JPH03134560A - 液体クロマトグラフ分析計およびプレラベル反応処理方法 - Google Patents
液体クロマトグラフ分析計およびプレラベル反応処理方法Info
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- JPH03134560A JPH03134560A JP27166789A JP27166789A JPH03134560A JP H03134560 A JPH03134560 A JP H03134560A JP 27166789 A JP27166789 A JP 27166789A JP 27166789 A JP27166789 A JP 27166789A JP H03134560 A JPH03134560 A JP H03134560A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、液体クロマトグラフィーを適用する分析計お
よびその分析計のための試料の処理方法に係り、特に成
分分離する前に試料をラベル化するのに好適な装置およ
び方法に関する。
よびその分析計のための試料の処理方法に係り、特に成
分分離する前に試料をラベル化するのに好適な装置およ
び方法に関する。
液体クロマトグラフは、溶液状態で成分を分離した後、
特定成分を選択的に分析できるのが特徴で、臨床検査の
分野においても重要な分析項目が多い。しかし、一方に
おいて分析手段が複雑で分析に時間がかかるものが多く
、それが臨床検査など多数の検体を限られた時間内で処
理しなければならないルチーンヮークの業務における分
析検体数の増加をはばんでおり、この種の自動機の悼及
が遅れている原因になっている。
特定成分を選択的に分析できるのが特徴で、臨床検査の
分野においても重要な分析項目が多い。しかし、一方に
おいて分析手段が複雑で分析に時間がかかるものが多く
、それが臨床検査など多数の検体を限られた時間内で処
理しなければならないルチーンヮークの業務における分
析検体数の増加をはばんでおり、この種の自動機の悼及
が遅れている原因になっている。
このようなルチーンワークへの適用が遅れている分析項
目としてカテコールアミン類の分析が挙げられる。カテ
コールアミン類は、細胞腫、′＃環器、脳神経系、内分
秘代謝などの異常やストレスなどの診断に有効性が認め
られ、成人病集団検診の場合の重要項目として注目され
ている。
目としてカテコールアミン類の分析が挙げられる。カテ
コールアミン類は、細胞腫、′＃環器、脳神経系、内分
秘代謝などの異常やストレスなどの診断に有効性が認め
られ、成人病集団検診の場合の重要項目として注目され
ている。
カテコールアミン類を液体クロマトグラフィーで分離分
析する場合には、試料と蛍光ラベル剤を反応させ、蛍光
光度計によって測定するのが一般的である。ラベル化の
方法としては、分離カラムによる成分分離の前にラベル
剤と反応させるプレラベル法と分離カラムによって成分
分離した後にラベル剤と反応させるポストラベル法が知
られているが、ボストラベル法では分離カラム溶出後の
成分の拡散が大となるので高感度検出が困難であり、生
体試料中の微量成分を測定する場合にはプレラベル法が
有利である。
析する場合には、試料と蛍光ラベル剤を反応させ、蛍光
光度計によって測定するのが一般的である。ラベル化の
方法としては、分離カラムによる成分分離の前にラベル
剤と反応させるプレラベル法と分離カラムによって成分
分離した後にラベル剤と反応させるポストラベル法が知
られているが、ボストラベル法では分離カラム溶出後の
成分の拡散が大となるので高感度検出が困難であり、生
体試料中の微量成分を測定する場合にはプレラベル法が
有利である。
カテコールアミン類をプレラベル法によってラベル化（
誘導体化）し、クロマトグラフィー分析する先行技術と
して、特開昭６１−８１１１１４８号および特開昭６０
−１４３７６６号に記載された方法が知られている。
誘導体化）し、クロマトグラフィー分析する先行技術と
して、特開昭６１−８１１１１４８号および特開昭６０
−１４３７６６号に記載された方法が知られている。
この内、特開昭６１−８８１４８号では、試料にアルミ
ナを添加してアルミナにカテコールアミンを吸着させ、
吸着中にダンシル・クロリドを反応させてカテコールア
ミンを誘導体化している。次いでアルミナから誘導体化
された試料を脱着させ液を蒸発濃縮する。このようにし
て準備された試料を液体クロマトグラフの流路内へ注入
して成分分離し蛍光を検出する。
ナを添加してアルミナにカテコールアミンを吸着させ、
吸着中にダンシル・クロリドを反応させてカテコールア
ミンを誘導体化している。次いでアルミナから誘導体化
された試料を脱着させ液を蒸発濃縮する。このようにし
て準備された試料を液体クロマトグラフの流路内へ注入
して成分分離し蛍光を検出する。
また、特開昭６０−１４３７７６号では、血漿や尿など
の生体試料を流路内に注入したあと、その流路内に３種
の反応試薬を次々と導入し反応コイル内を流通させなか
らカテコールアミンをラベル化（誘導体化）している。
の生体試料を流路内に注入したあと、その流路内に３種
の反応試薬を次々と導入し反応コイル内を流通させなか
らカテコールアミンをラベル化（誘導体化）している。
このように処理した試料を濃縮カラムで捕捉濃縮した後
、分離カラムへ移送し成分分離して蛍光を検出する。
、分離カラムへ移送し成分分離して蛍光を検出する。
上述した特開昭６１−８８１４８号による方法では。
液体クロマトグラフの流路内に注入すべき試料を準備す
るための操作に時間がかかり、且つ自動化が困難なため
に臨床検査などのルチーンワークには不向きである。ま
た、特開昭６０−１４３７６６号による方法では、試薬
および試料をキャリヤ液流路内にそれぞれ導入したあと
、反応コイル内で試料を流通させながら試薬を混合させ
るため、長い反応コイルを必要とするばかりでなく、試
料が十分に誘導体化されるまでの時間が長くかかるとい
う問題を有する。また、これらの先行技術では、導入前
の試料の冷却については配慮されていない。
るための操作に時間がかかり、且つ自動化が困難なため
に臨床検査などのルチーンワークには不向きである。ま
た、特開昭６０−１４３７６６号による方法では、試薬
および試料をキャリヤ液流路内にそれぞれ導入したあと
、反応コイル内で試料を流通させながら試薬を混合させ
るため、長い反応コイルを必要とするばかりでなく、試
料が十分に誘導体化されるまでの時間が長くかかるとい
う問題を有する。また、これらの先行技術では、導入前
の試料の冷却については配慮されていない。
本発明の目的は、試料の誘導体化反応を確実に行うこと
ができるようにすることにある。
ができるようにすることにある。
本発明の他の目的は、反応中の試料に対する温度変化の
影響を低減できるように装置を構成することにある。
影響を低減できるように装置を構成することにある。
本発明のもう１つの目的は、多数の試料の取扱いを容易
にすることにある。
にすることにある。
本発明における解決手段の１つは、加温される反応容器
と試料注入ポートが配設された反応処理部を設け、この
反応処理部に対し着脱可能なサンプルラックを設け、上
記反応容器内で試薬とサンプルラックからの試料との反
応が開始されてから所定時間後に吸排ノズルによって上
記反応容器内の液を上記試料注入ポートに移すようにし
たものである。この場合１反応容器の代りに、混合容器
と所定温度に加温される反応維持流路を用いることもで
きる。
と試料注入ポートが配設された反応処理部を設け、この
反応処理部に対し着脱可能なサンプルラックを設け、上
記反応容器内で試薬とサンプルラックからの試料との反
応が開始されてから所定時間後に吸排ノズルによって上
記反応容器内の液を上記試料注入ポートに移すようにし
たものである。この場合１反応容器の代りに、混合容器
と所定温度に加温される反応維持流路を用いることもで
きる。
本発明における別の観点の解決手段は、試料にプレラベ
ル化処理をしてラベル化された試料を分離カラムで成分
分離し検出する方法において、プレラベル化処理が、加
温される混合用容器とサンプルラック収納部を有するラ
ベル化装置本体に、サンプルラックが収納されたあと、
吸排ノズルで上記混合用容器に試料およびラベル剤を添
加してプレラベル化反応を開始する工程と、上記混合用
容器内の試料を吸排ノズルによって分離カラムを有する
流路への試料注入ポートに移す工程を含むようにしたも
のである。
ル化処理をしてラベル化された試料を分離カラムで成分
分離し検出する方法において、プレラベル化処理が、加
温される混合用容器とサンプルラック収納部を有するラ
ベル化装置本体に、サンプルラックが収納されたあと、
吸排ノズルで上記混合用容器に試料およびラベル剤を添
加してプレラベル化反応を開始する工程と、上記混合用
容器内の試料を吸排ノズルによって分離カラムを有する
流路への試料注入ポートに移す工程を含むようにしたも
のである。
物理的性質の似た複数成分が共存するカテコールアミン
類を含む生体試料では、個々の成分をクロマトグラフィ
ーで分離して測定することが有効である。カテコールア
ミン類では、エピネフリン。
類を含む生体試料では、個々の成分をクロマトグラフィ
ーで分離して測定することが有効である。カテコールア
