DE112013003324T5 - Integrierte Vorverarbeitungs-/Elektrophoresekartusche, integriertes Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegerät und integriertes Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoreseverfahren - Google Patents

Integrierte Vorverarbeitungs-/Elektrophoresekartusche, integriertes Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegerät und integriertes Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoreseverfahren Download PDF

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Abstract

Um eine vollständig automatisierte Durchführung aller Schritte von der Vorverarbeitung bis hin zur Elektrophorese zu ermöglichen, wird eine integrierte Vorverarbeitungs-/Elektrophoresekartusche mit einer oder mehreren Blockstrukturen bereitgestellt, die den einzelnen Schritten der Vorverarbeitung entsprechen. Jede Blockstruktur weist jeweils (1) einen ersten Block mit einem Reaktionsbehälter, einem Reagensbehälter, mehreren Strömungskanälen, die die Behälter verbinden, mehreren in den Strömungskanälen angeordneten Regelventilen und einem Strömungskanal, der einen Reaktionsbehälter in einer Blockstruktur in einer vorherigen Stufe und einen Reaktionsbehälter in einer Blockstruktur in einer nächsten Stufe verbindet, und (2) einen zweiten Block mit einem Phoreselösungsbehälter, einem Kathodenpufferlösungsbehälter, einem Reinigungslösungsbehälter, einem Strömungskanal, der einen Trägerbehälter in der Blockstruktur in der vorherigen Stufe und den Phoreselösungsbehälter verbindet, und einem Regelventil für den Strömungskanal auf.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine integrierte Vorverarbeitungs-/Elektrophoresekartusche (das heißt ein integriertes Probenvorbereitungs- und Elektrophoresegerät), die für alle Schritte von der Vorverarbeitung wie etwa dem Extrahieren von Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe und dem Verstärken und Markieren von Nukleinsäuren bis zur Elektrophorese benutzt werden kann, eine integrierte Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresevorrichtung (das heißt eine integrierte Probenvorbereitungs- und Elektrophoresevorrichtung) und ein integriertes Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoreseverfahren (das heißt ein integriertes Probenvorbereitungs- und Elektrophoreseverfahren), das alle Schritte vollautomatisch ausführen kann.
  • Stand der Technik
  • Verfahren zur Gendiagnose oder Untersuchung von biologischen Proben auf genetischer Ebene, etwa die DNS-Analyse, weisen typischerweise die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte auf: (1) eine Vorverarbeitungsreaktionsstufe mit einem Schritt zum Extrahieren von Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe, einem Schritt zum Verstärken der extrahierten Nukleinsäuren und einem Schritt zum Markieren der Nukleinsäuren und (2) eine Elektrophoresestufe zum sequenziellen Lesen der Basensequenzen der Nukleinsäuren nach der Vorverarbeitung. In jeder Stufe werden mehrere Reagenzien gemischt, erwärmt und abgegeben. Daher ist zur Durchführung einer Untersuchung viel Arbeit erforderlich.
  • Zur Erhöhung der Funktionsfähigkeit und Durchführbarkeit ist ein Verfahren zum automatischen Ausführen eines Vorgangs bekannt, der in jedem Vorverarbeitungsschritt in einer Kartusche nötig ist, die Vorratsbehälter, Strömungskanäle und dergleichen für eine Entwicklungslösung umfasst (siehe zum Beispiel Patentliteratur 1).
  • Zur Durchführung der Elektrophorese von Nukleinsäuren wird in der Regel ein Kapillarelektrophoresegerät verwendet. Patentliteratur 2 beschreibt ein Beispiel des herkömmlichen Kapillarelektrophoresegeräts.
  • Zitierliste
  • Patentliteratur
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Technisches Problem
  • Obwohl Patentliteratur 1 eine Technik zur Automatisierung jedes Schritts der Genanalyse beschreibt, basiert diese Technik nicht auf der Annahme der vollständigen Automatisierung einer Reihe von Vorgängen zum Erhalten von Basensequenzen aus einer biologischen Probe oder von Nukleinsäuren durch Elektrophorese. Daher umfassen die herkömmlichen Techniken immer einen Vorgang zum Transportieren einer Kartusche oder einer Probe, die in jedem Schritt verwendet wird, zu einem entsprechenden Gerät und erfordern damit komplexe Vorgänge.
  • Daher stellt die vorliegende Erfindung eine Technologie bereit, die eine Reihe von Vorgängen von der Stufe zum Extrahieren von Nukleinsäuren aus einer Probenlösung oder von der anschließenden Vorverarbeitungsstufe zum Verstärken und Markieren der Nukleinsäuren bis zur Elektrophoresestufe zum Lesen der Basensequenzen der Nukleinsäuren vollständig automatisieren kann.
  • Lösung des Problems
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine integrierte Kartusche bereit, die für eine Reihe von Reaktionen von der Vorverarbeitung, die einen Schritt oder mehrere Schritte umfasst, bis zur Elektrophorese verwendet werden kann, und ein integriertes Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegerät und ein Verfahren zur Durchführung mittels dieser Kartusche einer Reihe von Reaktionen von der Vorverarbeitung bis zur Elektrophorese unter Verwendung eines einzigen Gerätes.
  • Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung
  • Nach der vorliegenden Erfindung kann eine Reihe von Reaktionen von der Vorverarbeitung bis zur Elektrophorese mit einem einzigen Geräte und einer einzigen Kartusche durchgeführt werden. Daher ist eine verbesserte Funktionsfähigkeit und Durchführbarkeit zu erwarten. Andere Probleme, Konfigurationen und Vorteile ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der Ausführungsformen.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt eine beispielhafte Konfiguration eines integrierten Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegeräts nach der ersten Ausführungsform.
  • 2 zeigt eine beispielhafte Konfiguration der Oberseite einer integrierten Kartusche für eine Entwicklungslösung für die Vorverarbeitung und Elektrophorese nach der ersten Ausführungsform.
  • 3 zeigt die Konfiguration der Oberseite eines Kapillarbündels.
  • 4 zeigt eine beispielhafte Konfiguration des Querschnitts einer Pumpen-/Puffereinheit.
  • 5 zeigt die Vorverarbeitungsschritte nach der ersten Ausführungsform.
  • 6 zeigt eine beispielhafte Konfiguration der Oberseite eines Nukleinsäureextraktionsblocks.
  • 7 zeigt eine beispielhafte Konfiguration der Oberseite eines PCR-Blocks.
  • 8 zeigt eine beispielhafte Konfiguration der Oberseite eines Zyklussequenzierungsblocks.
  • 9 zeigt eine beispielhafte Konfiguration der Oberseite eines Phoreseblocks.
  • 10 zeigt ein Ablaufdiagramm der Betriebsverfahren eines integrierten Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegeräts.
  • 11 zeigt eine beispielhafte Konfiguration der Oberseite einer Kartusche nach der zweiten Ausführungsform.
  • 12 zeigt eine beispielhafte Konfiguration der Oberseite einer Kartusche nach der vierten Ausführungsform.
  • Beschreibung der Ausführungsformen
  • Im Folgenden werden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung anhand der Zeichnungen beschrieben. Dabei ist zu beachten, dass die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung nicht auf die nachstehend beschriebenen Ausführungsformen beschränkt sind und eine Vielzahl von Variationen innerhalb des Gedankens und Umfangs der vorliegenden Erfindung möglich ist.
  • Erste Ausführungsform
  • Konfiguration des integrierten Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegeräts
  • 1 zeigt die Konfiguration eines integrierten Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegeräts 100 nach der ersten Ausführungsform. Das integrierte Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegerät 100 ist ein Gerät, das eine Reihe von Reaktionen/Vorgängen von der Vorverarbeitung bis zur Elektrophorese unter Verwendung einer in dieser Patentschrift vorgeschlagenen Kartusche 200 vollautomatisch ausführt. Die Einzelheiten der Kartusche 200 werden nachstehend beschrieben.
  • Das integrierte Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegerät 100 umfasst ein Kapillarbündel 400, eine Pumpen-/Puffereinheit 450, eine Thermostateinheit 410, eine Heizeinheit 500, eine Flüssigkeitstransferpumpe 520, eine Regelventileinheit 550, eine automatische Probenahmeeinheit 600, eine Detektionseinheit 700, eine Hochspannungsstromversorgungseinheit 800 und eine Steuerung 900. Die Einzelheiten dieser Einheiten werden nachstehend beschrieben. Es ist zu beachten, dass die Steuerung 900 den Betrieb aller Einheiten in dem integrierten Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegerät 100 steuert. Die Kartusche 200 ist auf einem Aufnahmetisch (nicht gezeigt) befestigt, und die Heizeinheit 500 ist im Inneren des Aufnahmetischs angebracht.
