DE3838385A1

DE3838385A1 - Verfahren zur durchfuehrung von biochemischen tests und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE3838385A1
Application number: DE3838385A
Authority: DE
Inventors: Junkichi Miura; Mamoru Taki; Yoshio Watanabe; Masao Kamahori; Hiroyuki Miyagi
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1987-11-11
Filing date: 1988-11-11
Publication date: 1989-05-24
Also published as: JPH01126544A; US5093267A; DE3838385C2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung von biochemischen Tests und eine Analysenvorrichtung zur Durch führung des Verfahrens. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Durchführung von biochemischen Tests, bei dem die gesuchten Komponenten in entsprechende Derivate um gewandelt, die Derivate in die entsprechenden Komponenten aufgetrennt und die Komponenten bestimmt werden.

Bei der Analyse von biochemischen Komponenten mittels Flüs sigchromatographie liegen die gesuchten Komponenten häufig in Spurenmengen vor. Es wurden hochempfindliche Methoden zum Nachweis dieser Spurenkomponenten entwickelt, wie nachstehend dargelegt ist. Ein Verfahren bedient sich der Derivatisierung, wobei verschiedene Derivatisierungsreagentien mit den gesuch ten Komponenten mit dem Ziel umgesetzt werden, sie in leich ter nachweisbare Derivate überzuführen. Das Derivatisierungs verfahren bei der Flüssigchromatographie läßt sich grob in ein vor der Säulenbehandlung durchgeführtes Markierungsver fahren, bei dem die Derivatbildung vor der Trennung mit einer Trennsäule durchgeführt wird, und ein nach der Säulenbehand lung durchgeführtes Markierungsverfahren einteilen, bei dem die Derivatbildung nach der Trennung in die jeweiligen Kompo nenten unter Verwendung einer Trennsäule vorgenommen wird. Die Wahl, ob die Markierung bei der Derivatisierung vor der Säu lenbehandlung oder nach der Säulenbehandlung vorgenommen wird, hängt von den Reaktionsbedingungen ab. Wie in ANALYSIS, Februar 1987, Seiten 100-105 beschrieben ist, wird beispiels weise in den Fällen, bei denen die Geschwindigkeit der Umset zung mit den Reagentien für die Derivatbildung langsam ist oder Druck angewandt werden muß, bei denen ein Gas entsteht, oder bei denen die Reagentien für die Derivatbildung den Nachweis stören, ein modifiziertes Markierungsverfahren vor der Säulen behandlung durchgeführt. Dieses modifizierte Verfahren umfaßt die Derivatisierung einer Probe im System unabhängig von einem Analysengerät und die Durchführung der Trennung und der quan titativen Bestimmung durch Flüssigchromatographie. Wenn ande rerseits die Reaktion nicht von den vorerwähnten Schwierigkei ten begleitet ist, wird ein vor der Säulenbehandlung durchge führtes Markierungsverfahren vorgenommen, bei dem die Probe in ein Analysengerät injiziert und die Derivatbildung in einer Reaktionsspirale unter Erzielung der Auftrennung und quantita tiven Bestimmung durchgeführt wird, oder es wird ein nach der Säulenbehandlung durchgeführtes Markierungsverfahren angewandt, bei dem ein Derivatisierungsreagens in ein Analysengerät nach flüssigchromatographischer Trennung eingeführt wird. Beim Mar kierungsverfahren nach der Säulenbehandlung bestehen starke Einschränkungen im Vergleich zum Markierungsverfahren vor der Säulenbehandlung, da die Umsetzung in einem Eluat vorgenom men wird. Jedoch hat sich dieses Verfahren für biochemische Analysengeräte, die vorwiegend auf Flüssigchromatographie be ruhen, wie Aminosäureanalysatoren, Catecholaminanalysatoren und dergl., weitgehend durchgesetzt, da sich das Verfahren leicht automatisieren läßt. Ferner lassen sich beim Markie rungsverfahren vor der Säulenbehandlung die Reaktionsbedin gungen unabhängig von den Bedingungen der Analysengeräte festlegen, so daß ein Derivatisierungsverfahren, das mit einer Vorbehandlung oder einer Konzentration verbunden ist, eben falls angewandt wird.

