DE4032963A1 - Fluessigphasenchromatographie-analysator, probenzufuehrung und verfahren zur vormarkierung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen Analysator, der das Flüssigpha­ senchromatographieprinzip nutzt, sowie ein Verfahren zum Behandeln von Proben für den Analysator. Insbesondere be­ trifft die Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung, die zum Markieren einer Probe vor deren Aufteilung in ihre Be­ standteile geeignet ist.

Flüssigphasenchromatographie ist durch ihre Fähigkeit ge­ kennzeichnet, einen besonderen Bestandteil selektiv analy­ sieren zu können, nachdem die Bestandteile einer Substanz im Lösungszustand getrennt wurden. Sie ist auf die Analyse vieler wichtiger Stoffe auf dem Gebiet klinischer Untersu­ chungen anwendbar. Andererseits benötigt Flüssigphasenchro­ matographie komplizierte Analyseeinrichtungen und erfordert in vielen Fällen viel Analysezeit. Dies stellte einen Hinde­ rungsgrund zum Anwenden von Flüssigphasenchromatographie bei Routinearbeiten in chemischen oder medizinischen Über­ prüfungen dar, wie klinischen Untersuchungen, bei denen eine große Anzahl von Proben innerhalb einer begrenzten Zeitspanne behandelt werden muß. Dieser Nachteil ist für die verzögerte Verbreitung automatischer Vorrichtung dieses Analysetyps verantwortlich.

Die Analyse von Catecholaminen kann als eine Art der Stoff­ analyse aufgeführt werden, die in ihre Anpassung an Routine­ arbeit im Rückstand ist. Es ist anerkannt, daß es sich hier um nützliche Stoffe für Diagnoseuntersuchungen von Zelltumo­ ren, Abnormalitäten der Kreislauforgane, des Gehirnnerven­ systems, innerer Stoffwechselprodukte usw., von Streß und anderer krankhafter Zustände handelt. Daher zieht die Analy­ se von Catecholaminen Aufmerksamkeit auf sich, als nützli­ cher und diagnostisch wichtiger Stoff für Gruppenuntersu­ chungen von Alterskrankheiten.

Trennung durch Flüssigphasenchromatographie und Analyse von Catecholaminen wird im allgemeinen dadurch ausgeführt, daß die Probe mit einem Fluoreszenzmarkieragens zur Reaktion ge­ bracht wird und das Reaktionsprodukt der Untersuchung durch ein Fluoreszenzphotometer unterworfen wird. Als Markiertech­ niken sind zwei Typen von Verfahren bekannt: ein Vormarkier­ verfahren, bei dem die Probe mit dem Markieragens zur Reak­ tion gebracht wird, bevor die Bestandteile durch eine Trenn­ säule getrennt werden, und ein Nachmarkierverfahren, bei dem die Reaktion mit dem Markieragens ausgeführt wird, nachdem die Bestandteile durch die Trennsäule getrennt wurden. Mit dem Nachmarkierverfahren ist keine hochempfindliche Unter­ suchung wegen starker Diffusion der Bestandteile nach Elu­ sion aus der Trennsäule möglich. Daher ist das Vormarkie­ rungsverfahren vorteilhafter, um Spurenbestandteile in einer Probe aus einem lebenden Organismus zu untersuchen.

Als Stand der Technik zum Markieren (Umwandeln in Derivate) von Catecholaminen durch das Vormarkierverfahren und in bezug auf das Unterwerfen der markierten Catecholamine einer chromatographischen Analyse sind Verfahren bekannt, wie sie in JP-A-61-88 148 und 60-1 43 766 beschrieben sind.

Gemäß dem Verfahren von JP-A-61-88 148 wird Aluminiumoxid zu einer Probe gegeben, damit Catecholamie am Aluminiumoxid adsorbieren, während im Verlauf der Adsorption Dansylchlorid zur Reaktion gebracht wird, um die Catecholamine in Derivate umzuwandeln. Anschließend werden die Derivate vom Aluminium­ oxid desorbiert, und die Derivate enthaltende Lösung wird durch Verdampfen konzentriert. Die so zubereitete konzen­ trierte Lösung wird in den Durchflußkanal einer Flüssigpha­ senchromatographieeinrichtung gegossen, um die Lösung in ihre Bestandteile aufzutrennen, und es wird die Fluoreszenz der Catecholaminderivate ermittelt.

Gemäß dem Verfahren von JP-A-0-1 43 766 wird eine Probe eines lebenden Organismus, wie ein Serium oder Urin in den Durch­ flußkanal eingeführt, und dann werden drei Arten von Reak­ tionsreagenzien aufeinanderfolgend in diesen Kanal einge­ führt, und während ihres Durchlaufs durch die Reaktions­ schlange werden die Catecholamine markiert (in Derivate um­ gewandelt). Die so zubereiteten markierten Catecholamine werden aufgefangen und durch eine Anreicherungssäule ange­ reichert und dann in eine Trennsäule überführt, um in die Bestandteile aufzutrennen, und Fluoreszenz der markierten Catechlamine wird ermittelt.

Das Verfahren von JP-A-61-88 148 ist nicht für Routinearbei­ ten wie klinische Untersuchungen geeignet. Dies, weil das Verfahren erheblich Zeit für das Zubereiten der in den Durchflußkanal des Flüssigphasenchromatographen zu geben­ den Probe benötigt. Außerdem ist Automation des Verfahrens schwierig. Das Verfahren von JP-A-O-1 43 766 erfordert demge­ genüber das Verwenden einer langen Reaktionsschlange, da die Probe und die Reagenzien, nachdem sie in den Durchfluß­ kanal für die Trägerflüssigkeit geleitet wurden, während ihrem Durchlauf durch die Reaktionsschlange in dieser ge­ mischt werden. Außerdem hat dieses Verfahren den Nachteil, daß es viel Zeit benötigt, bis die Bestandteile ganz in ihre Derivate gewandelt sind.

Darüber hinaus wird bei den bekannten Methoden der Kühlung der Proben vor ihrem Einführen in den Chromatographen keine Beachtung geschenkt.

Ein Problem, das die Erfinder lösen wollten, ist dasjenige, es zu ermöglichen, die Reaktion des Umwandelns der Bestand­ teile in ihre Derivate mit Sicherheit auszuführen.

Ein anderes Problem, das die Erfinder lösen wollten, ist das, eine Vorrichtung anzugeben, mit der der Einfluß von Temperaturänderungen auf die Probe während der Reaktion minimal gehalten werden kann.

Ein weiteres Problem, das die Erfinder lösen wollten, ist das, das Bearbeiten einer großen Anzahl von Proben zu ver­ einfachen.

Gemäß der Lösung der Probleme im Stand der Technik durch die Erfindung wird eine Vorrichtung angegeben, die einen Reak­ tionsbearbeitungsteil aufweist, in dem sich ein beheiztes Reaktionsgefäß und eine Probeneinführöffnung sowie ein ab­ nehmbares Probengestell befinden. Nach Ablauf einer vorgege­ benen Zeitspanne ab dem Start der Reaktion im Reaktionsge­ fäß zwischen dem Reagens und der vom Probengestell zugeführ­ ten Probe wird das Reaktionsgemisch in diesem Reaktionsge­ fäß durch eine Saug- und Entladedüse in die Probeneinführ­ öffnung überführt. Das Reaktionsgefäß kann durch ein Misch­ gefäß und einen Durchflußkanal ersetzt werden, der auf eine vorgegebene Temperatur erhitzt wird, um den Ablauf der Reak­ tion zu ermöglichen.

Gemäß einer anderen Lösung der Probleme mit der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren angegeben, bei dem die Probe zunächst einer Vormarkierungsbehandlung unterworfen wird und die markierte Probe durch eine Trennsäule geleitet wird, um ein Aufteilen in die Bestandteile und ein Ermitteln dersel­ ben vorzunehmen. Dieses Verfahren weist den Schritt der Vor­ markierbehandlung auf, bei der ein Probengestell im Gehäuse einer Markiervorrichtung mit einem beheizten Mischgefäß und einem Probengestellaufnahmeteil in Position gebracht wird und dann eine Probe und ein Markieragens durch die Saug- und Entladedüse in das Mischgefäß gebracht werden, um die Vor­ markierreaktion zu starten. Dann wird die Probe aus dem Reaktionsgefäß in eine Probeneinführöffnung gegeben, die zum Durchflußkanal einer Trennsäule führt.

In der Zeichnung stellt Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfin­ dung dar.

Fig. 2 ist ein Flußdiagramm des Analyseablaufs in der Vor­ richtung von Fig. 1.

Die Fig. 3A und 3B sind Diagramme, die den Zeitplan der Ab­ läufe in verschiedenen Teilen der Vorrichtung von Fig. 1 veranschaulichen.

Fig. 4 ist eine Draufsicht auf einen automatischen Proben­ nehmer in der Vorrichtung von Fig. 1.

