WO2014017193A1 - 前処理・電気泳動用一体型カートリッジ、前処理一体型キャピラリ電気泳動装置及び前処理一体型キャピラリ電気泳動方法 - Google Patents

前処理・電気泳動用一体型カートリッジ、前処理一体型キャピラリ電気泳動装置及び前処理一体型キャピラリ電気泳動方法 Download PDF

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electrophoresis
tank
pretreatment
nucleic acid
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友加里 佐保山
基博 山▲崎▼
佳孝 児玉
高道 村松
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株式会社日立ハイテクノロジーズ
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Definitions

  • the present invention is an integrated cartridge for pretreatment / electrophoresis (integrated sample-preparation-and electrophoresis-device) that can be used in all steps from, for example, extraction of nucleic acid from a biological sample and amplification and labeling to electrophoresis.
  • the present invention relates to a pretreatment integrated capillary electrophoresis apparatus (Integrated sample preparation and electrophoresis apparatus) and a pretreatment integrated capillary electrophoresis method (Integrated sample preparation and electrophoresis method) that can automatically execute all steps.
  • methods such as genetic diagnosis and DNA analysis that analyze biological samples at the genetic level generally include (1) the steps of extracting nucleic acids from biological samples, amplifying extracted nucleic acids, and labeling nucleic acids.
  • the step of executing the treatment reaction and the step (2) of electrophoresis for reading out the base sequence of the nucleic acid after the pretreatment are sequentially performed. In each of these stages, there are operations for mixing, heating, and dispensing a plurality of reagents, and a large amount of work is required for analysis.
  • a capillary electrophoresis apparatus is generally used for nucleic acid electrophoresis.
  • An example of a conventional capillary electrophoresis apparatus is disclosed in Patent Document 2.
  • Patent Document 1 describes a technique for automating each step of gene analysis, but it is assumed that the entire series of operations from obtaining a base sequence from a biological sample or from nucleic acid through electrophoresis is automated. Not. For this reason, in the prior art, an operation of transferring the cartridge or sample used in each process to the corresponding device is inevitably generated, and the operation for that purpose is complicated.
  • the present invention fully automatically executes a series of operations from the step of extracting nucleic acid from a sample solution or the subsequent step of amplifying and labeling the nucleic acid to electrophoresis of the nucleic acid and reading out the base sequence. Provide the technology that makes it possible.
  • the present invention provides an integrated cartridge that can be used for a series of reactions from pretreatment to electrophoresis, which is composed of one or a plurality of steps, and a series of reactions from pretreatment to electrophoresis using the cartridge.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a configuration example of a pretreatment-integrated capillary electrophoresis apparatus according to Embodiment 1.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating an example of a top surface configuration of an integrated cartridge for pretreatment / electrophoresis developing solution according to the first embodiment.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a pretreatment process according to the first embodiment.
  • FIG. 10 is a diagram illustrating a configuration example of a top surface of a cartridge according to a second embodiment.
  • FIG. 10 is a diagram illustrating a configuration example of a top surface of a cartridge according to a fourth embodiment.
  • FIG. 1 shows the configuration of a pretreatment integrated capillary electrophoresis apparatus 100 according to the first embodiment.
  • the pretreatment integrated capillary electrophoresis apparatus 100 is a device that performs a series of reactions and operations from pretreatment to electrophoresis in a fully automatic manner by using the cartridge 200 proposed in this specification. Details of the cartridge 200 will be described later.
  • the pretreatment integrated capillary electrophoresis apparatus 100 includes a capillary array 400, a pump / buffer unit 450, a constant temperature unit 410, a heater 500, a liquid feed pump 520, a control valve unit 550, an autosampler unit 600, a detection unit 700, and a high voltage power supply unit. 800 and a controller 900. Details of these units will be described later.
  • the controller 900 controls the operation of each unit constituting the pretreatment integrated capillary electrophoresis apparatus 100.
  • the cartridge 200 is mounted on a mounting table (not shown), and a heater 500 is attached inside the mounting table.
  • the cartridge 200 used in the present embodiment is composed of a single flat substrate having a flow path and a control valve formed on the surface thereof.
  • one cartridge 200 is used in a series of operations from nucleic acid extraction to preparation of an electrophoresis sample. Each operation is performed fully automatically by the cooperation of the units of the pretreatment integrated capillary electrophoresis apparatus 100 described in detail in the following sections.
  • one cartridge 200 is used up for each measurement.
  • FIG. 2 shows the overall configuration of the cartridge 200 used in this embodiment.
  • the cartridge 200 is roughly divided into four sections.
  • a nucleic acid extraction section 201 used for a reaction until nucleic acid is extracted from a biological sample
  • a PCR section 202 used for nucleic acid amplification and purification
  • a cycle sequence section 203 used when a label is added to the nucleic acid by a cycle sequence reaction.
  • an electrophoresis section 204 used in capillary electrophoresis. The structure and operation method of each section will be described later.
  • FIG. 3 shows the upper surface configuration of the capillary array 400.
  • the capillary array 400 has a configuration in which one or more capillaries 401 are bundled.
  • the capillary 401 is composed of a glass tube having an inner diameter of several tens to several hundreds of microns and an outer diameter of several hundreds of microns, and the surface is coated with polyimide or the like.
  • the capillary 401 is filled with a separation medium that gives a difference in migration speed to the sample during electrophoresis.
  • a capillary head 402 is provided at one end of the capillary 401.
  • the capillary head 402 is a member that bundles the capillaries 401.
  • the pump / buffer unit 450 and the capillary array 400 are connected through the capillary head 402.
  • a cathode electrode 403 is formed on the other end of the capillary 401.
  • the cathode electrode 403 is in contact with the sample / solution.
  • a detection unit 404 is provided in the vicinity of the capillary head 402. In the detection unit 404, the sample separated and electrophoresed in the capillary 401 is read. When the capillary 401 is broken or deteriorated in quality, it is replaced as necessary.
  • the constant temperature unit 410 has a function of keeping the temperature of the capillary array 400 at a set temperature during electrophoresis.
  • the constant temperature unit 410 is a flat plate-like component configured such that the capillary array 400 is sandwiched between a temperature control substrate to which a heater is attached and a heat insulating material.
  • a temperature sensor for feedback is attached to the temperature control board.
  • one end of the capillary array 400 on the cathode electrode 403 side is fixed to the constant temperature unit 410.
  • the tip of the capillary head 402 can be fixed at a desired position.
  • the pump / buffer unit 450 is a pump used to fill the capillary array 400 (specifically, individual capillaries 401) with a separation medium such as a polymer.
  • FIG. 4 shows the detailed structure of the pump / buffer unit 450.
  • the pump / buffer unit 450 is fixed to the disposer container 451, the piston 452 that seals the inside of the container and applies pressure to the inside, the valve 453 that connects the tip of the disposer container 451 and the capillary array 400, and the valve 453 or the piston 452.
  • the anode electrode 454 is provided.
  • the tip of the anode electrode 454 protrudes inward from the bottom surface (the surface provided with the output port) of the disposer container 451.
  • the separation medium 456 is accommodated inside the disposer container 451 in a state where the piston 452 is pulled (initial state).
  • a sachet surrounded by a thin film 455 is attached to the tip of the piston 452, and the inside thereof is filled with an anode buffer 457.
  • the inside of the disposer container 451 is divided into two sections. Therefore, the separation medium 456 and the anode buffer 457 are not mixed.
  • the piston 452 When filling the separation medium 456 into the capillary array 400, the piston 452 is pushed inside the disposer container 451 by applying pressure from the outside. At this time, a high pressure is applied to the inside of the disposer container 451. As a result, the separation medium 456 passes through the valve 453 and is filled into the capillary 401.
  • the separation medium 456 and the anode buffer 457 may be stored in different regions within the same component.
  • the anode electrode 454 needs to be in contact with the anode buffer solution 457 at all times.
  • the heater 500 is used to adjust the temperature of the solution held in the cartridge 200, such as heat retention and thermal cycle.
  • the heater 500 is disposed inside or on the surface of the mounting table of the cartridge 200.
  • the heater 500 and the cartridge 200 are fixed with a fixture or the like.
  • the liquid feed pump 520 sends air or the like to a control valve formed in the cartridge 200, pressurizes / depressurizes the flow path / tank in the cartridge, and adjusts the liquid feed of the solution in the cartridge 200.
  • the control valve unit 550 is a mechanism that opens and closes the control valve formed in the cartridge 200.
  • the autosampler unit 600 is a robot apparatus that sequentially transports the cartridge 200 to the initial setting position, then to the pretreatment reaction unit, and then to the sample introduction end of the capillary 400.
  • the detection unit 700 irradiates the detection unit 404 of the capillary array 400 with excitation light 701 output from a light source such as a laser or LED, and the detector 703 detects scattered light 702 or the like emitted from the capillary 401.
  • the detected light is output to a measuring device (not shown).
  • the measuring device analyzes the sample based on the detected signal intensity of the scattered light 702.
  • the high-voltage power supply unit 800 is connected to the anode electrode 454 and the cathode electrode 403, and executes electrophoresis by applying a high voltage to the capillary 401 filled with the polymer.
  • the controller 900 controls the operation of each unit so that the heater 500, the liquid feed pump 520, and the control valve unit 550 operate in cooperation.
  • the pretreatment is an operation of extracting a nucleic acid from a biological sample such as a swab or blood and processing the sample for analysis (base sequence analysis by capillary electrophoresis).