ミン類では、エピネフリン。
ノルエピネフリン、ドーパミンなどが共存しているので
、これらをクロマトグラフィー分離すれば個々の成分濃
度を求めることが可能となる。
、これらをクロマトグラフィー分離すれば個々の成分濃
度を求めることが可能となる。
しかし、カテコールアミン類は、そのままの状態では検
出することが困難であるので、本発明ではクロマトグラ
フィー分離カラムで成分分離する前に、試料にラベル剤
を反応させて誘導体化し、その後検出精度を低下させる
ような夾雑物や過剰の反応試薬などの不要物をプリカラ
ムで除去し、次いで、誘導体化されている試料を分離カ
ラムに導入して成分分離し、分離カラムからの流出物を
検出器で検出する。例えば誘導体化のために蛍光ラベル
剤を用いる場合には、検出器として蛍光検出器を用い、
被検成分が誘導体化によって得た性質を検出に利用する
。検出器はラベル化の態様によって吸光光度計や電導度
検出器など種々のものから選択される。
出することが困難であるので、本発明ではクロマトグラ
フィー分離カラムで成分分離する前に、試料にラベル剤
を反応させて誘導体化し、その後検出精度を低下させる
ような夾雑物や過剰の反応試薬などの不要物をプリカラ
ムで除去し、次いで、誘導体化されている試料を分離カ
ラムに導入して成分分離し、分離カラムからの流出物を
検出器で検出する。例えば誘導体化のために蛍光ラベル
剤を用いる場合には、検出器として蛍光検出器を用い、
被検成分が誘導体化によって得た性質を検出に利用する
。検出器はラベル化の態様によって吸光光度計や電導度
検出器など種々のものから選択される。
オートサンプラ又はラベル化装置とも称される試料供給
装置は、非可動部およびサンプルラックを備えている。
装置は、非可動部およびサンプルラックを備えている。
サンプルラックは非可動部に対して着脱可能である。非
可動部は、ラベル化装置本体又は反応処理部と称される
こともある。この非可動部には、試料注入ボート、混合
用容器又は反応容器、ドレインボートなどが配置される
。また、非可動部には、サンプルラック収容部又はサン
プルステージと称されるサンプルラック収納領域が設け
られており、通常４〜１７℃の範囲内の一定温度に維持
される。
可動部は、ラベル化装置本体又は反応処理部と称される
こともある。この非可動部には、試料注入ボート、混合
用容器又は反応容器、ドレインボートなどが配置される
。また、非可動部には、サンプルラック収容部又はサン
プルステージと称されるサンプルラック収納領域が設け
られており、通常４〜１７℃の範囲内の一定温度に維持
される。
混合用容器内で試料とラベル化試薬が混合されたあと、
その混合液を直ちに試料注入ポートに移す場合には、そ
の混合液は反応維持流路に導かれ、そこで反応が実質的
に完了するまでの所定時間移動しないように留められる
。この場合、混合用容器は特に昇温する必要がなく、反
応維持流路が所定温度に加温される。
その混合液を直ちに試料注入ポートに移す場合には、そ
の混合液は反応維持流路に導かれ、そこで反応が実質的
に完了するまでの所定時間移動しないように留められる
。この場合、混合用容器は特に昇温する必要がなく、反
応維持流路が所定温度に加温される。
混合用容器内で試料と試薬が混合されたあと、その容器
内で又は他の容器へ混合液を移してラベル化反応を進行
せしめる場合には、その容器が加温される。このときの
加温温度は４０〜５０℃の範囲内の一定温度とされる。
内で又は他の容器へ混合液を移してラベル化反応を進行
せしめる場合には、その容器が加温される。このときの
加温温度は４０〜５０℃の範囲内の一定温度とされる。
この場合、混合用容器又は他の容器は、反応容器と称さ
れる。
れる。
サンプルラック収納領域に着脱可能に収納されるサンプ
ルラックには、多数の試料容器装填穴の他にラベル化試
薬用容器収納部が形成される。試料および試薬は収納領
域上で冷却され得る。
ルラックには、多数の試料容器装填穴の他にラベル化試
薬用容器収納部が形成される。試料および試薬は収納領
域上で冷却され得る。
試料供給装置は、ノズル移動機構を備えており、吸排ノ
ズルに多様な動作をさせることができる。
ズルに多様な動作をさせることができる。
例えば、吸排ノズルは、試料容器から混合用容器への試
料の分注、試薬容器から混合用容器への試薬の分注、混
合用容器内の液の吸入および吐出の繰り返しによる攪拌
、混合液の試料注入ポートへの移送などである。混合用
容器には次々と新しい試料が分注されるから、洗浄が必
要となるが、そのための洗浄液は吸排ノズルを通して混
合用容器へ吐出される。
料の分注、試薬容器から混合用容器への試薬の分注、混
合用容器内の液の吸入および吐出の繰り返しによる攪拌
、混合液の試料注入ポートへの移送などである。混合用
容器には次々と新しい試料が分注されるから、洗浄が必
要となるが、そのための洗浄液は吸排ノズルを通して混
合用容器へ吐出される。
本発明においては、試料および試薬が同じ混合用容器内
に分注されるので、両者が混合された時点から反応開始
され１反応開始から試料注入ポー１〜へ移すまでの時間
を吸排ノズルの動作タイミングを制御することによって
正確に規定できる。混合は容器内でなされるので、均一
化が促進される。
に分注されるので、両者が混合された時点から反応開始
され１反応開始から試料注入ポー１〜へ移すまでの時間
を吸排ノズルの動作タイミングを制御することによって
正確に規定できる。混合は容器内でなされるので、均一
化が促進される。
試料として生体試料を用いる場合には、試料を冷却して
変質を防止する。一方、ラベル化反応を促進するために
は１反応容器を加温するのがよいが、この加温温度が試
料側の冷却によって影響されたのでは反応温度にバラツ
キが生じ反応条件が一定に保たれ麺い。本発明では、反
応容器がサンプルラックから離間されており、断熱材を
設けることも容易であるので、安定した反応条件が得ら
れる。また、サンプルラックは反応処理部から取り外す
ことができるので、分析計による操作を開始する前に、
他の場所でサンプルラックに試料や試薬を装、′ｔして
きて分析計へセットすることも、分析終了ｎ：の試料を
ラック毎持ち去ることも容易である。
変質を防止する。一方、ラベル化反応を促進するために
は１反応容器を加温するのがよいが、この加温温度が試
料側の冷却によって影響されたのでは反応温度にバラツ
キが生じ反応条件が一定に保たれ麺い。本発明では、反
応容器がサンプルラックから離間されており、断熱材を
設けることも容易であるので、安定した反応条件が得ら
れる。また、サンプルラックは反応処理部から取り外す
ことができるので、分析計による操作を開始する前に、
他の場所でサンプルラックに試料や試薬を装、′ｔして
きて分析計へセットすることも、分析終了ｎ：の試料を
ラック毎持ち去ることも容易である。
カテコールアミン類の誘導体化試薬としての蛍光ラベル
剤には、例えば１，２−ジフェニルエチレンジアミン（
ＤＰＥ）を用いることができる。
剤には、例えば１，２−ジフェニルエチレンジアミン（
ＤＰＥ）を用いることができる。
準備される蛍光ラベル剤溶液には、６０ｍＭのＤＰＥ、
２ｍＭのフェリシアン化カリウム、４０％のアセトニト
リルなどが含まれる。またカテコールアミン類を分離す
るために分離カラムに供給される溶離液は、例えばアセ
トニトリルとメタノールと水溶液を５：２：４の割合で
含む液が使用される。この場合水溶液には、５０ｍＭの
硝酸リチウムと１０ｍＭのドデシル硫酸ナトリウムが含
有されている。
２ｍＭのフェリシアン化カリウム、４０％のアセトニト
リルなどが含まれる。またカテコールアミン類を分離す
るために分離カラムに供給される溶離液は、例えばアセ
トニトリルとメタノールと水溶液を５：２：４の割合で
含む液が使用される。この場合水溶液には、５０ｍＭの
硝酸リチウムと１０ｍＭのドデシル硫酸ナトリウムが含
有されている。
本発明を適用したカテコールアミン自動分析装置の例を
図面を参照して以下に説明する６第１図は、カテコール
アミン自動分析装置の全体構成を示す概略図である。こ
の装置は、各種容器や分注機構を備えた試料供給部２６
と、流路系内で試料の濃縮動作や分離動作を行う濃縮・
分離部４４を有する。以下では、試料供給部２６を便宜
上オートサンプラと称し、濃縮・分離部４４を分析と称
する。
図面を参照して以下に説明する６第１図は、カテコール
アミン自動分析装置の全体構成を示す概略図である。こ
の装置は、各種容器や分注機構を備えた試料供給部２６
と、流路系内で試料の濃縮動作や分離動作を行う濃縮・
分離部４４を有する。以下では、試料供給部２６を便宜
上オートサンプラと称し、濃縮・分離部４４を分析と称
する。
オートサンプラ２６は、非可動部又は反応処理部９０お
よび着脱可能なサンプルラック２７を備えている。
よび着脱可能なサンプルラック２７を備えている。
オートサンプラ２Ｇのサンプルステージ２８には、サン
プルラック２７が装填される。サンプルラック２７は、
血漿試料を収容した複数の試料容器を保持している。ま
たサンプルラック２７には。
プルラック２７が装填される。サンプルラック２７は、
血漿試料を収容した複数の試料容器を保持している。ま
たサンプルラック２７には。
蛍光ラベリング用の反応試薬容器３０．内部標準液容器
３１．標準サンプル容器３２が配置されている。このオ
ートサンプラ２６では、非可動部９０のサンプルステー