Fig. 5 ist ein vergrößerter Querschnitt einer Abflußöffnung und benachbarter Teile in einem Abschnitt des Probennehmers gemäß Fig. 4.

Fig. 6 ist eine Außenansicht der Vorrichtung gemäß Fig. 1 von vorne.

Fig. 7 ist eine schematische Seitenansicht der Anordnung von Teilen in der Vorrichtung gemäß Fig. 6.

Fig. 8 ist eine Blockdarstellung des Steuersystems der Vor­ richtung von Fig. 1.

Fig. 9 ist ein Meßspektrum zum Veranschaulichen der Analyse von Catecholaminen.

Fig. 10 ist eine schematische Darstellung der Anordnung we­ sentlicher Teile bei einem ersten Beispiel einer geänderten Vorrichtung.

Fig. 11 ist eine schematische Darstellung der Anordnung we­ sentlicher Teile bei einem zweiten Beispiel einer geänderten Vorrichtung.

Fig. 12 ist eine schematische Darstellung der Anordnung we­ sentlicher Teile bei einem dritten Beispiel einer geänderten Vorrichtung.

Die Fig. 13A und 13B sind Diagramme, die den Zeitplan für den Betrieb jeweiliger Abschnitte in einem Analysator mit der Änderung gemäß Fig. 11 zeigen.

Die in den Zeichnungen verwendeten Bezugszeichen bezeichnen die folgenden Teile oder Elemente:

25: automatischer Probennehmer, 27: Probengestell, 28: Pro­ bentisch, 29: Probenbehälter, 30: Reaktionsagensbehälter, 33, 79a und 79b: Reaktionsgefäß, 35 und 81: Abflußöffnung, 36: Probeneinführöffnung, 38: Fülldüse, 47: Probenzuführven­ til, 48: Vorsäule, 49 und 83: Dosierleitung, 52: Säulenum­ schaltventil, 53: Trennsäule, 54: Fluoreszenzphotometer, 56: Steuereinheit, 82: Mischgefäß, 85: Sperrventil und 90: nichtbeweglicher Abschnitt.

Zum Analysieren von Proben lebender Organismen, die Cate­ cholamine und andere Bestandteile mit ähnlichen physikali­ schen Eigenschaften enthalten, ist es zweckmäßig, die ein­ zelnen Bestandteile durch Chromatographie zu trennen und zu bestimmen. In Catecholaminen sind Epinephrin, Norepinephrin und Dopamin vorhanden, wobei die Konzentration der verschie­ denen Bestandteile durch Trennen derselben durch Chromato­ graphie bestimmt werden kann.

Es ist jedoch schwierig, die Catecholaminbestandteile in derjenigen Form zu bestimmen, wie sie in der Probe vorlie­ gen. Gemäß der Erfindung werden daher die Catecholamine in der Probe zur Reaktion mit einem Markieragens gebracht und in Derivate umgewandelt, bevor Komponententrennung durch Trennsäulenchromatographie ausgeführt wird. Dann werden Verunreinigungen und unnötige Stoffe wie überschüssiges Reaktionsagens, die die Meßempfindlichkeit senken könnten, durch eine Vorsäule entfernt. Anschließend werden die Deri­ vate in eine Trennsäule überführt, um ein Auftrennen in die Bestandteile vorzunehmen. Das von der Trennsäule ausflie­ ßende Medium wird durch einen Detektor untersucht. Wenn ein Fluoreszenzmarkieragens zur Umwandlung der Catecholamine in Derivate verwendet wird, wird ein Fluoreszenzdetektor ver­ wendet, der an die Eigenschaften der zu ermittlenden Be­ standteile angepaßt ist, die diese infolge der Umwandlung in Derivate erfahren haben. Der Detektor kann einer von verschiedenen Detektortypen sein, wie ein Adsorptionsphoto­ meter, ein Leitfähigkeitsdetektor usw., abhängig von der Markierart.

Die Probenzuführung, die auch als automatischer Probennehmer oder Markiervorrichtung bezeichnet wird, weist einen nicht­ beweglichen Teil auf und ist mit einem Probengestell ausge­ rüstet. Das Probengestell wird abnehmbar auf den nichtbeweg­ lichen Teil gesetzt. Der nichtbewegliche Teil kann als Grundkörper (Teil) der Markiervorrichtung oder als Reak­ tionsbehandlungsabschnitt bezeichnet werden. In diesem nichtbeweglichen Abschnitt sind eine Probeneinführöffnung, ein Misch- oder Reaktionsgefäß, eine Ablauföffnung usw. angeordnet. Ebenfalls ist dort eine Probengestellanordnungs­ zone vorhanden, die als Probengestellanordnungsteil oder Probentisch bezeichnet wird. Dieser Abschnitt wird auf einer konstanten Temperatur, gewöhnlich im Bereich zwischen 4 Grad und 17 Grad Celsius gehalten.

Wenn die Mischung der Proben und des Markierreagens im Misch­ behälter direkt nach dem Mischen in die Probeneinführöffnung übertragen wird, wird die gemischte Lösung zunächst in den Durchflußkanal geleitet, um in Fortschreiten der Reaktion zu ermöglichen, wozu die Lösung für eine vorgegebene Zeit­ spanne zurückgehalten wird, bis die Reaktion im wesentlichen abgeschlossen ist. In diesem Fall muß der Mischbehälter nicht geheizt werden, jedoch wird der Durchflußkanal auf eine vorgegebene Temperatur geheizt.

Wenn die Markierreaktion in der Mischungslösung der Probe und des Reagens im Mischbehälter oder nach Überführen der gemischten Lösung in einen anderen Behälter ausgeführt wird, wird der Mischbehälter oder der andere Behälter geheizt. Dieses Heizen erfolgt bei konstanter Temperatur im Bereich zwischen 40 Grad und 50 Grad Celsius. In diesem Fall wird der Mischbehälter oder der andere Behälter als Reaktionsge­ fäß bezeichnet.

Das im Probengestellaufnahmeabschnitt abnehmbar aufgesetzte Reaktionsgestell ist mit mehreren Löchern versehen, um darin Probenbehälter festzuhalten. Es weist auch einen Teil zum Aufnehmen des Markierreagensbehälters auf. Die Probe und das Reagens werden in diesem Probengestellaufnahmeabschnitt ge­ kühlt.

Die Probenzuführen weist einen Düsenverstellmechanismus auf und ist so ausgebildet, daß die Saug- und Entladedüse ver­ schiedene Funkionen ausführen kann. Zum Beispiel kann die Saug- und Entladedüseprobe in das Mischgefäß aus dem Proben­ behälter geben, das Reagens aus dem Reagensbehälter in das Mischgefäß geben, die Lösung im Mischgefäß durch wiederhol­ tes Ansaugen und Wiederausgeben der Lösung umrühren und die gemischte Lösung in die Probeneinführöffnung übertragen. Da aufeinanderfolgend jeweils frische Proben in das Mischgefäß übertragen werden, ist Reinigen des Zuführsystems erforder­ lich. Daher wird von Zeit zu Zeit eine Reinigungsflüssigkeit durch die Saug- und Entladedüse geleitet und in das Mischge­ fäß ausgegeben.

Da bei der Erfindung sowohl die Probe wie auch das Reagens in dasselbe Mischgefäß gegeben werden, startet die Reaktion sobald diese Bestandteile im Gefäß gemischt werden. Die Reaktionszeit, die mit dem Mischen der Probe und des Rea­ gens beginnt, endet mit dem Übertragen der Reaktionslösung in die Probeneinführöffnung. Sie kann genau durch Steuern des zeitlichen Ablaufs der Funktion der Saug- und Entlade­ düse gesteuert werden. Da das Mischen in einem Gefäß ausge­ führt wird, ist dadurch Homogenisieren der gemischten Lösung gefördert.

Wenn eine Probe von einem lebenden Organismus verwendet wird, wird die Probe gekühlt, um Änderungen zu verhindern. Um die Markierreaktion zu fördern, ist es zweckmäßig, das Reaktionsgefäß zu beheizen. Wenn jedoch die Heiztemperatur durch die Kühleinrichtung für die Probe beeinflußt wird, kann die Reaktionstemperatur schwanken, was es erschwert, die Reaktionsbedingungen konstant zu halten. Da gemäß der vorliegenden Erfindung das Reaktionsgefäß getrennt vom Pro­ bengestell angebracht ist und ein Wärmeisolator leicht zwi­ schen diesen beiden Teilen angeordnet werden kann, ist es möglich, stabile Reaktionsbedingungen aufrechtzuerhalten. Da darüber hinaus das Probengestell abnehmbar vom Reaktions­ abschnitt ausgebildet ist, ist es möglich, eine Probe und/ oder ein Reagens in das Probengestell vorab zu übertragen und dann dieses Gestell in den Analysator zu setzen, um die Analyse auszuführen, oder die analysierte Probe mit dem Gestell wieder wegzunehmen.