  • the pretreatment can be roughly divided into three steps. Nucleic acid extraction 1100, PCR reaction 1200, and cycle sequence reaction 1300. Depending on the analysis target, the pretreatment may be completed only with the nucleic acid extraction 1100 and the PCR reaction 1200, and the capillary electrophoresis 1400 may be executed.
  • the control operation 1101 of (1) is executed.
  • a sample is inserted into the cartridge 200.
  • the sample is sent to the reaction vessel in which the reagent is stored and mixed.
  • the sample is, for example, a biological sample.
  • the reagent is, for example, a cell lysate or a buffer.
  • control operation 1102 (2) is executed.
  • the temperature of the cartridge 200 is overheated or cooled to an appropriate reaction temperature by the heater 500.
  • the biological sample is dissolved and the nucleic acid is exposed.
  • control operation 1103 (3) is executed.
  • the dissolved sample is sent to the carrier tank and mixed with the carrier, and the nucleic acid is adsorbed on the surface of the carrier.
  • control operation 1104 (4) is executed.
  • the cleaning liquid is sent to the carrier tank, and the reagent / sample other than the nucleic acid adsorbed on the carrier is washed away.
  • the waste liquid is sent to the waste liquid tank.
  • control operation 1105 (5) is executed. In this control operation 1105, the eluate is sent to the carrier tank, and the nucleic acid adsorbed on the carrier is recovered.
  • (1-2) PCR Reaction Also in the PCR reaction 1200, first, the control operation 1101 of (1) is executed. In this control operation 1101, first, a sample after nucleic acid extraction is sent from the nucleic acid extraction section 201 to the PCR section 202. The sample is sent to a reaction vessel in which reagents (primer, dNTP, buffer, enzyme) are stored and mixed.
  • reagents primary, dNTP, buffer, enzyme
  • control operation 1102 (2) is executed.
  • the temperature of the mixed solution in the cartridge 200 is overheated or cooled to an appropriate reaction temperature by the heat cycle of the heater 500.
  • the temperature adjustment only the target region of the nucleic acid is amplified.
  • control operation 1103 (3) is executed.
  • the reaction product is sent to the carrier tank and mixed with the carrier, and the nucleic acid is adsorbed on the surface of the carrier.
  • control operation 1104 (4) is executed.
  • the cleaning liquid is sent to the carrier tank, and the reagent / sample other than the nucleic acid adsorbed on the carrier is washed away.
  • the waste liquid is sent to the waste liquid tank.
  • control operation 1105 (5) is executed. In this control operation 1105, the eluate is sent to the carrier tank, and the nucleic acid adsorbed on the carrier is recovered.
  • (1-3) Cycle Sequence Reaction Also in the cycle sequence reaction 1300, first, the control operation 1101 of (1) is executed. In this control operation 1101, first, the product after the PCR reaction is sent from the PCR section 202 to the cycle sequence section 203. The product from the PCR compartment 202 is sent to a reaction vessel in which reagents (primers, fluorescently labeled dNTPs, enzymes, buffers, etc.) are stored and mixed.
  • reagents primary, fluorescently labeled dNTPs, enzymes, buffers, etc.
  • control operation 1102 (2) is executed.
  • the temperature of the mixed solution in the cartridge 200 is overheated or cooled to an appropriate reaction temperature by the heat cycle of the heater 500.
  • the nucleic acid is hybridized with dNTPs fluorescently labeled.
  • control operation 1103 (3) is executed.
  • the reaction product is sent to the carrier tank and mixed with the carrier, and the nucleic acid is adsorbed on the surface of the carrier.
  • control operation 1104 (4) is executed.
  • the cleaning liquid is sent to the carrier tank, and the reagent / sample other than the nucleic acid adsorbed on the carrier is washed away.
  • the waste liquid is sent to the waste liquid tank.
  • control operation 1105 (5) is executed.
  • the eluate is sent to the carrier tank, and the nucleic acid adsorbed on the carrier is recovered. That is, excess fluorescence and primers are removed from the reaction product, and the nucleic acid is recovered.
  • the nucleic acid is collected in the electrophoresis compartment 204.
  • Capillary electrophoresis 1400 is performed on the nucleic acid collected in the electrophoresis section 204.
  • the cartridge 200 is preferably made of a material that is difficult for biological samples to adsorb, such as quartz glass, PMMA, polycarbonate, and the like.
  • FIG. 6 shows a configuration example of the nucleic acid extraction section 201.
  • the nucleic acid extraction section 201 includes a reagent tank 211 containing a reagent, a reaction tank 212 for mixing the inserted biological sample and the reagent, a carrier tank 213 containing a carrier used for purification of the reaction product, and a washing liquid for washing the carrier.
  • a cleaning liquid tank 214 containing a liquid
  • a waste liquid tank 215 for collecting a solution other than nucleic acid from the carrier tank
  • an eluent tank 216 containing an eluent for collecting the nucleic acid from the carrier.
  • the reagent tank 211 adopts a sealed structure so that the reagent can be transported in a stored state.
  • an arbitrary reagent may be injected into the empty reagent tank 211 immediately before the analysis and analyzed.
  • the channel 246 is a channel that connects the nucleic acid extraction section 201 and the PCR section 202.
  • the nucleic acid extraction section 201 is formed with ports 217 to 220 and port channels 221 to 224 that are used to send the solution by pressurization by the liquid feed pump 520.
  • the port channels 221 to 224 are channels that individually connect the ports 217 to 220 and the corresponding tanks.
  • the control valve 231 is disposed in the flow path 241 connecting the reagent tank 211 and the reaction tank 212, the control valve 232 is disposed in the flow path 242 connecting the reaction tank 212 and the carrier tank 213, and the control valve 233 is a cleaning liquid.
  • the control valve 234 and the control valve 235 are disposed in the flow path 244 connecting the carrier tank 213 and the waste liquid tank 215, and the control valve 236 is disposed in the elution liquid tank.
  • the control valve 237 is disposed in the flow path 246 connecting the carrier tank 213 and the PCR section 202.
  • the carrier tank 213 is connected to the reaction tank 212, the cleaning liquid tank 214, the waste liquid tank 215, and the eluate tank 216 through different flow paths 242, 243, 244, and 245, respectively.
  • the flow direction of all the flow paths is determined, and in principle, no back flow is allowed.
  • the reagent tank 211, the cleaning liquid tank 214, the waste liquid tank 215, and the eluate tank 216 are connected to the ports 217 to 220 via the port channels 221 to 224, respectively.
  • the carrier placed in the carrier tank 213 is preferably one that is particularly easy to adsorb nucleic acids such as glass beads, glass wool, and porous glass.
  • nucleic acids such as glass beads, glass wool, and porous glass.
  • a primer to which biotin has been added in advance is used for the reaction, and streptavidin is surface-modified in the carrier tank 213.
  • the washing liquid contains an organic solvent such as alcohol at a high concentration, and removes components other than nucleic acids from the carrier by washing the carrier a plurality of times.
  • FIG. 7 shows a configuration example of the PCR section 202.
  • the PCR section 202 includes a reagent tank 251 that contains a reagent, a reaction tank 252 that mixes the product of the nucleic acid extraction section 201 and the reagent and performs thermal cycling, and a carrier tank that contains a carrier used for purification of the reaction product. 253, a washing liquid tank 254 containing a washing liquid for washing the carrier, a waste liquid tank 255 for collecting a solution other than the nucleic acid from the carrier tank, and an elution liquid tank 256 containing an elution liquid for collecting the nucleic acid from the carrier.
  • the channel 286 is a channel that connects the PCR section 202 and the cycle sequence section 203.
  • ports 257 to 260 and port channels 261 to 264 used for feeding the solution by pressurization by the liquid feed pump 520 are formed in the PCR section 202.
  • the port channels 261 to 264 are channels that individually connect the ports 257 to 260 and the corresponding tanks. Also in the case of the PCR section 202, the flow directions of all the flow paths are determined, and in principle, no back flow is allowed.
  • FIG. 8 shows a configuration example of the cycle sequence section 203.
  • the cycle sequence section 203 includes a reagent tank 311 containing a reagent, a reaction tank 312 for mixing the product of the PCR section 202 and the reagent to perform a thermal cycle, and a carrier tank containing a carrier used for purification of the reaction product. 313, a washing liquid tank 314 containing a washing liquid for washing the carrier, a waste liquid tank 315 for collecting a solution other than the nucleic acid from the carrier tank, and an elution liquid tank 316 containing an elution liquid for collecting the nucleic acid from the carrier.
  • the flow path 346 is a flow path that connects the cycle sequence section 203 and the migration section 204.
  • the cycle sequence section 203 is formed with ports 317 to 320 and port flow paths 321 to 324 used to send the solution by pressurization by the liquid feed pump 520.
  • the port channels 321 to 324 are channels that individually connect the ports 317 to 320 and the corresponding tanks. Also in the case of the cycle sequence section 203, the flow directions of all the flow paths are determined, and in principle, backflow is not allowed.
  • FIG. 9 shows a configuration example of the migration section 204.
  • the electrophoresis section 204 includes an electrophoresis solution tank 351, a cathode buffer solution tank 352 containing a buffer solution containing an electrolyte, and a washing water tank 353 containing washing water for washing the capillary.
  • the electrophoretic solution tank 351 is connected to the cycle sequence section 203 via the flow path 346.