ジ２８に近接した固定位置に、反応容器３３．ノズル洗
浄槽３４．ドレインボート３５．注入ポート３６が設け
られている。
３１．標準サンプル容器３２が配置されている。このオ
ートサンプラ２６では、非可動部９０のサンプルステー
ジ２８に近接した固定位置に、反応容器３３．ノズル洗
浄槽３４．ドレインボート３５．注入ポート３６が設け
られている。
分注ノズル３８は、試料や試薬を反応容器３３ヘビベツ
テイングにより分注したり、反応した試料を反応容器３
３から注入ポート３６へ移す働きをする。駆動機構３７
はＸＹｚの駆動機能を有し。
テイングにより分注したり、反応した試料を反応容器３
３から注入ポート３６へ移す働きをする。駆動機構３７
はＸＹｚの駆動機能を有し。
分注ノズル３８を縦横上下自在に駆動して、前記サンプ
ラー上の容器やポートの位置に移動させることが出来る
。分注ノズル３８の上端はプラスチックチューブなどの
細管３９により三方弁４０を介して１分注ポンプ４１、
および洗浄液槽４２に連結されている。分注ポンプ４１
はパルスモータ−で駆動されるシリンジポンプを使用し
ている。
ラー上の容器やポートの位置に移動させることが出来る
。分注ノズル３８の上端はプラスチックチューブなどの
細管３９により三方弁４０を介して１分注ポンプ４１、
および洗浄液槽４２に連結されている。分注ポンプ４１
はパルスモータ−で駆動されるシリンジポンプを使用し
ている。
恒温ブロック８０は反応容器３３の温度を所定の条件に
保つために設けられている。またサンプルステージ２８
にはサンプルラック２７上のサンプルや試薬を、分析中
低温に保つよう冷却装置が組込まれている。
保つために設けられている。またサンプルステージ２８
にはサンプルラック２７上のサンプルや試薬を、分析中
低温に保つよう冷却装置が組込まれている。
分析部４４はサンプルの濃縮と不要物除去を行なうプリ
カラム流路系、サンプル成分の分離を行なう分離カラム
流路系、および測定演算部からなる。プリカラム流路系
では、液槽４５の移送・洗浄液がポンプ４６により一定
流速で送液され、試料導入弁４７を経由してプリカラム
４８に流れている。試料導入弁４７にはオートサンプラ
の注入ポート３６から注入されたサンプル液を所定量計
量して分析部に導入するための計量管４９が設けられて
いる。
カラム流路系、サンプル成分の分離を行なう分離カラム
流路系、および測定演算部からなる。プリカラム流路系
では、液槽４５の移送・洗浄液がポンプ４６により一定
流速で送液され、試料導入弁４７を経由してプリカラム
４８に流れている。試料導入弁４７にはオートサンプラ
の注入ポート３６から注入されたサンプル液を所定量計
量して分析部に導入するための計量管４９が設けられて
いる。
分離カラム流路系では溶離液槽５０の溶離液がポンプ５
１により一定流速で送液され、カラム切換弁５２を経由
して単一の分離カラム５３に流れている。カラム切換弁
５２を切換えることにより溶離液はプリカラム４８を経
由して流れ、プリカラム４８で処理されたサンプルを分
離カラム５３に移送する。測定演算部は分離カラム５３
から溶出するサンプル成分の蛍光強度を測定する蛍光光
度計５４および測定結果の演算処理および表示を行なう
ためのＡ／Ｄ変換部５５．制御部５６．プリンター５７
．ＣＲＴ５８などからなり、蛍光光度計５４にはフロー
セル５９を有する。切換弁６０．６１はポンプ４６．５
１内の液を必要時にパージ出来るよう設けられている。
１により一定流速で送液され、カラム切換弁５２を経由
して単一の分離カラム５３に流れている。カラム切換弁
５２を切換えることにより溶離液はプリカラム４８を経
由して流れ、プリカラム４８で処理されたサンプルを分
離カラム５３に移送する。測定演算部は分離カラム５３
から溶出するサンプル成分の蛍光強度を測定する蛍光光
度計５４および測定結果の演算処理および表示を行なう
ためのＡ／Ｄ変換部５５．制御部５６．プリンター５７
．ＣＲＴ５８などからなり、蛍光光度計５４にはフロー
セル５９を有する。切換弁６０．６１はポンプ４６．５
１内の液を必要時にパージ出来るよう設けられている。
本実施例による分析は、
（１）オーサンプラ上でのサンプルの蛍光ラベリング作
業。
業。
（２）プリカラムによる濃縮および不純物除去作業、（
３）分離カラムによるサンプル成分の分離および測定、 の順序で行われる。第２図のフローチャー１・を参照し
て次に一連の分析操作を説明する。
３）分離カラムによるサンプル成分の分離および測定、 の順序で行われる。第２図のフローチャー１・を参照し
て次に一連の分析操作を説明する。
反夏皇塁洗止
ステップ１０１の分析動作開示のあと、ステップ１０２
で反応容器３３が洗浄される。この際、ノズル３８を反
応容器３３の位置に移動し、ボンブ４１を動作させ洗浄
液槽４２からの洗浄液を反応容器へ注入する。注入量は
反応容器３３の容量より多量に注入し、余剰の洗浄液は
オーバーフローさせドレインポート３５から排出管４３
の方へ廃出させる。次いで、ノズル３８を反応容器３３
の底に降下させ容器内の洗浄液を吸いあげ、ノズル３８
をドレインポート３５に移動させて吸い上げた液を廃出
する。この動作に先たち吸いあげた汚れた洗浄液がノズ
ル内の新鮮な洗浄液に拡散しないよう予めノズル３８の
先端に若干量の空気を吸っておく必要がある。（吸引に
先たち、気泡を吸って境界を作っておく作業は、後のサ
ンプルや試薬を吸いあげる場合にも必要であるが、説明
が繁雑になるので以後の説明では消略する。）以上の動
作を複数回（例えば３回）繰り返すことにより反応容器
３３の洗浄が終る。
で反応容器３３が洗浄される。この際、ノズル３８を反
応容器３３の位置に移動し、ボンブ４１を動作させ洗浄
液槽４２からの洗浄液を反応容器へ注入する。注入量は
反応容器３３の容量より多量に注入し、余剰の洗浄液は
オーバーフローさせドレインポート３５から排出管４３
の方へ廃出させる。次いで、ノズル３８を反応容器３３
の底に降下させ容器内の洗浄液を吸いあげ、ノズル３８
をドレインポート３５に移動させて吸い上げた液を廃出
する。この動作に先たち吸いあげた汚れた洗浄液がノズ
ル内の新鮮な洗浄液に拡散しないよう予めノズル３８の
先端に若干量の空気を吸っておく必要がある。（吸引に
先たち、気泡を吸って境界を作っておく作業は、後のサ
ンプルや試薬を吸いあげる場合にも必要であるが、説明
が繁雑になるので以後の説明では消略する。）以上の動
作を複数回（例えば３回）繰り返すことにより反応容器
３３の洗浄が終る。
世）ゴｆｔｖ分り。
ステップ１０３では反応容器３３への試料（サンプル）
の分注が行われる。ノズル３８を内部標準液容器３１の
位置に移動し、降下させて所定量吸引し、ついで分析す
る試料容器２９の位置に移動し、所定量のサンプルを吸
引した後、ノズル３８を反応容器３３の位置に移動させ
、吸引保持されているサンプルと内部標準液を反応容器
３３に吐出分注する。内部標準液は、カラムの回収率の
変動などを補正するために使用される標準液で、本実施
例の場合はイソプロテレノールを標準物質として用いて
いる。
の分注が行われる。ノズル３８を内部標準液容器３１の
位置に移動し、降下させて所定量吸引し、ついで分析す
る試料容器２９の位置に移動し、所定量のサンプルを吸
引した後、ノズル３８を反応容器３３の位置に移動させ
、吸引保持されているサンプルと内部標準液を反応容器
３３に吐出分注する。内部標準液は、カラムの回収率の
変動などを補正するために使用される標準液で、本実施
例の場合はイソプロテレノールを標準物質として用いて
いる。
ツクｌ東
ステップ１０４では、ノズル３８を洗浄する。
この場合、ノズル３８をドレインポート３５に移動し、
洗浄液を吐出して、内部標準液およびサンプルによるノ
ズル３８の内壁の汚れを洗い出した後、ノズルを洗浄槽
３４に移動して槽内に降下させ、洗浄液を吐出してノズ
ル３８の尖端外側を洗浄する。
洗浄液を吐出して、内部標準液およびサンプルによるノ
ズル３８の内壁の汚れを洗い出した後、ノズルを洗浄槽
３４に移動して槽内に降下させ、洗浄液を吐出してノズ
ル３８の尖端外側を洗浄する。
莢粟分圧星査
ステップ１０５では反応容器３３へ試薬を加える。ノズ
ル３８を反応試薬の容器３ｏの位置に移動し、ノズル内
に誘導体化試薬を所定量吸引し、反応容器３３に注入し
先に注入されているサンプルおよび内部標準液と混合さ
せる。混合はこの他に、ノズル内に予め空気を吸引して
おき、容器内に挿入して空気を吐出する方法や、外部か
ら機械的または電気的に容器を振動させる方法などによ
り行うこともできるが、混合しやすい液体で且つ吐出量
が比較的多量であれば高速度で吐出するだけで可能な場
合もある。
ル３８を反応試薬の容器３ｏの位置に移動し、ノズル内
に誘導体化試薬を所定量吸引し、反応容器３３に注入し
先に注入されているサンプルおよび内部標準液と混合さ
せる。混合はこの他に、ノズル内に予め空気を吸引して
おき、容器内に挿入して空気を吐出する方法や、外部か
ら機械的または電気的に容器を振動させる方法などによ
り行うこともできるが、混合しやすい液体で且つ吐出量
が比較的多量であれば高速度で吐出するだけで可能な場
合もある。
反−閃
ステップ１０６では、カテコールアミン類に対する蛍光
性物質への誘導体化が行われるように蛍光ラベリング反
応を開始させる。反応容器３３内におけるサンプルと誘