Als Fluoreszenzmarkieragens, das als Reagens zum Umwandeln von Catecholaminen in Derivate dient, kann z. B. 1,2-Diphe­ nylethyldiamin (DPE) verwendet werden. Die Lösung des zu be­ reitenden Fluoreszenzmarkieragens beinhaltet 60 mM DPE, 2 mM Kaliumferrizyanid und 40% Acetonitril. Als Eluierlösung, die zum Trennen der Catecholamine in Bestandteile der Tren­ säule zugeführt wird, wird z. B. eine Flüssigkeit verwendet, die Acetonitril, Methanol und eine wäßrige Lösung im Verhältnis 5 : 2 : 4 enthält, wobei die wäßrige Lösung 50 mM Lithiumnitrat und 10 mM Natriumdodecylsulfat enthält.

Ein Beispiel einer automatischen Catecholaminanalysevorrich­ tung gemäß der Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben.

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des Aufbaus eines automatischen Catecholaminanalysesystems. Das System weist einen Probenzuführbereich 26 auf, in dem verschiedene Arten von Behältern und Lademechanismen angeordnet sind, und einen Anreicherungs- und Trennbereich 44, in dem Anreicherung und Trennung der Probe in jeweiligen Durchflußkanälen erfolgt. Im folgenden wird der Probenzuführbereich 26 als automati­ scher Probennehmer und der Anreicherungs- und Trennbereich 44 als Analysebereich bezeichnet.

Der automatische Probennehmer 26 weist einen nichtbewegli­ chen oder Reaktionsbehandlungsbereich 90 auf und ist mit einem abnehmbaren Probengestell 27 ausgestattet.

Dieses Probengestell 27 wird auf einen Probentisch 28 im automatischen Probennehmer 26 gesetzt und hält mehrere Pro­ benbehälter fest, von denen jeder eine Plasmaprobe enthält.

Im Probengestell 27 sind auch ein Reaktionsreagensbehälter 30 für Fluoreszenzmarkierung, ein Behälter 31 für eine in­ terne Bezugsflüssigkeit und ein Bezugsflüssigkeitsbehälter 32 eingesetzt. An festgelegten Stellen des nichtbeweglichen Bereichs 90 dicht am Probentisch 28 sind ein Reaktionsgefäß 33, ein Düsenreinigungstank 34, eine Abflußöffnung 35 und eine Einführöffnung 36 angeordnet.

Die Saug- und Entladedüse 38 hat die Funktion, die Probe und das Reagens durch eine Pipette in das Reaktionsgefäß 33 Fig. zu geben und die Probe nach der Reaktion aus dem Reaktionsgefäß 33 in die Zuführöffnung 36 zu übertragen. Ein Antriebsmecha­ nismus 37 dient dazu, die Düse 38 entlang rechtwinklig auf­ einanderstehender x-, y- und z-Achsen zu bewegen. Der Mecha­ nismus ermöglicht es, die Düse 38 frei in drei Dimensionen zu bewegen, damit sie an einem Behälter oder einer Öffnung des automatischen Probennehmers positioniert werden kann. Das obere Ende der Düse 38 ist mit einer Ladepumpe 41 und einem Reinigungsflüssigkeitstank 42 über eine dünne Leitung 39, wie eine Kunststoffleitung, und über ein Dreiwegeventil 40 verbunden. Beim Ausführungsbeispiel wird eine durch einen Pulsmotor angetriebene Spritzpumpe als Ladepumpe 41 ver­ wendet. Ein thermostatischer Block 80 dient zum Aufrechter­ halten der Temperatur des Reaktionsgefäßes 33 auf einem vorgegebenen Wert. Im Probentisch 28 ist eine Kühleinrich­ tung vorhanden, die die Probe und das Reagens im Probenge­ stell 27 während der Analyse auf niedriger Temperatur hält.

Der Analysebereich 44 verfügt über ein Vorsäulen-Durchfluß­ system, in dem eine Probe angereichert wird und in dem Ver­ unreinigungen beseitigt werden. Außerdem sind ein Trenn­ säulen-Durchflußsystem, in dem die Probe in ihre Bestand­ teile aufgeteilt wird, und eine Meß- und Bedieneinheit vor­ handen. Im Vorsäulen-Durchflußsystem wird eine Reinigungs­ flüssigkeit aus ihrem Vorratstank 45 mit konstanter Fließ­ geschwindigkeit durch eine Pumpe 46 ausgepumpt und durch ein Probeneinführventil 47 in eine Vorsäuleneinheit 48 geleitet. Mit dem Probeneinlaßventil 47 ist auch eine Dosierleitung 49 verbunden, durch die der Fluß der von der Einführöffnung 36 zugeführten Probenlösung so eingestellt wird, daß eine vor­ gegebene Menge an Probenlösung in den Analysebereich einge­ führt wird.

Im Trennsäulen-Durchflußsystem wird eine Eluierlösung aus ihrem Vorratsbehälter 50 mit konstanter Fließgeschwindigkeit durch eine Pumpe 51 ausgepumpt und in eine einzige Trenn­ säule 53 über ein Säulenumschaltventil 52 geleitet. Dieses Säulenumschaltventil 52 kann umgeschaltet werden, damit die Eluierlösung durch die Vorsäule 48 fließt, um die dort be­ handelte Probe in die Trennsäule 53 zu überführen. Das Meß- und Bediensystem weist ein Fluoreszenzphotometer 54 zum Mes­ sen der Fluoreszenzintensität von Probenbestandteilen auf, die aus der Trennsäule 53 eluiert wurden. Außerdem sind ein A/D-Wandler 55 zum Abarbeiten von Funktionen und zum Anzei­ gen von Ergebnissen, eine Steuereinheit 56, ein Drucker 57, eine Kathodenstrahlröhre 58 und andere Funktionsgruppen vorhanden. Das Fluoreszenzphotometer 54 weist eine Durch­ flußzelle 59 auf. Umschaltventile 60 und 61 sind so ausge­ bildet, daß durch sie Flüssigkeit aus den Pumpen 46 bzw. 51 abgelassen werden kann, falls dies erforderlich sein sollte.

Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel der Erfindung wird Analyse durch aufeinanderfolgendes Ausführen der folgenden Funktionen vorgenommen:

• 1. Fluoreszenzmarkierung der Proben im automatischen Proben­ nehmer,
• 2. Anreichern und Entfernen von Verunreinigungen durch die Vorsäule,
• 3. Trennen der Bestandteile der Probe durch die Trennsäule und Bestimmen derselben.

Der Ablauf der Analysefunktionen wird im folgenden unter Bezugnahme auf das Flußdiagramm von Fig. 2 erläutert.

Reinigen des Reaktionsgefäßes

Nach Anzeigen des Starts des Analysevorgangs in einem Schritt 101 wird in einem Schritt 102 das Reaktionsgefäß 33 gereinigt. In diesem Schritt wird die Düse 38 zur Position des Reaktionsgefäßes 33 bewegt, und die Pumpe 41 wird so be­ tätigt, daß sie Reinigungsflüssigkeit vom Vorratstank 42 in das Reaktionsgefäß leitet. Die Reinigungsflüssigkeit wird in größerer Menge zugeführt, als es dem Aufnahmevermögen des Reaktionsgefäßes 33 entspricht, wodurch Reinigungsflüssig­ keit überfließt und über die Abflußöffnung 35 und eine Ab­ flußleitung 43 abfließt. Anschließend wird die Düse 38 bis zum Boden des Reaktionsgefäßes 33 abgesenkt, um die Reini­ gungsflüssigkeit im Gefäß abzusaugen. Anschließend wird die Düse zum Ort der Abflußöffnung 35 bewegt, um die angesaugte Flüssigkeit wieder abzugeben. Vor dieser Funktion muß eine kleine Menge Luft angesaugt und am Ende der Düse 38 belassen werden, damit die durch die Düse angesaugte verschmutzte Flüssigkeit in frische Reinigungsflüssigkeit in der Düse diffundiert. (Die Funktion des Ansaugens von Luft, um eine Grenze mit einem Luftraum vor dem Ansaugen bereits genutz­ ter Flüssigkeiten zu schaffen, muß auch ausgeführt werden, wenn die Probe und das Reagens in späteren Schritten ange­ saugt werden, jedoch wird zum Vereinfachen der Erläuterun­ gen diese Funktion bei der folgenden Beschreibung nicht mehr erwähnt.) Die oben beschriebene Funktionsfolge wird geeignet oft (z. B. dreimal) wiederholt, um das Reinigen des Reaktionsgefäßes 33 abzuschließen.