Abgesehen von der bestehenden Tendenz, daß eine hohe Nachweis empfindlichkeit für Spurenkomponenten verlangt wird, wurden auch umfangreiche Entwicklungsarbeiten an der Ultrahochlei stungs-Flüssigchromatographie unter Verwendung von fein ver teilten Füllstoffen oder an der Mikroflüssigchromatographie unter Verwendung von Mikrosäulen vorgenommen. Die Wirkungen, die sich mit derartigen Analysengeräten erreichen lassen, sind detailliert in J. Chromatogr. Library, "The Science of Chromatography", Bd. 32, (1985), Seiten 435 bis 447 beschrie ben. Der Ultrahochleistungs-Flüssigchromatographie und der Mikroflüssigchromatographie räumt man große Aussichten für die zukünftige Flüssigchromatographie ein. Zur Anwendung eines Markierungsverfahrens nach der Säulenbehandlung bei der Bereitstellung eines biochemischen Analysengeräts unter Anwendung von Ultrahochleistungs-Flüssigchromatographie oder Mikroflüssigchromatographie ergibt sich bei der Derivatisie rung eine Verdünnung der gesuchten Komponenten und somit eine Verbreiterung der Nachweispeaks oder eine Verringerung der Nachweisempfindlichkeit aufgrund eines Pulsierungsrauschens der für die Zufuhr des Derivatisierungsreagens verwendeten Pumpe und dergl., wodurch die vorteilhaften Wirkungen der Ultrahochleistungs-Flüssigchromatographie oder der Mikroflüs sigchromatographie wieder verloren gehen. Von diesem Stand punkt aus hat man versucht, biochemische Tests und entspre chende Analysengeräte auf der Grundlage der Flüssigchromato graphie und unter Anwendung einer Markierung vor der Säulen behandlung bereitzustellen, mit denen die Analyse von Aminen, Aminosäuren, Aldehyden und dergl. möglich ist. Bei diesen Ver fahren werden jedoch teilweise die gesuchten Komponenten in einer Reaktionsspirale des Analysatorsystems nach dem Ein spritzen der Probe in den Analysator in Derivate umgewandelt, wie aus ANALYSIS (a.a.O.) hervorgeht. Daher dauert es im Ver gleich zu der Zeitspanne, die zur Abtrennung und zum Nachweis durch Flüssigchromatographie erforderlich ist, lange, bis die Derivatisierung der gesuchten Komponenten in der Reaktions spirale erfolgt ist. Daher ist es bei der Behandlung von zahlreichen Proben vorteilhaft, die Derivatisierungsstufe in einer Reihenbehandlung außerhalb des Systems, d.h. nicht in der Reaktionsspirale, durchzuführen. Derartige biochemische Tests sind beispielsweise aus J. Chromatogr., Bd. 344 (1985), Seiten 61 bis 70 oder Anal. Biochem, Bd. 155 (1986), Seiten 28 bis 33 bekannt. Dieser Test betrifft die Analyse von Catechol aminen und zeichnet sich gegenüber einem herkömmlichen Verfah ren durch höhere Empfindlichkeit und einfachere Durchführung aus. Die Derivatisierung der Catecholamine wird außerhalb des Analysatorsystems durchgeführt, da sie im allgemeinen einen Zeitraum von 40 Minuten erfordert. Auf der anderen Seite ist auch das Markierungsverfahren vor der Säulenbehand lung gemäß Anal. Biochem., Bd. 133 (1983), S. 330 bis 335 be kannt. In diesem Fall ist die Vorbehandlung einer Probe, bei spielsweise die Entfernung von Protein aus der Probe, erfor derlich. Außerdem ist es schwierig, die gesuchten Komponen ten in der Probe gleichmäßig mit einem Derivatisierungsreagens zu vermischen.

In JP-B 62-56 460 wird ein flüssigchromatographisches Verfah ren unter Verwendung einer Vorrichtung zum Markieren vor der Säulenbehandlung für die Derivatbildung der gesuchten Kompo nenten angewandt, wobei eine Probe einer Adsorptionssäule zu geführt wird, die mit einem Füllstoff zur Adsorption der ge suchten Komponenten in der Probe gepackt ist, um die gesuch ten Komponenten am Füllstoff zu adsorbieren, und anschließend der Adsorptionssäule ein Markierungsmittel zugeführt wird, um die gesuchten Komponenten in die entsprechenden Derivate überzuführen. Bei dieser vor der Säulenbehandlung eingesetz ten Markierungsvorrichtung wird jedoch als Adsorptionssäule eine rotierende Säule eingesetzt, deren Aufbau äußerst kompli ziert ist und die eine lange Analysenzeit erfordert. Die vorerwähnte Druckschrift befaßt sich nicht mit der Analyse von Catecholaminen.