  • a port 354 and a port channel 355 are formed in the electrophoresis section 204 to be used for feeding a solution by pressurization by a liquid feed pump 520.
  • the port channel 355 connects the port 354 and the electrophoresis solution tank 351.
  • the cleaning liquid tank and the waste liquid tank are separately formed in each of the nucleic acid extraction section 201 to the cycle sequence section 203 .
  • the cleaning liquid tank and the waste liquid tank in the corresponding section may be shared by one.
  • the case where the number of partitions constituting the cartridge 200 is four has been described, but the number of partitions may be increased or decreased depending on the type of sample to be analyzed or the sample to be started.
  • control valves and ports mounted on the cartridge 200 are in a closed state, and an opening operation is performed as necessary.
  • the control valve in the closed state does not allow the solutions to pass therethrough, but has a mechanism for allowing a gas such as air or gas to pass therethrough. Since a control valve having this type of characteristic is already known, a detailed description thereof will be omitted.
  • the solution feeding in the nucleic acid extraction section 201, the PCR section 202, and the cycle sequence section 203 is completed by sequentially performing five liquid feeding operations for each section.
  • the first nucleic acid extraction section 201 will be described as an example.
  • the liquid feeding operation in the PCR section 202 and the cycle sequence section 203 follows this.
  • a biological sample such as a swab or blood is inserted into the reaction vessel 212 and covered with a seal or the like to seal the system.
  • the control valve 231 and the ports 217 and 218 are opened, and air is injected from the port 217.
  • the air flows in the order of port 217 ⁇ reagent tank 211 ⁇ reaction tank 212 ⁇ support tank 213 ⁇ waste liquid tank 215 ⁇ port 218.
  • the cartridge 200 may be heated using the heater 500 to adjust the temperature of the mixed liquid in the reaction tank 212 to an appropriate temperature.
  • Operation (2) Subsequently, air is injected from the port 217 while the control valve 232 is opened.
  • the air flow path is the same as in operation (1).
  • the liquid mixture of the biological sample and the reagent in the reaction tank 212 flows to the carrier tank 213 through the flow path 242.
  • the nucleic acid in the mixed solution adheres to the carrier in the carrier tank 213.
  • the solution in the carrier tank 213 flows through the flow path 246 into the next section, that is, the reaction tank 252 in the PCR section 202.
  • the ports 220 and 258 are closed.
  • the PCR section 202 and the cycle sequence section 203 have the same structure as the nucleic acid extraction section 201. Accordingly, operations similar to the operations (1) to (5) described above are repeatedly performed on the PCR section 202 and the cycle sequence section 203.
  • a migration agent tank 351 in the migration section 204 is preliminarily sealed with a denaturing agent such as formamide.
  • the eluate sent from the cycle sequence section 203 is mixed with the denaturant in the electrophoresis solution tank 351.
  • the electrophoresis compartment 204 is provided with a cathode buffer solution tank 352 and a washing water tank 353. In order to prevent evaporation of the solution from each tank and external contamination, Each tank opening is covered with a thin film.
  • the tip of the capillary 401 breaks through a thin film covering the opening of the electrophoresis solution tank 351 and is immersed in the solution in the tank.
  • the thin film may be broken using a needle separately prepared instead of the capillary tip.
  • it instead of covering the opening of each tank with a seal, it may be covered with a rubber film having a slit, and the tip of the capillary may be inserted through the cut.
  • FIG. 10 shows an operation procedure of the pretreatment integrated capillary electrophoresis apparatus 100 according to the present embodiment. Each step will be described with reference to the drawings.
  • Step 2001 As a premise, first, the cartridge 200 into which the sample has been introduced is attached to the mounting table of the pretreatment integrated capillary electrophoresis apparatus 100. Further, the pump / buffer unit 450 is attached to the pretreatment integrated capillary electrophoresis apparatus 100. In this state, when the apparatus main body is turned on, this operation procedure is started. First, the cartridge 200 enclosing the biological sample and the reagent is fixed to the autosampler unit 600. At that time, the bottom surface of the cartridge 200 and the heater 500 are in contact with each other.
  • the control valves 231 to 237, 271 to 277, and 331 to 337 of the cartridge 200 are connected to the control valve unit 550, and the ports 217 to 220, 257 to 260, and 317 to 320 are connected to the liquid feed pump 520.
  • the pump / buffer unit 450 is connected to one end of the capillary array 400 and the high-voltage power supply unit 800.
  • Step 2002 temperature adjustment by the heater 500 is started.
  • the temperature may be set manually by the user for each use, or may be automatically set to a predetermined temperature according to the content of measurement.
  • irradiation with the laser 701 is also started. Note that the output is unstable immediately after laser irradiation. Therefore, in order to maintain detection sensitivity, laser irradiation may be started before electrophoresis is started.
  • Step 2003 The arm of the autosampler unit 600 that fixes the cartridge 200, the heater 500, and the control valve unit 520 moves, and the tip of the capillary array 400 is immersed in the cathode buffer solution tank 352.
  • Step 2004 Next, an external force is applied to the piston 452 of the pump / buffer unit 450 by manual or automatic control, and the built-in separation medium 456 is filled in the capillary array 400. At the same time, the anode electrode 454 is immersed in the anode buffer 457.
  • Step 2005 In the cartridge 200, nucleic acid extraction, PCR reaction, and cycle sequence reaction are continuously performed.
  • the implementation method is as described above. Further, a voltage is applied to both ends of the capillary by the high voltage power supply unit 800. This operation is called pre-run. By performing the pre-run for a long time, there is an effect of improving the analysis performance of capillary electrophoresis.
  • Step 2006 By the control valve unit 550 and the liquid feed pump 520, the sample in the cycle sequence section 203 is fed to the electrophoretic solution tank 351 located in the subsequent stage.
  • the amount of the liquid fed can be adjusted by adjusting the amount of air injected from the pump 520.
  • Step 2007 Here, the voltage application is temporarily stopped. In this state, the autosampler unit 600 operates and the tip of the capillary array 400 is inserted into the electrophoresis solution tank 351.
  • Step 2008 By applying a weak voltage from the high-voltage power supply unit 800 to both ends of the capillary array for a short time, an appropriate amount of sample is introduced into the capillary array 400 filled with the separation medium.
  • Step 2009 The autosampler unit 600 operates again, and the tip of the capillary array 400 is immersed in the cathode buffer solution sealed in the cathode buffer solution tank 352.
  • Step 2010 A high voltage is applied from the high-voltage power supply unit 800 to the capillary array 400 to perform electrophoresis.
  • the detection unit 404 of the capillary 401 is irradiated with excitation light 701.
  • the detector 703 detects that the sample is fluorescent by the excitation light 701 and outputs the detection result to a measurement device (not shown).
  • the measuring device analyzes the sample based on the detection result.
  • Step 2011 At this stage, electrophoresis is completed.
  • Step 2012 After the voltage application is completed, the autosampler unit 600 operates to immerse the tip of the capillary array 400 in the cleaning liquid tank 353.
  • the washing water tank 353 contains washing water for washing the tip and the inside of the capillary.
  • Step 2013 The piston 452 of the pump / buffer unit 450 is pulled manually or automatically to fill the inside of the capillary array with the cleaning liquid. By repeating this operation several times, the cleaning effect can be improved.
  • Example 2 In this embodiment, a configuration example of a cartridge 200 suitable for performing capillary electrophoresis from purified nucleic acid and performing fragment analysis is shown.
  • the basic configuration and operation of the pretreatment integrated capillary electrophoresis apparatus 100 are the same as those in the first embodiment. Below, it demonstrates focusing on the difference between a present Example and Example 1.
  • FIG. 1 A configuration example of a cartridge 200 suitable for performing capillary electrophoresis from purified nucleic acid and performing fragment analysis is shown.
  • the basic configuration and operation of the pretreatment integrated capillary electrophoresis apparatus 100 are the same as those in the first embodiment. Below, it demonstrates focusing on the difference between a present Example and Example 1.
  • FIG. 11 shows a configuration example of the cartridge 200 according to the present embodiment.
  • the cartridge 200 shown in FIG. 11 includes only a PCR section 202 and an electrophoresis section 204, and the nucleic acid extraction section 201 and the cycle sequence section 203 are omitted.
  • the treatment process is started by introducing the purified nucleic acid solution into the reaction tank 252 and then sealing with a seal or the like. Subsequent steps are the same as those in the first embodiment. Also in this case, the same effect as in the first embodiment can be realized.
  • Example 3 different analysis can be performed by using different reagents to be sealed in the tank.
  • the reagent tank 251 of the PCR section 202 is sealed so that the reagent can be transported in a stored state.
  • an arbitrary reagent may be injected into the empty reagent tank 251 and analyzed immediately before the analysis.
  • STR short tandem repeat
  • the reagent tank 251 has a mixed solution of enzyme, dNTP, buffer, etc. for PCR reaction
  • the reaction liquid tank 252 has a fluorescently labeled primer mixed solution corresponding to the STR region. It is a point to enclose. Also in this case, the same effect as in the second embodiment can be realized.
  • Example 4 In this example, a configuration in which PCR reaction and cycle sequence reaction can be performed from purified nucleic acid will be described.
  • the basic configuration and operation of the pretreatment integrated capillary electrophoresis apparatus 100 are the same as those in the first embodiment. Below, it demonstrates focusing on the difference between Example 1 and a present Example.