導体化試薬との混合液（以下サンプル液と称する）を、
一定温度に保温された反応容器３３内で所定時間放置し
て反応を進行させ、蛍光ラベリングを行う。
性物質への誘導体化が行われるように蛍光ラベリング反
応を開始させる。反応容器３３内におけるサンプルと誘
導体化試薬との混合液（以下サンプル液と称する）を、
一定温度に保温された反応容器３３内で所定時間放置し
て反応を進行させ、蛍光ラベリングを行う。
量 へのサンプル導入
ステップ１０７では、反応容器３３内の反応液を計量管
４９内へ導入する。反応容器３３内で実質的に反応の終
了した誘導体化されたサンプル液をノズル３８内に吸引
し、ノズルを注入ポート３６へ移動してその中に挿入し
、試料導入弁４７を第１図の如き状態にして試料計量管
４９ヘサンプル液を注入する。計量管４９がサンプル液
で満たされた後試料導入弁４７を切換えると、切換弁４
７のポートに接続されている計量管４９は、流路６２と
流路６３の間に接続され、移送・洗浄液の流れにより所
定量のサンプル液がプリカラム４８へ移送される。
４９内へ導入する。反応容器３３内で実質的に反応の終
了した誘導体化されたサンプル液をノズル３８内に吸引
し、ノズルを注入ポート３６へ移動してその中に挿入し
、試料導入弁４７を第１図の如き状態にして試料計量管
４９ヘサンプル液を注入する。計量管４９がサンプル液
で満たされた後試料導入弁４７を切換えると、切換弁４
７のポートに接続されている計量管４９は、流路６２と
流路６３の間に接続され、移送・洗浄液の流れにより所
定量のサンプル液がプリカラム４８へ移送される。
１−鼠
ステップ１０８では、プリカラム４８内への誘導体化さ
れたカテコールアミン類の捕捉と夾雑物や過剰試薬の除
去が行われ、同時にサンプル液の濃縮が行われる。移送
・洗浄液の流れによりプリカラム４８にサンプル液が導
入されると、プリカラム４８内にはサンプルが吸着捕捉
され蓄積される。このとき測定の妨害となる不要物であ
る夾雑物や過剰試薬がプリカラムを通過して排出口６４
を経て排出される。
れたカテコールアミン類の捕捉と夾雑物や過剰試薬の除
去が行われ、同時にサンプル液の濃縮が行われる。移送
・洗浄液の流れによりプリカラム４８にサンプル液が導
入されると、プリカラム４８内にはサンプルが吸着捕捉
され蓄積される。このとき測定の妨害となる不要物であ
る夾雑物や過剰試薬がプリカラムを通過して排出口６４
を経て排出される。
友ｙじθに隻送−
ステップ１０９では、不要物を除去されて捕捉されてい
るサンプルをプリカラム４８から脱離し、分離カラム５
３へ導く。第１図に実線図示の状態から破線の状態にカ
ラム切換弁５２を切換えると、プリカラム４８は流路６
５，６６の間に接続され、溶離液はプリカラム４８を経
由して流れ、プリカラム４８に濃縮されたサンプルを解
離して分離カラム５３に送り、分離が開始される。全サ
ンプルが流路６６に移動した時点で、カラム切換弁５２
を再び切換える（図示の実線状態となる）と溶離液はプ
リカラム４８を経由せず直接分離カラム５３に流れ、プ
リカラム４８には移送・洗浄液が流れ始める。
るサンプルをプリカラム４８から脱離し、分離カラム５
３へ導く。第１図に実線図示の状態から破線の状態にカ
ラム切換弁５２を切換えると、プリカラム４８は流路６
５，６６の間に接続され、溶離液はプリカラム４８を経
由して流れ、プリカラム４８に濃縮されたサンプルを解
離して分離カラム５３に送り、分離が開始される。全サ
ンプルが流路６６に移動した時点で、カラム切換弁５２
を再び切換える（図示の実線状態となる）と溶離液はプ
リカラム４８を経由せず直接分離カラム５３に流れ、プ
リカラム４８には移送・洗浄液が流れ始める。
分−凰
ステップ１１０では、引きつづき溶離液を分離カラム５
３に流し、カテコールアミン類の成分分離が行われ、ノ
ルエピネフリン（ＮＥ）、エピネフリン（Ｅ）、ドーパ
ミン（ＤＡ）が成分バンドを形成して分離カラムから溶
出される。
３に流し、カテコールアミン類の成分分離が行われ、ノ
ルエピネフリン（ＮＥ）、エピネフリン（Ｅ）、ドーパ
ミン（ＤＡ）が成分バンドを形成して分離カラムから溶
出される。
プ刃ノしトに再進４
ステップ１１０のサンプル成分の分離と並行して、ステ
ップ１１１ではプリカラム４８に移送・洗浄液を流し、
つぎのサンプルを受入れられる状態に復元させる。
ップ１１１ではプリカラム４８に移送・洗浄液を流し、
つぎのサンプルを受入れられる状態に復元させる。
几一定
ステップ１１２では１分離カラム５３からの溶出液が蛍
光光度計５４によって観測される。分離カラム５３によ
り分離され溶出したサンプル成分は順次、蛍光光度計５
４のフローセル５９に流れ、分離された各成分の蛍光強
度を検出し、演算処理して各成分の濃度を求める。
光光度計５４によって観測される。分離カラム５３によ
り分離され溶出したサンプル成分は順次、蛍光光度計５
４のフローセル５９に流れ、分離された各成分の蛍光強
度を検出し、演算処理して各成分の濃度を求める。
ｆ：ｊｊ１１５尺Ｊ−
ステップ１１３では、ステップ１１２で得たデータをプ
リンター５７．ＣＲＴ５８などにより表示出力する。ス
テップ１１４では、オー１〜サンプラ２６上の試料がす
べて処理されたかどうかが判断され、まだ残っていれば
ステップ１０２に戻り。
リンター５７．ＣＲＴ５８などにより表示出力する。ス
テップ１１４では、オー１〜サンプラ２６上の試料がす
べて処理されたかどうかが判断され、まだ残っていれば
ステップ１０２に戻り。
すべて処理されていればステップ１１５に進んで装置の
分析動作が終了する。
分析動作が終了する。
以上一検体についての分析手順を説明したが、つづいて
多数検体連続処理の手順について説明する。第３図Ａお
よび第３図Ｂにその分析プログラムの一例を示す。
多数検体連続処理の手順について説明する。第３図Ａお
よび第３図Ｂにその分析プログラムの一例を示す。
図の縦軸は、先に説明した分析フローチャートの作業内
容を工程１，２．３に区分して示している。第１工程は
主としてサンプルを誘導体化するためのオートサンプラ
上での作業、第乏工程はプリカラムによるサンプルの濃
縮作業、第３工程は分離カラムによるサンプル成分の分
離および測定の作業であり、各工程の境界区分はそれぞ
れの工程の時間配分がプログラム上適当になるよう区分
されている。横軸は進行する分析プログラムのサイクル
数と経過時間を示す、プログラムは１サイクル内で第１
．２．３各工程の作業がそれぞれ一巡するよう組まれて
いる。
容を工程１，２．３に区分して示している。第１工程は
主としてサンプルを誘導体化するためのオートサンプラ
上での作業、第乏工程はプリカラムによるサンプルの濃
縮作業、第３工程は分離カラムによるサンプル成分の分
離および測定の作業であり、各工程の境界区分はそれぞ
れの工程の時間配分がプログラム上適当になるよう区分
されている。横軸は進行する分析プログラムのサイクル
数と経過時間を示す、プログラムは１サイクル内で第１
．２．３各工程の作業がそれぞれ一巡するよう組まれて
いる。
第３図Ａはｎ番目の検体の分析する状態を中心に示した
ものである。実線太線がその状態を示す。
ものである。実線太線がその状態を示す。
実線細線は（ｎ＋１）番目と（ｎ−１）番目の検体、鎖
線は（ｎ−２）番目と（ｎ＋２）番目の検体の状態を示
している。第３図Ｂには切換弁の動作を示している。試
料導入弁４７の「計量」状態ａはサンプル液を注入ポー
ト３６から計量管４９に注入出来る状態すなわち、第１
図に図示された状態、「移送」状態すは弁が切換わり計
量管４９がプリカラム流路に接続された状態を示す。ま
た、カラム切換弁５２の「接続」状態Ｃはプリカラム４
８が分離カラム流路に接続された状態、「並行処理」状
態ｄは切離されて移送・洗浄液が流れている状態すなわ
ち第１図実線で図示された状態を示す。各切換弁の動作
を１サイクル毎に繰り返し動作を行なう。
線は（ｎ−２）番目と（ｎ＋２）番目の検体の状態を示
している。第３図Ｂには切換弁の動作を示している。試
料導入弁４７の「計量」状態ａはサンプル液を注入ポー
ト３６から計量管４９に注入出来る状態すなわち、第１
図に図示された状態、「移送」状態すは弁が切換わり計
量管４９がプリカラム流路に接続された状態を示す。ま
た、カラム切換弁５２の「接続」状態Ｃはプリカラム４
８が分離カラム流路に接続された状態、「並行処理」状
態ｄは切離されて移送・洗浄液が流れている状態すなわ
ち第１図実線で図示された状態を示す。各切換弁の動作
を１サイクル毎に繰り返し動作を行なう。
分析操作は、第１検体（１番目に分析する検体）の分析
を第１サイクルで開始し、つづいて１サイクル毎に順次
オートサンプラ上のサンプルの分析を開始させることに
より進行する。第３図Ａは第ｎサイクルから第（ｎ＋２
）サイクルにおける作業状態を示している。すなわち第
ｎサイクルに第ｎ検体（ｎ番目に分析する検体）の分析
が開始し、第１工程の作業が行われる。これと並行して
先に分析を開始している第（ｎ−１）検体の第２工程の
作業、および第（ｎ−２）検体の第３工程の作業が進ん
でいる。ついで第（ｎ＋１）サイクルにおいては、第ｎ
検体は第２工程の作業に進み、つぎの第（ｎ＋１）検体
の第１工程の作業が開始される。これと並行して第（ｎ
＋１）検体の第３工程の作業が行われている。さらに第
（ｎ ＋ ２）サイクルにおいては第ｎ検体の第３工程