  • Konfiguration der Kartusche
  • Die bei dieser Ausführungsform verwendete Kartusche 200 weist ein einziges flaches Substrat mit Strömungskanälen und Regelventilen auf. die auf dessen Oberfläche gebildet sind. Bei dieser Ausführungsform wird eine einzige Kartusche 200 für eine Reihe von Vorgängen vom Extrahieren von Nukleinsäuren bis zur Vorbereitung einer Phoreseprobe verwendet. Jeder Vorgang wird durch das Zusammenwirken aller Einheiten des integrierten Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegeräts 100 vollautomatisch ausgeführt, wie nachstehend ausführlich beschrieben. Bei dieser Ausführungsform wird im Prinzip eine einzige Kartusche 200 in einer einzigen Messung verwendet.
  • 2 zeigt die gesamte Konfiguration der in dieser Ausführungsform verwendeten Kartusche 200. Die Kartusche 200 weist im Allgemeinen vier Blöcke auf, bei denen es sich um einen Nukleinsäureextraktionsblock 201 zur Verwendung in einer Reaktion zum Extrahieren von Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe, einen PCR-Block 202 zur Verwendung beim Verstärken und Reinigen der Nukleinsäuren, einen Zyklussequenzierungsblock 203 zur Verwendung beim Markieren der Nukleinsäuren durch eine Zyklussequenzierungsreaktion und einen Phoreseblock 204 zur Verwendung bei der Kapillarelektrophorese handelt. Die Konfiguration jedes Blocks und ein Betriebsverfahren dafür werden nachstehend beschrieben.
  • Konfiguration des Kapillarbündels
  • 3 zeigt die Konfiguration der Oberseite des Kapillarbündels 400. Das Kapillarbündel 400 besteht aus einem Bündel von einer oder mehreren Kapillaren 401. Jede Kapillare 401 weist eine Glasröhre mit einem Innendurchmesser von mehreren zig bis mehreren hundert Mikrometern und einem Außendurchmesser von mehreren hundert Mikrometern auf, und die Oberfläche der Glasröhre ist mit Polyimid oder dergleichen beschichtet. Das Innere der Kapillare 401 ist mit einem Trennmedium gefüllt, das bei der Elektrophorese einen Unterschied in der Elektrophoresegeschwindigkeit für eine Probe bewirkt.
  • Ein Kapillarkopf 402 ist an einem Ende der Kapillaren 401 vorgesehen. Der Kapillarkopf 402 ist ein Element zum Bündeln der Kapillaren 401. Die Pumpen-/Puffereinheit 450 und das Kapillarbündel 400 sind über den Kapillarkopf 402 verbunden. Eine Kathodenelektrode 403 ist am anderen Ende der Kapillaren 401 gebildet. Die Kathodenelektrode 403 kommt mit einer Probe, einer Lösung oder dergleichen in Kontakt. Zu beachten ist, dass eine Detektionseinheit 404 an einer Position nahe dem Kapillarkopf 402 vorgesehen ist. Die Detektionseinheit 404 misst eine Probe, die in den Kapillaren 401 elektrophoretisch getrennt worden ist. Wenn die Kapillaren 401 beschädigt sind oder ihre Qualität nachgelassen hat, werden die betreffenden Kapillaren 401 nach Bedarf ersetzt.
  • Konfiguration der Thermostateinheit
  • Die Thermostateinheit 410 hat die Funktion, die Temperatur des Kapillarbündels 400 bei der Elektrophorese auf einer voreingestellten Temperatur zu halten. Die Thermostateinheit 410 ist ein flaches Bauteil mit einer Konfiguration, bei der die Kapillaren 400 im Sandwich zwischen einem Temperaturregelsubstrat mit einer daran angebrachten Heizeinheit und einem Wärmeisoliermaterial eingeschlossen sind. An dem Temperaturregelsubstrat ist auch ein Temperaturrückkopplungssensor angebracht. Hierbei ist ein Ende des Kapillarbündels 400 auf der Seite der Kathodenelektrode 403 an der Thermostateinheit 410 befestigt. Daher kann die Spitze des Kapillarkopfes 402 an einer gewünschten Position befestigt werden.
  • Konfiguration der Pumpen-/Puffereinheit
  • Die Pumpen-/Puffereinheit 450 ist eine Pumpe, die verwendet wird, um das Kapillarbündel 400 (genau genommen die einzelnen Kapillaren 401) mit einem Trennmedium wie etwa einem Polymer zu füllen.
  • 4 zeigt den detaillierten Aufbau der Pumpen-/Puffereinheit 450. Die Pumpen-/Puffereinheit 450 weist einen Abgabebehälter 451, einen Kolben 452 zum hermetischen Abdichten des Behälters und Ausüben von Druck auf das Innere des Behälters, ein Ventil 453, das eine Spitze des Abgabebehälters 451 und das Kapillarbündel 400 verbindet, und eine Anodenelektrode 454 auf, die an dem Ventil 453 oder dem Kolben 452 befestigt ist.
  • Eine Spitze der Anodenelektrode 454 steht nach innen von der Unterseite (das heißt einer Ebene mit einer Ausgangsöffnung) des Abgabebehälters 451 vor.
  • Ein Trennmedium 456 ist in dem Abgabebehälter 451 in einem Zustand enthalten, in dem der Kolben 452 herausgezogen ist (das heißt im Ausgangszustand). Es ist zu beachten, dass ein kleiner Beutel, der von einer Dünnschicht 455 umgeben ist, an einer Spitze des Kolbens 452 angebracht ist und das Innere des Beutels mit einer Anodenpufferlösung 457 gefüllt ist. Wie vorstehend beschrieben, ist das Innere des Abgabebehälters 451 in dem Zustand, in dem der Kolben 452 herausgezogen ist, in zwei Blöcke unterteilt. Daher besteht keine Möglichkeit, dass das Trennmedium 456 mit der Anodenpufferlösung 457 vermischt wird.
  • Um das Kapillarbündel 400 mit dem Trennmedium 456 zu füllen, wird der Kolben 452 mit von außen darauf einwirkendem Druck in das Innere des Abgabebehälters 451 geschoben. Dabei wird ein hoher Druck auf das Innere des Abgabebehälters 451 ausgeübt. Daher werden die Kapillaren 401 über das Ventil 453 mit dem Trennmedium 456 gefüllt.
  • Bei der Elektrophorese wird der Kolben 452 weiter unter Einwirkung von Druck darauf in das Innere des Abgabebehälters 451 gedrückt. Wenn der Hub des Kolbens 452 einen bestimmten Betrag überschreitet, ragt dabei die Spitze der Anodenelektrode 454 durch die Dünnschicht 455 hervor. Daher werden das Trennmedium 456 und die Anodenpufferlösung 457 in dem Abgabebehälter 451 vermischt.
  • Es ist zu beachten, dass das Trennmedium 456 und die Anodenpufferlösung 457 in der Pumpen-/Puffereinheit 450 auch in verschiedenen Bereichen in einem einzigen Bauteil enthalten sein können. Die Anodenelektrode 454 muss jedoch immer in Kontakt mit der Anodenpufferlösung 457 sein.
  • Konfiguration des Heizeinheit
  • Die Heizeinheit 500 wird verwendet, um die Temperatur einer Lösung in der Kartusche 200 aufrechtzuerhalten und die Temperatur mit Heizzyklen und dergleichen einzustellen. Bei dem in 1 gezeigten Beispiel, ist die Heizeinheit 500 im Inneren oder auf der Oberfläche des Aufnahmetischs für die Kartusche 200 angeordnet. Die Heizeinheit 500 und die Kartusche 200 werden zum Beispiel mit einer Befestigungsvorrichtung oder dergleichen befestigt.
  • Konfiguration der Flüssigkeitstransferpumpe
  • Die Flüssigkeitstransferpumpe 520 leitet Luft oder dergleichen zu den Regelventilen, die in der Kartusche 200 gebildet sind, und beaufschlagt die Strömungskanäle und die Behälter in der Kartusche mit oder verringert den Druck in diesen, wodurch der Transfer einer Lösung in der Kartusche 200 gesteuert wird.
  • Konfiguration der Regelventileinheit
  • Die Regelventileinheit 550 ist eine Funktionseinheit, die die Regelventile, die in der Kartusche 200 gebildet sind, öffnet und schließt.
  • Konfiguration der automatischen Probenahmeeinheit
  • Die automatische Probenahmeeinheit 600 ist ein Robotergerät, um die Kartusche 200 nacheinander zu der eingestellten Ausgangsposition, anschließend zu der Vorverarbeitungs-Reaktionseinheit und dann weiter zu den Probeneinführungsenden der Kapillaren 400 zu transportieren.
  • Konfiguration der Detektionseinheit
  • Die Detektionseinheit 700 bestrahlt die Detektionseinheit 404 des Kapillarbündels 400 mit Anregungslicht 701, das von einer Lichtquelle wie einem Laser oder einer LED ausgegeben wird, und erfasst Streulicht 702 und dergleichen, das von den Kapillaren 401 erzeugt wird, mit einem Detektor 703. Das erfasste Licht wird an ein Messgerät (nicht gezeigt) ausgegeben. Das Messgerät analysiert eine Probe auf der Grundlage der Signalintensität des erfassten Streulichts 702.