Wie vorstehend erwähnt, zielt der Stand der Technik nicht auf eine Verkürzung der Analysendauer einschließlich der Derivati sierungsdauer und auch nicht auf die Verbesserung der Analysen genauigkeit ab. Sofern die Derivatisierungsreaktion zur Erhö hung der Anzahl der zu behandelnden Proben seriell durchge führt wird, variiert die Zeitspanne von der Reaktion bis zum Nachweis je nach Art der Probe, so daß bei den herkömmlichen Verfahren Schwierigkeiten auftreten, die die analytische Genauigkeit verringern.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Durchführung von biochemischen Tests bereitzustellen, das eine hohe Empfindlichkeit und eine hohe Genauigkeit gewährleistet, ohne daß die Eigenschaften der Ultrahochleistungs-Flüssig chromatographie und der Mikroflüssigchromatographie beein trächtigt werden. Dabei soll erfindungsgemäß insbesondere ein biochemisches Testverfahren bereitgestellt werden, das den Nachweis von Catecholaminen mit hoher Empfindlichkeit innerhalb kurzer Analysenzeiten ermöglicht. Außerdem soll er findungsgemäß ein Analysengerät bereitgestellt werden, mit dem derartige biochemische Tests durchgeführt werden können.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Durchführung von biochemischen Tests, das durch folgende Stufen gekenn zeichnet ist:

- eine erste Stufe, bei dem Probenmaterial zur Herstellung einer Probe vorbereitet oder eingestellt wird;
- eine zweite Stufe, bei dem die Probe auf eine mit einem Adsorptionsmittel gepackte Säule aufgesetzt und über diese Säule gegeben wird, um die gesuchten Komponenten an der Adsorptionssäule zu adsorbieren;
- eine dritte Stufe, bei der ein Derivatisierungsreagens zu geführt wird, um Derivate der gesuchten Komponenten zu bilden;
- eine vierte Stufe, bei der eine Desorptionslösung in die Adsorptionssäule eingeführt wird, um die Derivate der ge suchten Komponenten, die in der Adsorptionssäule festge halten sind, zu desorbieren;
- eine fünfte Stufe, bei der die Derivate der gesuchten Komponente in die jeweiligen Komponenten aufgetrennt werden; und
- eine sechste Stufe, bei der ein Konzentrationsprofil der jeweiligen aufgetrennten Komponenten ermittelt wird, um ein Nachweissignal auszugeben.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Durch führung von biochemischen Tests, das durch folgende Stufen gekennzeichnet ist:

- eine erste Stufe, bei dem Probenmaterial zur Herstellung einer Probe mit einem Gehalt an Catecholaminen vorbereitet oder eingestellt wird;
- eine zweite Stufe, bei der die Probe auf eine mit einem Adsorptionsmittel gepackte Säule aufgesetzt und über diese Säule gegeben wird, um die Catecholamine an der Adsorp tionssäule zu adsorbieren;
- eine dritte Stufe, bei der ein Derivatisierungsreagens und ein Reaktionsbeschleuniger zugeführt werden, um Catechol aminderivate zu bilden;
- eine vierte Stufe, bei der eine Desorptionslösung in die Adsorptionssäule eingeführt wird, um die in der Adsorp tionssäule festgehaltenen Catecholaminderivate zu desor bieren;
- eine fünfte Stufe, bei der die Catecholaminderivate in die jeweiligen Komponenten aufgetrennt werden; und
- eine sechste Stufe, bei der ein Konzentrationsprofil der jeweiligen aufgetrennten Komponenten ermittelt wird, um ein Nachweissignal auszugeben.