の作業、第（ｎ＋１）検体の第２工程の作業が行われ、
つぎの第（ｎ＋２）検体の第１工程の作業が開始される
。
を第１サイクルで開始し、つづいて１サイクル毎に順次
オートサンプラ上のサンプルの分析を開始させることに
より進行する。第３図Ａは第ｎサイクルから第（ｎ＋２
）サイクルにおける作業状態を示している。すなわち第
ｎサイクルに第ｎ検体（ｎ番目に分析する検体）の分析
が開始し、第１工程の作業が行われる。これと並行して
先に分析を開始している第（ｎ−１）検体の第２工程の
作業、および第（ｎ−２）検体の第３工程の作業が進ん
でいる。ついで第（ｎ＋１）サイクルにおいては、第ｎ
検体は第２工程の作業に進み、つぎの第（ｎ＋１）検体
の第１工程の作業が開始される。これと並行して第（ｎ
＋１）検体の第３工程の作業が行われている。さらに第
（ｎ ＋ ２）サイクルにおいては第ｎ検体の第３工程
の作業、第（ｎ＋１）検体の第２工程の作業が行われ、
つぎの第（ｎ＋２）検体の第１工程の作業が開始される
。
以上説明した分析手順により、本装置の分析処理時間は
、一検体のみ分析する場合には第１．第２、第３工程の
合計時間すなわち３サイクルの時間が必要であるが、複
数の検体を連続して分析する場合は１サイクル毎に１検
体ずつ分析が出来る。
、一検体のみ分析する場合には第１．第２、第３工程の
合計時間すなわち３サイクルの時間が必要であるが、複
数の検体を連続して分析する場合は１サイクル毎に１検
体ずつ分析が出来る。
本実施例では１サイクルの時間が５分であるため、−検
体当りの処理時間は５分となる。
体当りの処理時間は５分となる。
カテコールアミン類のクロマトグラフィーにおいては、
１時間に１０検体以上の処理能力を持つことが望ましい
ので、１サイクルの時間は、６分以内とされる。
１時間に１０検体以上の処理能力を持つことが望ましい
ので、１サイクルの時間は、６分以内とされる。
第４図は、第１図の実施例のオートサンプラ２６の平面
図である。サンプルステージ２８上に着脱可能なサンプ
ルラック２７には、試料容器挿入ロア０が横１０個、縦
５列の計５０個所マトリックス状に設けられており、こ
れに分析すべきサンプルを収容した試料容器が装填され
て配列される。サンプルラック２７上には、また反応試
薬３０、内部標準液３１．標準サンプル３２の百き場が
あり、さらに分析中緊急割込測定が出来るよう、緊急検
体容器挿入ロア １ ａ 、 ７ ｌ ｂ 、 ７１
ｃが設けられている。またサンプルラック２７の側方に
は反応容器３３．ノズル洗浄槽３４．ドレインボート３
５．計量管４９への注入ボート３６がそれぞれ固定の位
置に設けられている。分注ノズル３８は移動体３の軸４
上を滑動し得る保持部Ｓに保持されており、駆動機構３
７により縦、横。
図である。サンプルステージ２８上に着脱可能なサンプ
ルラック２７には、試料容器挿入ロア０が横１０個、縦
５列の計５０個所マトリックス状に設けられており、こ
れに分析すべきサンプルを収容した試料容器が装填され
て配列される。サンプルラック２７上には、また反応試
薬３０、内部標準液３１．標準サンプル３２の百き場が
あり、さらに分析中緊急割込測定が出来るよう、緊急検
体容器挿入ロア １ ａ 、 ７ ｌ ｂ 、 ７１
ｃが設けられている。またサンプルラック２７の側方に
は反応容器３３．ノズル洗浄槽３４．ドレインボート３
５．計量管４９への注入ボート３６がそれぞれ固定の位
置に設けられている。分注ノズル３８は移動体３の軸４
上を滑動し得る保持部Ｓに保持されており、駆動機構３
７により縦、横。
上下のｘ、ｙ、ｚ方向に自在に駆動され、上記各容器あ
るいはボートの位置に随時位置づけられ、必要な作業を
行なう。非可動部９０とラック２７の間には断熱部材９
２が配置されている。
るいはボートの位置に随時位置づけられ、必要な作業を
行なう。非可動部９０とラック２７の間には断熱部材９
２が配置されている。
分析操作は、上記分析すべきサンプルや試薬を配置した
サンプルラック２７をオートサンプラ２Ｇのサンプルス
テージ２８に装着し、オペレータが操作パネル７７の分
析スタートスイッチを押すことにより開始される。
サンプルラック２７をオートサンプラ２Ｇのサンプルス
テージ２８に装着し、オペレータが操作パネル７７の分
析スタートスイッチを押すことにより開始される。
第５図は、反応容器３３．ノズル洗浄槽３４゜ドレイン
ボート３５の断面図である。反応容器３３は毎検体毎に
洗浄する必要があるので、この場合はオーバーフロ一方
式により、反応容器の底からノズル先より洗浄液を吐出
させ、上側より自動的に廃山するようになっている。こ
のように−方向からの流れを作ることによって、より洗
浄効果を上げている。恒温ブロック８０はヒータ９４を
備えている。また、この反応容器３３は同時に混合容器
としての役目を果たしている。さらにこの反応容器３３
は、恒温ブロック４３により、４０〜５０℃の範囲の温
度で恒温され（例えば４５℃）、反応を促進している。
ボート３５の断面図である。反応容器３３は毎検体毎に
洗浄する必要があるので、この場合はオーバーフロ一方
式により、反応容器の底からノズル先より洗浄液を吐出
させ、上側より自動的に廃山するようになっている。こ
のように−方向からの流れを作ることによって、より洗
浄効果を上げている。恒温ブロック８０はヒータ９４を
備えている。また、この反応容器３３は同時に混合容器
としての役目を果たしている。さらにこの反応容器３３
は、恒温ブロック４３により、４０〜５０℃の範囲の温
度で恒温され（例えば４５℃）、反応を促進している。
恒温にするのは、反応条件の再現性向上がねらいである
。すなわち、夏や冬でも、又は夜や昼でも反応条件を一
定化し、いつのデータも同一条件で比較できるようにす
るためである。４０’Ｃ〜５０℃に維持する理由を述べ
る。まず、４０℃以上にするのは、この装置を設置する
室温条件を１５℃〜３５℃と仮定しているため、それよ
り装置内温度が上昇することを考慮し、安定に制御する
ためである。また、５０℃以下にするのは、温度が高け
れば反応が促進されるが逆に５０℃以上では試料の変成
が起こるのでそれを防止するためと、オペレータが万−
触れることがあっても火傷しない程度に保つためである
。
。すなわち、夏や冬でも、又は夜や昼でも反応条件を一
定化し、いつのデータも同一条件で比較できるようにす
るためである。４０’Ｃ〜５０℃に維持する理由を述べ
る。まず、４０℃以上にするのは、この装置を設置する
室温条件を１５℃〜３５℃と仮定しているため、それよ
り装置内温度が上昇することを考慮し、安定に制御する
ためである。また、５０℃以下にするのは、温度が高け
れば反応が促進されるが逆に５０℃以上では試料の変成
が起こるのでそれを防止するためと、オペレータが万−
触れることがあっても火傷しない程度に保つためである
。
第４図に示すように、サンプルラック２７は外形が角形
であり、横方向に１０個の試料容器挿入穴７０が形成さ
れているが、これはオペレータが試料数を数えやすくす
るためである。このような１０個からなる穴の列が、第
４図の例では５列形成されている。特定の穴の列と隣の
穴の列との間の穴中心間隔ｙは、１５〜２５ＩＩＩ１１
にされている。
であり、横方向に１０個の試料容器挿入穴７０が形成さ
れているが、これはオペレータが試料数を数えやすくす
るためである。このような１０個からなる穴の列が、第
４図の例では５列形成されている。特定の穴の列と隣の
穴の列との間の穴中心間隔ｙは、１５〜２５ＩＩＩ１１
にされている。
この間隔はオペレータが試料容器をサンプルラッり２７
に出し入れするときに掴みやすいようにオペレータの指
が入るように設計されたことによる。
に出し入れするときに掴みやすいようにオペレータの指
が入るように設計されたことによる。
一方、サンプルラック２７はできるだけ小さい方が好ま
しいが、これを充足するため、横方向の同じ穴の列にお
ける隣の穴との中心間隔Ｘは、ｙよりも小さく、例えば
１２閣以下にされている。
しいが、これを充足するため、横方向の同じ穴の列にお
ける隣の穴との中心間隔Ｘは、ｙよりも小さく、例えば
１２閣以下にされている。
第６図および第７図は、第１図の実施例装置の全体の構
成外観と各部の配置関係を表している。
成外観と各部の配置関係を表している。
このカテコールアミン分析計は縦形で分析に必要な各ユ
ニットを全部組込んだ構成となっている。
ニットを全部組込んだ構成となっている。
装置は二段に仕切られ、上段にはオートサンプラ２６．
蛍光光度計５４．カラムパネル７２が配置されており、
カラムパネル７２にはプリカラム４８、分離カラム５３
．試料導入弁４７、およびカラム切換弁５２が配置され
ている。分離カラム５３は分析中の温度状態を一定に保
つため、恒温ブロック７３により温度制御されている。
蛍光光度計５４．カラムパネル７２が配置されており、
カラムパネル７２にはプリカラム４８、分離カラム５３
．試料導入弁４７、およびカラム切換弁５２が配置され
ている。分離カラム５３は分析中の温度状態を一定に保
つため、恒温ブロック７３により温度制御されている。
オートサンプラ２６へのサンプルラック２７の装着、取
出しはカバー７５を開閉して行なう。蛍光光度計５４の
上部には、測定データを記憶しておくためのフロッピー
ディスク７５が組込まれている。
出しはカバー７５を開閉して行なう。蛍光光度計５４の