  • FIG. 12 shows a configuration example of the cartridge 200 according to the present embodiment.
  • the cartridge 200 shown in FIG. 12 is configured by only three of a PCR section 202, a cycle sequence section 203, and an electrophoresis section 204, and the nucleic acid extraction section 201 is omitted.
  • the reaction operation is started from a state in which the purified nucleic acid solution is inserted into the reaction tank 252 and the system is sealed with a seal or the like.
  • the subsequent steps are the same as in the first embodiment. Also in this case, the same effect as in the first embodiment can be realized.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments, and includes various modifications.
  • the above-described embodiments have been described in detail for easy understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations.
  • a part of a certain embodiment can be replaced with a configuration of another embodiment, and a configuration of another embodiment can be added to a configuration of a certain embodiment.

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Abstract

　前処理から電気泳動までの全ての工程を全自動で実現可能とする。前処理を構成する個々の工程に対応する１つ又は複数の区画構造を有し、各区画構造は、（１）反応槽と、試薬槽と、各槽間を接続する複数の流路と、前記流路に配置された複数の調節弁とを有し、かつ、前段に位置する区画構造の反応槽と次段に位置する区画構造の反応槽を接続する流路を有する第１の区画と、（２）泳動溶液槽と、陰極緩衝液槽と、洗浄液槽とを有し、かつ、前段に位置する前記区画構造の担体槽と前記泳動溶液槽とを接続する流路とその調整弁とを有する第２の区画とを有する前処理・電気泳動用一体型カートリッジを提供する。

Description

前処理・電気泳動用一体型カートリッジ、前処理一体型キャピラリ電気泳動装置及び前処理一体型キャピラリ電気泳動方法
　本発明は、例えば生体サンプルから核酸を抽出し、増幅・標識付加をする前処理から電気泳動までの全工程で使用可能な前処理・電気泳動用一体型カートリッジ（Integrated sample preparation and electrophoresis device）、並びに、全工程を自動実行可能な前処理一体型キャピラリ電気泳動装置（Integrated sample preparation and electrophoresis apparatus）及び前処理一体型キャピラリ電気泳動方法（Integrated sample preparation and electrophoresis method）に関する。
　遺伝子診断やDNA鑑定などの生体サンプルを遺伝子レベルで解析する手法では、一般に、(1) 生体サンプルから核酸を抽出する工程、抽出された核酸を増幅する工程、核酸に標識を付ける工程などの前処理反応を実行する段階と、(2) 前処理後の核酸の塩基配列を読み出す電気泳動の段階が順番に実行される。これらの各段階には、それぞれ複数の試薬を混合し、加熱し、分注する操作があり、解析にあたって多くの作業量が必要とされる。
　そこで作業性向上などを目的として、前処理の各工程で必要になる操作を、展開液の貯蔵槽・流路などを組み入れたカートリッジ上で自動的に実行する手法が知られている（例えば特許文献１参照）。
　また、核酸の電気泳動には、一般に、キャピラリ電気泳動装置が用いられる。従来のキャピラリ電気泳動装置の一例として、特許文献２に記載のものがある。
特開２００７－３３０１７９号公報 米国特許第５３６６６０８号明細書
　ところが、特許文献１は、遺伝子解析の各工程を自動化する技術を記載しているが、生体サンプルから又は核酸から電気泳動を経て塩基配列を得るまでの一連の操作全体を自動化することは想定していない。このため、従来技術では、各工程で使用するカートリッジやサンプルを対応装置に載せ替える作業が必ず発生し、そのための作業が煩雑であった。
　そこで、本発明は、サンプル液から核酸を抽出する段階又はその後の核酸を増幅し、標識を付ける前処理の段階から、核酸を電気泳動し塩基配列を読み出すまでの一連の操作を全自動で実行可能とする技術を提供する。
　本発明は、１つ又は複数の工程から構成される前処理から電気泳動までの一連の反応に使用可能な一体型カートリッジと、当該カートリッジを使用して前処理から電気泳動までの一連の反応を１つの装置だけで実現する前処理一体型キャピラリ電気泳動装置及び方法を提供する。
　本発明によれば、前処理から電気泳動までの一連の反応を１つの装置及び１つのカートリッジを用いて実行することができ、作業性の向上が期待される。前述した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
実施例１に係る前処理一体型キャピラリ電気泳動装置の構成例を示す図。 実施例１に係る前処理・電気泳動用展開液の一体型カートリッジの上面構成例を示す図。 キャピラリアレイの上面構成を示す図。 ポンプ・バッファユニットの断面構成例を示す図。 実施例１に係る前処理工程を説明する図。 核酸抽出区画の上面構成例を示す図。 ＰＣＲ区画の上面構成例を示す図。 サイクルシーケンス区画の上面構成例を示す図。 泳動区画の上面構成例を示す図。 前処理一体型キャピラリ電気泳動装置の動作手順を説明するフローチャート。 実施例２に係るカートリッジの上面構成例を示す図。 実施例４に係るカートリッジの上面構成例を示す図。
　以下、図面に基づいて、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明の実施態様は、後述する実施例に限定されるものではなく、その技術思想の範囲において、種々の変形が可能である。
[実施例１]
　［前処理一体型キャピラリ電気泳動装置の構成］
　図１は、実施例１に係る前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００の構成を示す。前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００は、前処理から電気泳動までの一連の反応・操作を、本明細書で提案するカートリッジ２００を用いることにより、全自動で実行する装置である。カートリッジ２００の詳細については後述する。
　前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００は、キャピラリアレイ４００、ポンプ・バッファユニット４５０、恒温ユニット４１０、ヒータ５００、送液ポンプ５２０、調節弁ユニット５５０、オートサンプラユニット６００、検出ユニット７００、高圧電源ユニット８００、コントローラ９００を有している。これらユニットの詳細については後述する。なお、コントローラ９００は、前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００を構成する各部の動作を制御する。また、カートリッジ２００は、不図示の載置台に載置され、載置台の内部にヒータ５００が取り付けられる。
　［カートリッジの構成］
　本実施例で使用するカートリッジ２００は、その表面に流路や調節弁を形成した１枚の平板状の基板で構成される。本実施例では、１枚のカートリッジ２００を核酸抽出から泳動サンプルの準備までの一連の操作で使用する。各操作は、次項以降で詳細に説明する前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００の各ユニットの協働により全自動で実行される。本実施例では、１回の測定につき、原則、１枚のカートリッジ２００を使い切るものとする。
　図２に、本実施例で使用するカートリッジ２００の全体構成を示す。カートリッジ２００は、大きく分けて４つの区画で構成される。生体サンプルから核酸を抽出するまでの反応に使用する核酸抽出区画２０１と、核酸の増幅と精製に使用するＰＣＲ区画２０２と、サイクルシーケンス反応により標識を核酸に付加する際に使用するサイクルシーケンス区画２０３と、キャピラリ電気泳動で使用する泳動区画２０４である。各区画の構造及び操作方法については後述する。
　［キャピラリアレイの構成］