  • Konfiguration der Hochspannungsstromversorgungseinheit
  • Die Hochspannungsstromversorgungseinheit 800 ist an die Anodenelektrode 454 und die Kathodenelektrode 403 angeschlossen und führt die Elektrophorese durch Anlegen von Hochspannung an die mit einem Polymer gefüllten Kapillaren 401 durch.
  • Konfiguration der Steuerung
  • Die Steuerung 900 steuert den Betrieb jeder Einheit, so dass die Heizeinheit 500, die Flüssigkeitstransferpumpe 520 und die Regelventileinheit 550 im Zusammenwirken miteinander arbeiten.
  • Zusammenfassung der Vorgänge von der Vorverarbeitung bis zur Elektrophorese
  • Als Nächstes wird eine Reihe von Vorgängen beschrieben, die von dem integrierten Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegerät automatisch ausgeführt werden.
  • (1) Vorverarbeitungsvorgang
  • Hier wird eine Zusammenfassung der Vorverarbeitung anhand von 5 beschrieben. Es ist zu beachten, dass die Vorverarbeitung ein Vorgang ist, bei dem Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe wie etwa einem Abstrich oder Blut extrahiert werden und die Probe zur Analyse (das heißt zum Durchführen der Basensequenzanalyse mittels Kapillarelektrophorese) verarbeitet wird. Die Vorverarbeitung kann allgemein in drei Schritte unterteilt werden, zu denen das Extrahieren von Nukleinsäuren 1100, eine PCR-Reaktion 1200 und eine Zyklussequenzierungsreaktion 1300 gehören.
  • Es ist zu beachten, dass je nach dem Analyseziel die Kapillarelektrophorese 1400 nur ausgeführt werden kann, nachdem das Extrahieren von Nukleinsäuren 1100 und die PCR-Reaktion 1200 als Vorverarbeitung abgeschlossen sind.
  • Die drei Schritte können nach denselben Verfahren ausgeführt werden. Das heißt, jeder Schritt umfasst (1) das Mischen eines Reagens mit einer Probe 1101, (2) den Reaktionsverlauf 1102, (3) das Absorbieren von Nukleinsäuren auf einem Träger 1103, (4) das Waschen des Trägers 1104 und (5) das Eluieren von Nukleinsäuren 1105. Dabei entsprechen (1) und (2) der Ausführung von Reaktionen, während (3) bis (5) dem Reinigen von Reaktionspartnern entsprechen.
  • Nachstehend werden die Steuerungsoperationen beschrieben, die von der Steuerung 900 in jeder Stufe ausgeführt werden.
  • (1-1) Extrahieren von Nukleinsäuren
  • Beim Extrahieren von Nukleinsäuren 1100 wird zuerst die Steuerungsoperation 1101 von (1) ausgeführt. Bei der Steuerungsoperation 1101 wird eine Probe zuerst in die Kartusche 200 eingeführt. Die Probe wird in einen Reaktionsbehälter überführt, in dem sich ein Reagens befindet, und auf diese Weise mit dem Reagens vermischt. Die Probe ist zum Beispiel eine biologische Probe. Dabei ist das Reagens zum Beispiel eine zelllösliche Lösung, eine Pufferlösung oder dergleichen.
  • Als Nächstes wird die Steuerungsoperation 1102 von (2) ausgeführt. Bei der Steuerungsoperation 1102 wird die Kartusche 200 mit der Heizeinheit 500 auf eine geeignete Reaktionstemperatur erwärmt oder gekühlt. Wenn die Temperatur auf diese Weise eingestellt wird, löst sich die biologische Probe und die Nukleinsäuren werden freigesetzt.
  • Danach wird die Steuerungsoperation 1103 von (3) ausgeführt. Bei der Steuerungsoperation 1103 wird die gelöste Probe in einen Trägerbehälter überführt, so dass die Probe mit einem Träger vermischt wird und die Nukleinsäuren auf der Oberfläche des Trägers absorbiert werden. Als Nächstes wird die Steuerungsoperation 1104 von (4) ausgeführt. Bei der Steuerungsoperation 1104 wird eine Reinigungslösung in den Trägerbehälter überführt, so dass das Reagens und die Probe mit Ausnahme der auf dem Träger absorbierten Nukleinsäuren weggewaschen werden. Dabei ist zu beachten, dass die Abfallflüssigkeit danach in einen Abfallflüssigkeitsbehälter überführt wird. Zum Schluss wird die Steuerungsoperation 1105 von (5) ausgeführt. Bei der Steuerungsoperation 1105 wird ein Eluat in den Trägerbehälter überführt, so dass die auf dem Träger absorbierten Nukleinsäuren wiedergewonnen werden.
  • (1-2) PCR-Reaktion
  • Bei der PCR-Reaktion 1200 wird ebenfalls zuerst die Steuerungsoperation 1101 von (1) ausgeführt. Bei der Steuerungsoperation 1101 wird die Probe nach dem Extrahieren von Nukleinsäuren aus dem Nukleinsäureextraktionsblock 201 in den PCR-Block 202 überführt. Die Probe wird in einen Reaktionsbehälter überführt, in dem sich ein Reagens (das heißt Primer, dNTP, Pufferlösung oder Enzyme) befindet, und auf diese Weise mit dem Reagens vermischt.
  • Als Nächstes wird die Steuerungsoperation 1102 von (2) ausgeführt. Bei der Steuerungsoperation 1102 wird die Temperatur des Lösungsgemischs in der Kartusche 200 durch Heizzyklen der Heizeinheit 500 auf eine geeignete Reaktionstemperatur erwärmt oder gekühlt. Diese Temperatureinstellung ermöglicht eine Verstärkung nur des Zielbereichs der Nukleinsäuren.
  • Danach wird die Steuerungsoperation 1103 von (3) ausgeführt. Bei der Steuerungsoperation 1103 wird das Reaktionsprodukt in einen Trägerbehälter überführt, so dass das Reaktionsprodukt mit einem Träger vermischt wird und die Nukleinsäuren auf der Oberfläche des Trägers absorbiert werden. Als Nächstes wird die Steuerungsoperation 1104 von (4) ausgeführt. Bei der Steuerungsoperation 1104 wird eine Reinigungslösung in den Trägerbehälter überführt, so dass das Reagens und die Probe mit Ausnahme der auf dem Träger absorbierten Nukleinsäuren weggewaschen werden. Dabei ist zu beachten, dass die Abfallflüssigkeit danach in einen Abfallflüssigkeitsbehälter überführt wird. Zum Schluss wird die Steuerungsoperation 1105 von (5) ausgeführt. Bei der Steuerungsoperation 1105 wird hier ein Eluat in den Trägerbehälter überführt, so dass die auf dem Träger absorbierten Nukleinsäuren wiedergewonnen werden.
  • (1-3) Zyklussequenzierungsreaktion
  • Bei der Zyklussequenzierungsreaktion 1300 wird ebenfalls zuerst die Steuerungsoperation 1101 von (1) ausgeführt. Bei der Steuerungsoperation 1101 wird hier ein Produkt der PCR-Reaktion zuerst aus dem PCR-Block 202 in den Zyklussequenzierungsblock 203 überführt. Das Produkt aus dem PCR-Block 202 wird in einen Reaktionsbehälter überführt, in dem sich ein Reagens (das heißt Primer, fluoreszenzmarkierte dNTP, Enzyme oder Pufferlösung) befindet, und auf diese Weise mit dem Reagens vermischt.
  • Als Nächstes wird die Steuerungsoperation 1102 von (2) ausgeführt. Bei der Steuerungsoperation 1102 wird die Temperatur des Lösungsgemischs in der Kartusche 200 durch Heizzyklen der Heizeinheit 500 auf eine geeignete Reaktionstemperatur erwärmt oder gekühlt. Diese Temperatureinstellung ermöglicht eine Hybridisierung von fluoreszenzmarkierten dNTP mit den Nukleinsäuren.
  • Danach wird die Steuerungsoperation 1103 von (3) ausgeführt. Bei der Steuerungsoperation 1103 wird das Reaktionsprodukt in einen Trägerbehälter überführt, so dass das Reaktionsprodukt mit einem Träger vermischt wird und die Nukleinsäuren auf der Oberfläche des Trägers absorbiert werden. Als Nächstes wird die Steuerungsoperation 1104 von (4) ausgeführt. Bei der Steuerungsoperation 1104 wird hier eine Reinigungslösung in den Trägerbehälter überführt, so dass das Reagens und die Probe mit Ausnahme der auf dem Träger absorbierten Nukleinsäuren weggewaschen werden. Dabei ist zu beachten, dass die Abfallflüssigkeit danach in einen Abfallflüssigkeitsbehälter überführt wird. Zum Schluss wird die Steuerungsoperation 1105 von (5) ausgeführt. Bei der Steuerungsoperation 1105 wird ein Eluat in den Trägerbehälter überführt, so dass die auf dem Träger absorbierten Nukleinsäuren wiedergewonnen werden. Das heißt überschüssige Fluoreszenz, Primer und dergleichen werden aus dem Reaktionsprodukt entfernt, so dass die Nukleinsäuren wiedergewonnen werden. Die Nukleinsäuren werden in dem Phoreseblock 204 wiedergewonnen.