上部には、測定データを記憶しておくためのフロッピー
ディスク７５が組込まれている。
装置下段には、洗浄液槽４２．移送・洗浄液槽４５、溶
離液槽５０２分注ポンプ４１．移送・洗浄液送液用のポ
ンプ４６．溶離液送液用のポンプ５１が配置され、ここ
から装置上段の分析ユニットに必要な液体の送液が行わ
れる。なお装置の下段後部には電源や基板類などの電気
系７６が収められている。装置上面にはプリンタ５７．
ＣＲＴ５８および本装置による分析のための入力操作を
行なうための操作パネル７７が配置されている。
離液槽５０２分注ポンプ４１．移送・洗浄液送液用のポ
ンプ４６．溶離液送液用のポンプ５１が配置され、ここ
から装置上段の分析ユニットに必要な液体の送液が行わ
れる。なお装置の下段後部には電源や基板類などの電気
系７６が収められている。装置上面にはプリンタ５７．
ＣＲＴ５８および本装置による分析のための入力操作を
行なうための操作パネル７７が配置されている。
第８図に本実施例の制御系統図を示す。前記した本実施
例の装置による分析制御は、操作パネル７７からの入力
により制御部５６を中心に行われる。先ずパワースイッ
チをＯＮすると温度制御装置７８が動作すると共に、蛍
光光度計５４の光源が点燈する。つぎに分析標準のスイ
ッチをＯＮするとポンプ４６．ポンプ５１が送液を開始
する。
例の装置による分析制御は、操作パネル７７からの入力
により制御部５６を中心に行われる。先ずパワースイッ
チをＯＮすると温度制御装置７８が動作すると共に、蛍
光光度計５４の光源が点燈する。つぎに分析標準のスイ
ッチをＯＮするとポンプ４６．ポンプ５１が送液を開始
する。
オートサンプラ２６にサンプルラック２７を装着した後
、分析開始スイッチをＯＮにすると、オートサンプラ２
６．試料導入弁４７．カラム切換弁５２が動作開始し、
第２図および第３図で説明した分析手順に従って分析操
作が行われる。測定結果は蛍光光度計５４からの信号を
Ａ／Ｄ変換器５５を経由して制御部内でデーター処理さ
れ、プリンタ５７に打出すと共にＣＲＴ５８に表示され
る。
、分析開始スイッチをＯＮにすると、オートサンプラ２
６．試料導入弁４７．カラム切換弁５２が動作開始し、
第２図および第３図で説明した分析手順に従って分析操
作が行われる。測定結果は蛍光光度計５４からの信号を
Ａ／Ｄ変換器５５を経由して制御部内でデーター処理さ
れ、プリンタ５７に打出すと共にＣＲＴ５８に表示され
る。
第９図に本実施例の装置によるカテコールアミン類の分
析結果の一例を示す。各ピークに打出されている数値は
、リテンションタイムすなわち分離開始してから分離さ
れた各成分が検知器に到達するまでの時間を示す。本装
置おいては分離開始はカラム切換弁５２を切換え、プリ
カラム４８内に濃縮されたサンプルの分離カラム５３へ
の移送を開始した時点からであり、最初の０．４８秒の
ピークはプリカラムに満されていた移送液が分離され溶
出されるサンプルに先立って検知器を通過するために検
出されるピークである。つづいて。
析結果の一例を示す。各ピークに打出されている数値は
、リテンションタイムすなわち分離開始してから分離さ
れた各成分が検知器に到達するまでの時間を示す。本装
置おいては分離開始はカラム切換弁５２を切換え、プリ
カラム４８内に濃縮されたサンプルの分離カラム５３へ
の移送を開始した時点からであり、最初の０．４８秒の
ピークはプリカラムに満されていた移送液が分離され溶
出されるサンプルに先立って検知器を通過するために検
出されるピークである。つづいて。
ノルエピネフリン（ＮＥ）、エピネフリン（Ｅ）。
ドーパミン（ＤＡ）の順序で分離カラム５３により分離
されたサンプル成分が溶出し、最後に内部標準液として
添加された、内標準物質のイソプロテレノールが溶出し
て検出される。各成分の濃度は、それぞれのピーク面積
から求める。
されたサンプル成分が溶出し、最後に内部標準液として
添加された、内標準物質のイソプロテレノールが溶出し
て検出される。各成分の濃度は、それぞれのピーク面積
から求める。
本分析例の場合は分離開始すなわちカラム切換弁５２の
切換後約４分強で目的の分離が終了している。すなわち
、この分析例によると先に説明した５分１サイクル内で
の分離が可能である。
切換後約４分強で目的の分離が終了している。すなわち
、この分析例によると先に説明した５分１サイクル内で
の分離が可能である。
本装置ではルチーンヮークで使用する場合の出力は検体
番号と分析した三成分の記号と濃度をプリンタ５７に打
出し、第９図のようなりロマトグラムは必要によりＣＲ
Ｔ表示やプリンター出力が出来るようになっている。
番号と分析した三成分の記号と濃度をプリンタ５７に打
出し、第９図のようなりロマトグラムは必要によりＣＲ
Ｔ表示やプリンター出力が出来るようになっている。
また本実施例ではプリカラムは１本となっているが、複
数のカラムを使用する場合もある。たとえば２本直列に
使用し、水溶性不純物の除去と疎水性不純物の除去を分
業させる方法などがある。
数のカラムを使用する場合もある。たとえば２本直列に
使用し、水溶性不純物の除去と疎水性不純物の除去を分
業させる方法などがある。
第１０．１１．１２図に誘導体化の具体的な反応の変形
例を示す。
例を示す。
第ＬＯ図に示す第１の変形例は反応容器を２個設ける方
法である。すなわちオートサンプラ上に２個の反応容器
７９ａ、７９ｂを設け、各容器は恒温ブロック８０によ
り恒温にされ、また洗浄の際にオーバーフローする洗浄
液はドレインポート８１に流れる構造となっている。こ
の方式は反応に時間がかかるなどの理由により、オート
サンプラ上の誘導体化の作業、すなわち前記第一工程が
。
法である。すなわちオートサンプラ上に２個の反応容器
７９ａ、７９ｂを設け、各容器は恒温ブロック８０によ
り恒温にされ、また洗浄の際にオーバーフローする洗浄
液はドレインポート８１に流れる構造となっている。こ
の方式は反応に時間がかかるなどの理由により、オート
サンプラ上の誘導体化の作業、すなわち前記第一工程が
。
１サイクルの時間よりも長くかかる場合に用いられる。
すなわち１サイクルの時間間隔で２個の反応容器に交互
にサンプルと試薬を分注し反応を進行させることにより
、１サイクル毎に一検体ずつの処理を終らせることが出
来る。ただし作業時間が１サイクルの２倍以上になれば
、さらに反応容器の数を増加させる必がある。いずれに
してもこれ等反応容器は周期的に繰返して使用すること
になる。
にサンプルと試薬を分注し反応を進行させることにより
、１サイクル毎に一検体ずつの処理を終らせることが出
来る。ただし作業時間が１サイクルの２倍以上になれば
、さらに反応容器の数を増加させる必がある。いずれに
してもこれ等反応容器は周期的に繰返して使用すること
になる。
第１の変形例はもう１つの利用方法がある。それは反応
容器の２個の内１個７９ａを混合容器として使用し、混
合が終ったら毎回混合液を反応容器７９ｂに移し変える
方法である。この方法の長所は混合条件２反応温度を含
めた反応条件など動作シーケンスが一定化することで反
応再現性を良好に保つことができる。
容器の２個の内１個７９ａを混合容器として使用し、混
合が終ったら毎回混合液を反応容器７９ｂに移し変える
方法である。この方法の長所は混合条件２反応温度を含
めた反応条件など動作シーケンスが一定化することで反
応再現性を良好に保つことができる。
第１１図に示す第２の変形例は、試料４人弁の計量管内
で反応を進める例である。オートサンプラ上の容器８２
はサンプルと試薬を混合させる混合容器として使用し、
混合によって反応開始された反応液を分注ノズル３８を
用いて注入ポート３６から計量管８３に注入し、ここで
液が流通しない状態で一定時間放置し反応させる。この
場合、計量管８３は恒温ブロック８４により所定の温度
に保持され、また反応中、液が移動しないよう、出口流
路に停止弁８５が設けである。この方式は反応時間が試
料導入弁４７の動作間隔により決まるので、長時間の反
応には採用できないが、計量管８３が合成樹脂チューブ
などをコイル状に巻いて作られているので、温度制御が
しやすく、また場所的にも自由度があり１例えば分離カ
ラムの恒温ブロックと一体化出来るなどの利点がある。
で反応を進める例である。オートサンプラ上の容器８２
はサンプルと試薬を混合させる混合容器として使用し、
混合によって反応開始された反応液を分注ノズル３８を
用いて注入ポート３６から計量管８３に注入し、ここで
液が流通しない状態で一定時間放置し反応させる。この
場合、計量管８３は恒温ブロック８４により所定の温度
に保持され、また反応中、液が移動しないよう、出口流
路に停止弁８５が設けである。この方式は反応時間が試
料導入弁４７の動作間隔により決まるので、長時間の反
応には採用できないが、計量管８３が合成樹脂チューブ
などをコイル状に巻いて作られているので、温度制御が
しやすく、また場所的にも自由度があり１例えば分離カ
ラムの恒温ブロックと一体化出来るなどの利点がある。
第１３図Ａおよび第１３図Ｂは、第１１図の第２変形例
におけるプログラム例である。工程１は誘導体のための
オートサンプラ上での作業、工程２はプリカラムによる
濃縮作業、工程３は分離カラムによる分離、測定の作業
に大別されているのは前記実施例の第３図のプログラム
と同じであるが、各工程の区分の境界は多少異なってい
