JP2017077180A - 核酸分析装置 - Google Patents

Abstract

【課題】電気泳動前にカートリッジ上でＰＣＲ産物濃度の診断を行える、核酸分析装置の提供。
【解決手段】ＤＮＡ抽出、ＤＮＡ増幅、およびＤＮＡシーケンスを行う、核酸分析装置であって、ＤＮＡ抽出、およびＤＮＡ増幅に必要な試薬が封入されたカートリッジと、カートリッジを温調する温調機構と、カートリッジ内で送液を行う送液機構と、ＤＮＡシーケンスを電気泳動で行うための電気泳動機構と、を備え、前記カートリッジは、ＤＮＡ抽出用の第１の層と、抽出後のＤＮＡとＰＣＲ試薬を混合する第２の層と、ＰＣＲを行う第３の層と、これらの層を接続する流路を有し、第１の層と第２の層の間に光を照射し、ＤＮＡ抽出濃度を検出することを特徴とする、核酸分析装置。
【選択図】図３

Description

本発明は、生化学反応により物質を抽出し、必要に応じて合成し分析するために用いる生化学用カートリッジ及び核酸分析装置に関する。

遺伝子診断やＤＮＡ鑑定などの生体サンプルを遺伝子レベルで解析する手法では、一般的に、(1)生体サンプルから核酸を抽出する工程、抽出された核酸を増幅する工程、核酸に標識を付ける前処理反応を実行する段階と、(2)前処理後の核酸の塩基配列を読み出す電気泳動の段階が順番に実行される。これらの各段階には、それぞれ複数の試薬を混合、加熱、分注する操作があり、その精度は解析結果に大きな影響を与える。

遺伝子解析分野ではＰＣＲ反応(ポリメラーゼ連鎖反応 Polymerase Chain Reaction)という、ＤＮＡを増幅させる工程がある。検出器が検出できる程度までＤＮＡをＰＣＲ反応で増幅させる必要があり、非常に有効な方法として知られている。

またＤＮＡ抽出濃度が高ければＰＣＲサイクル数は少なく、ＤＮＡ抽出濃度が低ければＰＣＲサイクル数を多くする必要があることが知られている。

近年では前処理の各工程で必要になる操作を、反応試薬の貯蔵層・流路などが組み入れたカートリッジ内で自動的に実行する手法が知られている(例えば特許文献１参照)。

またカートリッジ内の送液の性能の診断として、層内の液体の有無あるいは液量を検出する手法が知られている(例えば特許文献２参照)。

特開２００７−３３０１７９号公報 特開２００６−１７０６５４号公報

カートリッジ内で微量の試薬とＤＮＡ抽出液やＰＣＲ産物を混合し、化学反応や分析を行うためには、カートリッジ内での試薬やＤＮＡ抽出液、ＰＣＲ産物の量的制御が重要となる。

量的制御の診断として特許文献２では層内の液量について記載されているが、ＤＮＡ抽出濃度やＰＣＲ産物濃度については記載されていない。電気泳動を行ってもＰＣＲ産物が低濃度であると検出できない。

本発明の目的は、電気泳動前にカートリッジ上でＰＣＲ産物濃度の診断を行える、核酸分析装置を提供することである。

上記目的を達成するための本発明に係る核酸分析装置は
ＤＮＡ抽出、ＤＮＡ増幅、およびＤＮＡシーケンスを行う、核酸分析装置であって、
ＤＮＡ抽出、およびＤＮＡ増幅に必要な試薬が封入されたカートリッジと、
カートリッジを温調する温調機構と、
カートリッジ内で送液を行う送液機構と、
ＤＮＡシーケンスを電気泳動で行うための電気泳動機構と、を備え、
前記カートリッジは、ＤＮＡ抽出用の第１の層と、抽出後のＤＮＡとＰＣＲ試薬を混合する第２の層と、ＰＣＲを行う第３の層と、これらの層を接続する流路を有し、
第１の層と第２の層の間に光を照射し、ＤＮＡ抽出濃度を検出する。

本発明に係る核酸分析装置はＤＮＡ抽出液、ＰＣＲ産物の精度と送液プロセスの正常が診断でき、低濃度PCR産物による電気泳動の失敗を防ぐことができる。これにより、プロセスの異常が早い段階で検出できるため、反応・検査のやり直しによる時間の無駄を軽減できる効果がある。

