JP7210502B2

JP7210502B2 - 反応分離分析システム

Info

Publication number: JP7210502B2
Application number: JP2020077230A
Authority: JP
Inventors: 佳則山口; 剛嗣大野
Original assignee: ピコテクバイオ株式会社; Ｚｉｇｅｎ．株式会社
Priority date: 2020-04-24
Filing date: 2020-04-24
Publication date: 2023-01-23
Anticipated expiration: 2040-04-24
Also published as: JP2021170990A

Description

本発明は、サンプル中の遺伝子増幅処理及び遺伝子増幅処理後の分離分析を簡易迅速に実行することができる反応分離分析システムに関するものである。

サンプル中の遺伝子を増幅させるためにＰＣＲがよく用いられ、ＰＣＲを行なうための容器も提案されている（特許文献１参照。）。特許文献１で提案されているＰＣＲ容器は、容器本体と蓋体からなり、蓋体に設けられた凹部にサンプルが保持され、容器本体の内部に試薬が固定されており、蓋体が容器本体に装着されたときにサンプルが試薬に接するようになっている。試薬は、ＰＣＲ前は固定状であり、ＰＣＲの際の加熱によって溶融する封止手段によって封止されている。ＰＣＲが開始されると、封止手段が溶融してサンプルと試薬が混合される。

特開２０１９－１１８３３８号公報

ＰＣＲなどの遺伝子増幅処理で遺伝子を増幅すると、目的とする遺伝子配列以外の遺伝子配列についても増幅される場合が多くある。そのような場合、遺伝子増幅処理後の遺伝子の定量を行なうと、目的とする遺伝子配列以外の遺伝子配列も一緒に定量されてしまうため、増幅後の目的遺伝子の量を正確に定量することができない。したがって、サンプルの遺伝子増幅処理後に目的の遺伝子生成物とそれ以外の非特異的に増幅された遺伝子とを分離することが望ましい。

本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、サンプルの遺伝子増幅処理及び遺伝子増幅処理後のサンプルの分離分析を簡易迅速に行なうことができるシステムを提供することを目的とするものである。

本発明に係る反応分離分析システムは、サンプルの遺伝子増幅処理、例えばＰＣＲを行なうための反応空間を内部に有する反応部、及び、内部空間が前記反応部と流体連通する分離部を備え、前記反応部の前記反応空間に遺伝子増幅試薬が保持され、前記分離部の前記内部空間に電気泳動媒体が配置され、前記電気泳動媒体の両端に導通する端子が前記分離部の外面に設けられている反応分離容器と、前記反応分離容器を用いてサンプルの遺伝子増幅処理及び分離分析を行なうための反応分離分析装置と、を備えている。前記反応分離分析装置は、前記反応分離容器の前記反応部の温度を昇降させるための遺伝子増幅部と、所定位置に配置された前記反応分離容器の前記端子に接触して前記電気泳動媒体の両端に電圧を印加するための電極を有する分析部と、前記反応分離容器を保持する容器保持部をもち、前記反応分離容器を前記遺伝子増幅部及び前記分析部へ搬送する搬送装置と、を備えている。

前記搬送装置は円周軌道を描くように前記容器保持部を移動させるものであってよい。その場合、前記遺伝子増幅部及び前記分析部は同一円周上に配置される。

また、前記分析部の前記電極は円環形状であってよい。そうすれば、前記反応分離容器の前記端子に対する電気的接触が容易になる。

また、前記反応分離容器の前記分離部は、蛍光色素により標識化されたサンプル成分からの蛍光を透過させる材質からなる筒状部材の内部に前記電気泳動媒体が保持されて構成されており、前記分析部は、前記反応分離容器の前記分離部へ励起光を照射する励起光源、及び、サンプル成分からの蛍光の強度を検出するための検出素子を備えていてもよい。そうすれば、分析部は、電気泳動によるサンプルの分離だけでなく分離されたサンプル成分の検出も行なうことができる。