  • (2) Phoresevorgang
  • Die in dem Phoreseblock 204 wiedergewonnenen Nukleinsäuren werden der Kapillarelektrophorese 1400 unterzogen.
  • Aufbau der einzelnen Blöcke und Flüssigkeitstransfer
  • Als Nächstes werden die Flüssigkeitstransferverfahren in jedem Block der Kartusche 200 im Einzelnen beschrieben. Dabei ist zu beachten, dass die allgemeinen Konfigurationen und Flüssigkeitstransferverfahren für den Nukleinsäureextraktionsblock 201, den PCR-Block 202 und den Zyklussequenzierungsblock 203 identisch sind. Außerdem ist zu beachten, dass die Kartusche 200 vorzugsweise aus einem Material hergestellt ist, auf dem eine biologische Probe nur schwer absorbiert wird, zum Beispiel Quarzglas, PMMA oder Polycarbonat.
  • 6 zeigt eine beispielhafte Konfiguration des Nukleinsäureextraktionsblocks 201. Der Nukleinsäureextraktionsblock 201 umfasst einen Reagensbehälter 211, der ein Reagens enthält, einen Reaktionsbehälter 212, in dem eine eingebrachte biologische Probe mit dem Reagens vermischt wird, einen Trägerbehälter 213, der einen Träger zur Verwendung bei der Reinigung eines Reaktionsprodukts enthält, einen Reinigungslösungsbehälter 214, der eine Reinigungslösung zum Waschen des Trägers enthält, einen Abfallflüssigkeitsbehälter 215, der eine Lösung außer den Nukleinsäuren aus dem Trägerbehälter aufnimmt, und einen Eluatbehälter 216, der ein Eluat zum Wiedergewinnen der Nukleinsäuren aus dem Träger enthält.
  • Für den Reagensbehälter 211 wird ein hermetisch abgedichteter Aufbau verwendet, so dass die Kartusche mit einem Reagens in dem Reagensbehälter 211 transportiert werden kann. Dabei ist es auch möglich, eine Analyse durch Injizieren eines beliebigen Reagens in einen leeren Reagensbehälter 211 unmittelbar vor Beginn der Analyse durchzuführen.
  • Die Strömungskanäle 241 bis 246 und die Regelventile 231 bis 237 zum Steuern des Öffnens und Schließens der Strömungskanäle sind zwischen den Behältern 211 bis 216 vorgesehen. Der Strömungskanal 246 ist ein Strömungskanal, der den Nukleinsäureextraktionsblock 201 und den PCR-Block 202 verbindet. Außerdem weist der Nukleinsäureextraktionsblock 201 Öffnungen bzw. Ports 217 bis 220 zur Verwendung beim Überführen einer Lösung unter Druckeinwirkung von der Flüssigkeitstransferpumpe 520 sowie Port-Strömungskanäle 221 bis 224 auf. Die Port-Strömungskanäle 221 bis 224 sind Strömungskanäle, die jeweils die Ports 217 bis 220 und deren entsprechende Behälter verbinden.
  • Das Regelventil 231 ist in einem Strömungskanal 241 angeordnet, der den Reagensbehälter 211 und den Reaktionsbehälter 212 verbindet. Das Regelventil 232 ist in einem Strömungskanal 242 angeordnet, der den Reaktionsbehälter 212 und den Trägerbehälter 213 verbindet. Das Regelventil 233 ist in einem Strömungskanal 243 angeordnet, der den Reinigungslösungsbehälter 214 und den Trägerbehälter 213 verbindet. Das Regelventil 234 und das Regelventil 235 sind in einem Strömungskanal 244 angeordnet, der den Trägerbehälter 213 und den Abfallflüssigkeitsbehälter 215 verbindet. Das Regelventil 236 ist in einem Strömungskanal 245 angeordnet, der den Eluatbehälter 216 und den Trägerbehälter 213 verbindet. Das Regelventil 237 ist in einem Strömungskanal 246 angeordnet, der den Trägerbehälter 213 und den PCR-Block 202 verbindet.
  • Der Trägerbehälter 213 ist über die verschiedenen Strömungskanäle 242, 243, 244 bzw. 245 mit dem Reaktionsbehälter 212, dem Reinigungslösungsbehälter 214, dem Abfallflüssigkeitsbehälter 215 und dem Eluatbehälter 216 verbunden. Zu beachten ist, dass die Strömungsrichtungen aller Strömungskanäle im Voraus festgelegt sind, und ein Rückströmen ist im Prinzip nicht möglich.
  • Der Reagensbehälter 211, der Reinigungslösungsbehälter 214, der Abfallflüssigkeitsbehälter 215 und der Eluatbehälter 216 sind über die Port-Strömungskanäle 221, 223, 222 bzw. 224 mit den Ports 217, 219, 218 und 220 verbunden.
  • Ein in dem Trägerbehälter 213 enthaltener Träger ist vorzugsweise einer, auf dem Nukleinsäuren besonders leicht absorbiert werden, zum Beispiel Glasperlen, Glaswolle oder poröses Glas. Um den Reinigungsgrad weiter zu erhöhen, kann ein Verfahren verwendet werden, bei dem Primer, denen zuvor Biotin zugesetzt worden ist, für die Reaktion benutzt werden, und bei dem die Oberfläche des Trägerbehälters 213 mit Streptavidin modifiziert ist. Die Reinigungslösung enthält eine hohe Konzentration eines organischen Lösungsmittels wie etwa Alkohol und entfernt andere Bestandteile außer Nukleinsäuren aus dem Träger, indem der Träger mehrmals gewaschen wird.
  • 7 zeigt eine beispielhafte Konfiguration des PCR-Blocks 202. Der PCR-Block 202 umfasst einen Reagensbehälter 251, der ein Reagens enthält, einen Reaktionsbehälter 252, in dem ein Produkt aus dem Nukleinsäureextraktionsblock 201 mit dem Reagens vermischt wird und der Heizzyklen ausführt, einen Trägerbehälter 253, der einen Träger zur Verwendung bei der Reinigung eines Reaktionsprodukts enthält, einen Reinigungslösungsbehälter 254, der eine Reinigungslösung zum Waschen des Trägers enthält, einen Abfallflüssigkeitsbehälter 255, der eine Lösung außer den Nukleinsäuren aus dem Trägerbehälter aufnimmt, und einen Eluatbehälter 256, der ein Eluat zum Wiedergewinnen der Nukleinsäuren aus dem Träger enthält.
  • Die Strömungskanäle 281 bis 286 und die Regelventile 271 bis 277 zum Steuern des Öffnens und Schließens der Strömungskanäle sind zwischen den Behältern 251 bis 256 vorgesehen. Der Strömungskanal 286 ist ein Strömungskanal, der den PCR-Block 202 und den Zyklussequenzierungsblock 203 verbindet. Außerdem weist der PCR-Block 202 Öffnungen bzw. Ports 257 bis 260 zur Verwendung beim Überführen einer Lösung unter Druckeinwirkung von der Flüssigkeitstransferpumpe 520 sowie Port-Strömungskanäle 261 bis 264 auf. Die Port-Strömungskanäle 261 bis 264 sind Strömungskanäle, die jeweils die Ports 257 bis 260 und deren entsprechende Behälter verbinden. In dem PCR-Block 202 sind die Strömungsrichtungen aller Strömungskanäle ebenfalls im Voraus festgelegt, und ein Rückströmen ist im Prinzip nicht möglich.
  • 8 zeigt eine beispielhafte Konfiguration des Zyklussequenzierungsblocks 203. Der Zyklussequenzierungsblock 203 umfasst einen Reagensbehälter 311, der ein Reagens enthält, einen Reaktionsbehälter 312, in dem ein Produkt aus dem PCR-Block 202 mit dem Reagens vermischt wird und der Heizzyklen ausführt, einen Trägerbehälter 313, der einen Träger zur Verwendung bei der Reinigung eines Reaktionsprodukts enthält, einen Reinigungslösungsbehälter 314, der eine Reinigungslösung zum Waschen des Trägers enthält, einen Abfallflüssigkeitsbehälter 315, der eine Lösung außer den Nukleinsäuren aus dem Trägerbehälter aufnimmt, und einen Eluatbehälter 316, der ein Eluat zum Wiedergewinnen der Nukleinsäuren aus dem Träger enthält.
  • Die Strömungskanäle 341 bis 346 und die Regelventile 331 bis 337 zum Steuern des Öffnens und Schließens der Strömungskanäle sind zwischen den Behältern 311 bis 316 vorgesehen. Der Strömungskanal 346 ist ein Strömungskanal, der den Zyklussequenzierungsblock 203 und den Phoreseblock 204 verbindet. Außerdem weist der Zyklussequenzierungsblock 203 ebenfalls Öffnungen bzw. Ports 317 bis 320 zur Verwendung beim Überführen einer Lösung unter Druckeinwirkung von der Flüssigkeitstransferpumpe 520 sowie Port-Strömungskanäle 321 bis 324 auf. Die Port-Strömungskanäle 321 bis 324 sind Strömungskanäle, die jeweils die Ports 317 bis 320 und deren entsprechende Behälter verbinden. In dem Zyklussequenzierungsblock 203 sind die Strömungsrichtungen aller Strömungskanäle ebenfalls im Voraus festgelegt, und ein Rückströmen ist im Prinzip nicht möglich.