Zuführen der Probe

In einem Schritt 103 wird die Probe in das Reaktionsgefäß 33 gegeben. Die Düse 38 wird zunächst zum Ort des Behälters 31 für die interne Bezugslösung bewegt, dann in diesen abge­ senkt, um eine vorgegebene Lösungsmenge anzusaugen, aus dem Behälter 31 wieder angehoben und dann zur Position des Pro­ benbehälters 39 bewegt, um eine vorgegebene Menge zu analy­ sierender Probe anzusaugen. Dann erfolgt ein Verstellen zum Ort des Reaktionsgefäßes 33, wo die von der Düse aufgenom­ mene Probe und die interne Bezugslösung in das Reaktionsge­ fäß 33 entladen werden. Die interne Bezugslösung ist eine Bezugslösung, wie sie zum Korrigieren von Änderungen in der prozentualen Erholung der Säule und anderer Bestandteile verwendet wird. Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel der Erfindung wird Isoproterenol als Standardmaterial verwendt.

Reinigen der Düse

Die Düse wird in einem Schritt 104 gereinigt. Hierzu wird sie zum Ort der Abflußöffnung 35 bewegt, und Reinigungs­ flüssigkeit wird durch die Düse ausgegeben, um Verunreini­ gungen von der Innenwand der Düse 38 abzuwaschen, wie sie durch die interne Bezugslösung und die Probe verursacht sind. Dann wird die Probe weiter zum Ort des Reinigungsbe­ hälters 34 verfahren, in diese abgesenkt, und Reinigungs­ flüssigkeit wird ausgegeben, der Düse 38 zu reinigen.

Zuführen und Mischen des Reagens

Das Reagens wird in einem Schritt 105 in das Reaktionsgefäß 33 zugegeben. Die Düse 38 wird zum Ort des Reaktionsreagens­ behälters 30 bewegt, und eine vorgegebene Menge des derivat­ bildenden Reagens wird in die Düse eingesaugt. Dieses Rea­ gens wird dann in den Reaktionsbehälter 33 eingespritzt und mit der Probe und der internen Bezugslösung vermischt, die zuvor dem Reaktiongsgefäß zugeführt wurden. Mischen kann auch durch andere Verfahren erfolgen, z. B. durch Ansaugen von Luft in die Düse, Einführen der Düse in das Reaktions­ gefäß und Entladen der Luft aus der Düse in das Gefäß, oder durch Schütteln oder in Schwingung versetzen des Reaktions­ gefäßes durch äußere mechanische oder elektrische Einrich­ tungen. Wenn das Reagens eine Flüssigkeit ist, die sich leicht mit der Probe und der internen Standardlösung mischt und eine relativ große Menge ausgegeben wird, kann es aus­ reichend sein, lediglich das Ausgeben der Flüssigkeiten mit hoher Geschwindigkeit vorzunehmen.

Reaktion

In einem Schritt 106 wird eine Fluoreszenzmarkierreaktion ausgeführt, um Umwandlung von Catecholaminen in fluoreszie­ rende Substanzen (Derivate) vorzunehmen. Die Mischlösung der Probe und des Umwandlungsreagens im Reaktionsgefäß 33 (im folgenden als Probenlösung bezeichnet) verbleibt im Reak­ tionsgefäß 33 für eine vorgegebene Zeitspanne auf einer vor­ gegebenen Temperatur, um ein Ablaufen der Reaktion zu ermög­ lichen; dabei wird Fluoreszenzmarkierung bewirkt.

Einführen der Probe in die Dosierleitung

In einem Schritt 107 wird die Reaktionslösung aus dem Reak­ tionsgefäß 33 in die Dosierleitung 49 eingeführt. Proben­ lösungen mit Catecholaminen, die im wesentlichen die Mar­ kierreaktion im Reaktionsgefäß 33 durchlaufen haben und in Derivate umgewandelt sind, werden in die Düse 38 eingesaugt. Düse wird zum Ort der Einführöffnung 36 verstellt und die Düse eingeführt, und die Probenlösung wird in die Proben­ dosierleitung 49 injiziert, indem das Probeneinführventil 47 in die in Fig. 1 dargestellte Stellung gestellt wird. Wenn dieses Ventil 47 umgestellt wird, nachdem die Dosierleitung 49 mit der Probenlösung gefüllt wurde, wird die mit einem Einlaß des Umschaltventils 47 verbundene Dosierleitung 49 zwischen einen Durchflußkanal 62 und einen Durchflußkanal 63 geschaltet, und eine vorgegebene Menge an Probenlösung wird durch den Fluß einer Tansport- und Reinigungsflüssigkeit in die Vorsäule 48 übertragen.

Anreicherung

In einem Schritt 108 erfolgt das Festhalten von Catecholami­ nen in der Form von Derivaten in der Vorsäule 48 und ein Entfernen von Verunreinigungen und überschüssigem Reagens. Anreichern der Probenlösung wird ausgeführt. Da die Proben­ lösung durch den Fluß der Transport- und Reinigungsflüssig­ keit in die Vorsäule 48 eingeführt wurde, wird die Probe durch Adsorption festgehalten und sammelt sich in der Vor­ säule 48 an. Stoffe, die die Untersuchung stören, wie Verun­ reinigungen und überschüssiges Reagens, laufen durch die Vorsäule durch und werden an einem Entladeauslaß 64 ausge­ geben.

Übertragen der Probe

In einem Schritt 109 wird die von nicht erforderlichen Stof­ fen gereinigte und in der Vorsäule 48 festgehaltene Probe aus dieser herausgeleitet und in die Trennsäule 53 über­ führt. Wenn das Säulenumschaltventil 52 von dem in Fig. 1 mit durchgezogenen Linien dargestellten Zustand in den mit gestrichelten Linien dargestellten Zustand überführt wird, wird die Vorsäule 48 zwischen Durchflußkanäle 65 und 66 geschaltet, wodurch der Fluß von Eluierlösung durch die Vorsäule 48 ermöglicht wird, was zum Dissoziieren der in der Vorsäule 48 konzentrierten Probe und zu deren Übertragen in die Trennsäule 53 führt. Wenn das Säulenumschaltventil 52 wieder umgeschaltet wird (in die mit durchgezogenen Linien dargestellte Stellung in der Zeichnung), wenn die gesamte Probe in den Durchflußkanal 66 überführt ist, kann Eluier­ lösung direkt in die Trennsäule 53 ohne Durchgang durch die Vorsäule 48 fließen, und Transport- und Reinigungsflüssig­ keit beginnt, in die letztere zu fließen.

Trennung

In einem Schritt 110 wird dafür gesorgt, daß Eluierlösung durch die Trennsäule 53 fließt, in der das Trennen der aus den Catecholaminen abgeleiteten Bestandteile erfolgt, wo­ durch Norepinephrin (NE). Epinephrin (E), Dopamin (DA) usw. ein Komponentenband bilden, das aus der Trennsäule eluiert wird.

Regenerieren der Vorsäule

In einem Schritt 111 wird Transport- und Reingungsflüssig­ keit in die Vorsäule 48 geleitet, synchron mit der Probenbe­ standteilstrennung in Schritt 110. Die Vorsäule 48 wird in einen Zustand regeneriert, in dem sie zum Empfangen der nächsten Probenmenge bereit ist.

Bestimmung

In einem Schritt 112 wird das Eluat von der Trennsäule 53 durch das Fluoreszenzphotometer 54 untersucht. Die durch die Trennsäule 53 getrennten und aus dieser eluierten Bestand­ teile fließen aufeinanderfolgend in die Durchflußzelle 59 des Fluoreszenzphotometers 54. Es wird die Fluoreszenzinten­ sität jedes abgetrennten Bestandteils untersucht, und das Meßergebnis wird arithmetischen Berechnungen unterworfen, um die Konzentration jedes Bestandteils zu bestimmen.

Datenanzeige und Ausgabe

In einem Schritt 113 werden die in Schritt 112 erhaltenen Daten angezeigt und mit Hilfe des Druckers 57, der Bildröhre 58, usw. ausgegeben. In einem Schritt 114 wird untersucht, ob alle Proben im automatischen Probennehmer 26 dem Prozeß­ schema unterworfen wurden. Wenn noch unbearbeitete Proben vorhanden sind, kehrt das Verfahren zu Schritt 102 zurück und führt alle vorstehend genannten Schritte zur Analyse wieder durch. Wenn festgestellt wird, daß alle Proben ord­ nungsgemäß die obigen Schritte durchlaufen haben, geht der Ablauf zu einem Schritt 115 über, um die Analysefunktion der Vorrichtung zu beenden.

Vorstehend wurde der Analyseablauf gemäß der Erfindung für eine einzige Probe beschrieben. Nachstehend wird der Ablauf für kontinuierliche Analysefunktionen für mehrere Proben be­ schrieben. Die Fig. 3A und 3B veranschaulichen ein Beispiel für ein Analyseprogramm zum Ausführen kontinuierlicher Ana­ lysefunktionen.