また、前記遺伝子増幅部は前記反応部の温度を調節するための複数の温調部を備えることができる。その場合、複数の前記温調部は互いに異なる位置に設けられ、かつ、前記反応部を互いに異なる温度に調節するものであり、前記搬送装置を制御する制御部は、前記反応分離容器を複数の前記温調部のそれぞれへ予め設定された順序で搬送する遺伝子増幅処理を実行し、前記遺伝子増幅処理が終了した後で、前記反応分離容器を前記分析部へ搬送するように構成される。

本発明に係る反応分離分析システムでは、反応分離容器内においてサンプルの遺伝子増幅処理及び遺伝子増幅処理後のサンプルの分離分析を簡易迅速に行なうことができる。

また、遺伝子増幅処理を行なった後で分離分析を行なうための構成を備えることで、一度の遺伝子増幅処理により複数種類の生物に特有の遺伝子を増幅した場合にも、増幅されたそれぞれの遺伝子を定量することが可能となる。従来では、複数種類の微生物の存在量を確認するためには、微生物の数だけ遺伝子増幅処理と分析を行なう必要があった。対照的に、本発明の技術を用いれば、サンプル中における複数種類の微生物の存在量を確認したいような場合に、それらの微生物に特有の遺伝子を一度の遺伝子増幅処理で増幅し、それらを一度の分離分析処理で定量することができる。

蓋部を容器本体から取り外した状態の反応分離容器を示す断面図である。蓋部を容器本体に装着した状態の反応分離容器を示す断面図である。同反応分離容器の遺伝子増幅処理時の内部状態を示す断面図である。同反応分離容器の分離部における電気泳動分離の概念図である。同反応分離容器の分離部において分離した遺伝子バンドの定量の概念図である。同反応分離容器においてサンプルを反応部から分離部へ電気的に導入するための構成の一例を示す概念図である。反応分離容器の分離部において分離された遺伝子バンドの画像である。反応分離分析システムの一実施例を示す概略構成図である。反応分離分析装置の搬送装置の機能を説明するための図である。反応分離容器を第１温調部に設置した状態を示す図である。反応分離容器を第２温調部に設置した状態を示す図である。反応分離容器を分析部に設置した状態を示す図である。反応分離分析装置の各部の配置の一例を示す平面図である。

以下、図面を参照しながら、本発明に係る反応分離分析システムの実施形態について説明する。

反応分離分析システムを構成する反応分離容器の一例を図１に示す。

反応分離容器１は、容器本体２及び蓋部４によって構成されている。容器本体２は、上方から順に、試薬収容部６、反応部８及び分離部１０を備えている。容器本体２の試薬収容部６は上端に開口１２を有する円筒状の容器である。試薬収容部６の内部に、サンプルを反応させるための試薬１４が配置されている。試薬収容部６の底部には、下方へいくほど内径が小さくなる漏斗状部分が設けられており、その漏斗状部分の下方に円筒状の反応部８が設けられている。試薬収容部６と反応部８は、例えばポリプロピレンなどの樹脂によって一体的に形成されている。試薬収容部６内に収容されている試薬１４はＰＣＲ試薬（遺伝子増幅試薬）である。試薬１４は、遺伝子増幅処理であるＰＣＲ前はパラフィンなどによって固体状となっており、ＰＣＲ時に加熱されることで液状となる。加熱によって液状となった試薬１４は反応部８へ移行し、反応部８内でＰＣＲによるサンプル中の遺伝子の増幅が行われる。