る。すなわち本プログラムでは、サンプル液を試料導入
弁４７の計量管８３に注入するまでが第１工程となって
おり、計量管内での反応開始から第２工程となり、また
、プリカラムによるサンプルの濃縮で第２工程が終り１
分離カラムのサンプルの移送から第３工程が始まるよう
プログラムが組まれている。このように、第１１図の例
でも分析作業を、オートサンプラ、プリカラム、分離カ
ラムの作業に大別し、繰り返しプログラムにより連続し
て分析する検体についてそれぞれの作業を並行して行わ
せることができる。
におけるプログラム例である。工程１は誘導体のための
オートサンプラ上での作業、工程２はプリカラムによる
濃縮作業、工程３は分離カラムによる分離、測定の作業
に大別されているのは前記実施例の第３図のプログラム
と同じであるが、各工程の区分の境界は多少異なってい
る。すなわち本プログラムでは、サンプル液を試料導入
弁４７の計量管８３に注入するまでが第１工程となって
おり、計量管内での反応開始から第２工程となり、また
、プリカラムによるサンプルの濃縮で第２工程が終り１
分離カラムのサンプルの移送から第３工程が始まるよう
プログラムが組まれている。このように、第１１図の例
でも分析作業を、オートサンプラ、プリカラム、分離カ
ラムの作業に大別し、繰り返しプログラムにより連続し
て分析する検体についてそれぞれの作業を並行して行わ
せることができる。
第１２図に示す第３の変形例は、試料注入ポート３６か
ら試料導入弁４７に到る流路に反応コイル８７を設け、
ここにサンプル液を注入して反応させた後、試料導入弁
を切換えて計量管４９に送り、再び弁４７を切換えて分
析部に導入する方式である。この方式は、前記の変形例
に比し、反応時間に自由度があるが、サンプル液を二段
に移送しなければならないので作業が複雑になる。
ら試料導入弁４７に到る流路に反応コイル８７を設け、
ここにサンプル液を注入して反応させた後、試料導入弁
を切換えて計量管４９に送り、再び弁４７を切換えて分
析部に導入する方式である。この方式は、前記の変形例
に比し、反応時間に自由度があるが、サンプル液を二段
に移送しなければならないので作業が複雑になる。
以上本発明の実施例としてカテコールアミン自動分析装
置の例につき説明したが、本発明の適用範囲は必ずしも
この実施例の範囲内に限られるものでない。すなわち分
析対象は、カテコールアミン以外にも例えばアミノ酸、
胆汁酸、グアニジンなど、各種の物質の分析に適用出来
る。また誘導体化の方法と使用する検出器についても必
ずしも蛍光光度法に限らず、酵素活性やＵｖ活性法によ
り紫外あるいは可視の光度計を用いて測定する方法など
も適用できる。さらに誘導体化を行わしめる具体的な方
法すなわち、反応場所や作業手順、およびプログラムの
構成なども各種の変形例が考えられる。
置の例につき説明したが、本発明の適用範囲は必ずしも
この実施例の範囲内に限られるものでない。すなわち分
析対象は、カテコールアミン以外にも例えばアミノ酸、
胆汁酸、グアニジンなど、各種の物質の分析に適用出来
る。また誘導体化の方法と使用する検出器についても必
ずしも蛍光光度法に限らず、酵素活性やＵｖ活性法によ
り紫外あるいは可視の光度計を用いて測定する方法など
も適用できる。さらに誘導体化を行わしめる具体的な方
法すなわち、反応場所や作業手順、およびプログラムの
構成なども各種の変形例が考えられる。
本発明によれば、液体クロマトグラフィーにおけるプレ
ラベル処理を再現性良く行うことができ、検査業務の自
動化に貢献できる。
ラベル処理を再現性良く行うことができ、検査業務の自
動化に貢献できる。
第１図は本発明の一実施例装置の概略構成を示す図、第
２図は第１図の装置における分析操作のフローを示す図
、第３図Ａおよび第３図Ｂは第１図の装置における各部
の動作タイミングを示す図、第４図は第１図の装置にお
けるオートサンプラの平面図、第５図は第４図における
ドレインポート付近の縦断面図、第６図は第１図の装置
の正面外観図、第７図は第６図の側方からの配置概念図
、第８図は第１図の装置の制御系統図、第９図はカテコ
ールアミン類の分析例を示す図、第１０図は第１の変形
例の要部概略構成図、第１１図は第２の変形例の要部概
略構成図、第１２図は第３の変形例の要部概略構成図、
第１３図Ａおよび第１３図Ｂは第１１図の変形例を適用
した分析計における各部の動作タイミングを示す図であ
る。 ２６・・・オートサンプラ、２７・・・サンプルラック
。 ２８・・・サンプルステージ、２９・・・試料容器、３
０・・・反応試薬容器、３３，７９ａ、７９ｂ・・・反
応容器、３５．８１・・・ドレインポート、３６・・・
試料注入ポート、３８・・・分注ノズル、４７・・・試
料導入弁。 ４８・・・プリカラム、４９．８３・・・計量管、５２
・・・カラム切換弁、５３・・・分離カラム、５４・・
・蛍光光度計、５６・・・制御部、８２・・・混合容器
、８５・・・停第２図 第１図 第３図Ａ 第 図 ６ 第 図 第 図 第 図 第 ８ 図 第 図 螢光強度 第 ０ 図
２図は第１図の装置における分析操作のフローを示す図
、第３図Ａおよび第３図Ｂは第１図の装置における各部
の動作タイミングを示す図、第４図は第１図の装置にお
けるオートサンプラの平面図、第５図は第４図における
ドレインポート付近の縦断面図、第６図は第１図の装置
の正面外観図、第７図は第６図の側方からの配置概念図
、第８図は第１図の装置の制御系統図、第９図はカテコ
ールアミン類の分析例を示す図、第１０図は第１の変形
例の要部概略構成図、第１１図は第２の変形例の要部概
略構成図、第１２図は第３の変形例の要部概略構成図、
第１３図Ａおよび第１３図Ｂは第１１図の変形例を適用
した分析計における各部の動作タイミングを示す図であ
る。 ２６・・・オートサンプラ、２７・・・サンプルラック
。 ２８・・・サンプルステージ、２９・・・試料容器、３
０・・・反応試薬容器、３３，７９ａ、７９ｂ・・・反
応容器、３５．８１・・・ドレインポート、３６・・・
試料注入ポート、３８・・・分注ノズル、４７・・・試
料導入弁。 ４８・・・プリカラム、４９．８３・・・計量管、５２
・・・カラム切換弁、５３・・・分離カラム、５４・・
・蛍光光度計、５６・・・制御部、８２・・・混合容器
、８５・・・停第２図 第１図 第３図Ａ 第 図 ６ 第 図 第 図 第 図 第 ８ 図 第 図 螢光強度 第 ０ 図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、試料注入ポートから導入された試料を分離カラムで
成分分離し検出器で検出する液体クロマトグラフ分析計
において、加温される反応容器と試料注入ポートが配設
された反応処理部を設け、上記反応処理部に対し着脱可
能なサンプルラックを設け、上記反応容器内で試薬と上
記サンプルラックからの試料との反応が開始されてから
所定時間後に吸排ノズルによつて上記反応容器内の液を
上記試料注入ポートに移すことを特徴とする液体クロマ
トグラフ分析計。 ２、請求項第１項記載の分析計において、上記反応容器
は４０〜５０℃の範囲内の所定温度に加温されることを
特徴とする液体クロマトグラフ分析計。 ３、請求項第１項又は第２項記載の分析計において、上
記反応処理部はサンプルラック収納領域を有しており、
このサンプルラック収納領域は４〜１７℃の範囲内の所
定温度に維持されることを特徴とする液体クロマトグラ
フ分析計。 ４、請求項第１項記載の分析計において、上記サンプル
ラックは、複数の試料容器装填部と、プレラベル化剤を
収容した試薬容器の装填部を備えていることを特徴とす
る液体クロマトグラフ分析計。 ５、請求項第１項又は第４項記載の分析計において、上
記サンプルラックは、１０個の試料容器装填穴からなる
列が複数列形成されたものであることを特徴とする液体
クロマトグラフ分析計。 ６、請求項第５項記載の分析計において、特定の列と隣
の列との間の装填穴の間隔は、同じ列における装填穴同
士の間隔よりも大きく、大きい方の間隔が１５〜２５ｍ
ｍであることを特徴とする液体クロマトグラフ分析計。 ７、請求項第１項記載の分析計において、上記試料注入
ポートと上記分離カラムの間に計量管を設け、試料導入
時に上記試料注入ポートと上記計量管を連通するための
流路切換手段を設けたことを特徴とする液体クロマトグ
ラフ分析計。 ８、試料注入ポートから導入された試料を一旦プレカラ
ムで捕捉したあと分離カラムで成分分離する液体クロマ
トグラフ分析計において、混合用容器へ試料および試薬
を加え、かつ上記混合用容器内の混合液を試料注入ポー
トへ移す吸排ノズルを設け、上記試料注入ポートと上記
プリカラムの間に所定温度に加温される反応維持流路を
設け、上記反応維持流路内の液の移動を所定時間停止さ
せる手段を設けたことを特徴とする液体クロマトグラフ
分析計。 ９、請求項第８項記載の分析計において、上記分離カラ
ムによる成分分離動作の１サイクルの間に、上記プリカ
ラムにおける試料捕捉工程と上記反応維持流路における
誘導体化反応工程を並行して進めることを特徴とする液
体クロマトグラフ分析計。 １０、分析部への試料注入ポートと加温される少なくと
も１個の混合用容器と冷却可能なサンプルラック収容部
を設け、上記混合用容器に洗浄液を供給する手段を設け
、上記サンプルラック収容部と上記混合用容器を熱的に