　図３に、キャピラリアレイ４００の上面構成を示す。キャピラリアレイ４００は、１本以上のキャピラリ４０１を束ねた構成を有している。キャピラリ４０１は、内径が数十～数百ミクロン、外径が数百ミクロンのガラス管で構成され、表面はポリイミド等でコーティングされている。キャピラリ４０１の内部には、電気泳動時に、サンプルに泳動速度差を与える分離媒体が充填されている。
　キャピラリ４０１の一端には、キャピラリヘッド４０２が設けられる。キャピラリヘッド４０２は、キャピラリ４０１を束ねる部材である。このキャピラリヘッド４０２を通じ、ポンプ・バッファユニット４５０とキャピラリアレイ４００とが接続される。キャピラリ４０１の他端には陰極電極４０３が形成されている。陰極電極４０３は、サンプル・溶液等に接触する。なお、キャピラリヘッド４０２の近傍位置には検出部４０４が設けられている。この検出部４０４において、キャピラリ４０１内で泳動分離されたサンプルの読み取りが行われる。キャピラリ４０１が破損又は品質劣化したときは、必要に応じて取り換えられる。
　［恒温ユニットの構成］
　恒温ユニット４１０は、電気泳動時に、キャピラリアレイ４００の温度を設定温度に保つ機能を有している。恒温ユニット４１０は、ヒータが取り付けられた温度制御基板と断熱材とでキャピラリアレイ４００を挟み込む構成の平板状の部品である。温度制御基板には、フィードバック用の温度センサが取り付けられている。ここで、キャピラリアレイ４００の陰極電極４０３側の一端は、恒温ユニット４１０に固定されている。これにより、キャピラリヘッド４０２の先端を所望の位置に固定することができる。
　［ポンプ・バッファユニットの構成］
　ポンプ・バッファユニット４５０は、キャピラリアレイ４００（具体的には、個々のキャピラリ４０１）にポリマなどの分離媒体を充填するために用いられるポンプである。
　図４に、ポンプ・バッファユニット４５０の詳細構造を示す。ポンプ・バッファユニット４５０は、ディスポーザ容器４５１と、容器内を密閉し内部へ圧力をかけるピストン４５２と、ディスポーザ容器４５１の先端とキャピラリアレイ４００とを接続するバルブ４５３と、バルブ４５３又はピストン４５２に固定された陽極電極４５４を有する。
　陽極電極４５４の先端は、ディスポーザ容器４５１の底面（出力口の設けられた面）から内側に突き出ている。
　ディスポーザ容器４５１の内部には、ピストン４５２を引いた状態（初期状態）で、分離媒体４５６が収容されている。なお、ピストン４５２の先端には薄膜４５５で囲まれた小袋が取り付けられており、その内部には陽極緩衝液４５７が充填されている。このように、ピストン４５２を引いた状態では、ディスポーザ容器４５１の内側は２つの区画に分割されている。従って、分離媒体４５６と陽極緩衝液４５７が混ざることはない。
　分離媒体４５６をキャピラリアレイ４００内に充填する際には、外部から圧力をかけてピストン４５２がディスポーザ容器４５１の内側に押し込まれる。この際、ディスポーザ容器４５１の内側には高い圧力が掛かる。これにより、分離媒体４５６がバルブ４５３を通過してキャピラリ４０１内に充填される。
　電気泳動時には、さらに圧力をかけてピストン４５２をディスポーザ容器４５１のさらに内側に押し込む。この際、ピストン４５２のストローク量が一定量を超えると、陽極電極４５４の先端が薄膜４５５を突き破る。これにより、分離媒体４５６と陽極緩衝液４５７がディスポーザ容器４５１の内部で混合される。
　なお、ポンプ・バッファユニット４５０においては、分離媒体４５６と陽極緩衝液４５７とが同一部品内の別領域に保存されていても良い。ただし、陽極電極４５４は、常時、陽極緩衝液４５７に接している必要がある。
　［ヒータの構成］
　ヒータ５００は、カートリッジ２００に保持される溶液の保温、熱サイクルなどの温度調整に用いられる。図１に示す例の場合、ヒータ５００は、カートリッジ２００の載置台の内側又は表面に配置される。例えばヒータ５００とカートリッジ２００は、固定具などで固定される。
　［送液ポンプの構成］
　送液ポンプ５２０は、カートリッジ２００に形成された調節弁に空気などを送り、カートリッジ内の流路・槽を加圧・減圧し、カートリッジ２００内での溶液の送液を調整する。
　［調節弁ユニットの構成］
　調節弁ユニット５５０は、カートリッジ２００に形成された調節弁を開閉する機構部である。
　［オートサンプラユニットの構成］
　オートサンプラユニット６００は、カートリッジ２００を、初期セット位置に、次に前処理反応ユニット部に、そしてキャピラリ４００のサンプル導入端に、順番に運搬するロボット装置である。
　［検出ユニットの構成］
　検出ユニット７００は、キャピラリアレイ４００の検出部４０４に対し、レーザやLEDなどの光源から出力された励起光７０１を照射し、キャピラリ４０１より発する散乱光７０２などを検出器７０３で検出する。検出した光は、不図示の測定装置に出力される。測定装置は、検出された散乱光７０２の信号強度に基づいてサンプルを分析する。
　［高圧電源ユニットの構成］
　高圧電源ユニット８００は、陽極電極４５４と陰極電極４０３に接続されており、ポリマが充填されたキャピラリ４０１に高電圧を印加することにより電気泳動を実行する。
　［コントローラの構成］
　コントローラ９００は、ヒータ５００と、送液ポンプ５２０と、調節弁ユニット５５０が連携して動作するように各部の動作を制御する。
　［前処理から電気泳動までの動作の概要］
　続いて、前処理一体型キャピラリ電気泳動装置において自動的に実行される一連の動作について説明する。
　（１）前処理動作
　ここでは、図５を参照し、前処理の処理内容の概要を説明する。なお、前処理とは、スワブや血液などの生体サンプルから核酸を抽出し、分析用（キャピラリ電気泳動による塩基配列解析）にサンプルを処理する操作である。前処理は、大まかに３つの工程に分けることができる。核酸抽出１１００、ＰＣＲ反応１２００、サイクルシーケンス反応１３００である。なお、解析対象によっては、核酸抽出１１００とＰＣＲ反応１２００のみで前処理を終え、キャピラリ電気泳動１４００を実行する場合もある。
　３つの工程は、どれも同じ手順で実行することができる。すなわち、(1)試薬とサンプルの混合１１０１、(2)反応の進行１１０２、(3)核酸と担体の吸着１１０３、(4)担体の洗浄１１０４、(5)核酸の溶出１１０５の５つである。このうち、(1)と(2)は反応の実施であり、(3)～(5)は反応物の精製である。
　以下、各段階で、コントローラ９００により実行される制御動作の内容を説明する。
　（１－１）核酸抽出
　核酸抽出１１００では、まず、(1)の制御動作１１０１が実行される。この制御動作１１０１では、まず、サンプルがカートリッジ２００に挿入される。サンプルは、試薬が貯蔵されている反応槽へと送液され、混合される。サンプルは例えば生体サンプルである。また、試薬は例えば細胞可溶化液、緩衝液などである。
　次に、(2)の制御動作１１０２が実行される。この制御動作１１０２では、ヒータ５００により、カートリッジ２００の温度が適切な反応温度に過熱又は冷却される。この温度調整により、生体サンプルが溶解され、核酸が露出される。
　続いて、(3)の制御動作１１０３が実行される。この制御動作１１０３では、溶解させたサンプルを担体槽に送液して担体と混合し、核酸を担体表面に吸着させる。次に、(4)の制御動作１１０４が実行される。この制御動作１１０４では、洗浄液が担体槽に送液され、担体に吸着している核酸以外の試薬・サンプルが洗い流される。なお、廃液は廃液槽に送液される。最後に、(5)の制御動作１１０５が実行される。この制御動作１１０５では、溶出液を担体槽に送液し、担体に吸着している核酸を回収する。
　（１－２）ＰＣＲ反応
　ＰＣＲ反応１２００においても、まず、(1)の制御動作１１０１が実行される。この制御動作１１０１では、まず、核酸抽出後のサンプルが核酸抽出区画２０１からＰＣＲ区画２０２に送液される。サンプルは、試薬（プライマ、dNTP、緩衝液、酵素）が貯蔵されている反応槽へと送液され、混合される。
　次に、(2)の制御動作１１０２が実行される。この制御動作１１０２では、ヒータ５００の熱サイクルにより、カートリッジ２００内の混合溶液の温度が適切な反応温度に過熱又は冷却される。この温度調整により、核酸のうち目的領域のみが増幅される。
　続いて、(3)の制御動作１１０３が実行される。この制御動作１１０３では、反応産物を担体槽に送液して担体と混合し、核酸を担体表面に吸着させる。次に、(4)の制御動作１１０４が実行される。この制御動作１１０４では、洗浄液が担体槽に送液され、担体に吸着している核酸以外の試薬・サンプルが洗い流される。なお、廃液は廃液槽に送液される。最後に、(5)の制御動作１１０５が実行される。この制御動作１１０５では、溶出液を担体槽に送液し、担体に吸着している核酸を回収する。
　（１－３）サイクルシーケンス反応
　サイクルシーケンス反応１３００においても、まず、(1)の制御動作１１０１が実行される。この制御動作１１０１では、まず、ＰＣＲ反応後の産物がＰＣＲ区画２０２からサイクルシーケンス区画２０３に送液される。ＰＣＲ区画２０２からの産物は、試薬（プライマ、蛍光標識したdNTP、酵素、緩衝液など）が貯蔵されている反応槽へと送液され、混合される。
　次に、(2)の制御動作１１０２が実行される。この制御動作１１０２では、ヒータ５００の熱サイクルにより、カートリッジ２００内の混合溶液の温度が適切な反応温度に過熱又は冷却される。この温度調整により、核酸に蛍光標識したdNTPをハイブリダイズする。
