト
    グラフ分析計。
  4. 【請求項４】請求項第１項記載の分析計において、上記
    サプルラックは、10個の試料容器装填穴からなる列が複
    数列形成されたものであることを特徴とする液体クロマ
    トグラフ分析計。
  5. 【請求項５】請求項第４項記載の分析計において、特定
    の列と隣の列との間の装填穴の間隔は、同じ列における
    装填穴同士の間隔よりも大きく、大きい方の間隔が15〜
    25mmであることを特徴とする液体クロマトグラフ分析
    計。
  6. 【請求項６】請求項第１項記載の分析計において、上記
    非可動部における上記反応容器と上記サンプルラック収
    容領域とを熱的に隔離したことを特徴とする液体クロマ
    トグラフ分析計。
  7. 【請求項７】請求項第１項記載の分析計において、上記
    吸排ノズル駆動部は、上記吸排ノズルから上記反応容器
    に洗浄液を供給せしめ、その後上記反応容器内の洗浄液
    を上記吸排ノズル内に吸入保持して上記ドレインポート
    へ排出させることを特徴とする液体クロマトグラフ分析
    計。
  8. 【請求項８】請求項第１項記載の分析計において、上記
    分離カラムによる第１の試料に対する成分分離動作の間
    に、上記プリカラムによる第２の試料に対するラベル化
    試料成分捕捉動作と、上記試料供給装置における第３の
    試料に対するラベル化反応動作とを、並行して進めるこ
    とを特徴とする液体クロマトグラフ分析計。
  9. 【請求項９】非可動部とサンプルラックと吸排ノズル駆
    動部を有する試料供給装置と、可動吸排ノズルによって
    注入された混合液が導入される計量管と、この計量管を
    所定温度に加温する加温手段と、プレラベル化反応を進
    行せしめる所定時間の間、混合液を上記計量管内に停止
    させる手段と、切換弁を介して上記計量管に接続されて
    おり上記計量管からの混合液導入時にラベル化試料成分
    を内部に捕捉すると共に不要物を排出するプリカラム
    と、このプリカラムから脱離されたラベル化試料成分を
    分離する分離カラムと、この分離カラムの下流に配置さ
    れた検出器とを備えた液体クロマトグラフ分析計であっ
    て、上記非可動部は、試料とラベル化剤が加えられる混
    合用容器と上記計量管に通じている注入ポートとを有す
    る混合液処理領域と、上記サンプルラックを受け入れる
    サンプルラック収納領域とを備えたものであり、上記吸
    排ノズル駆動部は、上記吸排ノズルを上記混合液処理領
    域と上記サンプルラック収納領域の所望位置に移動せし
    めて試料およびラベル化剤を上記混合用容器に分注する
    動作および上記混合用容器から試料とラベル化剤との混
    合液を上記吸排ノズルによって上記注入ポートに注入す
    る動作を行わせるものであり、上記分離カラムによる第
    １の試料に対するラベル化試料成分の分離行程の間に、
    上記プリカラムにおける第２の試料に対するラベル化試
    料成分捕捉行程と、上記試料供給装置における第３の試
    料に対する試料とラベル化剤の混合行程とを並行して実
    行することを特徴とする液体クロマトグラフ分析計。
  10. 【請求項１０】試料にプレラベル化処理をしてラベル化
    された試料成分を分離カラムで成分分離し検出する方法
    において、複数の試料容器が装填されるサンプルラック
    を試料供給装置に装填したあと、上記試料供給装置上で
    繰り返し使用される混合用容器に単一の可動吸排ノズル
    によって試料およびラベル化剤を分注すること、上記吸
    排ノズル内に上記混合用容器内の試料とラベル化剤の混
    合液を吸入し、計量管に通じ上記試料供給装置上に設け
    られている注入ポートに、吸入された混合液を上記吸排
    ノズルから注入すること、上記計量管とプリカラムの間
    に設けた切換弁を切換えるのに伴って上記計量管内にあ
    った混合液を上記プリカラムに導入しラベル化試料成分
    の捕捉と不要物排出を行うこと、上記プリカラムから脱
    離されたラベル化試料成分を上記分離カラムによって分
    離すること、上記分離カラムによる第１の試料に対する
    ラベル化試料成分の分離行程と、上記プリカラムによる
    第２の試料に対するラベル化試料成分捕捉行程と、上記
    試料供給装置による第３の試料に対する試料とラベル化
    剤の混合行程とを並行して進めること、を特徴とするプ
    レラベル反応処理方法。
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