分離部１０は、反応部８の下端に連結された円筒状の筒状部材１６の内側に分離媒体１８が配置されたものである。すなわち、分離部１０は、反応部８と流体連通する内部空間内に分離媒体１８が配置されたものである。筒状部材１６の内径は２ｍｍ程度、長さは１０ｍｍ程度である。この実施例において、分離媒体１８は電気泳動用ゲルである。電気泳動用ゲルとしては、アガロースなどの水和性ゲル、ポリエチレングリコールなどの水溶性ポリマー、架橋された水溶性ポリマーなどであり、検出対象となる成分に応じて選択して使用することができる。筒状部材１６の両端部には、電気泳動用ゲル１８の両端に電気泳動用の電圧を印加するための電極２０及び２２が設けられている。電気泳動用ゲル１８には、サンプル中の遺伝子を標識化するための色素が混合されており、電気泳動用ゲル１８中でサンプルを電気泳動することによって、サンプル中の遺伝子が標識化されながら分離される。

筒状部材１６は、サンプル中の遺伝子を標識化する色素を励起するための励起光及び励起した色素からの蛍光を透過させる材質によって形成されている。筒状部材１６の材質は例えばガラスであり、電気泳動用ゲル１８がガラス製の筒状部材１６の内壁と架橋されることによって筒状部材１６の内側に固定されている。

分離部１０の筒状部材１６は、連結部材２４によって容器本体２の反応部８に連結されている。連結部材２４は、容器本体２の反応部８の外周面及び筒状部材１６の外周面をともに保持することによって筒状部材１６を反応部８に連結させる筒状の部材である。連結部材２４には、筒状部材１６の電極２０と電気的接触をとるための端子２６が設けられている。また、連結部材２４には、分離部１８内の色素に対する励起光及び色素からの蛍光を通過させるための窓部２８が設けられている。

蓋部４は、図２に示されているように、試薬収容部６の上部を覆うように容器本体２に装着されて試薬収容部６の開口１２を封止するものである。蓋部４の下部に下方へ延びる突起３０が設けられている。蓋部４の突起３０の下端には、サンプルを保持するための凹部３２が設けられており、蓋部４が容器本体２に装着されたときに凹部３２に保持されたサンプルが試薬収容部６内の試薬１４に接触するようになっている。

また、図では省略されているが、試薬収容部６の外周面上部にネジが設けられており、容器本体２に装着されたときに試薬収容部６の外周面を覆う外周部３４の内側に試薬収容部６の外周面のネジと螺合するネジが設けられている。

この反応分離容器１を用いたＰＣＲ（遺伝子増幅処理）を行なう際は、先端の凹部３２にサンプルを保持した蓋部４を容器本体２に装着した状態（図２の状態）で、試薬収容部６の下部及び反応部８を所定温度に加熱する。そうすると、図３に示されているように、サンプルと試薬収容部６の試薬１４とが混合された状態で反応部８へ移動する。この状態で反応部８の温度を順に変化させていくことにより、サンプル中の遺伝子が増幅される。ＰＣＲが終了した後、反応部８のサンプル及び試薬を一定時間冷却する。この間に、反応部８内のサンプルが重力によって分離部１０の分離媒体１８の上端部に移動する。

サンプルが分離媒体１８の上端部にまで移動した後、サンプルの電気泳動による分離を実行することができる。電気泳動は、図４に示されているように、電極２０及び２２の間に所定の電圧を一定時間印加することにより行なう。これにより、サンプル中の成分（遺伝子）が分離部１８の長手方向に分離される。分離媒体１８にはサンプル中の成分を標識化するための色素が混合されているため、電気泳動により各成分が分離と同時に標識化される。

図５に示されているように、サンプルの電気泳動が終了した後、分離部１８に対して励起光を照射し、各成分を標識化している色素から発せられる蛍光の強度を検出することで、ＰＣＲ後のサンプル中の各成分量を同時に測定することができる。