Auf der vertikalen Achse in der Zeichnung sind die Funk­ tionen gemäß dem oben beschriebenen Flußplan der Analyse in drei Schritte oder Abschnitte entsprechend den Funktionsin­ halten unterteilt. Der erste Schritt beinhaltet im wesentli­ chen die Funktionen zum Umwandeln der Catecholamine in Deri­ vate in einem automatischen Probennehmer. Der wesentliche Punkt des zweiten Schrittes ist Anreichern der Probe in einer Vorsäule. Der dritte Schritt deckt die Funktionen des Trennens und Bestimmens der Probenbestandteile durch eine Trennsäule ab. Die Grenzen zwischen den jeweiligen Schritten der Funktionen wurden so gewählt, daß die zeitliche Zuord­ nung für die verschiedenen Schritte in das geplante Analyse­ programm paßt. Die Anzahl von Zyklen und die Zeiten, die für jeweilige Funktionen beim Fortschreiten des Analysepro­ gramms erforderlich sind, sind auf der horizontalen Achse aufgetragen. Das Programm ist so ausgearbeitet, daß ein Ablauf der Funktionen vom ersten bis zum dritten Schritt in einem Zyklus abgearbeitet wird.

Fig. 3A veranschaulicht ein Analyseprogramm unter Hervorhe­ ben des Analysezustandes (angezeigt durch dicke, durchgezo­ gene Linien) einer n-ten Probe. Dünne, durchgezogene Linien zeigen den Funktionsablauf für die (n + 1)-te Probe und die (n - 1)-te Probe auf. Gestrichelte Linien zeigen den Funk­ tionsablauf für die (n - 2)-te Probe und die (n + 2)-te Probe auf. Fig. 3B veranschaulicht den zeitlichen Funktionsablauf des Umschaltventils. Der "Dosier"-Zustand a des Probenein­ führventils 47 ist der Zustand, bei dem die Probenlösung von der Einführöffnung 36 in die Dosierleitung 49 injiziert werden kann, also der in Fig. 1 dargestellte Zustand. Der "Übertragungs"-Zustand b ist der Zustand, bei dem das Ventil so umgeschaltet ist, daß es die Dosierleitung 46 mit dem Vorsäulen-Durchflußkanal verbindet. Der "Verbindungs"-Zu­ stand c des Zeilenumschaltventils 52 bezeichnet den Zustand, bei dem die Vorsäule 48 mit dem Trennsäulen-Durchflußkanal verbunden ist. Der "Synchronbearbeitungs"-Zustand d be­ zeichnet einen Zustand, bei dem die Transport- und Reini­ gungsflüssigkeit parallel zum Ablauf der Probenbestandteils­ trennung fließt. Dieser Zustand ist in Fig. 1 mit durchgezo­ genen Linien dargestellt. Die Umschaltfunktion jedes der Umschaltventile wird für jeden Funktionszyklus wiederholt.

Bei kontinuierlichen Analyseabläufen in der Praxis wird ein Durchgang von Analyseabläufen für die erste Probe (die als erste analysierte Probe) im ersten Zyklus ausgeführt. Diesem folgen ein zweiter und weitere Zyklen von Analyseabläufen für die zweiten bzw. folgenden Proben vom automatischen Pro­ bennehmer. Fig. 3A zeigt das Betriebsprogramm für den n-ten bis zum (n + 2)-ten Zyklus. Es wird darauf hingewiesen, daß im n-ten Zyklus die Analyse der n-ten Probe (der Probe, die als n-te untersucht wird) begonnen wird, und die Funktionen des ersten Schrittes ausgeführt werden. Dies wird mit zuvor begonnenen Abläufen für den zweiten Schritt mit der (n - 1)- ten Probe und den Abläufen im dritten Schritt für die (n - 2)- te Probe synchronisiert. Im (n ± 1)-ten Schritt durchläuft die n-te Probe die Abläufe im zweiten Schritt und die fol­ gende (n + 1)-te Probe unterliegt den Abläufen im ersten Schritt. Dies wird mit den Funktionen im dritten Schritt für die (n - 1)-te Probe synchronisiert. Im (n + 2)-ten Zyklus schließlich durchläuft die n-te Probe den dritten Schritt der Analysevorgänge, während die (n + 1)-te Probe den Abläufen im zweiten Schritt unterliegt. Parallel dazu werden die Abläufe des ersten Schrittes mit der folgenden (n + 2)-ten Probe ausgeführt.

Wenn nur eine Probe analysiert wird, ist die für die Analyse mit der beschriebenen Vorrichtung erforderliche Zeit die Summe der Zeiten für den ersten, zweiten und dritten Schritt. Wenn jedoch drei Proben nebeneinander her und aufeinan­ derfolgend analysiert werden, ist es möglich, Zeit für die Analyse einzusparen. Beim vorliegenden Beispiel benötigt es 15 Minuten, um eine Analyse insgesamt abzuschließen, so daß alle 5 Minuten eine Probe bearbeitet werden kann.

Wenn Catecholamine chromatographisch behandelt werden, ist es wünschenswert, mindestens 10 Proben pro Stunde zu chroma­ tographieren, so daß die Zeit, die mit einer Probe zuge­ bracht werden kann, höchstens 6 Minuten beträgt.

Fig. 4 ist eine Draufsicht auf den automatischen Probenneh­ mer 26 in der Analysevorrichtung gemäß Fig. 1. Das Probenge­ stell 27 ist abnehmbar auf dem Probentisch 28 angebracht. Dieses Probengestell 27 verfügt über eingeformte Probenbe­ hälter-Halterungslöcher 70, die in Zeilen mit 10 Löchern und Spalten mit 5 Löchern angeordnet sind, also mit insge­ samt 50 Löchern in Form einer Matrix. Die Probenbehälter, von denen jeder eine zu analysierende Probe enthält, werden in den Löchern 70 angeordnet und in diesen gehalten. Auf dem Probengestell 27 sind auch Aufnahmen für ein Reaktions­ reagens 30, eine interne Bezugslösung 31 und eine Bezugspro­ be 32 vorhanden, wie auch Haltelöcher 71a, 71b, 71c zum Aufnehmen von Notprobenbehältern, um das Einführen von Not­ bestimmungen während der Analyse zu ermöglichen. An einer Seite des Probengestells 27 sind das Reaktionsgefäß 33, die Düsenreinigungsöffnung 34, die Abflußöffnung 35 und die zur Dosierleitung 49 führende Einführöffnung 36 vorhanden, je­ weils in fester Lage. Die Ladedüse 38 ist an einem Halteteil 5 befestigt, der verschiebbar auf einer Welle 4 eines Bewegungsblocks 3 angeordnet ist. Angetrieben durch einen Antriebsmechanismus 37 kann sich die Düse 38 frei in drei Dimensionen entlang der x-, y- und z-Achse bewegen, so daß sie an die Orte jedes der Behälter oder Öffnungen bewegt werden kann, um die erforderlichen Arbeiten auszuführen. Ein Wärmeisolationsteil 92 ist zwischen dem nichtbeweglichen Teil 90 und dem Probengestell 27 angeordnet.

Der Analyseablauf beginnt damit, daß eine Bedienperson einen Analysestartschalter an einem Bedienpanel 77 betätigt, nach­ dem das Probengestell 27 mit den zu analysierenden Proben und dem Reagens auf dem Probentisch 28 des automatischen Probennehmers 26 aufgestellt wurde.

Fig. 5 zeigt einen Querschnitt durch ein Reaktionsgefäß 33, einen Düsenreinigungsbehälter 34 und eine Ablauföffnung 35. Da es erforderlich ist, jede in das Reaktionsgefäß 33 über­ führte Probe zu waschen, wird ein Überlaufsystem verwendet, bei dem Waschflüssigkeit aus der Düsenspitze so ausgegeben wird, daß sie vom Boden des Reaktionsgefäßes hochläuft und oben automatisch überläuft. Der Wascheffekt wird durch Her­ stellen eines Flusses in einer Richtung, wie beschrieben, verstärkt. Ein thermostatischer Block 80 mit einem Heizer 94 ist eingebaut. Das Reaktionsgefäß 33 ist auch dazu vorgese­ hen, als Mischbehälter zu dienen. Das Reaktionsgefäß 33 wird durch den thermostatischen Block 80 auf konstanter Tempera­ tur im Bereich zwischen 40 Grad und 50 Grad Celsius (z. B. auf 45 Grad Celsius) gehalten, um die Reaktion zu fördern.

