JP2014021052A - 前処理・電気泳動用一体型カートリッジ、前処理一体型キャピラリ電気泳動装置及び前処理一体型キャピラリ電気泳動方法 - Google Patents
前処理・電気泳動用一体型カートリッジ、前処理一体型キャピラリ電気泳動装置及び前処理一体型キャピラリ電気泳動方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】前処理を構成する個々の工程に対応する1つ又は複数の区画構造を有し、各区画構造は、(1)反応槽と、試薬槽と、各槽間を接続する複数の流路と、前記流路に配置された複数の調節弁とを有し、かつ、前段に位置する区画構造の反応槽と次段に位置する区画構造の反応槽を接続する流路を有する第1の区画と、(2)泳動溶液槽と、陰極緩衝液槽と、洗浄液槽とを有し、かつ、前段に位置する前記区画構造の担体槽と前記泳動溶液槽とを接続する流路とその調整弁とを有する第2の区画とを有する前処理・電気泳動用一体型カートリッジを提供する。
【選択図】図2
Description
[前処理一体型キャピラリ電気泳動装置の構成]
図1は、実施例1に係る前処理一体型キャピラリ電気泳動装置100の構成を示す。前処理一体型キャピラリ電気泳動装置100は、前処理から電気泳動までの一連の反応・操作を、本明細書で提案するカートリッジ200を用いることにより、全自動で実行する装置である。カートリッジ200の詳細については後述する。
本実施例で使用するカートリッジ200は、その表面に流路や調節弁を形成した1枚の平板状の基板で構成される。本実施例では、1枚のカートリッジ200を核酸抽出から泳動サンプルの準備までの一連の操作で使用する。各操作は、次項以降で詳細に説明する前処理一体型キャピラリ電気泳動装置100の各ユニットの協働により全自動で実行される。本実施例では、1回の測定につき、原則、1枚のカートリッジ200を使い切るものとする。
図3に、キャピラリアレイ400の上面構成を示す。キャピラリアレイ400は、1本以上のキャピラリ401を束ねた構成を有している。キャピラリ401は、内径が数十〜数百ミクロン、外径が数百ミクロンのガラス管で構成され、表面はポリイミド等でコーティングされている。キャピラリ401の内部には、電気泳動時に、サンプルに泳動速度差を与える分離媒体が充填されている。
恒温ユニット410は、電気泳動時に、キャピラリアレイ400の温度を設定温度に保つ機能を有している。恒温ユニット410は、ヒータが取り付けられた温度制御基板と断熱材とでキャピラリアレイ400を挟み込む構成の平板状の部品である。温度制御基板には、フィードバック用の温度センサが取り付けられている。ここで、キャピラリアレイ400の陰極電極403側の一端は、恒温ユニット410に固定されている。これにより、キャピラリヘッド402の先端を所望の位置に固定することができる。
ポンプ・バッファユニット450は、キャピラリアレイ400(具体的には、個々のキャピラリ401)にポリマなどの分離媒体を充填するために用いられるポンプである。
ヒータ500は、カートリッジ200に保持される溶液の保温、熱サイクルなどの温度調整に用いられる。図1に示す例の場合、ヒータ500は、カートリッジ200の載置台の内側又は表面に配置される。例えばヒータ500とカートリッジ200は、固定具などで固定される。
送液ポンプ520は、カートリッジ200に形成された調節弁に空気などを送り、カートリッジ内の流路・槽を加圧・減圧し、カートリッジ200内での溶液の送液を調整する。
調節弁ユニット550は、カートリッジ200に形成された調節弁を開閉する機構部である。
オートサンプラユニット600は、カートリッジ200を、初期セット位置に、次に前処理反応ユニット部に、そしてキャピラリ400のサンプル導入端に、順番に運搬するロボット装置である。
検出ユニット700は、キャピラリアレイ400の検出部404に対し、レーザやLEDなどの光源から出力された励起光701を照射し、キャピラリ401より発する散乱光702などを検出器703で検出する。検出した光は、不図示の測定装置に出力される。測定装置は、検出された散乱光702の信号強度に基づいてサンプルを分析する。
高圧電源ユニット800は、陽極電極454と陰極電極403に接続されており、ポリマが充填されたキャピラリ401に高電圧を印加することにより電気泳動を実行する。
コントローラ900は、ヒータ500と、送液ポンプ520と、調節弁ユニット550が連携して動作するように各部の動作を制御する。