実施例に係る前処理一体型キャピラリ電気泳動装置の構成例を示す図。 実施例に係る前処理機構の構成例を示す図。 実施例に係るカートリッジ部の構成例を示す図。 実施例に係る送液機能診断の動作フローの一例を示す図。

以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。なお、本発明の実施の態様は、後述する実施例に限定されるものではなく、その技術思想の範囲において、種々の変形が可能である。

（装置の全体構成）
本実施例では、核酸分析装置の一例として、ＤＮＡの解析に使用される前処理一体型キャピラリ電気泳動装置について説明する。図１に、前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１の構成例を示す。前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１は、前処理部２と分析部３で構成される。前処理部２は、反応液からＤＮＡを抽出して増幅する前処理を実行し、分析部３は、前処理部２で処理されたＤＮＡをキャピラリ電気泳動により分析する。前処理部２の詳細構成については後述する。分析部３は、キャピラリ５と、検出部６と、オーブン８と、高圧電源９を有する。

前処理一体型キャピラリ電気泳動装置１は、前処理の終了後、オートサンプラ４を通じて前処理部２を水平方向に駆動し、前処理部２の流路の一端を分析部３のキャピラリ５の一端と接続する。キャピラリ５にはポリマが充填されており、オーブン８により一定温度に保持されている。キャピラリ５の接続後、分析部３は、その両端部に高圧電源９で高電圧を印加して、キャピラリ内に導入されたPCR産物を電気泳動し、検出部６において蛍光分析する。

（前処理部の構成）
ここでは、前処理の処理内容の概要を説明する。なお、前処理とは、スワブや、血液などの生体サンプルから核酸を抽出し、分析用(キャピラリ電気泳動による塩基配列解析)に処理する操作である。前処理は３つの工程に分けることができる。核酸抽出、ＰＣＲ反応、ディネーチャ反応である。なお、解析対象によっては、核酸抽出とＰＣＲ反応のみで前処理を終え、キャピラリ電気泳動を実行する場合もある。

図２に、前処理部２の構成例を示す。前処理部２は、送液機構１２と温調機構１３とを有している。前処理部２には、マイクロ流体デバイスとしてのカートリッジ１１が装着された状態を表している。平板状のカートリッジ１１の下面には空気圧により変形可能な弾性体であるメンブレンが貼り付けられており、外界から密閉された流路が形成され、当該流路内でＤＮＡの抽出から増幅までの生化学的な処理が実行される。送液機構１２は、前述のカートリッジ１１を支持する支持面（載置面）と、カートリッジ１１に形成された流路を通じ、ＤＮＡ抽出液、ＰＣＲ産物、試薬等の流体を空気圧を用いて送液する機構（図１のポンプ７を含む。）を有する。カートリッジ上の送液に関しては後述で詳しく述べる。温調機構１３は、例えばペルチェ素子で構成され、カートリッジ１１内の流体をＰＣＲに適した温度に制御する。カートリッジ１１の材質は、ポリカーボネート樹脂やポリプロピレン樹脂、もしくは石英材など、光を通す材質である。透明性が良いのが望ましい。ＤＮＡ抽出濃度測定用レーザ１４はレーザ光をＤＮＡ抽出後の流路に向けて照射し、その透過光をＤＮＡ抽出濃度測定用受光器１５で読み取る。レーザ１４は、固体レーザや半導体レーザ、LEDなどである。波長は紫外領域である。受光器１５は、フォトダイオード、光電子倍増管、CCDカメラなど、微細な光を捕らえ、受光量を信号強度に変換する素子である。