Gegenstand der Erfindung ist schließlich auch eine Analysen vorrichtung zur Durchführung der genannten biochemischen Tests, die mit einer Pumpe zum Zuführen einer Probe, einer Trennsäule zum Abtrennen der gesuchten Komponenten aus der Probe und einem Detektor zur Ermittlung eines Konzentrations profils der einzelnen Komponenten in dem aus der Trennsäule abgegebenen Eluat ausgerüstet ist, wobei in einem Flüssigkeitsweg, der die Pumpe und die Trennsäule ver bindet, ein Flüssigkeitsweg-Umschaltventil vorgesehen ist und die mit dem Adsorptionsmittel gepackte Adsorptions säule über das Flüssigkeitsweg-Umschaltventil verbunden ist.

Nachstehend wird die Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 ein Fließdiagramm zur Erläuterung einer Ausführungs form des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Durchfüh rung von biochemischen Tests;

Fig. 2 ein Fließdiagramm zur Erläuterung eines herkömmlichen Verfahrens zur Durchführung von biochemischen Tests;

Fig. 3 den Aufbau einer erfindungsgemäßen Analysenvorrichtung zur Durchführung der biochemischen Tests; und

Fig. 4-6 jeweils Chromatogramme, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Analysenvorrichtung von Fig. 3 er halten worden sind.

Nachstehend wird die erste bevorzugte Ausführungsform unter Bezugnahme auf Fig. 1 bis 5 näher erläutert.

Bei dieser Ausführungsform wird auf eine Probe mit einem Ge halt an Catecholaminen Bezug genommen, was aber keine Beschrän kung der Erfindung auf Catecholamine darstellen soll. Viel mehr kann es sich auch um Proben mit einem Gehalt an Amino säuren, Prostaglandinen, Polyaminen und dergl. handeln.

In einer ersten Stufe, die in Fig. 1 mit (a) bezeichnet ist, wird ein Probenmaterial, wie Blutserum, Urin und dergl., durch Einstellen ihres pH-Werts auf einen geeigneten Wert oder durch Vermischen des Materials mit einer Standardlösung zu einer Probe verarbeitet.

Anschließend wird in der zweiten Stufe, die in Fig. 1 mit (b) bezeichnet ist, die Probe auf eine Adsorptionssäule, die mit einem Adsorptionsmittel gepackt ist, aufgesetzt und über die Säule gegeben. Dabei werden die Art des Adsorptionsmittels und die Flüssigkeitsnatur und die Ionenstärke der zur Zufuhr der Probe zur Adsorptionssäule verwendeten Trägerlösung in geeigneter Weise so gewählt, daß nur die in der Probe enthaltenen Catecholamine am Adsorptionsmittel adsorbiert werden. Als Adsorptionsmittel werden Ionenaustauscherharze, Aluminiumoxid und dergl. ver wendet. Als Adsorptionssäule ist eine mehrstufige Säule, z.B. eine rotierende oder Drehsäule nicht speziell erforderlich, vielmehr können beliebige einfache Einstufensäulen verwendet werden.

Anschließend wird in der dritten Stufe, die in Fig. 1 mit (c) bezeichnet ist, der Adsorptionssäule ein Derivatisierungs reagens zugeführt und mit den Catecholaminen, die vom Ad sorptionsmittel festgehalten werden, umgesetzt. Auf diese Wei se läßt sich die Markierung unter Bildung von Catecholaminde rivaten leicht durchführen.

Als Reagens für die Derivatisierung wird vorzugsweise 1,2-Diphenylethylendiamin verwendet. Beim Markieren wird vor zugsweise ein Reaktionsbeschleuniger eingesetzt. Typische Beispiele für Reaktionsbeschleuniger sind Salze von Metalloxi den, wie Ammoniummolybdat, Wolframate, Niobate, Chromate und dergl.; und Kombinationen von stickstoffhaltigen Verbindungen, wie Harnstoff, Hexamethylentetramin, Ammoniumcarbonat und dergl., mit Zinkionen. Unter anderem werden Salze von Metall oxiden besonders bevorzugt. Zur Markierung werden im allge meinen zusammen mit diesen Reagentien ein Oxidationsmittel, z.B. Kaliumhexacyanoferrat(III) und dgl., oder ein Hilfs reagens, wie Acetonitril und dgl., eingesetzt.

Bei Verwendung des vorstehend erwähnten Reaktionsbeschleuni gers kann die Markierung bei einer Temperatur von 30°C oder darunter innerhalb von kürzeren Zeitspannen durchgeführt werden.