Die thermostatische Anordnung zielt darauf hin, die Reprodu­ zierbarkeit der Reaktionsbedingungen zu verbessern. Das De­ sign dient dazu, die Reaktionsbedingungen zu jeder Jahres- oder Tageszeit konstant zu halten, so daß die erhaltenen Da­ ten jeweils im selben Licht betrachtet werden können. Der Grund zum Aufrechterhalten kontanter Temperatur bei etwa 40 Grad bis 50 Grad Celsius ist der folgende. Zunächst ist zu beachten, daß eine Temperatur von mindestens 40 Grad Celsius aufrechterhalten wird, da die Temperatur des Raums, in dem die Vorrichtung angeordnet ist, zwischen 15 und 35 Grad Celsius liegen kann, so daß die Temperatureinstellung (über 40 Grad Celsius) für stabile Steuerung der Reaktion erforderlich ist, da die Möglichkeit besteht, daß sich die Temperatur in der Vorrichtung noch über dem angenommenen Temperaturbereich von 15 Grad bis 35 Grad Celsius hinaus er­ höht. Was ein Einstellen der Temperatur unter 50 Grad Cel­ sius betrifft, ist anzumerken, daß, obwohl die Reaktionsge­ schwindigkeit mit steigender Temperatur gefördert wird, eine Temperatur von über 50 Grad Celsius zu Verfälschung der Probe führen kann, so daß diese Temperatureinstellung (unter 50 Grad Celsius) beabsichtigt, das Auftreten solcher Ver­ fälschung der Probe zu vermeiden, und um darüber hinaus die Bedienperson vor Verbrennungen zu schützen, wenn diese die Reaktionsvorrichtung berühren sollte.

Wie aus Fig. 4 ersichtlich, ist das Probengestell 27 recht­ eckig, und in ihm sind Probenbehälteraufnahmelöcher 70 aus­ gebildet, die regelmäßig in Zeilen mit 10 Spalten angeordnet sind. Diese Anordnung dient dazu, einfaches Zählen der Pro­ benanzahl durch die Bedienperson zu ermöglichen. Beim Aus­ führungsbeispiel gemäß Fig. 4 liegen die Probenbehälterauf­ nahmelöcher in 5 Zeilen mit jeweils 10 Löchern vor. Der Ab­ stand der Löcher in Zeilenrichtung y zwischen benachbarten Löchern ist 15 bis 25 mm. Dieses Intervall ist so gewählt, daß es der Bedienperson möglich ist, leicht mit den Fingern auf einen Probenbehälter zuzugreifen, um diesen in das Pro­ bengestell zu stecken oder aus ihm herauszunehmen. Was die Größe des Probengesells 27 anbetrifft, ist festzustellen, daß eine kleinere Größe die Handhabbarkeit verbessert. Aus diesem Grund wird der Abstand x zwischen benachbarten Lö­ chern in Spaltenrichtung kleiner gemacht als der Abstand y, z. B. 12 mm.

Die Fig. 6 und 7 zeigen allgemein das äußere Erscheinungs­ bild und örtliche Beziehungen wesentlicher Teile der Vor­ richtung des Ausführungsbeispiels gemäß Fig. 1. Dieser Cate­ cholaminkatalysator ist von vertikalem Typ und beinhaltet alle Einheiten, die zur Analyse erforderlich sind.

Die Vorrichtung ist in zwei Stufen unterteilt. In der oberen Stufe sind der automatische Probennehmer 26, das Fluores­ zenzphotometer 54 und eine Zeilenkonsole 72 angeordnet. Auf der Säulenkonsole 72 sind die Vorsäule 48, die Trennsäule 53, das Probeneinführventil 47 und das Probenumschaltventil 52 angebracht. Die Temperatur der Trennsäule 43 wird durch einen thermostatischen Block 73 geregelt, der dazu dient, die Temperatur während der Analyse auf einem vorgegebenen Wert konstant zu halten. Anbringen und Wegnehmen des Proben­ gestells 27 am bzw. vom automatischen Probengeber 26 erfolgt durch Öffnen oder Schließen eines Deckels 75. Ein Floppy- Disk-Laufwerk 57 zum Speichern von Untersuchungsdaten ist oberhalb des Fluoreszenzphotometers 54 angeordnet.

In der unteren Stufe der Vorrichtung sind der Reinigungs­ flüssigkeitstank 42, ein Tank 45 für Transport- und Reini­ gungsflüssigkeit, ein Eluierlösungstank 50, die Ladepumpe 41, die Pumpe 46 für Transport- und Reinigungsflüssigkeit und die Pumpe 51 zum Fördern der Eluierlösung angebracht. Die für die Analysiereinheiten in der oberen Stufe der Vor­ richtung erforderlichen Flüssigkeiten werden von der unte­ ren Stufe bereitgestellt. Im hinteren Teil der unteren Stufe der Vorrichtung ist eine elektrische Einheit 76 mit einer Spannungsquelle, Platinen usw. vorhanden. Oben auf der Vor­ richtung sind ein Drucker 57, eine Kathodenstrahlröhre 58 und eine Bedienkonsole 57 angeordnet, die das Eingeben von Bedienfunktionen zur Analyse für die Vorrichtung gestattet.

Fig. 8 zeigt ein Blockschaltbild des Steuersystems beim vor­ liegenden Ausführungsbeispiel der Erfindung. Das Steuern der Analyseabläufe der Vorrichtung erfolgt mit einer Steuerein­ heit 56 als Mittelpunkt des Systems auf das Erhalten von Eingangssignalen über die Bedienkonsole 77 hin. Wenn der Spannungsversorgungsschalter eingeschaltet wird, wird eine Temperatursteuerungseinrichtung 78 aktiviert, und die Licht­ quelle des Fluoreszenzphotometers 54 wird eingeschaltet. An­ schließend wird ein Standardanalysenschalter betätigt, um die Pumpen 46 und 51 dazu zu veranlassen, Flüssigkeiten zu liefern. Nach dem Aufstellen des Probengestells 27 an seinem Ort am automatischen Probennehmer 26 wird ein Analyse­ startschalter betätigt, um den automatischen Probennehmer 26, das Probeneinführventil 47 und das Zeilenumschaltventil 52 zu aktivieren, um damit die Abfolge analytischer Funk­ tionen zu starten, die entsprechend der Vorgehensweise er­ folgen, wie sie oben anhand der Fig. 2 und 3 erläutert wur­ den. Das Untersuchungsergebnis wird als Signal vom Fluores­ zenzphotometer 54 über den A/D-Wandler 55 in die Steuerein­ heit 56 übertragen, wo die Signale eine Datenverarbeitung unterlaufen. Die erhaltene Information wird durch den Drucker 57 ausgedruckt und auf der Kathodenstrahlröhre 58 angezeigt.

Fig. 9 zeigt ein Beispiel eines Analyseergebnisses für Cate­ cholamine mit dem oben beschriebenen System. Der an jedem Peak angegebene numerische Wert gibt die Zurückhaltezeit an, also diejenige Zeitspanne, die zwischen dem Beginn der Tren­ nung und dem Durchlaufen des abgetrennten Bestandteils durch den Detektor vergeht. Beim vorliegenden System beginnt die Trennung zu dem Zeitpunkt, zu dem das Säulenumschaltventil 52 so umgeschaltet wird, daß das Übertragen der angerei­ cherten Probe von der Vorsäule 48 in die Trennsäule 53 be­ gonnen wird. Der erste Peak bei 0,48 Sekunden entspricht dem Durchlaufen von Transportflüssigkeit, wie sie sich in der Vorsäule ansammelte, was vor dem Ermitteln abgetrennter und eluierter Probenbestandteile erfolgt. Dann werden die durch die Trennsäule 53 getrennten Bestandteile in der Rei­ henfolge Norepinephrin (NE), Epinephrin (E) und Dopamin (DA) eluiert, und schließlich wird die interne Bezugssub­ stanz, Isoproterenol, die als interne Bezugslösung zuge­ führt wurde, eluiert und festgestellt. Die Konzentration jedes Bestandteils ist durch die Fläche des jeweils zugehö­ rigen Peaks bestimmt.

Bei diesem Analysebeispiel wurde die Trennung nach dem ange­ gebenen Schema in etwas mehr als 4 Minuten nach dem Start der Trennung abgeschlossen, also nach dem Umschalten des Zeilenumschaltventils 52. Damit ermöglicht dieses Analyse­ beispiel eine Probentrennung innerhalb von 5 Minuten pro Probe, wie oben erläutert.

Wenn dieses Analysesystem verwendet wird, können die Proben­ nummern und Signale und Konzentrationsergebnisse zu den drei analysierten Bestandteilen durch denDrucker 57 ausgedruckt werden. Ein Chromatogramm gemäß Fig. 9 kann, falls er­ wünscht, auf der Kathodenstrahlröhre angezeigt oder ausge­ druckt werden.

Beim vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiel der Erfin­ dung wird eine einzige Vorsäule verwendet. Es besteht aber auch die Möglichkeit, mehrere Säulen einzusetzen. Es werden z. B. zwei Vorsäulen verwendet, die hintereinander geschaltet werden, um die Arbeiten des Entfernens wasserlöslicher Ver­ unreinigungen bzw. hydrophober Verunreinigungen voneinander zu trennen.

Die Fig. 10, 11 und 12 veranschaulichen unterschiedliche Möglichkeiten zum Ausführen der Reaktion zum Umwandeln von Catecholaminen in einer Probe in Derivate.