レーザ光は、抽出濃度に合わせて、光の吸収量が変化する。そこで、その変化量を受光器１５にて読み取り、濃度測定を行う。

図３に、カートリッジの構成例を示す。試薬貯蔵層２２にはＤＮＡ溶解液が封入されている。ここにＤＮＡサンプルが付着したスワブを挿入する。ＤＮＡ抽出液は流路２８を通り、反応層２３に送液される。試薬貯蔵層１８に封入されたＰＣＲマスターミックス、試薬貯蔵層１９に封入されたプライマーセットは混合層２０、２１を経て反応層２３に送液される。この反応層２３でＤＮＡ抽出液と混合、撹拌が行われる。ＤＮＡ抽出液を送液する流路２８に光源１４からレーザ光を照射する。その反応を受光器１５で読み取り、ＤＮＡ抽出濃度の測定を行う。ＤＮＡ抽出濃度によってＰＣＲ回数の決定を行う。そして反応層２４に送液し、ＰＣＲ反応を行う。またＰＣＲ産物を送液する流路２９に光源１６からレーザ光を照射し、受光器１７でその反応を読み取り、ＰＣＲ産物濃度の測定を行う。レーザ光は、抽出濃度に合わせて、光の蛍光量が変化する。そこで、その変化量を受光器１５にて読み取り、濃度測定を行う。

その後、反応層２５でＨｉ-Ｄｉホルムアミドと混合、撹拌を行う。反応層２６に送液し、ディネーチャ（９５℃３分）を行う。その後、接続部２７に送液し、分析部３に接続、電気泳動を行う。カートリッジはＤＮＡ抽出濃度とＰＣＲ産物濃度を光を利用して読み取るため、光に対して透明な材料で構成する。

送液機能の診断動作フローを図４に示す。

［ステップ３０］
スワブでサンプルＤＮＡを採取し、スワブを試薬貯蔵層２２に挿入する。

［ステップ３１］
試薬貯蔵層２２にはＤＮＡ溶解液が封入されており、撹拌・混合を行い、ＤＮＡを抽出する。

［ステップ３２］
反応層２３にＤＮＡ抽出液を送液する流路２８に光源１４からレーザ光を照射する。その反応を受光器１５で読み取り、ＤＮＡ抽出濃度の測定を行う。レーザ光の透過量を濃度に換算する。ＤＮＡ抽出濃度よってＰＣＲサイクル数の決定を行う。またＤＮＡ抽出濃度が低く、電気泳動が失敗する可能性がある場合、ステップ３０に戻り、再びＤＮＡサンプルの採取から行う。これにより、低濃度ＰＣＲ産物による電気泳動の失敗を防ぐことができ、作業時間の短縮ができる。

［ステップ３３］
ＰＣＲマスターミックスを試薬貯蔵層１８から、プライマーセットを試薬貯蔵層１９から混合層２０、２１を経て反応層２３に送液する。反応層２３でＰＣＲマスターミックス、プライマーセットとＤＮＡ抽出液を撹拌・混合する。

［ステップ３４］
ＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡを増幅する。

［ステップ３５、３６、３７、３８］
反応層２５にＰＣＲ産物を送液する流路２９にレーザを照射し、ＰＣＲ産物濃度を測定する。ＰＣＲ産物濃度が電気泳動に十分な濃度であればステップ３６のディネーチャに進む。ＰＣＲ産物濃度が不十分の場合はステップ３７に進み、再びＰＣＲ反応を行う。ステップ３８でＰＣＲ産物濃度の測定を再び行う。ここでＰＣＲ産物濃度が十分であればステップ３６のディネーチャに進む。不十分であればＰＣＲマスターミックス、プライマーセットの試薬の送液不良が考えられるためステップ３３に戻る。本実施例では、PCRの再試行は１回までとし、ここで増加しなければ、反応試薬の送液不良と判定する。

［ステップ３９］
キャピラリとの接続部２７にＰＣＲ産物を送液し、分析部３のキャピラリ５の一端と接続する。そして電気泳動を行う。

１ 前処理一体型キャピラリ電気泳動装置
２ 前処理部
３ 分析部
４ オートサンプラ
５ キャピラリ
６ 検出部
７ ポンプ
８ オーブン
９ 高圧電源
１１ カートリッジ
１２ 送液機構
１３ 温調機構
１４ ＤＮＡ抽出濃度測定用レーザ
１５ ＤＮＡ抽出濃度測定用受光器
１６ ＰＣＲ産物濃度測定用レーザ
１７ ＰＣＲ産物濃度測定用受光器
１８ ＰＣＲマスターミックス試薬封入層
１９ プライマーセット試薬封入層
２０ ＰＣＲマスターミックス試薬、プライマーセット撹拌・混合層
２１ ＰＣＲマスターミックス試薬、プライマーセット撹拌・混合層
２２ ＤＮＡサンプル抽出層
２３ ＤＮＡサンプルとＰＣＲマスターミックス試薬、プライマー試薬の撹拌・混合層
２４ ＰＣＲ反応層
２５ Ｈｉ-Ｄｉホルムアミドとの混合層
２６ ディネーチャ層
２７ キャピラリアレイとの接続部
２８ ＤＮＡ抽出濃度測定流路
２９ ＰＣＲ産物濃度測定流路