続いて、前処理一体型キャピラリ電気泳動装置において自動的に実行される一連の動作について説明する。
ここでは、図5を参照し、前処理の処理内容の概要を説明する。なお、前処理とは、スワブや血液などの生体サンプルから核酸を抽出し、分析用(キャピラリ電気泳動による塩基配列解析)にサンプルを処理する操作である。前処理は、大まかに3つの工程に分けることができる。核酸抽出1100、PCR反応1200、サイクルシーケンス反応1300である。なお、解析対象によっては、核酸抽出1100とPCR反応1200のみで前処理を終え、キャピラリ電気泳動1400を実行する場合もある。
以下、各段階で、コントローラ900により実行される制御動作の内容を説明する。
核酸抽出1100では、まず、(1)の制御動作1101が実行される。この制御動作1101では、まず、サンプルがカートリッジ200に挿入される。サンプルは、試薬が貯蔵されている反応槽へと送液され、混合される。サンプルは例えば生体サンプルである。また、試薬は例えば細胞可溶化液、緩衝液などである。
PCR反応1200においても、まず、(1)の制御動作1101が実行される。この制御動作1101では、まず、核酸抽出後のサンプルが核酸抽出区画201からPCR区画202に送液される。サンプルは、試薬(プライマ、dNTP、緩衝液、酵素)が貯蔵されている反応槽へと送液され、混合される。
サイクルシーケンス反応1300においても、まず、(1)の制御動作1101が実行される。この制御動作1101では、まず、PCR反応後の産物がPCR区画202からサイクルシーケンス区画203に送液される。PCR区画202からの産物は、試薬(プライマ、蛍光標識したdNTP、酵素、緩衝液など)が貯蔵されている反応槽へと送液され、混合される。
泳動区画204に回収された核酸について、キャピラリ電気泳動1400が実施される。
続いて、カートリッジ200を構成する各区画内における送液手順について具体的に説明する。なお、核酸抽出区画201、PCR区画202、サイクルシーケンス区画203のおおよその構成と送液のための手順は同じである。なお、カートリッジ200は、生体サンプルが吸着し難い材料、例えば石英ガラス、PMMA、ポリカーボネートなどで構成することが望ましい。
以下では、カートリッジ200を使用して、前処理とキャピラリ電気泳動を実施する手順について説明する。前処理からキャピラリ電気泳動までの一連の手順は、基本的に、送液による試薬の混合と加熱処理の組み合わせにより実現される。以下の説明では、溶液の送液に、最も一般的な方法である、ポンプによる加圧方式を採用するものとして説明する。
まず、スワブや血液などの生体サンプルを反応槽212に挿入し、シールなどで蓋をして系を密閉した状態にする。この状態で、調節弁231とポート217、218を開け、ポート217から空気を注入する。空気は、ポート217→試薬槽211→反応槽212→担体槽213→廃液槽215→ポート218の順番に流れる。空気がポート217に注入されると、試薬槽211に内蔵された試薬が流路241を通って反応槽212に流れ、生体サンプルと混ざり合わされる。このとき、必要に応じ、ヒータ500を用いてカートリッジ200を加熱し、反応槽212内の混合液の温度を適温になるよう調整しても良い。
続いて、更に調節弁232を開放した状態で、ポート217から空気を注入する。なお、空気の流路は操作(1)と同じである。この場合、反応槽212内の生体サンプルと試薬の混合液が流路242を通って担体槽213に流れる。このとき、混合液中の核酸は、担体槽213内の担体に付着する。
次に、調節弁232とポート217を閉じ、調節弁233〜235とポート219を開く。なお、ポート218は開いたままである。この状態でポート219から空気を注入する。この際、空気は、ポート219→洗浄液槽214→担体槽213→廃液槽215→ポート218の順番に流れる。空気がポート219に注入されると、担体槽213にあった混合液は流路244を通って廃液槽215へと流れ出す。代わりに、洗浄液槽214に内蔵された洗浄液が流路243を通って担体槽213へと流れ込む。さらに、空気のポート219への注入を継続すると、担体槽213に内蔵されていた洗浄液は、廃液槽215へ全て送られる。その後、逆流と混入を防ぐため、調節弁233〜235を閉じる。この操作は、複数回繰り返すことで精製の効果を高めることができる。