図７は、反応分離容器１の分離部１０において分離された遺伝子バンドの画像である。図７から明らかなように、反応分離容器１の反応部８においてＰＣＲにより増幅された遺伝子は、分離部１０において電気泳動により複数の遺伝子バンドに分離され、各遺伝子の量が蛍光の強度として表れている。この画像では、標的遺伝子がそれぞれに分離されているだけでなく、標的遺伝子と分離された非特異遺伝子も検出されている。このように、反応分離容器を用いてＰＣＲ及び電気泳動を実行すれば、各標的遺伝子を個別に定量できるだけでなく、非特定遺伝子による定量誤差を除くことができる。このように、反応分離容器１を用いることによって、複数種類の標的微生物の遺伝子を一度の遺伝子増幅処理によって同時に増幅し、増幅された複数種類の遺伝子を分離して同時に定量することができる。

なお、上記の例では、反応部８の下方に分離部１０を配置し、ＰＣＲ後のサンプルを重力によって分離部１０へ移動させる形態について説明したが、反応部８と分離部１０との間に電圧を印加するための電極を設けて、反応部８から分離部１０へのサンプルの移行を電気的に行なうこともできる。

図６は反応部８から分離部１０へのサンプルの移行を電気的に行なうための構成を備えた１つの実施例を示したものである。

図６の例では、図１の例の構成に加えて、反応部８の上部に電極２１を設け、電極２１に対して外部から電気的接触をとることができるように連結部材２４に端子２７を設けている。この構成では、分離部１０の下端の電極２２と反応部８の電極２１との間に電圧を印加し、分離部１０の上端部の電極２０を接地することで、反応部８内のサンプルが分離媒体１８の上端へ電気的に導入され、さらに分離部１０においてサンプルの電気泳動による分離が行われる。

また、分離部１０の筒状部材１６は試薬収容部６及び反応部８と一体的に形成されたものであってもよい。その場合、連結部材２４は不要である。

図８は、反応分離分析システムの一実施例を示す概略構成図である。

この実施例の反応分離分析システムは、上述の反応分離容器１及び反応分離分析装置１００によって構成されている。反応分離分析装置１００は、搬送機構１０２、遺伝子増幅部１０４、分析部１０６及び制御部１０７を備えている。

搬送機構１０２は、反応分離容器１を保持するための容器保持部１０８、及び、容器委保持部１０８を移動させる移動機構１１０を備えている。搬送機構１０２は、反応分離容器１の外周面を保持させた容器保持部１０８を水平方向及び鉛直方向へ移動させることにより、反応分離容器１を遺伝子増幅部１０４及び分析部１０６へ搬送する（図９参照）。

遺伝子増幅部１０４は、第１温調部１１２及び第２温調部１１４を備えている。第１温調部１１２及び第２温調部１１４のそれぞれは、熱伝導率の良好な金属性（例えばアルミニウム）の環状部材である。第１温調部１１２にはヒータ１１６及び温度センサ１１８が取り付けられており、予め設定された第１の温度に制御される。第２温調部１１４にはヒータ１２０及び温度センサ１２２が取り付けられており、予め設定された第２の温度に制御される。第１の温度と第２の温度は互いに異なる温度である。なお、この実施例では、遺伝子増幅部１０４は、温調部１１２及び１１４のほかにさらなる温調部を備えることもできる。

分析部１０６は、容器設置部１２６、電圧印加部１３４、励起光源１３６及びカメラ１３８を備えている。容器設置部１２６は上方が開口した容器設置用孔１２８を有する絶縁性の部材である。容器設置部１２６の容器設置用孔１２８は反応分離容器１の分離部１０を収容するためのものであり、容器設置用孔１２８の内側面に電極１３０が設けられ、容器設置用孔１２８の底面に電極１３２が設けられている。電圧印加部１３２は電極１３０及び１３２の間に所定の電圧を印加するための電気回路である。容器設置部１２６の側面には、励起光源１３６からの励起光を通過させるための窓部１４０、及び、容器設置用孔１２８に収容された反応分離容器１の分離部１０からの蛍光を通過させるための窓部１４２が設けられている。カメラ１３８は、窓部１４２を介して分離部１０からの蛍光を検出するように設けられている。