Claims (8)

1. ＤＮＡ抽出、ＤＮＡ増幅、およびＤＮＡシーケンスを行う、核酸分析装置であって、
   ＤＮＡ抽出、およびＤＮＡ増幅に必要な試薬が封入されたカートリッジと、
   カートリッジを温調する温調機構と、
   カートリッジ内で送液を行う送液機構と、
   ＤＮＡシーケンスを電気泳動で行うための電気泳動機構と、を備え、
   前記カートリッジは、ＤＮＡ抽出用の第１の層と、抽出後のＤＮＡとＰＣＲ試薬を混合する第２の層と、ＰＣＲを行う第３の層と、これらの層を接続する流路を有し、
   第１の層と第２の層の間に光を照射し、ＤＮＡ抽出濃度を検出することを特徴とする、核酸分析装置。
2. ＤＮＡ抽出、ＤＮＡ増幅、およびＤＮＡシーケンスを行う、核酸分析装置であって、
   ＤＮＡ抽出、およびＤＮＡ増幅に必要な試薬が封入されたカートリッジと、
   カートリッジを温調する温調機構と、
   カートリッジ内で送液を行う送液機構と、
   ＤＮＡシーケンスを電気泳動で行うための電気泳動機構と、を備え、
   前記カートリッジは、ＤＮＡ抽出用の第１の層と、抽出後のＤＮＡとＰＣＲ試薬を混合する第２の層と、ＰＣＲを行う第３の層と、これらの層を接続する流路を有し、
   第３の層の下流側に光を照射し、ＰＣＲ産物濃度を検出することを特徴とする、核酸分析装置。
3. ＤＮＡ抽出、ＤＮＡ増幅、およびＤＮＡシーケンスを行う、核酸分析装置であって、
   ＤＮＡ抽出、およびＤＮＡ増幅に必要な試薬が封入されたカートリッジと、
   カートリッジを温調する温調機構と、
   カートリッジ内で送液を行う送液機構と、
   ＤＮＡシーケンスを電気泳動で行うための電気泳動機構と、を備え、
   前記カートリッジは、ＤＮＡ抽出用の第１の層と、抽出後のＤＮＡとＰＣＲ試薬を混合する第２の層と、ＰＣＲを行う第３の層と、これらの層を接続する流路を有し、
   第１の層と第２の層の間に光を照射し、ＤＮＡ抽出濃度を検出すると共に、
   第３の層の下流側に光を照射し、ＰＣＲ産物濃度を検出することを特徴とする、核酸分析装置。
4. 請求項１に記載の核酸分析装置であって、
   第１の層と第２の層との間に光を照射する光源と、光源からの光を受光する受光部とが、第１の層と第２の層との間の流路を挟んで設けられていることを特徴とする、核酸分析装置。
5. 請求項１に記載の核酸分析装置であって、
   第３の層の下流側に光を照射する光源と、光源からの光を受光する受光部とが、３の層の下流側の流路を挟んで設けられていることを特徴とする、核酸分析装置。
6. 請求項２または３に記載の核酸分析装置であって、
   ＰＣＲ反応終了後にＰＣＲ産物濃度を測定、低濃度であったらＰＣＲ反応を再試行することを特徴とする核酸分析装置。
7. 請求項１〜６のいずれかに記載の核酸分析装置であって、
   カートリッジが光に対して透明な材料であることを特徴とする生化学用カートリッジを有する核酸分析装置。
8. カートリッジ上で、DNA抽出、及びPCR反応を行う工程、
   DNA抽出後にDNA抽出濃度をカートリッジ上で光検出する工程、
   PCR反応にPCR産物濃度をカートリッジ上で光検出する工程
   を備えた核酸分析方法。