Beim ersten abgeänderten Beispiel gemäß Fig. 10 werden zwei Reaktionsgeräte verwendet. In diesem Fall sind zwei Reak­ tionsgefäße 79a und 79b am automatischen Probennehmer vor­ handen, von denen jedes eine Temperaturregelung durch einen thermostatischen Block 80 erfährt. Beim Reinigen der Reak­ tionsgefäße läßt man die überlaufende Reinigungsflüssigkeit in eine Abflußöffnung 81 ablaufen. Dieses System wird zweck­ mäßigerweise dann verwendet, wenn der Ablauf zum Bilden von Derivaten mit einem automatischen Probennehmer (also die Ab­ läufe des ersten oben beschriebenen Schritts) längere Zeit in Anspruch nehmen, als es der für einen Zyklus beabsichtig­ ten Zeit entspricht. Ein solcher Fall tritt z. B. auf, wenn die Reaktion viel Zeit in Anspruch nimmt. Gemäß diesem System ist es möglich, das Behandeln einer Probe innerhalb einem Ablaufzyklus abzuschließen, indem zwei Sätze von Pro­ ben und Reagens in die zwei Reaktionsgefäße abwechselnd eingegeben werden und jeweils eine Probe mit fortgeschrit­ tener Reaktion im Zeitintervall eines Zyklus zugeführt wird. Wenn die Reaktionszeit mehr als das Doppelte der Perioden­ dauer eines Zyklus beansprucht, kann es ausreichen, die Anzahl von Reaktionsgefäßen zu erhöhen. In jedem Fall werden die Reaktionsgefäße wiederholt periodisch verwendet.

Die erste Änderung beinhaltet eine andere Nutzungsmöglich­ keit. Das heißt, eines (79a) der beiden Reaktionsgefäße wird als Mischgefäß verwendet, und jedesmal dann, wenn der Misch­ vorgang abgeschlossen ist, wird die gemischte Lösung in das andere Reaktionsgefäß 79b übertragen. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, daß die Reproduzierbarkeit der Reak­ tion in vorteilhafter Weise aufrechterhalten werden kann, da die Ablauffolge, die Mischbedingungen und die Reaktions­ bedingungen einschließlich der Reaktionstemperatur mit gere­ gelten Verhältnissen betrieben werden.

Fig. 11 zeigt ein zweites abgeändertes Ausführungsbeispiel, bei dem die Reaktion in der dem Probeneinlaßventil zugeord­ neten Dosierleitung ausgeführt wird. Ein Behälter 82 auf dem automatischen Probennehmer wird als Mischbehälter zum Mi­ schen der Probe und des Reagens verwendet. Die Lösung, in der die Probe und das Reagens zu reagieren beginnen, sobald sie gemischt sind, wird über die Entladeöffnung 36 durch die Entladedüse 38 in die Dosierleitung 83 übertragen. In der Dosierleitung 83 wird die Lösung für eine vorgegebene Zeitspanne in ruhendem Zustand gehalten, und es wird ihr ermöglicht, zu reagieren. Die Dosierleitung 83 wird durch einen thermostatischen Block 84 auf fester Temperatur gehal­ ten. Weiterhin ist ein Sperrventil 85 im Entladekanal vor­ handen, um es zu ermöglichen, daß die Lösung während der Reaktion stillsteht. Dieses System kann für langdauernde Reaktionen nicht verwendet werden, da die Reaktionszeiten nach oben hin durch das Betätigungsintervall des Probenein­ führventils 47 begrenzt ist. Wenn die Dosierleitung 83 durch Aufwickeln einer Leitung aus synthetischem Kunst­ stoff oder dergleichen gebildet wird, hat dieses System die Vorteile einfacher Temperatursteuerung und eines hohen Frei­ heitsgrades in der räumlichen Anordnung. Zum Beispiel kann die Trennsäule im thermostatischen Block integriert werden.

Die Fig. 13A und 13B zeigen Beispiele für ein Ablaufprogramm unter Nutzen des zweiten geänderten Ausführungsbeispiels ge­ mäß Fig. 11. Dieses Programm ist, wie dasjenige des vorigen Beispiels gemäß Fig. 3 grob in drei Schritte unterteilt, wo­ bei Schritt 1 die Abläufe am automatischen Probennehmer für die Derivatbildung, Schritt 2 die Anreicherungsarbeit durch die Vorsäule und Schritt 3 die Trenn- und Bestimmungsfunk­ tionen durch die Trennsäule beinhaltet. Die Grenzen der Abläufe zwischen den jeweiligen Schritten unterscheiden sich jedoch leicht von denjenigen des Programms von Fig. 3. Beim vorliegenden Programm endet der erste Schritt mit dem Einführen der Probenlösung in die Dosierleitung 83 über das Probeneinführventil 47. Der zweite Schritt beginnt mit dem Einleiten der Reaktion in der Dosierleitung und endet mit der Anreicherung der Probe durch die Vorsäule. Der dritte Schritt beginnt mit dem Übertragen der Probe in die Trenn­ säule. Es kann also auch beim Beispiel gemäß Fig. 11 jeder Analyseablauf grob in drei Typen von Arbeiten untergliedert werden, nämlich die Arbeiten durch den automatischen Proben­ nehmer, die Arbeiten durch die Vorsäule und die Arbeiten durch die Trennsäule. Die jeweiligen Arbeiten können ent­ sprechend dem Programm synchron und kontinuierlich an den zu analysierenden Proben ausgeführt werden, und sie können wiederholt werden.

Das dritte Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 12 betrifft ein System, bei dem eine Reaktionsschlange 87 entlang des Durch­ flußwegs von der Probeneinführöffnung 36 zum Probeneinführ­ ventil 47 angeordnet ist. Die Probenlösung wird in diese Reaktionsschlange zum Durchführen der Reaktion eingeführt, wonach das Probeneinführventil umgeschaltet wird, um die Probenlösung nach Abschluß der Reaktion in die Dosierlei­ tung 49 zu überführen. Dann wird das Ventil 47 wieder so umgeschaltet, daß es die Lösung in die Analysiereinheit führt. Dieses System läßt eine viel größere Zeitreserve für die Reaktion als die vorstehend beschriebene Änderung zu, ist jedoch im Ablauf komplizierter, da die Probenlösung in zwei Stufen übertragen werden muß.

Vorstehend wurde die Erfindung anhand von Beispielen für einen automatischen Analysator für Catecholamine beschrie­ ben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele begrenzt. Sie kann vielmehr auf die Analyse unterschied­ lichster Arten von Substanzen neben Catecholaminen einge­ setzt werden, wie z. B. zur Analyse von Aminosäuren, Gallen­ säure, Guanidin usw. Was das Verfahren zum Herstellen eines Derivats und einen Detektor für die Messung betrifft, wird zwar vorstehend ein Verfahren unter Nutzung eines Fluores­ zenzphotometers beschrieben, jedoch ist es möglich, andere Analyseverfahren zu verwenden, die ein UV-Photometer oder ein solches für sichtbares Licht nutzen, entsprechend einer enzymatischen oder UV-Aktivierungstechnik. Darüber hinaus kann die Derivatbildung bei konkreten Verfahren auch abge­ ändert werden, z. B. nach Reaktionsort, Schritten des Be­ dienablaufs oder Zusammensetzung des Programms.

Wie vorstehend beschrieben, ermöglicht es die vorliegende Erfindung, Vormarkierungsbehandlungen bei Flüssigphasen­ chromatographie mit ausgezeichneter Reproduzierbarkeit aus­ zuführen. Die Erfindung trägt zur Automatisierung von Unter­ suchungsarbeiten bei.

Claims (16)

1. Flüssigphasenchromatographie-Analysator, gekennzeichnet durch

• i) einen Reaktionsausführungsbereich mit einem Reaktionsge­ fäß (33) mit einer Heizeinrichtung (80), einer Probenein­ führöffnung (36), durch die eine Probe eingeführt wird, und einer Saug- und Entladedüse (38), die in drei Dimensionen frei beweglich ist,
• ii) ein Probengestell (27) zum Haltern von Proben, die zu analysierende Bestandteile enthalten, und eines Vormarkie­ rungsreagens für die Bestandteile, welches Gestell abnehmbar im Reaktionsausführungsbereich angeordnet ist,
• iii) eine Trennsäule (53) zum Auftrennen der Probe in die vormarkierten Bestandteile zum Analysieren derselben und
• iv) einen Detektor (54) zum Ermitteln der getrennten Be­ standteile,
  • - wobei das Reaktionsgefäß dazu dient, das Vormarkierungs­ reagens mit der vom Probengestell zugeführten Probe für eine vorgegebene Zeitspanne zur Reaktion zu bringen, um ein Reaktionsgemisch zu erhalten,
  • - und wobei die Saug- und Entladedüse dazu dient, das Reak­ tionsgemisch über die Probeneinführöffnung zur Trennsäule zu leiten.

2. Analysator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur des Reaktionsgefäßes (33) auf 40 Grad bis 50 Grad Celsius eingestellt wird.