  • 9 zeigt eine beispielhafte Konfiguration des Phoreseblocks 204. Der Phoreseblock 204 umfasst einen Phoreselösungsbehälter 351, einen Kathodenpufferlösungsbehälter 352, der eine Pufferlösung mit einem Elektrolyt enthält, und einen Reinigungslösungsbehälter 353, der eine Reinigungslösung zum Reinigen der Kapillaren enthält. Dabei ist der Phoreselösungsbehälter 351 über den Strömungskanal 346 mit dem Zyklussequenzierungsblock 203 verbunden. Außerdem weist der Phoreseblock 204 auch eine Öffnung bzw. einen Port 354 zur Verwendung beim Überführen einer Lösung unter Druckeinwirkung von der Flüssigkeitstransferpumpe 520 sowie einen Port-Strömungskanal 355 auf. Der Port-Strömungskanal 355 verbindet den Port 354 und den Phoresebehälter 351.
  • Diese Ausführungsform beschreibt einen Fall, bei dem in jedem der Blöcke vom Nukleinsäureextraktionsblock 201 bis zum Zyklussequenzierungsblock 203 ein Reinigungslösungsbehälter und ein Abfallflüssigkeitsbehälter einzeln ausgebildet sind, wie in 6 bis 8 gezeigt. Der Reinigungslösungsbehälter und der Abfallflüssigkeitsbehälter in jedem Block können auch als ein einziger Behälter kombiniert werden. Obwohl diese Ausführungsform einen Fall beschreibt, bei dem die Anzahl der Blöcke, die die Kartusche 200 bilden, vier beträgt, kann darüber hinaus die Anzahl der Blöcke erhöht oder verringert werden, abhängig von der zu untersuchenden Probe oder abhängig davon, welche Art von Probenanalyse gestartet wird.
  • Öffnen/Schließen der Regelventile mit Flüssigkeitstransfer
  • Nachstehend werden die Verfahren zur Durchführung der Vorverarbeitung und Kapillarelektrophorese mit der Kartusche 200 beschrieben. Eine Reihe von Verfahren von der Vorverarbeitung bis zur Kapillarelektrophorese wird im Wesentlichen durch eine Kombination aus dem Mischen eines Reagens, das durch Transfer einer Flüssigkeit bewirkt wird, und eine Wärmebehandlung realisiert. Die nachfolgende Beschreibung basiert auf der Annahme, dass ein Pumpendruckverfahren, das das allgemein übliche Verfahren darstellt, für das Überführen einer Flüssigkeit verwendet wird.
  • Zunächst befinden sich die Regelventile und die Öffnungen/Ports an der Kartusche 200 alle in der geschlossenen Stellung, und die Vorgänge zum Öffnen werden nach Bedarf ausgeführt. Ein Regelventil in der geschlossenen Stellung verfügt über einen Mechanismus, der keine Lösungen und dergleichen durchlässt, wohl aber Gas wie etwa Luft durchlassen kann. Weil ein Regelventil mit dieser Art von Eigenschaften bereits bekannt ist, wird hier auf dessen ausführliche Beschreibung verzichtet.
  • Der Transfer einer Lösung in dem Nukleinsäureextraktionsblock 201, dem PCR-Block 202 und dem Zyklussequenzierungsblock 203 erfolgt jeweils, indem nacheinander fünf Flüssigkeitstransfervorgänge in jedem Block durchgeführt werden. Hier wird ein Beispiel für den ersten Nukleinsäureextraktionsblock 201 beschrieben. Die nachfolgende Beschreibung gilt auch für die Flüssigkeitstransfervorgänge in dem PCR-Block 202 und dem Zyklussequenzierungsblock 203.
  • Vorgang (1)
  • Zuerst wird eine biologische Probe, etwa ein Abstrich oder Blut, in den Reaktionsbehälter 212 eingebracht, und der Behälter wird mit einer Dichtung oder dergleichen abgedeckt, um ihn hermetisch zu verschließen. In diesem Zustand werden das Regelventil 231 und die Ports 217 und 218 geöffnet, so dass Luft durch den Port 217 injiziert wird. Danach strömt die Luft nacheinander durch den Port 217 -> den Reagensbehälter 211 -> den Reaktionsbehälter 212 -> den Trägerbehälter 213 -> den Abfallflüssigkeitsbehälter 215 -> den Port 218. Wenn Luft in den Port 217 injiziert wird, strömt ein in dem Reagensbehälter 211 enthaltenes Reagens durch den Strömungskanal 241 in den Reaktionsbehälter 212 und wird dann mit der biologischen Probe vermischt. Dabei kann die Kartusche 200 nach Bedarf mit der Heizeinheit 500 erwärmt werden, um die Temperatur des Lösungsgemischs in dem Reaktionsbehälter 212 auf eine geeignete Temperatur einzustellen.
  • Vorgang (2)
  • Als Nächstes wird weiter Luft durch den Port 217 injiziert, während das Regelventil 232 in der geöffneten Stellung ist. Dabei ist zu beachten, dass der Strömungskanal für die Luft derselbe ist wie in Vorgang (1). In diesem Fall strömt das Lösungsgemisch aus der biologischen Probe und dem Reagens in dem Reaktionsbehälter 212 über den Strömungskanal 242 in den Trägerbehälter 213. Dabei bleiben Nukleinsäuren in dem Lösungsgemisch an dem Träger in dem Trägerbehälter 213 haften.
  • Vorgang (3)
  • Als Nächstes werden das Regelventil 232 und der Port 217 geschlossen, und die Regelventile 233 bis 235 und der Port 219 werden geöffnet. Es sei darauf hingewiesen, dass der Port 218 geöffnet bleibt. In diesem Zustand wird Luft durch den Port 219 injiziert. Danach strömt die Luft nacheinander durch den Port 219 -> den Reinigungslösungsbehälter 214 -> den Trägerbehälter 213 -> den Abfallflüssigkeitsbehälter 215 -> den Port 218. Wenn Luft in den Port 219 injiziert wird, strömt das Lösungsgemisch in dem Trägerbehälter 213 über den Strömungskanal 244 in den Abfallflüssigkeitsbehälter 215 aus. Stattdessen strömt eine Reinigungslösung, die in dem Reinigungslösungsbehälter 214 enthalten ist, über den Strömungskanal 243 in den Trägerbehälter 213. Wenn das Injizieren von Luft in den Port 219 weiter fortgesetzt wird, wird die in dem Trägerbehälter 213 enthaltene Reinigungslösung vollständig in den Abfallflüssigkeitsbehälter 215 überführt. Danach werden die Regelventile 233 bis 235 geschlossen, um ein Rückströmen und Vermischen zu vermeiden. Das mehrmalige Wiederholen dieser Vorgänge kann die Reinigungswirkung erhöhen.
  • Vorgang (4)
  • Als Nächstes wird der Port 219 geschlossen, und das Regelventil 236 und der Port 220 werden geöffnet. Dabei bleibt der Port 218 geöffnet. Danach strömt die Luft nacheinander durch den Port 219 -> den Reinigungslösungsbehälter 214 -> den Trägerbehälter 213 -> den Abfallflüssigkeitsbehälter 215 -> den Port 218. Wenn Luft durch den Port 220 injiziert wird, strömt ein in dem Eluatbehälter 216 enthaltenes Eluat über den Strömungskanal 245 in den Trägerbehälter 213.
  • Vorgang (5)
  • Nachdem das Eluat in dem Eluatbehälter 216 in den Trägerbehälter 213 geströmt ist, wird der Behälter eine ausreichende Zeit lang in Ruhe gelassen, damit sich die Nukleinsäuren, die an dem Träger haften geblieben sind, in dem Eluat lösen können. Danach wird der Port 218 geschlossen, und das Regelventil 237 und der Port 258 werden geöffnet. Dabei wird der Port 258 in dem PCR-Block 202 geöffnet. Danach strömt die Luft nacheinander durch den Port 220 -> den Eluatbehälter 216 -> den Trägerbehälter 213 -> den Reaktionsbehälter 252 -> den Trägerbehälter 253 -> den Abfallflüssigkeitsbehälter 255 -> den Port 258. In diesem Zustand wird Luft durch den Port 220 injiziert. Danach strömt die Lösung in dem Trägerbehälter 213 über den Strömungskanal 246 in den Reaktionsbehälter 252 in dem nächsten Block, das heißt den PCR-Block 202. Wenn der Flüssigkeitstransfer aus dem Nukleinsäureextraktionsblock 201 in den PCR-Block 202 abgeschlossen ist, wie vorstehend beschrieben, werden die Ports 220 und 258 geschlossen.