制御部１０７は、ＣＰＵ（中央演算装置）が所定のプログラムを実行することによって実現されるものであって、搬送装置１０２、遺伝子増幅部１０４及び分析部１０６を制御して、反応分離容器１内に入れられたサンプルの遺伝子増幅処理及び電気泳動処理を実行するように構成されている。

サンプルの遺伝子増幅処理及び電気泳動処理が実行される際の動作について説明する。

搬送装置１０２の容器保持部１０８への反応分離容器１の設置は、ユーザが容易保持部１０８の穴へ反応分離容器１を上方から嵌め込むことによって行われる。容器保持部１への反応分離容器１の設置が完了し、ユーザが処理の開始をシステムに対して入力すると、図１０及び図１１に示されているように、反応分離容器１を搬送装置１０２によって搬送して、遺伝子増幅部１０４の第１温調部１１２、第２温調部１１４のそれぞれに予め設定された順序で設置する。反応分離容器１が第１温調部１１２に設置されると、反応分離容器１の反応部８（図１等参照）が第１の温度に調節される。反応分離容器１が第２温調部１１４に設置されると、反応分離容器１の反応部８が第２の温度に調節される。反応分離容器１を第１温調部１１２に設置する動作と第２温調部に設置する動作は予め設定された回数だけ繰り返され、それによって反応分離容器１の反応部８内でサンプル中の特定遺伝子が増幅される。

遺伝子増幅部１０４での遺伝子増幅処理が終了した後、反応分離容器１を分析部１０６に設置する。分析部１０６へ反応分離容器１を設置する際は、図１２に示されているように、反応分離容器１を分析部１０６の容器設置部１２６の容器設置用孔１２８に下端から挿入し、反応分離容器１の下端の端子２２を容器設置用孔１２８の底面に設けられている電極１３２に接触させる。このとき、容器設置部１２６内の電極１３０が反応分離容器１の端子２６と接触する。反応分離容器１が容器設置部１２６に設置されたときに、電極１３０が反応分離容器１の端子２６に確実に接触するように、電極１３０は容器設置用孔１２８の内面から内側方向へ突出している。電極１３０は、弾力性を有するエラストマーなどの導電性材質によって構成されていてもよいし、板バネなどの弾性部材によって容器設置用孔１２８の中心軸方向へ付勢されていてもよい。

反応分離容器１を分析部１０６に設置した後、電圧印加部１３４によって反応分離容器１の分離部１０内の電気泳動媒体１８の両端に所定電圧を印加し、分離部１０内においてサンプルの電気泳動を行なう。電気泳動を開始してから予め設定された時間が経過した後、電圧印加を解除し、励起光源１３６から分離部１０に向かって励起光を照射し、カメラ１３８によってサンプル中の各成分を標識化している色素から発せられる蛍光の強度を検出する。

上記実施例における反応分離分析装置１００の分析部１０６は、電極１３０及び１３２に加えて、図６を用いて説明した反応分離容器１の端子２７に対して電気的接触をとるための端子を備えていてもよい。そうすれば、図６に示した反応分離容器を用いることができ、遺伝子増幅処理後のサンプルを電気的に電気泳動媒体１８へ導入することが可能となる。

反応分離分析システム１００の各部の配置の一例を図１３に示す。

この例において、搬送装置１０２の移動機構１１０は回転可能な鉛直軸１１０であり、容器保持部１０８は鉛直軸１１０に取り付けられて鉛直軸１１０の回転に伴って水平面内において円周軌道を描くように移動する。また、容器保持部１０８の上下動は、鉛直軸１１０自体が鉛直方向へ移動することによって、又は、容器保持部１０８が鉛直軸１０に沿って移動することにより実現される。第１温調部１１２、第２温調部１１４及び容器設置部１２６は、容器保持部１０８の円周軌道上にくるように同一円周上に設けられている。