3. Analysator nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktionsausführungsbereich einen Abschnitt zum Aufnehmen des Probengestells aufweist, der auf eine Temperatur von 4 Grad bis 17 Grad Celsius eingestellt wird.

4. Analysator nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Probengestell (27) Probenbehälter- Haltebereiche (70) und einen Bereich zum Halten eines Behäl­ ters (30) für das Vormarkierungsreagens aufweist.

5. Analysator nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenbehälter-Haltebereiche Zeilen mit jeweils 10 Lö­ chern (70) aufweisen.

6. Analysator nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand in Zeilenrichtung der Löcher größer ist als der Abstand in Spaltenrichtung und der Abstand in Zeilenrichtung 15 bis 25 mm beträgt.

7. Analysator nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeich­ net durch eine Dosierleitung (83) zwischen der Probenein­ führöffnung (36) und der Trennsäule (53), und durch eine Flußumschalteinrichtung (47) zum Verbinden der Probenein­ führöffnung mit der Dosierleitung beim Einführen der Probe.

8. Flüssigphasenchromatographie-Analysator, gekennzeichnet durch

• - ein Mischgefäß (33, 79a) zum Mischen einer Probe und eines Vormarkierungsreagens zum Erhalten eines Lösungsgemisches,
• - eine Probeneinführöffnung (36), durch die das Lösungsge­ misch zugeführt wird,
• - eine Vorsäule (48) zum Aufnehmen des eingeführten Lösungs­ gemischs und zum Anreichern der Lösung, um eine angerei­ cherte Lösung zu erhalten,
• - eine Trennsäule (53) zum Auftrennen der konzentrierten Lösung in ihre Bestandteile,
• - eine Saug- und Entladedüse (38) zum Zuführen des Lösungs­ gemischs zur Säule durch die Probeneinführöffnung,
• - einen Durchflußkanal (87) zwischen der Probeneinführöff­ nung und der Vorsäule, dessen Temperatur auf einen vorge­ gebenen Wert eingestellt wird,
• - und eine Einrichtung (85) zum Aufhalten des Flusses der Mischflüssigkeit im Durchflußkanal für eine vorgegebene Zeitspanne, um die Vormarkierungsreaktion zwischen der Probe und dem Vormarkierungsagens hervorzurufen.

9. Analysator nach Anspruch 8, gekennzeichnet durch eine Einrichtung (52) zum Ausführen der Schritte des Festhaltens des eingeführten Lösungsgemischs und des Anreicherns der Lösung zum Erhalten einer angereicherten Lösung in der Vor­ säule und zum Hervorrufen der Vormarkierungsreaktion zwi­ schen den Bestandteilen der Probe und dem Vormarkierungsrea­ gens im Durchflußkanal neben dem Schritt des Trennens einer konzentrierten Lösung in der Säule.

10. Probenzuführung, gekennzeichnet durch

• - eine Probeneinführöffnung (36), durch die eine Probe ein­ geführt wird,
• - mindestens ein Gefäß (73, 79a) zum Mischen der Probe, wel­ ches Gefäß mit einer Heizeinrichtung (80) ausgestattet ist,
• - einen Aufnahmebereich für ein Probengestell (27) mit einer Kühleinrichtung,
• - und eine Einrichtung zum Zuführen einer Reinigungsflüssig­ keit in das Gefäß,
• - wobei der Aufnahmebereich für das Probengestell und das Gefäß thermisch voneinander isoliert (33) sind.

11. Probenzuführung nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch eine Ablauföffnung (35) zum Ausgeben genutzter Flüssigkeit, wobei die Probeneinführöffnung (35), das Gefäß (30) und die Abflußöffnung entlang einer geraden Linie angeordnet sind.

12. Probenzuführung nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch

• - ein Probengestell (27) zum Tragen einer Probe und von Rea­ genzien, wie sie zur Analyse verwendet werden, welches Ge­ stell im Aufnahmebereich für das Aufnahmegestell angeord­ net wird,
• - und eine Saug- und Entladedüse (38) zum Zuführen der Probe und der Reagenzien, wie sie vom Gestell gehalten werden, zum Gefäß (33), welche Düse auch als Einrichtung zum Zu­ führen von Waschflüssigkeit zum Gefäß dient.

13. Catecholamin-Analysator, gekennzeichnet durch

• - einen nichtbeweglichen Teil mit einer Probeneinführöffnung (36),
• - ein Gefäß (33) mit einer Heizeinrichtung (80),
• - ein Gestellanbringungsbereich,
• - ein Probengestell (27) zum Tragen von Proben und eines Reagens zum Umwandeln von Catecholaminen in Derivate, wel­ ches Gestell im Aufnahmebereich für das Gestell angeordnet wird,
• - eine Einrichtung zum Übertragen der Probe und des Reagens im Gefäß durch eine Saug- und Entladedüse (38) innerhalb einer vorgegebenen Zeitspanne ab dem Beginn der Markie­ rungsreaktion der Catecholamine,
• - eine Vorsäule (48) zum Festhalten der markierten Catecho­ lamine, wie sie über die Probeneinführöffnung zugeführt werden,
• - eine Trennsäule (53) zum Auftrennen der von der Vorsäule zugeführten Catecholaminprobe in ihre Bestandteile,
• - und einen Fluoreszenzdetektor (54), der stromabwärts von der Säule angeordnet ist.

14. Verfahren zur Vormarkierungsbehandlung mit den Schritten des Vormarkierens von Bestandteilen in einer Probe, des Auf­ trennens der markierten Bestandteile und des Ermittelns der Bestandteile, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Vormarkierens folgende Unterschritte aufweist

• - Einsetzen eines Aufnahmegestells in eine vorgegebene Stel­ le eines Gehäuseteils einer Markiereinrichtung mit einem Mischgefäß mit einer Heizeinrichtung und einem Aufnahme­ teil für ein Probengestell,
• - Einleiten der Vormarkierungsreaktion durch Übertragen einer Probe und eines Vormarkierungsreagens in das Misch­ gefäß mit Hilfe einer Saug- und Entladedüse,
• - und Übertragen der vormarkierten Reaktionsmischung in eine Probeneinführöffnung, die in einen Durchflußkanal mit einer Trennsäule führt.

15. Flüssigphasenchromatographie-Analysator zum Analysieren einer Bestandteile enthaltenden Probe, dadurch gekennzeich­ net, daß er zum Analysieren die Probe mit einem Vormarkie­ rungsreagens zur Reaktion bringt, um eine Reaktionsmischung mit markierten Bestandteilen zu erhalten, das Reaktionsge­ misch anreichert, die markierten Bestandteile voneinander trennt und die voneinander getrennten markierten Bestandtei­ le durch einen Detektor ermittelt, wobei die Analyseschritte so durch eine Steuereinheit gesteuert werden, daß sie nebeneinander ablaufen, wodurch die Analysezeit pro Probe verringert wird, wozu der Analysator folgende Funktionsgrup­ pen aufweist

• a) eine Einrichtung (27) zum Lagern bei konstanter Tempera­ tur von Proben, die zu analysierende Bestandteile enthalten, und eines Vormarkierreagens,
• b) eine Einrichtung (33), um die Probe mit dem Vormarkie­ rungsreagens bei konstanter Temperatur zur Reaktion zu brin­ gen, um eine Reaktionsmischung zu erhalten, die markierte Bestandteile enthält,
• c) eine Einrichtung (38) zum Übertragen der Proben und des Vormarkierreagens von der Einrichtung (a) zur Einrichtung (b),
• d) eine Einrichtung (48, 53) zum Anreichern der Reaktions­ mischung und zum Trennen der markierten Bestandteile vonein­ ander,
• e) eine Einrichtung (54) zum Ermitteln der voneinander ge­ trennten markierten Bestandteile, und
• f) eine Einrichtung (56) zum Steuern der Analyseschritte so, daß sie nebeneinander ablaufen, wodurch die Analysezeit pro Probe verkürzt wird.

16. Verfahren zum Analysieren von Catecholaminen, gekenn­ zeichnet durch folgende Schritte

• - Lagern von Proben, die Catecholamine enthalten, und eines Vormarkierungsreagens für Catecholamine bei konstanter Temperatur,
• - Übertragen einer der Proben und des Vormarkierungsreagens mit Hilfe einer frei in drei Dimensionen beweglichen Saug- und Entladedüse in ein auf konstanter Temperatur gehalte­ nes Gefäß,
• - Ausführen der Reaktion der Probe mit dem Vormarkierungs­ reagens im Gefäß, um eine Reaktionsmischung zu erhalten die markierte Bestandteile enthält,
• - Anreichern der Reaktionsmischung und Trennen der markier­ ten Bestandteile voneinander in einer Säule,
• - und Ermitteln der voneinander getrennten markierten Be­ standteile durch einen Detektor,
• - wobei die Analyseschritte durch eine Steuerungseinheit so gesteuert werden, daß sie nebeneinander ablaufen, wodurch die Analysezeit pro Probe verkürzt wird.