  • Bei dieser Ausführungsform weisen der PCR-Block 202 und der Zyklussequenzierungsblock 203 jeweils denselben Aufbau wie der Nukleinsäureextraktionsblock 201 auf. Daher werden ähnliche Vorgänge wie die vorstehend beschriebenen Vorgänge (1) bis (5) in dem PCR-Block 202 und in dem Zyklussequenzierungsblock 203 jeweils wiederholt durchgeführt.
  • Als Nächstes wird der Transfer einer Lösung in den Phoreseblock 204 beschrieben. Ein Denaturierungsmittel wie etwa Formamid ist in dem Phoreselösungsbehälter 351 in dem Phoreseblock 204 enthalten. Das aus dem Zyklussequenzierungsblock 203 überführte Eluat wird mit dem Denaturierungsmittel in dem Phoreselösungsbehälter 351 vermischt. Es ist zu beachten, dass in dem Phoreseblock 204 der Kathodenpufferlösungsbehälter 352 und der Reinigungslösungsbehälter 353 zusätzlich zu dem Phoreselösungsbehälter 351 vorgesehen sind. Eine Öffnung in jedem Behälter ist mit einer Dünnschicht wie etwa einer Dichtung abgedeckt, um ein Verdunsten der Lösung aus dem jeweiligen Behälter und eine Verunreinigung von der Außenseite zu vermeiden.
  • Wenn die Kapillarelektrophorese durchgeführt wird, werden die Spitzen der Kapillaren 401 veranlasst, die Dünnschicht, die die Öffnung des Phoreselösungsbehälters 351 abdeckt, zu durchstoßen, so dass die Spitzen der Kapillaren 401 in eine Lösung in dem Behälter eintauchen. Alternativ kann die Dünnschicht nicht durch die Spitzen der Kapillaren durchstoßen werden, sondern durch eine separat vorgesehene Nadel. Als weitere Alternative kann die Öffnung jedes Behälters nicht mit einer Dichtung, sondern mit einer Gummischicht mit einem Schlitz abgedeckt sein, so dass die Spitzen der Kapillaren durch den Schlitz eingesteckt werden können.
  • Verarbeitungsvorgang im integrierten Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegerät
  • 10 zeigt die Betriebsverfahren für das integrierte Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegerät 100 nach dieser Ausführungsform. Jeder Schritt wird anhand ergänzender Erläuterungen der Zeichnungen beschrieben.
  • Schritt 2001
  • Als eine Voraussetzung wird die Kartusche 200 mit einer Probe darin an dem Aufnahmetisch des integrierten Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegeräts 100 angebracht. Darüber hinaus wird die Pumpen-/Puffereinheit 450 an dem integrierten Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegerät 100 angebracht. Wenn die Stromversorgung zum Hauptteil des Geräts in diesem Zustand eingeschaltet wird, werden die vorliegenden Betriebsverfahren gestartet. Zuerst wird die Kartusche 200, in der sich eine biologische Probe und ein Reagens befinden, auf der automatischen Probenahmeeinheit 600 befestigt. Dabei befindet sich die Unterseite der Kartusche 200 in Kontakt mit der Heizeinheit 500. Die Regelventile 231 bis 237, 271 bis 277 und 331 bis 337 der Kartusche 200 sind mit der Regelventileinheit 550 verbunden, während die Ports 217 bis 220, 257 bis 260 und 317 bis 320 mit der Flüssigkeitstransferpumpe 520 verbunden sind. Darüber hinaus ist die Pumpen-/Puffereinheit 450 mit einem Ende des Kapillarbündels 400 und mit der Hochspannungsstromversorgungseinheit 800 verbunden.
  • Schritt 2002
  • In diesem Zustand wird die Temperatureinstellung durch die Heizeinheit 500 gestartet. Die Temperatur kann vom Benutzer bei jeder Verwendung des Geräts manuell eingestellt werden oder sie kann automatisch auf eine vorbestimmte Temperatur entsprechend der durchzuführenden Messung eingestellt werden. In dieser Phase wird auch die Bestrahlung mit dem Laser 701 gestartet. Es ist zu beachten, dass ein Ausgang unmittelbar nach dem Starten der Laserbestrahlung instabil ist. Daher kann die Laserbestrahlung zur Aufrechterhaltung der Detektionsempfindlichkeit im Voraus gestartet werden, bevor die Elektrophorese gestartet wird.
  • Schritt 2003
  • Ein Arm der automatischen Probenahmeeinheit 600, an der die drei Einheiten Kartusche 200, Heizeinheit 500 und Regelventileinheit 520 befestigt sind, wird bewegt, um die Spitze des Kapillarbündels 400 in den Kathodenpufferlösungsbehälter 352 einzutauchen.
  • Schritt 2004
  • Als Nächstes wird manuell oder mittels automatischer Steuerung eine externe Kraft auf den Kolben 452 der Pumpen-/Puffereinheit 450 ausgeübt, so dass das Kapillarbündel 400 mit dem Trennmedium 456 gefüllt wird, das in der Pumpen-/Puffereinheit 450 enthalten ist. Gleichzeitig wird die Anodenelektrode 454 in die Anodenpufferlösung 457 eingetaucht.
  • Schritt 2005
  • In der Kartusche 200 werden das Extrahieren von Nukleinsäuren, eine PCR-Reaktion und eine Zyklussequenzierungsreaktion kontinuierlich durchgeführt. Die Ausführungsverfahren hierfür sind wie vorstehend beschrieben. Darüber hinaus wird durch die Hochspannungsstromversorgungseinheit 800 eine Spannung an die gegenüberliegenden Enden der Kapillaren angelegt. Dieser Vorgang wird als Vorlauf bezeichnet. Wenn der Vorlauf über längere Zeit durchgeführt wird, kann die Analyseleistung der Kapillarelektrophorese vorteilhaft verbessert werden.
  • Schritt 2006
  • Eine Probe in dem Zyklussequenzierungsblock 203 wird mittels der Regelventileinheit 550 und der Flüssigkeitstransferpumpe 520 in den Phoreselösungsbehälter 351 in der nächsten Stufe überführt. Wenn ein Reagens, ein Lösungsgemisch und eine Reaktionslösung in die Kartusche 200 überführt werden, ist es möglich, die Menge der überführten Flüssigkeit einzustellen, indem die Menge der Luft eingestellt wird, die von der Pumpe 520 injiziert wird. Es ist wünschenswert, dass ein Eluat in jedem Block nicht vollständig in den nächsten Behälter überführt wird, sondern teilweise aufgehoben wird. Dadurch ist es möglich, die Analyse später wieder ab der mittleren Phase des Prozesses auszuführen.
  • Schritt 2007
  • Hier wird das Anlegen der Spannung zeitweilig unterbrochen. In diesem Zustand wird die automatische Probenahmeeinheit 600 betätigt, um die Spitze des Kapillarbündels 400 in den Phoreselösungsbehälter 351 einzuführen.
  • Schritt 2008
  • Von der Hochspannungsstromversorgungseinheit 800 wird für kurze Zeit eine niedrige Spannung an die gegenüberliegenden Enden des Kapillarbündels angelegt, wodurch eine geeignete Menge der Probe in das mit dem Trennmedium gefüllte Kapillarbündel 400 eingebracht werden kann.
  • Schritt 2009
  • Die automatische Probenahmeeinheit 600 wird erneut betätigt, um die Spitze des Kapillarbündels 400 in eine Kathodenpufferlösung in dem Kathodenpufferlösungsbehälter 352 einzutauchen.
  • Schritt 2010
  • Von der Hochspannungsstromversorgungseinheit 800 wird eine Hochspannung an das Kapillarbündel 400 angelegt, um die Elektrophorese durchzuführen. Während der Elektrophorese wird die Detektionseinheit 404 der Kapillaren 401 mit Anregungslicht 701 bestrahlt. Der Detektor 703 erfasst eine Probe, die als Reaktion auf das Anregungslicht 701 Fluoreszenzlicht emittiert, und gibt die Detektionsergebnisse an ein Messgerät (nicht gezeigt) aus. Das Messgerät analysiert die Probe auf der Grundlage der Detektionsergebnisse.
  • Schritt 2011
  • An dieser Stelle endet die Elektrophorese.
  • Schritt 2012
  • Nach Beendigung des Anlegens der Spannung wird die automatische Probenahmeeinheit 600 betätigt, um die Spitze des Kapillarbündels 400 in den Reinigungslösungsbehälter 353 einzutauchen. Wasser zum Reinigen der Spitzen und des Inneren der Kapillaren ist in dem Reinigungslösungsbehälter 353 enthalten.
  • Schritt 2013
  • Der Kolben 452 der Pumpen-/Puffereinheit 450 wird manuell oder mittels automatischer Steuerung herausgezogen, so dass das Innere des Kapillarbündels mit der Reinigungslösung gefüllt wird. Wenn dieser Vorgang mehrmals wiederholt wird, kann die Reinigungswirkung verbessert werden.