次に、ポート219を閉じ、調節弁236とポート220を開く。ここでも、ポート218は開いたままである。この際、空気は、ポート219→洗浄液槽214→担体槽213→廃液槽215→ポート218の順番に流れる。ポート220から空気を注入すると、溶出液槽216に内蔵されていた溶出液が流路245を通って担体槽213へと流れ込む。
溶出液槽216の溶出液を担体槽213に流し込んだ後は、担体に付着した核酸が溶出液に溶けだすのに十分な時間だけ放置する。その後、ポート218を閉じ、調節弁237とポート258を開ける。この際、PCR区画202に設けられたポート258を開く。これにより、空気は、ポート220→溶出液槽216→担体槽213→反応槽252→担体槽253→廃液槽255→ポート258に順番に流れる。この状態で、ポート220から空気を注入する。すると、担体槽213の溶液は、流路246を通って次の区画、すなわちPCR区画202の反応槽252に流れ込む。このように、核酸抽出区画201からPCR区画202への送液が完了すると、ポート220及び258を閉じる。
図10に、本実施例に係る前処理一体型キャピラリ電気泳動装置100の動作手順を示す。各ステップについて、図を補足しながら説明する。
前提として、まず、サンプルを導入したカートリッジ200を、前処理一体型キャピラリ電気泳動装置100の載置台に取り付ける。また、ポンプ・バッファユニット450を前処理一体型キャピラリ電気泳動装置100に取り付ける。この状態で、装置本体の電源をオンにすると、本動作手順が開始される。まず、生体サンプル及び試薬が封入されたカートリッジ200が、オートサンプラユニット600に固定される。その際、カートリッジ200の底面とヒータ500は接触している。カートリッジ200の調節弁231〜237、271〜277、331〜337は調節弁ユニット550に接続され、ポート217〜220、257〜260、317〜320は送液ポンプ520に接続される。また、ポンプ・バッファユニット450を、キャピラリアレイ400の一端部と高圧電源ユニット800とにそれぞれ接続する。
この状態で、ヒータ500による温度調整が開始される。温度は、ユーザが使用毎に手動で設定しても良いし、測定の内容に応じて予め定めた温度に自動的に設定しても良い。また、この段階で、レーザ701の照射も開始される。なお、レーザの照射直後は出力が不安定である。従って、検出感度を維持するためには、電気泳動を開始する前に、レーザの照射を開始しておけば良い。
カートリッジ200、ヒータ500、調節弁ユニット520の3つを固定しているオートサンプラユニット600のアームが動き、陰極緩衝液槽352にキャピラリアレイ400の先端が浸される。
次に、ポンプ・バッファユニット450のピストン452に対し、手動又は自動制御により外力が加えられ、内蔵していた分離媒体456がキャピラリアレイ400に充填される。同時に、陽極電極454が陽極緩衝液457に浸された状態になる。
カートリッジ200では、核酸抽出、PCR反応、サイクルシーケンス反応が連続で実施される。実施方法については前記の通りである。また、高圧電源ユニット800により、キャピラリの両端に電圧を印加する。この操作は、プレラン(pre-run)と呼ばれる。プレランを長時間実施することにより、キャピラリ電気泳動の分析性能を向上させる効果がある。
調節弁ユニット550と送液ポンプ520により、サイクルシーケンス区画203のサンプルが後段に位置する泳動溶液槽351に送液される。カートリッジ200において試薬・混合液・反応液を送液する際、ポンプ520から注入する空気の量を調整すれば、送液量を調整することができる。なお、各区画における溶出液の全量を、次の槽に送るのではなく、一部を保管しておくことが望ましい、そうすれば、途中から分析を再実施することが可能である。
ここでは、一時的に、電圧の印加が停止される。この状態で、オートサンプラユニット600が動作し、キャピラリアレイ400の先端が泳動溶液槽351に挿入される。
高圧電源ユニット800からキャピラリアレイの両端に弱い電圧を短時間印加することにより、適量のサンプルを分離媒体が充填されたキャピラリアレイ400に導入する。
再度、オートサンプラユニット600が動作し、キャピラリアレイ400の先端を陰極緩衝液槽352内に封入された陰極緩衝液に浸す。
高圧電源ユニット800からキャピラリアレイ400に高電圧を印加し、電気泳動を実施する。電気泳動中、キャピラリ401の検出部404には、励起光701が照射される。検出器703は、励起光701によってサンプルが蛍光している様子を検出し、不図示の測定装置に検出結果を出力する。測定装置は、検出結果に基づき、サンプルを分析する。