１反応分離容器
２容器本体
４蓋部
６試薬収容部
８反応部
１０分離部
１２開口
１４試薬
１６筒状部材
１８分離媒体
２０，２１，２２電極
２４連結部材
２６，２７端子
２８窓部
３０突起
３２凹部
３４外周部
１００反応分離分析装置
１０２搬送装置
１０４遺伝子増幅部
１０６分析部
１０７制御部
１０８容器保持部
１１０移動機構
１１２第１温調部
１１４第２温調部
１１６，１２０ヒータ
１１８，１２２温度センサ
１２６容器設置部
１２８容器設置用孔
１３０，１３２電極
１３４電圧印加部
１３６励起光源
１３８カメラ

Claims

反応分離容器、及び、前記反応分離容器を用いてサンプルの遺伝子増幅処理と分離分析を行なうための反応分離分析装置を備えた反応分離分析システムであって、
前記反応分離容器は、
サンプルのＰＣＲを行なうための反応空間を内部に有する反応部、及び、
前記反応部の下端において内部空間が前記反応部の前記反応空間と流体連通するように設けられた円筒状の分離部、を備え、
前記反応部の前記反応空間に遺伝子増幅試薬が保持され、前記分離部の前記内部空間に電気泳動媒体が配置され、前記電気泳動媒体の上端に導通する第１の端子が前記分離部の上端部の外面に設けられ、前記電気泳動媒体の下端に導通する第２の端子が前記分離部の下端に設けられており、
前記反応分離分析装置は、
前記反応分離容器の前記反応部の温度を昇降させるための遺伝子増幅部と、
上方が開口し前記反応分離容器の前記分離部を収容するための容器設置用孔をもち、前記容器設置用孔に収容された前記反応分離容器の前記分離部の前記第１の端子及び前記第２の端子にそれぞれ電気的に接触して前記電気泳動媒体の両端に電圧を印加するための第１の電極及び第２の電極が前記容器設置用孔の内部に設けられている分析部と、
前記反応分離容器を保持する容器保持部をもち、前記反応分離容器を前記遺伝子増幅部及び前記分析部へ搬送する搬送装置と、を備えており、
前記分析部の前記第１の電極は弾力性又は弾性を有する部材で構成されて前記容器設置用孔の内側面から内側方向へ突出し、前記分析部の前記第２の電極は前記容器設置用孔の底面に設けられており、それによって、前記反応分離容器の前記分離部の前記下端が前記容器設置用孔の前記底面に接するまで前記反応分離容器の前記分離部が前記容器設置用孔に収容されたときに前記反応分離容器の前記第１の端子及び前記第２の端子に対して前記第１の電極及び前記第２の電極が確実に電気的に接触するようになっている、反応分離分析システム。
前記搬送装置は円周軌道を描くように前記容器保持部を移動させるものであり、
前記遺伝子増幅部及び前記分析部は同一円周上に配置されている、請求項１に記載の反応分離分析システム。
前記分析部の前記電極は円環形状である、請求項１又は２に記載の反応分離分析システム。
前記反応分離容器の前記分離部は、蛍光色素により標識化されたサンプル成分からの蛍光を透過させる材質からなる筒状部材の内部に前記電気泳動媒体が保持されて構成されており、
前記分析部は、前記反応分離容器の前記分離部へ励起光を照射する励起光源、及び、サンプル成分からの蛍光の強度を検出するための検出素子を備えている、請求項１から３のいずれか一項に記載の反応分離分析システム。
前記遺伝子増幅部は前記反応部の温度を調節するための複数の温調部を備え、複数の前記温調部は互いに異なる位置に設けられ、かつ、前記反応部を互いに異なる温度に調節するものであり、
前記搬送装置を制御する制御部は、前記反応分離容器を複数の前記温調部のそれぞれへ予め設定された順序で搬送する遺伝子増幅処理を実行し、前記遺伝子増幅処理が終了した後で、前記反応分離容器を前記分析部へ搬送するように構成されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の反応分離分析システム。