　続いて、(3)の制御動作１１０３が実行される。この制御動作１１０３では、反応産物を担体槽に送液して担体と混合し、核酸を担体表面に吸着させる。次に、(4)の制御動作１１０４が実行される。この制御動作１１０４では、洗浄液が担体槽に送液され、担体に吸着している核酸以外の試薬・サンプルが洗い流される。なお、廃液は廃液槽に送液される。最後に、(5)の制御動作１１０５が実行される。この制御動作１１０５では、溶出液を担体槽に送液し、担体に吸着している核酸を回収する。すなわち、反応産物から余分な蛍光、プライマなどを除去し、核酸を回収する。核酸は、泳動区画２０４に回収される。
　（２）泳動動作
　泳動区画２０４に回収された核酸について、キャピラリ電気泳動１４００が実施される。
　［各区画の構造と送液］
　続いて、カートリッジ２００を構成する各区画内における送液手順について具体的に説明する。なお、核酸抽出区画２０１、ＰＣＲ区画２０２、サイクルシーケンス区画２０３のおおよその構成と送液のための手順は同じである。なお、カートリッジ２００は、生体サンプルが吸着し難い材料、例えば石英ガラス、PMMA、ポリカーボネートなどで構成することが望ましい。
　図６に、核酸抽出区画２０１の構成例を示す。核酸抽出区画２０１は、試薬を内蔵する試薬槽２１１と、挿入した生体サンプルと試薬とを混合する反応槽２１２と、反応産物の精製に用いる担体を内蔵した担体槽２１３と、担体を洗浄する洗浄液を内蔵した洗浄液槽２１４と、担体槽から核酸以外の溶液を回収する廃液槽２１５と、担体から核酸を回収するための溶出液を内蔵した溶出液槽２１６とを有している。
　試薬槽２１１は、試薬が保管された状態で運搬できるように、密閉構造を採用する。一方で、空の試薬槽２１１に対して分析直前に任意の試薬を注入し、分析しても良い。
　各槽２１１～２１６の間には、流路２４１～２４６と、流路の開閉を調節する調節弁２３１～２３７が設けられている。なお、流路２４６は、核酸抽出区画２０１とＰＣＲ区画２０２とを接続する流路である。この他、核酸抽出区画２０１には、送液ポンプ５２０による加圧により溶液を送液するために使用するポート２１７～２２０と、ポート流路２２１～２２４が形成されている。ポート流路２２１～２２４は、ポート２１７～２２０とそれぞれに対応する槽とを個別に接続する流路である。
　調節弁２３１は、試薬槽２１１と反応槽２１２を接続する流路２４１に配置され、調節弁２３２は、反応槽２１２と担体槽２１３を接続する流路２４２に配置され、調節弁２３３は、洗浄液槽２１４と担体槽２１３を接続する流路２４３に配置され、調節弁２３４と調節弁２３５は、担体槽２１３と廃液槽２１５を接続する流路２４４に配置され、調節弁２３６は、溶出液槽２１６と担体槽２１３を接続する流路２４５に配置され、調節弁２３７は担体槽２１３とＰＣＲ区画２０２を接続する流路２４６に配置される。
　担体槽２１３は、反応槽２１２、洗浄液槽２１４、廃液槽２１５、溶出液槽２１６とそれぞれ異なる流路２４２、２４３、２４４、２４５で接続されている。なお、全ての流路の流れ方向は決められており、原則として逆流を許さない。
　また、試薬槽２１１、洗浄液槽２１４、廃液槽２１５、溶出液槽２１６は、それぞれポート流路２２１～２２４を介して、ポート２１７～２２０と接続されている。
　担体槽２１３に配置される担体は、ガラスビーズ、グラスウール、多孔質ガラス等の核酸が特に吸着しやすいものが望ましい。より精製の度合いを上げる場合には、予めビオチンが付加されたプライマを反応に用い、担体槽２１３にストレプトアビジンを表面修飾しておく方法がある。洗浄液は、アルコールなどの有機溶剤を高濃度に含むものであり、担体を複数回洗浄することで担体から核酸以外の成分を取り除く。
　図７に、ＰＣＲ区画２０２の構成例を示す。ＰＣＲ区画２０２は、試薬を内蔵する試薬槽２５１と、核酸抽出区画２０１の生成物と試薬とを混合し、熱サイクルを実施する反応槽２５２と、反応産物の精製に用いる担体を内蔵した担体槽２５３と、担体を洗浄する洗浄液を内蔵した洗浄液槽２５４と、担体槽から核酸以外の溶液を回収する廃液槽２５５と、担体から核酸回収するための溶出液を内蔵した溶出液槽２５６を有する。
　各槽２５１～２５６の間には、流路２８１～２８６と、流路の開閉を調節する調節弁２７１～２７７が設けられている。なお、流路２８６は、ＰＣＲ区画２０２とサイクルシーケンス区画２０３とを接続する流路である。この他、ＰＣＲ区画２０２には、送液ポンプ５２０による加圧により溶液を送液するために使用するポート２５７～２６０と、ポート流路２６１～２６４が形成されている。ポート流路２６１～２６４は、ポート２５７～２６０とそれぞれに対応する槽とを個別に接続する流路である。ＰＣＲ区画２０２の場合も、全ての流路の流れ方向は決められており、原則として逆流を許さない。
　図８に、サイクルシーケンス区画２０３の構成例を示す。サイクルシーケンス区画２０３は、試薬を内蔵する試薬槽３１１と、ＰＣＲ区画２０２の生成物と試薬とを混合し、熱サイクルを実施する反応槽３１２と、反応産物の精製に用いる担体を内蔵した担体槽３１３と、担体を洗浄する洗浄液を内蔵した洗浄液槽３１４と、担体槽から核酸以外の溶液を回収する廃液槽３１５と、担体から核酸回収するための溶出液を内蔵した溶出液槽３１６を有する。
　各槽３１１～３１６の間には、流路３４１～３４６と、流路の開閉を調節する調節弁３３１～３３７が設けられている。なお、流路３４６は、サイクルシーケンス区画２０３と泳動区画２０４を接続する流路である。この他、サイクルシーケンス区画２０３には、送液ポンプ５２０による加圧により溶液を送液するために使用するポート３１７～３２０と、ポート流路３２１～３２４が形成されている。ポート流路３２１～３２４は、ポート３１７～３２０とそれぞれに対応する槽とを個別に接続する流路である。サイクルシーケンス区画２０３の場合も、全ての流路の流れ方向は決められており、原則として逆流を許さない。
　図９に、泳動区画２０４の構成例を示す。泳動区画２０４は、泳動溶液槽３５１と、電解質を含む緩衝液を内蔵する陰極緩衝液槽３５２と、キャピラリの洗浄を行う洗浄水を内蔵した洗浄水槽３５３を有する。このうち、泳動溶液槽３５１は、流路３４６を介してサイクルシーケンス区画２０３と接続されている。この他、泳動区画２０４には、送液ポンプ５２０による加圧により溶液を送液するために使用するポート３５４と、ポート流路３５５が形成されている。ポート流路３５５は、ポート３５４と泳動溶液槽３５１を接続する。
　なお、本実施例では、図６～図８に示すように、核酸抽出区画２０１～サイクルシーケンス区画２０３の各区画の洗浄液槽と廃液槽が別々に形成されている場合について説明した。しかし、該当区画の洗浄液槽と廃液槽は１つに共通化されていても良い。また、本実施例では、カートリッジ２００を構成する区画の数が４つの場合について説明したが、解析対象となるサンプル又はスタートとなるサンプルのタイプにより、区画の数は増減してもよい。
　［送液に伴う調節弁の開閉］
　以下では、カートリッジ２００を使用して、前処理とキャピラリ電気泳動を実施する手順について説明する。前処理からキャピラリ電気泳動までの一連の手順は、基本的に、送液による試薬の混合と加熱処理の組み合わせにより実現される。以下の説明では、溶液の送液に、最も一般的な方法である、ポンプによる加圧方式を採用するものとして説明する。
　当初、カートリッジ２００に搭載された調節弁とポートは全て閉じた状態にあり、必要に応じて開く操作を行う。閉じた状態の調節弁は溶液類を通さない一方で、空気・ガス等の気体は通す機構を有している。この種の特性を有する調節弁は既知であるので詳細な説明については省略する。
　核酸抽出区画２０１、ＰＣＲ区画２０２、サイクルシーケンス区画２０３における溶液の送液は、各区画についてそれぞれ５回の送液操作を順番に実施することで完了する。ここでは、１番目の核酸抽出区画２０１を例に説明する。ＰＣＲ区画２０２及びサイクルシーケンス区画２０３における送液操作はこれに倣う。
　操作(1)
　まず、スワブや血液などの生体サンプルを反応槽２１２に挿入し、シールなどで蓋をして系を密閉した状態にする。この状態で、調節弁２３１とポート２１７、２１８を開け、ポート２１７から空気を注入する。空気は、ポート２１７→試薬槽２１１→反応槽２１２→担体槽２１３→廃液槽２１５→ポート２１８の順番に流れる。空気がポート２１７に注入されると、試薬槽２１１に内蔵された試薬が流路２４１を通って反応槽２１２に流れ、生体サンプルと混ざり合わされる。このとき、必要に応じ、ヒータ５００を用いてカートリッジ２００を加熱し、反応槽２１２内の混合液の温度を適温になるよう調整しても良い。
　操作(2)
　続いて、更に調節弁２３２を開放した状態で、ポート２１７から空気を注入する。なお、空気の流路は操作(1)と同じである。この場合、反応槽２１２内の生体サンプルと試薬の混合液が流路２４２を通って担体槽２１３に流れる。このとき、混合液中の核酸は、担体槽２１３内の担体に付着する。
　操作(3)
　次に、調節弁２３２とポート２１７を閉じ、調節弁２３３～２３５とポート２１９を開く。なお、ポート２１８は開いたままである。この状態でポート２１９から空気を注入する。この際、空気は、ポート２１９→洗浄液槽２１４→担体槽２１３→廃液槽２１５→ポート２１８の順番に流れる。空気がポート２１９に注入されると、担体槽２１３にあった混合液は流路２４４を通って廃液槽２１５へと流れ出す。代わりに、洗浄液槽２１４に内蔵された洗浄液が流路２４３を通って担体槽２１３へと流れ込む。さらに、空気のポート２１９への注入を継続すると、担体槽２１３に内蔵されていた洗浄液は、廃液槽２１５へ全て送られる。その後、逆流と混入を防ぐため、調節弁２３３～２３５を閉じる。この操作は、複数回繰り返すことで精製の効果を高めることができる。