  • Fazit
  • Wenn die Kartusche 200 nach dieser Ausführungsform in Kombination mit der Vorverarbeitung (zum Beispiel dem Extrahieren von Nukleinsäuren, einer Verstärkungsreaktion und einer Zyklussequenzierungsreaktion) verwendet wird, wie vorstehend beschrieben, wird es möglich, die Automatisierung aller Reaktionsschritte von der Vorverarbeitung bis zur Elektrophorese unter Verwendung eines einzigen Geräts und einer einzigen Kartusche vorzunehmen.
  • Zweite Ausführungsform
  • Diese Ausführungsform zeigt eine beispielhafte Konfiguration der Kartusche 200, die für einen Fall geeignet ist, wo die Kapillarelektrophorese an gereinigten Nukleinsäuren durchgeführt wird, um Fragmente zu analysieren. Die Grundkonfiguration und der Betrieb des integrierten Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegeräts 100 sind ähnlich denen bei der ersten Ausführungsform. Nachstehend werden hauptsächlich die Unterschiede zwischen dieser Ausführungsform und der ersten Ausführungsform beschrieben.
  • 11 zeigt eine beispielhafte Konfiguration der Kartusche 200 nach dieser Ausführungsform. Die in 11 gezeigte Kartusche 200 umfasst nur den PCR-Block 202 und den Phoreseblock 204. Der Nukleinsäureextraktionsblock 201 und der Zyklussequenzierungsblock 203 sind hier weggelassen.
  • Bei dieser Ausführungsform wird eine Lösung der gereinigten Nukleinsäuren in den Reaktionsbehälter 252 eingebracht, und danach wird der Behälter mit einer Dichtung oder dergleichen abgedeckt, um ihn hermetisch zu verschließen, so dass ein Verarbeitungsschritt gestartet wird. Die folgenden Schritte sind dieselben wie bei der ersten Ausführungsform. Auch in diesem Fall können ähnliche vorteilhafte Wirkungen wie bei der ersten Ausführungsform erzielt werden.
  • Dritte Ausführungsform
  • Bei dieser Ausführungsform ist ein anderes Reagens in dem Behälter enthalten, um die Durchführung einer anderen Analyse zu ermöglichen. Wie vorstehend beschrieben, ist der Reagensbehälter 251 in dem PCR-Block 202 hermetisch verschlossen, so dass die Kartusche mit einem Reagens in dem Reagensbehälter 251 transportiert werden kann. Dabei ist es auch möglich, eine Analyse durch Injizieren eines beliebigen Reagens in einen leeren Reagensbehälter 251 unmittelbar vor Beginn der Analyse durchzuführen.
  • Als ein Beispiel wird ein Verfahren zur Durchführung einer Short-Tandem-Repeat-Analyse (STR-Analyse) an gereinigten Nukleinsäuren beschrieben. Dabei ist zu beachten, dass die Grundkonfiguration und der Betrieb des integrierten Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegeräts 100 ähnlich denen bei der zweiten Ausführungsform sind.
  • Diese Ausführungsform unterscheidet sich von der zweiten Ausführungsform darin, dass ein Lösungsgemisch von Enzymen, dNTP, eine Pufferlösung und dergleichen zur Verwendung in einer PCR-Reaktion in dem Reagensbehälter 251 enthalten sind, während sich ein fluoreszenzmarkiertes Primer-Lösungsgemisch entsprechend einem STR-Bereich in dem Reaktionsbehälter 252 befindet. Auch in diesem Fall können ähnliche vorteilhafte Wirkungen wie bei der zweiten Ausführungsform erzielt werden.
  • Vierte Ausführungsform
  • Diese Ausführungsform beschreibt eine Konfiguration, mit der eine PCR-Reaktion und eine Zyklussequenzierungsreaktion an gereinigten Nukleinsäuren durchgeführt werden können. Die Grundkonfiguration und der Betrieb des integrierten Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegeräts 100 sind ähnlich denen bei der ersten Ausführungsform. Nachstehend werden hauptsächlich die Unterschiede zwischen der ersten Ausführungsform und der vorliegenden Ausführungsform beschrieben.
  • 12 zeigt eine beispielhafte Konfiguration der Kartusche 200 nach dieser Ausführungsform. Die in 12 gezeigte Kartusche 200 umfasst nur drei Blöcke, das heißt den PCR-Block 202, den Zyklussequenzierungsblock 203 und den Phoreseblock 204. Der Nukleinsäureextraktionsblock 201 ist hierbei weggelassen.
  • Bei dieser Ausführungsform wird ein Reaktionsvorgang in einem Zustand gestartet, in dem eine Lösung von gereinigten Nukleinsäuren in den Reaktionsbehälter 252 eingebracht wird und der Reaktionsbehälter 252 mit einer Dichtung oder dergleichen abgedeckt und auf diese Weise hermetisch verschlossen wird. Die folgenden Schritte sind ähnlich denen bei der ersten Ausführungsform. Auch in diesem Fall können ähnliche vorteilhafte Wirkungen wie bei der ersten Ausführungsform erzielt werden.
  • Weitere Ausführungsformen
  • Es sei darauf hingewiesen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die vorstehend genannten Ausführungsformen beschränkt ist und eine Vielzahl von Varianten umfasst. Obwohl die vorstehenden Ausführungsformen zum Beispiel im Detail beschrieben worden sind, um die vorliegende Erfindung klar zu illustrieren, muss die vorliegende Erfindung nicht alle in den Ausführungsformen beschriebenen Konfigurationen umfassen. Es ist möglich, einen Teil einer Konfiguration einer Ausführungsform durch eine Konfiguration einer anderen Ausführungsform zu ersetzen. Darüber hinaus ist es auch möglich, zu einer Konfiguration einer Ausführungsform eine Konfiguration einer anderen Ausführungsform hinzuzufügen. Außerdem ist es möglich, für einen Teil einer Konfiguration jeder Ausführungsformm eine Konfiguration einer anderen Ausführungsform hinzuzufügen, zu entfernen und/oder auszutauschen.
  • Bezugszeichenliste
    • 100
    Integriertes Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegerät
    200
    Kartusche
    201
    Nukleinsäureextraktionsblock
    202
    PCR-Block
    203
    Zyklussequenzierungsblock
    204
    Phoreseblock
    211, 251, 311
    Reagensbehälter
    212, 252, 312
    Reaktionsbehälter
    213, 253, 313
    Trägerbehälter
    214, 254, 314
    Reinigungslösungsbehälter
    215, 255, 315
    Abfallflüssigkeitsbehälter
    216, 256, 316
    Eluatbehälter
    217 bis 220, 257 bis 260, 317 bis 320 und 354
    Port
    221 bis 224, 261 bis 264 und 321 bis 324
    Port-Strömungskanal
    231 bis 237, 271 bis 277, 331 bis 337
    Regelventil
    241 bis 246, 281 bis 286, 341 bis 346 und 351
    Phoreselösungsbehälter
    352
    Kathodenpufferlösungsbehälter
    353
    Reinigungslösungsbehälter
    355
    Strömungskanal
    400
    Kapillarbündel
    401
    Kapillare
    402
    Kapillarkopf
    403
    Kathodenelektrode
    404
    Detektionseinheit
    410
    Thermostateinheit
    450
    Pumpen-/Puffereinheit
    451
    Abgabebehälter
    452
    Kolben
    453
    Ventil
    454
    Anodenelektrode
    455
    Dünnschicht
    456
    Trennmedium (Polymer)
    457
    Anodenpufferlösung
    500
    Heizeinheit
    520
    Flüssigkeitstransferpumpe
    550
    Regelventileinheit
    600
    Automatische Probenahmeeinheit
    700
    Detektionseinheit
    701
    Anregungslicht
    702
    Streulicht
    703
    Detektor
    800
    Hochspannungsstromversorgungseinheit
    900
    Steuerung

Claims (10)

  1. Integriertes Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegerät, aufweisend: einen Aufnahmetisch für eine integrierte Vorverarbeitungs-/Elektrophoresekartusche, wobei die Kartusche eine oder mehrere Blockstrukturen aufweist, die jeweils einem Schritt zum Extrahieren einer Nukleinsäure aus einer biologischen Probe, einem Schritt zum Durchführen einer PCR-Reaktion in einem Zielbereich der Nukleinsäure und einem Schritt zum Durchführen einer Zyklussequenzierungsreaktion an der verstärkten Nukleinsäure entsprechen, wobei jede Blockstruktur (1) einen ersten Block mit einem Reaktionsbehälter, in den eine biologische Probe injiziert wird, einem Reagensbehälter, der ein Reagens zur Verwendung in der Reaktion enthält, mehreren Strömungskanälen, die die Behälter verbinden, mehreren in den Strömungskanälen angeordneten Regelventilen und einem Strömungskanal, der einen Reaktionsbehälter in einer Blockstruktur in einer vorherigen Stufe und einen Reaktionsbehälter in einer Blockstruktur in einer nächsten Stufe verbindet, und (2) einen zweiten Block mit einem Phoreselösungsbehälter, der eine Phoreselösung enthält, einem Kathodenpufferlösungsbehälter, der eine Pufferlösung mit einem Elektrolyt zur Verwendung bei der Kapillarelektrophorese enthält, einem Reinigungslösungsbehälter, der eine Reinigungslösung zum Waschen einer Spitze einer Kapillare zwecks Vermeidung einer Verunreinigung zwischen Proben enthält, einem Strömungskanal, der einen Trägerbehälter in der Blockstruktur in der vorherigen Stufe und den Phoreselösungsbehälter verbindet, und einem Regelventil für den Strömungskanal aufweist, einen Temperatureinstellmechanismus zum Einstellen der Temperatur einer Lösung in der Kartusche, einen Kapillarelektrophoresemechanismus und eine Steuerung, die dazu eingerichtet ist, das Öffnen und Schließen der Regelventile zu steuern, um den Flüssigkeitstransfer in und zwischen den ersten und zweiten Blöcken zu steuern, und einen Elektrophoresevorgang durch Steuerung des Kapillarelektrophoresemechanismus zu steuern, wobei der Schritt zum Extrahieren einer Nukleinsäure aus der biologischen Probe, der Schritt zum Durchführen einer PCR-Reaktion in einem Zielbereich der Nukleinsäure und/oder der Schritt zum Durchführen einer Zyklussequenzierungsreaktion an der verstärkten Nukleinsäure und ein Kapillarelektrophoreseschritt zum Analysieren der Nukleinsäure alle automatisch ausgeführt werden.