この段階で、電気泳動が終了する。
電圧印加の終了後、オートサンプラユニット600が動作し、キャピラリアレイ400の先端を洗浄液槽353に浸す。洗浄水槽353にはキャピラリの先端及び内部を洗浄する洗浄水が封入されている。
ポンプ・バッファユニット450のピストン452を手動又は自動制御により引き、キャピラリアレイの内部を洗浄液で満たす。この操作を数回繰り返すと、洗浄効果を向上させることができる。
以上説明したように、本実施例に係るカートリッジ200と、前処理(核酸抽出、増幅反応、サイクルシーケンス反応など)一体型キャピラリ電気泳動装置100を組み合わせて用いれば、前処理から電気泳動までの全反応工程の自動化を、1台の装置と1個のカートリッジだけを用いて実行することができる。
本実施例では、精製した核酸からキャピラリ電気泳動を実施し、フラグメント解析を行う場合に適したカートリッジ200の構成例を示す。前処理一体型キャピラリ電気泳動装置100の基本的な構成や動作は実施例1と同様である。以下では、本実施例と実施例1との差異点を中心に説明する。
本実施例では、槽内に封入する試薬を異なるものにすることで、別の解析の実施を可能とする。先に述べたように、PCR区画202の試薬槽251には、試薬が保管された状態で運搬が可能なように密閉されている。一方で、空の試薬槽251に対し、分析直前に任意の試薬を注入して解析しても良い。
本実施例では、精製した核酸からPCR反応、サイクルシーケンス反応を行える構成について説明する。前処理一体型キャピラリ電気泳動装置100の基本的な構成や動作は実施例1と同様である。以下では、実施例1と本実施例との差異点を中心に説明する。
本発明は上述した実施例に限定されるものでなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上述した実施例は、本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも全ての構成を備えるものに限定されない。また、ある実施例の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成を追加、削除又は置換することも可能である。
Claims (10)
- 生体サンプルから核酸を抽出する工程、目的の領域についてPCR反応を行う工程、増幅された核酸についてサイクルシーケンス反応を行う工程のそれぞれに対応する1つ又は複数の区画構造を有し、各区画構造は、(1)生体サンプルを注入する反応槽と、前記反応に用いる試薬を内蔵した試薬槽と、各槽間を接続する複数の流路と、前記流路に配置された複数の調節弁とを有し、かつ、前段に位置する区画構造の反応槽と次段に位置する区画構造の反応槽を接続する流路を有する第1の区画と、(2)泳動溶液を内蔵する泳動溶液槽と、キャピラリ電気泳動で使用する電解質を含む緩衝液を内蔵した陰極緩衝液槽と、前記キャピラリ先端部を洗浄してサンプル間のコンタミネーションを防止する洗浄液を内蔵した洗浄液槽とを有し、かつ、前段に位置する前記区画構造の担体槽と前記泳動溶液槽とを接続する流路とその調整弁とを有する第2の区画とを有する前処理・電気泳動用一体型カートリッジの載置台と、
前記カートリッジ内の溶液温度を調整する温度調整機構と、
キャピラリ電気泳動機構と、
前記調節弁の開閉を制御し、前記第1及び第2の区画内及び間の送液を制御すると共に、前記キャピラリ電気泳動機構の制御を通じ、電気泳動動作を制御するコントローラと
を有し、
前記生体サンプルから核酸を抽出する工程と、目的の領域についてPCR反応を行う工程と、増幅された核酸についてサイクルシーケンス反応を行う工程の少なくとも1つと、キャピラリ電気泳動により核酸を分析する工程までの全工程を自動で実行する前処理一体型キャピラリ電気泳動装置。 - 請求項1に記載の前処理一体型キャピラリ電気泳動装置において、
前記第1の区画はPCR反応を行う工程に対応する1つの区画構造を有し、前記第2の区画は電気泳動の工程に対応する1つの区画構造を有するとき、
前記コントローラは、生体サンプルから精製された核酸の溶液を、前記第1の区画の前記反応槽に注入して前処理を開始する
ことを特徴とする前処理一体型キャピラリ電気泳動装置。 - 請求項1に記載の前処理一体型キャピラリ電気泳動装置において、
前記第1の区画はPCR反応を行う工程とサイクルシーケンス反応を行う工程に対応する2つの区画構造を有し、前記第2の区画は電気泳動の工程に対応する区画構造を有するとき、