　操作(4)
　次に、ポート２１９を閉じ、調節弁２３６とポート２２０を開く。ここでも、ポート２１８は開いたままである。この際、空気は、ポート２１９→洗浄液槽２１４→担体槽２１３→廃液槽２１５→ポート２１８の順番に流れる。ポート２２０から空気を注入すると、溶出液槽２１６に内蔵されていた溶出液が流路２４５を通って担体槽２１３へと流れ込む。
　操作(5)
　溶出液槽２１６の溶出液を担体槽２１３に流し込んだ後は、担体に付着した核酸が溶出液に溶けだすのに十分な時間だけ放置する。その後、ポート２１８を閉じ、調節弁２３７とポート２５８を開ける。この際、ＰＣＲ区画２０２に設けられたポート２５８を開く。これにより、空気は、ポート２２０→溶出液槽２１６→担体槽２１３→反応槽２５２→担体槽２５３→廃液槽２５５→ポート２５８に順番に流れる。この状態で、ポート２２０から空気を注入する。すると、担体槽２１３の溶液は、流路２４６を通って次の区画、すなわちＰＣＲ区画２０２の反応槽２５２に流れ込む。このように、核酸抽出区画２０１からＰＣＲ区画２０２への送液が完了すると、ポート２２０及び２５８を閉じる。
　本実施例の場合、ＰＣＲ区画２０２とサイクルシーケンス区画２０３は、核酸抽出区画２０１と同じ構造を有している。従って、ＰＣＲ区画２０２とサイクルシーケンス区画２０３についても、前述した操作(1)～(5)と同様の操作が繰り返し実施される。
　続いて、泳動区画２０４における溶液の送液を説明する。泳動区画２０４の泳動溶液槽３５１には、予めホルムアミドなどの変性剤が封入されている。サイクルシーケンス区画２０３から送液された溶出液は、泳動溶液槽３５１において変性剤と混合される状態となる。なお、泳動区画２０４には、泳動溶液槽３５１の他に、陰極緩衝液槽３５２と洗浄水槽３５３が設けられているが、各槽からの溶液の蒸発と外部からのコンタミネーションを防ぐため、シールなどの薄膜で各槽の開口が覆われている。
　キャピラリ電気泳動を行う際には、キャピラリ４０１の先端が泳動溶液槽３５１の開口を覆う薄膜を突き破り、槽内の溶液に浸される。薄膜は、キャピラリ先端ではなく、別に用意したニードルを用いて破っても良い。また、各槽の開口はシールで覆う替わりに、スリットが切られたゴム膜で覆い、その切れ目からキャピラリの先端を挿入しても良い。
　［前処理一体型キャピラリ電気泳動装置の処理動作］
　図１０に、本実施例に係る前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００の動作手順を示す。各ステップについて、図を補足しながら説明する。
　（ステップ２００１）
　前提として、まず、サンプルを導入したカートリッジ２００を、前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００の載置台に取り付ける。また、ポンプ・バッファユニット４５０を前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００に取り付ける。この状態で、装置本体の電源をオンにすると、本動作手順が開始される。まず、生体サンプル及び試薬が封入されたカートリッジ２００が、オートサンプラユニット６００に固定される。その際、カートリッジ２００の底面とヒータ５００は接触している。カートリッジ２００の調節弁２３１～２３７、２７１～２７７、３３１～３３７は調節弁ユニット５５０に接続され、ポート２１７～２２０、２５７～２６０、３１７～３２０は送液ポンプ５２０に接続される。また、ポンプ・バッファユニット４５０を、キャピラリアレイ４００の一端部と高圧電源ユニット８００とにそれぞれ接続する。
　（ステップ２００２）
　この状態で、ヒータ５００による温度調整が開始される。温度は、ユーザが使用毎に手動で設定しても良いし、測定の内容に応じて予め定めた温度に自動的に設定しても良い。また、この段階で、レーザ７０１の照射も開始される。なお、レーザの照射直後は出力が不安定である。従って、検出感度を維持するためには、電気泳動を開始する前に、レーザの照射を開始しておけば良い。
　（ステップ２００３）
　カートリッジ２００、ヒータ５００、調節弁ユニット５２０の３つを固定しているオートサンプラユニット６００のアームが動き、陰極緩衝液槽３５２にキャピラリアレイ４００の先端が浸される。
　（ステップ２００４）
　次に、ポンプ・バッファユニット４５０のピストン４５２に対し、手動又は自動制御により外力が加えられ、内蔵していた分離媒体４５６がキャピラリアレイ４００に充填される。同時に、陽極電極４５４が陽極緩衝液４５７に浸された状態になる。
　（ステップ２００５）
　カートリッジ２００では、核酸抽出、ＰＣＲ反応、サイクルシーケンス反応が連続で実施される。実施方法については前記の通りである。また、高圧電源ユニット８００により、キャピラリの両端に電圧を印加する。この操作は、プレラン（pre-run）と呼ばれる。プレランを長時間実施することにより、キャピラリ電気泳動の分析性能を向上させる効果がある。
　（ステップ２００６）
　調節弁ユニット５５０と送液ポンプ５２０により、サイクルシーケンス区画２０３のサンプルが後段に位置する泳動溶液槽３５１に送液される。カートリッジ２００において試薬・混合液・反応液を送液する際、ポンプ５２０から注入する空気の量を調整すれば、送液量を調整することができる。なお、各区画における溶出液の全量を、次の槽に送るのではなく、一部を保管しておくことが望ましい、そうすれば、途中から分析を再実施することが可能である。
　（ステップ２００７）
　ここでは、一時的に、電圧の印加が停止される。この状態で、オートサンプラユニット６００が動作し、キャピラリアレイ４００の先端が泳動溶液槽３５１に挿入される。
　（ステップ２００８）
　高圧電源ユニット８００からキャピラリアレイの両端に弱い電圧を短時間印加することにより、適量のサンプルを分離媒体が充填されたキャピラリアレイ４００に導入する。
　（ステップ２００９）
　再度、オートサンプラユニット６００が動作し、キャピラリアレイ４００の先端を陰極緩衝液槽３５２内に封入された陰極緩衝液に浸す。
　（ステップ２０１０）
　高圧電源ユニット８００からキャピラリアレイ４００に高電圧を印加し、電気泳動を実施する。電気泳動中、キャピラリ４０１の検出部４０４には、励起光７０１が照射される。検出器７０３は、励起光７０１によってサンプルが蛍光している様子を検出し、不図示の測定装置に検出結果を出力する。測定装置は、検出結果に基づき、サンプルを分析する。
　（ステップ２０１１）
　この段階で、電気泳動が終了する。
　（ステップ２０１２）
　電圧印加の終了後、オートサンプラユニット６００が動作し、キャピラリアレイ４００の先端を洗浄液槽３５３に浸す。洗浄水槽３５３にはキャピラリの先端及び内部を洗浄する洗浄水が封入されている。
　（ステップ２０１３）
　ポンプ・バッファユニット４５０のピストン４５２を手動又は自動制御により引き、キャピラリアレイの内部を洗浄液で満たす。この操作を数回繰り返すと、洗浄効果を向上させることができる。
　［まとめ］
　以上説明したように、本実施例に係るカートリッジ２００と、前処理（核酸抽出、増幅反応、サイクルシーケンス反応など）一体型キャピラリ電気泳動装置１００を組み合わせて用いれば、前処理から電気泳動までの全反応工程の自動化を、１台の装置と１個のカートリッジだけを用いて実行することができる。
[実施例２]
　本実施例では、精製した核酸からキャピラリ電気泳動を実施し、フラグメント解析を行う場合に適したカートリッジ２００の構成例を示す。前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００の基本的な構成や動作は実施例１と同様である。以下では、本実施例と実施例１との差異点を中心に説明する。
　図１１に、本実施例に係るカートリッジ２００の構成例を示す。図１１に示すカートリッジ２００は、ＰＣＲ区画２０２と泳動区画２０４のみで構成されており、核酸抽出区画２０１、サイクルシーケンス区画２０３は省かれている。
　この実施例の場合、精製された核酸の溶液を反応槽２５２に導入し、その後、シールなどで蓋をして系を密閉した状態にすることで処理工程が開始される。以降の工程は、実施例１と同じである。この場合にも、実施例１と同様の効果を実現することができる。
[実施例３]
　本実施例では、槽内に封入する試薬を異なるものにすることで、別の解析の実施を可能とする。先に述べたように、ＰＣＲ区画２０２の試薬槽２５１には、試薬が保管された状態で運搬が可能なように密閉されている。一方で、空の試薬槽２５１に対し、分析直前に任意の試薬を注入して解析しても良い。
　一例として、精製した核酸からＳＴＲ（ショートタンデムリピート）解析を実施する方法を説明する。なお、前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００の基本的な構成や動作は実施例２と同様である。
　本実施例と実施例２との相違点は、試薬槽２５１にはＰＣＲ反応のための酵素、dNTP、緩衝液等の混合溶液、反応液槽２５２にはＳＴＲ領域に対応した蛍光標識プライマ混合液を封入しておく点である。この場合にも、実施例２と同様の効果を実現することができる。
[実施例４]
　本実施例では、精製した核酸からＰＣＲ反応、サイクルシーケンス反応を行える構成について説明する。前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１００の基本的な構成や動作は実施例１と同様である。以下では、実施例１と本実施例との差異点を中心に説明する。