隔離したことを特徴とする試料供給装置。 １１、請求項第１０項記載の装置において、排液用ドレ
インポートを設け、上記試料注入ポートと上記混合用容
器と上記ドレインポートとを直線状に配列したことを特
徴とする試料供給装置。 １２、請求項第１０項記載の装置において、上記サンプ
ルラック収容部に適合されるサンプルラックを設け、こ
のサンプルラック上の試料および試薬を上記混合用容器
に移す吸排ノズルを設け、この吸排ノズルを通して上記
混合用容器へ洗浄液を供給することを特徴とする試料供
給装置。 １３、試料注入ポートと加温される容器とラック載置部
を有する非可動部と、カテコールアミン誘導体化試薬お
よび複数の試料が収容され上記ラック載置部に載置され
るサンプルラックと、吸排ノズルによつて上記加温容器
内の液を反応開始から所定時間後に上記試料注入ポート
に移すノズル移動機構と、上記試料注入ポートから導入
される誘導体化された試料を捕捉するプリカラムと、上
記プリカラムから導入した試料中のカテコールアミン類
を成分分離する分離カラムと、上記分離カラムの下流に
設けた蛍光検出器と、を備えたカテコールアミン分析計
。 １４、試料にプレラベル化処理をしてラベル化された試
料を分離カラムで成分分離し検出する方法において、上
記プレラベル化処理は、加温される混合用容器とサンプ
ルラック収納部を有するラベル化装置本体に、サンプル
ラックが収納されたあと、吸排ノズルで上記混合用容器
に試料およびラベル剤を添加してプレラベル化反応を開
始する工程と、上記混合用容器内の試料を上記吸排ノズ
ルによつて分離カラムを有する流路への試料注入ポート
に移す工程を含むことを特徴とするプレラベル反応処理
方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1271667A JPH0820426B2 (ja) | 1989-10-20 | 1989-10-20 | 液体クロマトグラフ分析計およびプレラベル反応処理方法 |
| DE19904032963 DE4032963C2 (de) | 1989-10-20 | 1990-10-17 | Flüssigphasenchromatographie-Analysator |
| US08/005,310 US5277871A (en) | 1989-10-20 | 1993-01-19 | Liquid chromatographic analyzer, sample feeder and prelabeling reaction treating method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1271667A JPH0820426B2 (ja) | 1989-10-20 | 1989-10-20 | 液体クロマトグラフ分析計およびプレラベル反応処理方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03134560A true JPH03134560A (ja) | 1991-06-07 |
| JPH0820426B2 JPH0820426B2 (ja) | 1996-03-04 |
Family
ID=17503207
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1271667A Expired - Lifetime JPH0820426B2 (ja) | 1989-10-20 | 1989-10-20 | 液体クロマトグラフ分析計およびプレラベル反応処理方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0820426B2 (ja) |
| DE (1) | DE4032963C2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0634615A (ja) * | 1992-07-17 | 1994-02-10 | Nkk Corp | 標識化合物等の精製装置 |
| JP2007225420A (ja) * | 2006-02-23 | 2007-09-06 | Dkk Toa Corp | オートサンプラ及び分析システム |
| US8747745B2 (en) | 2007-04-12 | 2014-06-10 | Canon Kabushiki Kaisha | Apparatus and method for biochemical analysis |
| WO2019038924A1 (ja) * | 2017-08-25 | 2019-02-28 | 株式会社島津製作所 | オートサンプラ |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19925658C2 (de) * | 1999-06-04 | 2002-04-18 | Andreas Zucker | Vorrichtung zur automatischen Probenvorbereitung und deren Verwendung |
| DE10322797B4 (de) * | 2003-05-19 | 2006-09-14 | Knf Neuberger Gmbh | Labor-Pumpeinheit |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5938651A (ja) * | 1982-08-27 | 1984-03-02 | Sekisui Chem Co Ltd | カテコ−ルアミンの定量法 |
| JPS60131464A (ja) * | 1983-12-20 | 1985-07-13 | Shimadzu Corp | プレラベル法分析装置 |
| JPS60142250A (ja) * | 1983-12-28 | 1985-07-27 | Shimadzu Corp | 液体クロマトグラフィによる第１級或いは第２級のアミノ基を有する化合物の分析装置 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60143766A (ja) * | 1983-12-29 | 1985-07-30 | Shimadzu Corp | カテコ−ルアミン類の分析装置 |
| JPH01126544A (ja) * | 1987-11-11 | 1989-05-18 | Hitachi Ltd | 生化学分析方法及び装置 |
| JP3126244B2 (ja) * | 1992-12-18 | 2001-01-22 | ティーディーケイ株式会社 | 高周波ｌｃ複合部品 |
-
1989
- 1989-10-20 JP JP1271667A patent/JPH0820426B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-10-17 DE DE19904032963 patent/DE4032963C2/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5938651A (ja) * | 1982-08-27 | 1984-03-02 | Sekisui Chem Co Ltd | カテコ−ルアミンの定量法 |
| JPS60131464A (ja) * | 1983-12-20 | 1985-07-13 | Shimadzu Corp | プレラベル法分析装置 |
| JPS60142250A (ja) * | 1983-12-28 | 1985-07-27 | Shimadzu Corp | 液体クロマトグラフィによる第１級或いは第２級のアミノ基を有する化合物の分析装置 |
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| JPH0634615A (ja) * | 1992-07-17 | 1994-02-10 | Nkk Corp | 標識化合物等の精製装置 |
| JP2007225420A (ja) * | 2006-02-23 | 2007-09-06 | Dkk Toa Corp | オートサンプラ及び分析システム |
| US8747745B2 (en) | 2007-04-12 | 2014-06-10 | Canon Kabushiki Kaisha | Apparatus and method for biochemical analysis |
| WO2019038924A1 (ja) * | 2017-08-25 | 2019-02-28 | 株式会社島津製作所 | オートサンプラ |
| JPWO2019038924A1 (ja) * | 2017-08-25 | 2020-05-28 | 株式会社島津製作所 | オートサンプラ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0820426B2 (ja) | 1996-03-04 |
| DE4032963A1 (de) | 1991-05-02 |
| DE4032963C2 (de) | 1993-09-30 |
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