Anschließend werden in der vierten Stufe, die in Fig. 1 mit (d) bezeichnet ist - gegebenenfalls nach Ablauf eines be stimmten Zeitraums für die Markierung - die nicht umgesetzten Komponenten oder abgebauten Komponenten in der Adsorpt le ausgewaschen und die gesuchten Komponentenderivate von der Adsorptionssäule mit einer Desorptionslösung desorbiert. Vorzugsweise wird eine Regenerationslösung in die Adsorptions säule eingeführt, um Globulin und dgl., das an der Adsorptions säule adsorbiert ist, vor der Desorption der gewünschten Kom ponentenderivate vollständig zu entfernen. Ein bevorzugtes Beispiel für eine Regenerationslösung ist eine wäßrige Lösung eines neutralen Mineralsalzes, wie Natriumchlorid, Kalium chlorid und Magnesiumchlorid.

Anschließend wird in der fünften Stufe, die in Fig. 1 mit (e) bezeichnet ist, das gesuchte desorbierte Komponentenderivat in die Flüssigchromatographie-Trennsäule (HPLC) eingeführt, um die gesuchte Komponente in die jeweiligen Komponenten auf zutrennen.

Schließlich wird in einer sechsten Stufe, die in Fig. 1 mit (f) bezeichnet ist, das Konzentrationsprofil der einzelnen, durch die Trennsäule getrennten Komponenten durch HPLC er mittelt, und ein Nachweissignal wird ausgegeben.

Um die Eigenschaften dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform klarer zu machen, ist in Fig. 2 ein Beispiel eines herkömm lichen Verfahrens gemäß Anal. Biochem., Bd. 155 (1986), S. 28-33, dargestellt. Dabei ist die erste Stufe (a) von Fig. 2 identisch mit der in Fig. 1 gezeigten erfindungsgemäßen Ausführungsform, jedoch werden die zweite bis vierte Stufe ((b) bis (d)) in Fig. 2 in einem Reagensglas außerhalb des Analysatorsystems und nicht an einer Adsorptionssäule durch geführt. Nach flüssigchromatographischer Trennung mittels einer Trennsäule in der fünften Stufe (e) gemäß Fig. 2 wird in der sechsten Stufe (f) gemäß Fig. 2 ein Konzentrationspro fil der einzelnen Komponenten ermittelt.

Wie aus Fig. 1 hervorgeht, ermöglicht die erfindungsgemäße Ausführungsform eine Testdurchführung mit hoher Empfindlich keit, was darauf zurückzuführen ist, daß keine Verdünnung der gesuchten Komponenten erforderlich ist, daß vollständige Proben verarbeitet werden und daß eine Verminderung der Meß genauigkeit aufgrund von durch eine Ausführung von Hand ver ursachten Schwankungen in der Reaktionszeit oder aufgrund einer Beeinträchtigung der gesuchten Komponenten durch Mikro organismen in der Atmosphäre verhindert wird. Ferner werden bei dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform die zweite und die dritte Stufe in der gleichen Adsorptionssäule durchge führt, so daß eine Verkürzung der Zeitspanne für die Markie rung, eine Verbesserung der Meßgenauigkeit und dgl. erreicht werden.

In Fig. 3 ist eine bevorzugte Ausführungsform einer Analysen vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen biochemi schen Tests schematisch dargestellt. Dabei umfaßt eine Vor richtung für die Hochleistungs-Flüssigchromatographie einen mit Desorptionslösung 1 gefüllten Behälter 2, eine Trennsäule 3, einen mit dem Behälter 2 und der Trennsäule 3 verbundenen Flüssigkeitsweg 4, eine im Fließweg angeordnete Speisepumpe 5 und einen Detektor 6. Die Trennsäule 3 ist ferner über ein Flüssigkeitsweg-Umschaltventil 7 mit einem automatischen Pro bennehmer zur Probenzufuhr, der aus einem Drehteller 9, einer Dosierpumpe 10 und einem Flüssigkeitsweg-Umschaltventil 11 be steht, verbunden. Ferner ist ein Behälter 13, der mit einer Einstellösung 12 gefüllt ist, über einen Flüssigkeitsweg 14 mit der Trennsäule 3 verbunden. Eine Flüssigkeitsspeisepumpe 15 zum Zuführen der Einstellösung 12 ist zwischen dem Flüssig keitsweg-Umschaltventil 11 und dem Behälter im Flüssigkeits weg 14 angeordnet. Eine mit einem Adsorptionsmittel gepackte Adsorptionssäule 8 ist mit der Flüssigkeitsspeisepumpe 15 und der Trennsäule 3 über das Flüssigkeitsweg-Umschaltventil 7 verbunden. Die Trennsäule 3 und die Adsorptionssäule 8 befin den sich im gleichen Ofen 16. Ferner sind die Flüssigkeitsweg- Umschaltventile 7 und 11, die Flüssigkeitsspeisepumpen 5 und 15, der Säulenofen 16 und der Detektor 6 mit einer Steuervor richtung 17 verbunden. Durch diese Steuervorrichtung 17 las sen sich der zeitliche Ablauf für den Umschaltvorgang der Flüssigkeitsweg-Umschaltventile 7 und 11, die Flüssigkeits menge der eingespeisten Lösung, die Temperatur, die Wellen länge und die Empfindlichkeit steuern.