　図１２に、本実施例に係るカートリッジ２００の構成例を示す。図１２に示すカートリッジ２００は、ＰＣＲ区画２０２と、サイクルシーケンス区画２０３と、泳動区画２０４の３つのみで構成され、核酸抽出区画２０１は省かれている。
　本実施例の場合、反応動作は、反応槽２５２に精製された核酸の溶液を挿入し、シールなどで蓋をして系を密閉した状態から開始される。以降の工程は実施例１と同様である。この場合にも、実施例１と同様の効果を実現することができる。
[他の実施例]
　本発明は上述した実施例に限定されるものでなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上述した実施例は、本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも全ての構成を備えるものに限定されない。また、ある実施例の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成を追加、削除又は置換することも可能である。
　１００：前処理一体型キャピラリ電気泳動装置、２００：カートリッジ、２０１：核酸抽出区画、２０２：ＰＣＲ区画、２０３：サイクルシーケンス区画、２０４：泳動区画、２１１、２５１、３１１：試薬槽、２１２、２５２、３１２：反応槽、２１３、２５３、３１３：担体槽、２１４、２５４、３１４：洗浄液槽、２１５、２５５、３１５：廃液槽、２１６、２５６、３１６：溶出液槽、２１７～２２０、２５７～２６０、３１７～３２０、３５４：ポート、２２１～２２４、２６１～２６４、３２１～３２４：ポート流路、２３１～２３７、２７１～２７７、３３１～３３７：調節弁、２４１～２４６、２８１～２８６、３４１～３４６、３５１:泳動溶液槽、３５２:陰極緩衝液槽、３５３:洗浄水槽、３５５：流路、４００：キャピラリアレイ、４０１：キャピラリ、４０２：キャピラリヘッド、４０３：陰極電極、４０４：検出部、４１０：恒温ユニット、４５０：ポンプ・バッファユニット、４５１：ディスポーザ容器、４５２：ピストン、４５３：バルブ、４５４：陽極電極、４５５：薄膜、４５６：分離媒体（ポリマ）、４５７：陽極緩衝液、５００：ヒータ、５２０：送液ポンプ、５５０：調節弁ユニット、６００：オートサンプラユニット、７００：検出ユニット、７０１：励起光、７０２：散乱光、７０３:検出器、８００：高圧電源ユニット、９００：コントローラ。

Claims (10)

  1. 　生体サンプルから核酸を抽出する工程、目的の領域についてＰＣＲ反応を行う工程、増幅された核酸についてサイクルシーケンス反応を行う工程のそれぞれに対応する１つ又は複数の区画構造を有し、各区画構造は、（１）生体サンプルを注入する反応槽と、前記反応に用いる試薬を内蔵した試薬槽と、各槽間を接続する複数の流路と、前記流路に配置された複数の調節弁とを有し、かつ、前段に位置する区画構造の反応槽と次段に位置する区画構造の反応槽を接続する流路を有する第１の区画と、（２）泳動溶液を内蔵する泳動溶液槽と、キャピラリ電気泳動で使用する電解質を含む緩衝液を内蔵した陰極緩衝液槽と、前記キャピラリ先端部を洗浄してサンプル間のコンタミネーションを防止する洗浄液を内蔵した洗浄液槽とを有し、かつ、前段に位置する前記区画構造の担体槽と前記泳動溶液槽とを接続する流路とその調整弁とを有する第２の区画とを有する前処理・電気泳動用一体型カートリッジの載置台と、
    　前記カートリッジ内の溶液温度を調整する温度調整機構と、
    　キャピラリ電気泳動機構と、
    　前記調節弁の開閉を制御し、前記第１及び第２の区画内及び間の送液を制御すると共に、前記キャピラリ電気泳動機構の制御を通じ、電気泳動動作を制御するコントローラと
    　を有し、
    　前記生体サンプルから核酸を抽出する工程と、目的の領域についてＰＣＲ反応を行う工程と、増幅された核酸についてサイクルシーケンス反応を行う工程の少なくとも１つと、キャピラリ電気泳動により核酸を分析する工程までの全工程を自動で実行する前処理一体型キャピラリ電気泳動装置。
  2. 　請求項１に記載の前処理一体型キャピラリ電気泳動装置において、
    　前記第１の区画はＰＣＲ反応を行う工程に対応する１つの区画構造を有し、前記第２の区画は電気泳動の工程に対応する１つの区画構造を有するとき、
    　前記コントローラは、生体サンプルから精製された核酸の溶液を、前記第１の区画の前記反応槽に注入して前処理を開始する
    　ことを特徴とする前処理一体型キャピラリ電気泳動装置。
  3. 　請求項１に記載の前処理一体型キャピラリ電気泳動装置において、
    　前記第１の区画はＰＣＲ反応を行う工程とサイクルシーケンス反応を行う工程に対応する２つの区画構造を有し、前記第２の区画は電気泳動の工程に対応する区画構造を有するとき、
    　前記コントローラは、生体サンプルから精製された核酸の溶液を、前記第１の区画の前記反応槽に注入して前処理を開始する
    　ことを特徴とする前処理一体型キャピラリ電気泳動装置。
  4. 　請求項１に記載の前処理一体型キャピラリ電気泳動装置において、
    　（１）前記キャピラリ電気泳動機構を構成するキャピラリに供給する緩衝液及びポリマを保持するディスペンサ容器であり、その出力口が前記キャピラリの先端に接続されるディスペンサ容器と、（２）前記緩衝液と前記ポリマの前記ディスペンサ容器内における初期状態での混合を妨げる隔壁と、（３）前記ディスペンサ容器の内部を加圧及び減圧するピストンと、（４）先端部分が前記ディスペンサ容器の内部に突き出た状態で設置され、前記ピストンによる加圧操作時に前記先端部分で前記隔壁を破り、前記緩衝液と前記ポリマを混合する一端が陽極端子と、を含むポンプ・バッファユニット
    　を有することを特徴とする前処理一体型キャピラリ電気泳動装置。
  5. 　生体サンプルから核酸を抽出する工程、目的の領域についてＰＣＲ反応を行う工程、増幅された核酸についてサイクルシーケンス反応を行う工程のそれぞれに対応する１つ又は複数の区画構造を有し、
    　各区画構造は、
    　生体サンプルを注入する反応槽と、前記反応に用いる試薬を内蔵した試薬槽と、各槽間を接続する複数の流路と、前記流路に配置された複数の調節弁とを有し、かつ、前段に位置する区画構造の反応槽と次段に位置する区画構造の反応槽を接続する流路を有する第１の区画と、
    　泳動溶液を内蔵する泳動溶液槽と、キャピラリ電気泳動で使用する電解質を含む緩衝液を内蔵した陰極緩衝液槽と、前記キャピラリ先端部を洗浄してサンプル間のコンタミネーションを防止する洗浄液を内蔵した洗浄液槽とを有し、かつ、前段に位置する前記区画構造の担体槽と前記泳動溶液槽とを接続する流路とその調整弁とを有する第２の区画と
    　を有する前処理・電気泳動用一体型カートリッジ。
  6. 　請求項５に記載の前処理・電気泳動用一体型カートリッジにおいて、
    　前記第１の区画はＰＣＲ反応を行う工程に対応する１つの区画構造を有し、前記第２の区画は電気泳動の工程に対応する１つの区画構造を有する
    　ことを特徴とする前処理・電気泳動用一体型カートリッジ。
  7. 　請求項５に記載の前処理・電気泳動用一体型カートリッジにおいて、
    　前記第１の区画はＰＣＲ反応を行う工程とサイクルシーケンス反応を行う工程に対応する２つの区画構造を有し、前記第２の区画は電気泳動の工程に対応する区画構造を有する
    　ことを特徴とする前処理・電気泳動用一体型カートリッジ。
  8. 　生体サンプルから核酸を抽出する工程と、目的の領域についてＰＣＲ反応を行う工程と、増幅された核酸についてサイクルシーケンス反応を行う工程の少なくとも１つと、キャピラリ電気泳動により核酸を分析する工程にそれぞれ対応する複数の区画が流路によって接続された前処理・電気泳動用一体型カートリッジを載置する載置台と、前記カートリッジ内の溶液温度を調整する温度調整機構と、キャピラリ電気泳動機構と、調節弁の開閉を制御し、第１及び第２の区画内及び間の送液を制御すると共に、前記キャピラリ電気泳動機構の制御を通じ、電気泳動動作を制御するコントローラとを有する前処理一体型キャピラリ電気泳動装置における前処理一体型キャピラリ電気泳動方法において、
    　前記コントローラは、
    　前処理・電気泳動用一体型カートリッジを構成する第１の区画の構造に応じ、
    　前記生体サンプルから核酸を抽出する工程と、目的の領域についてＰＣＲ反応を行う工程と、増幅された核酸についてサイクルシーケンス反応を行う工程の少なくとも１つと、キャピラリ電気泳動により核酸を分析する工程までの全工程の自動実行を制御する
    　ことを特徴とする前処理一体型キャピラリ電気泳動方法。
  9. 　請求項８に記載の前処理一体型キャピラリ電気泳動方法において、
    　前処理に対応する区画が、ＰＣＲ反応を行う工程に対応する１つの区画構造のみを有するとき、
    　前記コントローラは、生体サンプルから精製された核酸の溶液を、前記区画構造内の反応槽に注入した後に前記前処理を開始する
    　ことを特徴とする前処理一体型キャピラリ電気泳動方法。
  10. 　請求項８に記載の前処理一体型キャピラリ電気泳動方法において、
    　前処理に対応する区画が、ＰＣＲ反応を行う工程とサイクルシーケンス反応を行う工程に対応する２つの区画構造を有するとき、
    　前記コントローラは、生体サンプルから精製された核酸の溶液を、前記区画構造内の反応槽に注入して前処理を開始する
    　ことを特徴とする前処理一体型キャピラリ電気泳動方法。
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