  2. Integriertes Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegerät nach Anspruch 1, wobei, wenn der erste Block eine Blockstruktur entsprechend dem Schritt zum Durchführen einer PCR-Reaktion aufweist und der zweite Block eine Blockstruktur entsprechend dem Elektrophoreseschritt aufweist, die Steuerung dazu eingerichtet ist, die Vorverarbeitung nach dem Injizieren einer Lösung einer gereinigten Nukleinsäure aus einer biologischen Probe in den Reaktionsbehälter in dem ersten Block zu starten.
  3. Integriertes Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegerät nach Anspruch 1, wobei, wenn der erste Block zwei Blockstrukturen entsprechend dem Schritt zum Durchführen einer PCR-Reaktion bzw. dem Schritt zum Durchführen einer Zyklussequenzierungsreaktion aufweist und der zweite Block eine Blockstruktur entsprechend dem Elektrophoreseschritt aufweist, die Steuerung dazu eingerichtet ist, die Vorverarbeitung nach dem Injizieren einer Lösung einer gereinigten Nukleinsäure aus einer biologischen Probe in den Reaktionsbehälter in dem ersten Block zu starten.
  4. Integriertes Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegerät nach Anspruch 1, weiter aufweisend eine Pumpen-/Puffereinheit mit (1) einem Abgabebehälter, der eine Pufferlösung und ein Polymer enthält, die der Kapillare in dem Kapillarelektrophoresemechanismus zugeführt werden, wobei eine Ausgangsöffnung des Abgabebehälters mit der Spitze der Kapillare verbunden ist, (2) einer Trennwand, die ein Vermischen der Pufferlösung und des Polymers in dem Abgabebehälter in einem Ausgangszustand verhindert, (3) einem Kolben, der dazu eingerichtet ist, Druck in dem Abgabebehälter aufzubauen und zu verringern, und (4) einem Anodenterminal mit einer Spitze, die so angeordnet ist, dass sie in dem Abgabebehälter nach innen vorsteht, wobei die Spitze des Anodenterminals so eingerichtet ist, dass sie bei Anlegen von Druck durch den Kolben durch die Trennwand hervorsteht, wodurch die Pufferlösung und das Polymer vermischt werden.
  5. Integrierte Vorverarbeitungs-/Elektrophoresekartusche, aufweisend eine oder mehrere Blockstrukturen, die jeweils einem Schritt zum Extrahieren einer Nukleinsäure aus einer biologischen Probe, einem Schritt zum Durchführen einer PCR-Reaktion in einem Zielbereich der Nukleinsäure und einem Schritt zum Durchführen einer Zyklussequenzierungsreaktion an der verstärkten Nukleinsäure entsprechen, wobei jede Blockstruktur (1) einen ersten Block mit einem Reaktionsbehälter, in den eine biologische Probe injiziert wird, einem Reagensbehälter, der ein Reagens zur Verwendung in der Reaktion enthält, mehreren Strömungskanälen, die die Behälter verbinden, mehreren in den Strömungskanälen angeordneten Regelventilen und einem Strömungskanal, der einen Reaktionsbehälter in einer Blockstruktur in einer vorherigen Stufe und einen Reaktionsbehälter in einer Blockstruktur in einer nächsten Stufe verbindet, und (2) einen zweiten Block mit einem Phoreselösungsbehälter, der eine Phoreselösung enthält, einem Kathodenpufferlösungsbehälter, der eine Pufferlösung mit einem Elektrolyt zur Verwendung bei der Kapillarelektrophorese enthält, einem Reinigungslösungsbehälter, der eine Reinigungslösung zum Waschen einer Spitze einer Kapillare zwecks Vermeidung einer Verunreinigung zwischen Proben enthält, einem Strömungskanal, der einen Trägerbehälter in der Blockstruktur in der vorherigen Stufe und den Phoreselösungsbehälter verbindet, und einem Regelventil für den Strömungskanal aufweist.
  6. Integrierte Vorverarbeitungs-/Elektrophoresekartusche nach Anspruch 5, wobei der erste Block eine Blockstruktur entsprechend dem Schritt zum Durchführen einer PCR-Reaktion aufweist und der zweite Block eine Blockstruktur entsprechend dem Elektrophoreseschritt aufweist.
  7. Integrierte Vorverarbeitungs-/Elektrophoresekartusche nach Anspruch 5, wobei der erste Block zwei Blockstrukturen entsprechend dem Schritt zum Durchführen einer PCR-Reaktion bzw. dem Schritt zum Durchführen einer Zyklussequenzierungsreaktion aufweist und der zweite Block eine Blockstruktur entsprechend dem Elektrophoreseschritt aufweist.
  8. Integriertes Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoreseverfahren für eine integriertes Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoresegerät mit einem Aufnahmetisch für eine integrierte Vorverarbeitungs-/Elektrophoresekartusche, wobei die Kartusche mehrere mit Strömungskanälen verbundene Blöcke aufweist, die einem Schritt zum Extrahieren einer Nukleinsäure aus einer biologischen Probe, einem Schritt zum Durchführen einer PCR-Reaktion in einem Zielbereich der Nukleinsäure und/oder einem Schritt zum Durchführen einer Zyklussequenzierungsreaktion an der verstärkten Nukleinsäure und einem Kapillarelektrophoreseschritt zum Analysieren der Nukleinsäure entsprechen, einem Temperatureinstellmechanismus zum Einstellen der Temperatur einer Lösung in der Kartusche, einem Kapillarelektrophoresemechanismus und einer Steuerung, die dazu eingerichtet ist, das Öffnen und Schließen der Regelventile zu steuern, um den Flüssigkeitstransfer in und zwischen den ersten und zweiten Blöcken zu steuern, und einen Elektrophoresevorgang durch Steuerung des Kapillarelektrophoresemechanismus zu steuern, wobei die Steuerung einer Struktur des ersten Blocks in der integrierten Vorverarbeitungs-/Elektrophoresekartusche entspricht und wobei der Schritt zum Extrahieren einer Nukleinsäure aus der biologischen Probe, der Schritt zum Durchführen einer PCR-Reaktion in einem Zielbereich der Nukleinsäure und/oder der Schritt zum Durchführen einer Zyklussequenzierungsreaktion an der verstärkten Nukleinsäure und ein Kapillarelektrophoreseschritt zum Analysieren der Nukleinsäure alle automatisch ausgeführt werden.
  9. Integriertes Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoreseverfahren nach Anspruch 8, wobei, wenn ein Block entsprechend der Vorverarbeitung nur eine Blockstruktur entsprechend dem Schritt zum Durchführen einer PCR-Reaktion aufweist, die Steuerung dazu eingerichtet ist, die Vorverarbeitung nach dem Injizieren einer Lösung einer gereinigten Nukleinsäure aus einer biologischen Probe in einen Reaktionsbehälter in der Blockstruktur zu starten.
  10. Integriertes Vorverarbeitungs-Kapillarelektrophoreseverfahren nach Anspruch 8, wobei, wenn ein Block entsprechend der Vorverarbeitung zwei Blockstrukturen entsprechend dem Schritt zum Durchführen einer PCR-Reaktion bzw. dem Schritt zum Durchführen einer Zyklussequenzierungsreaktion aufweist, die Steuerung dazu eingerichtet ist, die Vorverarbeitung nach dem Injizieren einer Lösung einer gereinigten Nukleinsäure aus einer biologischen Probe in einen Reaktionsbehälter in der Blockstruktur zu starten.
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