前記コントローラは、生体サンプルから精製された核酸の溶液を、前記第1の区画の前記反応槽に注入して前処理を開始する
ことを特徴とする前処理一体型キャピラリ電気泳動装置。 - 請求項1に記載の前処理一体型キャピラリ電気泳動装置において、
(1)前記キャピラリ電気泳動機構を構成するキャピラリに供給する緩衝液及びポリマを保持するディスペンサ容器であり、その出力口が前記キャピラリの先端に接続されるディスペンサ容器と、(2)前記緩衝液と前記ポリマの前記ディスペンサ容器内における初期状態での混合を妨げる隔壁と、(3)前記ディスペンサ容器の内部を加圧及び減圧するピストンと、(4)先端部分が前記ディスペンサ容器の内部に突き出た状態で設置され、前記ピストンによる加圧操作時に前記先端部分で前記隔壁を破り、前記緩衝液と前記ポリマを混合する一端が陽極端子とを含むポンプ・バッファユニット
を有することを特徴とする前処理一体型キャピラリ電気泳動装置。 - 生体サンプルから核酸を抽出する工程、目的の領域についてPCR反応を行う工程、増幅された核酸についてサイクルシーケンス反応を行う工程のそれぞれに対応する1つ又は複数の区画構造を有し、
各区画構造は、
生体サンプルを注入する反応槽と、前記反応に用いる試薬を内蔵した試薬槽と、各槽間を接続する複数の流路と、前記流路に配置された複数の調節弁とを有し、かつ、前段に位置する区画構造の反応槽と次段に位置する区画構造の反応槽を接続する流路を有する第1の区画と、
泳動溶液を内蔵する泳動溶液槽と、キャピラリ電気泳動で使用する電解質を含む緩衝液を内蔵した陰極緩衝液槽と、前記キャピラリ先端部を洗浄してサンプル間のコンタミネーションを防止する洗浄液を内蔵した洗浄液槽とを有し、かつ、前段に位置する前記区画構造の担体槽と前記泳動溶液槽とを接続する流路とその調整弁とを有する第2の区画と
を有する前処理・電気泳動用一体型カートリッジ。 - 請求項5に記載の前処理・電気泳動用一体型カートリッジにおいて、
前記第1の区画はPCR反応を行う工程に対応する1つの区画構造を有し、前記第2の区画は電気泳動の工程に対応する1つの区画構造を有する
ことを特徴とする前処理・電気泳動用一体型カートリッジ。 - 請求項5に記載の前処理・電気泳動用一体型カートリッジにおいて、
前記第1の区画はPCR反応を行う工程とサイクルシーケンス反応を行う工程に対応する2つの区画構造を有し、前記第2の区画は電気泳動の工程に対応する区画構造を有する
ことを特徴とする前処理・電気泳動用一体型カートリッジ。 - 前記生体サンプルから核酸を抽出する工程と、目的の領域についてPCR反応を行う工程と、増幅された核酸についてサイクルシーケンス反応を行う工程の少なくとも1つと、キャピラリ電気泳動により核酸を分析する工程にそれぞれ対応する複数の区画が流路によって接続された前処理・電気泳動用一体型カートリッジを載置する載置台と、前記カートリッジ内の溶液温度を調整する温度調整機構と、キャピラリ電気泳動機構と、前記調節弁の開閉を制御し、前記第1及び第2の区画内及び間の送液を制御すると共に、前記キャピラリ電気泳動機構の制御を通じ、電気泳動動作を制御するコントローラとを有する前処理一体型キャピラリ電気泳動装置における前処理一体型キャピラリ電気泳動方法において、
前記コントローラは、
前処理・電気泳動用一体型カートリッジを構成する第1の区画の構造に応じ、
前記生体サンプルから核酸を抽出する工程と、目的の領域についてPCR反応を行う工程と、増幅された核酸についてサイクルシーケンス反応を行う工程の少なくとも1つと、キャピラリ電気泳動により核酸を分析する工程までの全工程の自動実行を制御する
ことを特徴とする前処理一体型キャピラリ電気泳動方法。 - 請求項8に記載の前処理一体型キャピラリ電気泳動方法において、
前記前処理に対応する区画が、PCR反応を行う工程に対応する1つの区画構造のみを有するとき、
前記コントローラは、生体サンプルから精製された核酸の溶液を、前記区画構造内の反応槽に注入した後に前記前処理を開始する
ことを特徴とする前処理一体型キャピラリ電気泳動方法。 - 請求項8に記載の前処理一体型キャピラリ電気泳動方法において、
前記前処理に対応する区画が、PCR反応を行う工程とサイクルシーケンス反応を行う工程に対応する2つの区画構造を有するとき、
前記コントローラは、生体サンプルから精製された核酸の溶液を、前記区画構造内の反応槽に注入して前処理を開始する
ことを特徴とする前処理一体型キャピラリ電気泳動方法。
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