Die Adsorptionssäule 8 befindet sich vorzugsweise in einem Thermostaten oder einem Behälter, der auf konstanter Tempera tur gehalten wird. Dadurch läßt sich die Markierungsgeschwin digkeit steuern und die Markierung kann bei Temperaturen von 30°C oder darunter durchgeführt werden. Es ist nicht erforder lich, als Adsorptionssäule eine mehrstufige Säule, z.B. eine rotierende Säule und dgl., zu verwenden, vielmehr können be liebige einstufige Säulen eingesetzt werden.

Gemäß dieser Ausführungsform besteht die Desorptionslösung 1 beispielsweise aus Acetonitril, Methanol und Wasser (mit einem Gehalt an 0,01 m Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0) und 0,1 m Natriumdodecylsulfat) im Verhältnis 5:2:3. Die Einstell lösung besteht beispielsweise aus 0,01 m Phosphatpuffer vom (pH-Wert 5,8). Einzelheiten über die Bestandteile sind nach stehend angegeben.

Adsorptionssäule 8:
Mitsubishi Chemical Industry Co., Ltd. CQK30S (saures Kationenaustauscherharz), 40 mm Innendurchmmesser × 10 mm

Flüssigkeitsweg-Umschaltventil 7:
Rheodyne 600

Flüssigkeitsweg-Umschaltventil 11:
Rheodyne 7125
(ausgerüstet mit einer Betätigungs-Antriebsvorrichtung)

Trennsäule 3:
Hitachi Gel Nr. 3057, 4 mm Innendurchmesser × 150 nm

Ofen 16:
Handfertigung

Flüssigkeitsweg-Umschaltventil 11, Drehteller 9 und Dosierpumpe 10:
automatischer Probennehmer, Hichachi 655A-40

Flüssigkeitsspeisepumpen 5, 15:
Hitachi L6000

Detektor 6:
Hitachi F-1000, Ex = 350 nm, Em = 485 nm

Steuergerät 17:
Hitachi L5000

Nachstehend wird die Betriebsweise des biochemischen Analysen geräts gemäß dieser Ausführungsform näher erläutert. Die Ein stellösung 12 wird der Adsorptionssäule 8, die z.B. mit einem Kationenaustauscherharz gepackt ist, in einer Geschwindigkeit von beispielsweise 1 ml/min mittels der Flüssigkeitsspeise pumpe 15 über den Flüssigkeitsweg 14 zugeführt. Probenmaterial, wie Blutserum und dgl., wird in die Adsorptionssäule 8 zusam men mit der Einstellösung eingespritzt. In diesem Fall ist das Adsorptionsmittel in der Adsorptionssäule 8 negativ geladen. Die Catecholamine im Serum sind positiv geladen, so daß es zu einer Adsorption kommt. Andererseits ist beispielsweise Albumin im Serum negativ geladen und wird somit aus dem System beseitigt. In diesem Zustand, in dem die Catecholamine an der Adsorptionssäule 8 adsorbiert sind, wird ein Derivatisierungs reagens aus dem automatischen Probennehmer, der aus dem Dreh teller 9, der Dosierpumpe 10 und dem Flüssigkeitsweg-Umschalt ventil 11 besteht, eingespritzt, so daß es zur Umsetzung des Reagens mit den Catecholaminen in der Adsorptionssäule 8 kommt. Dabei können die Flüssigkeitsspeisepumpe 15 gestoppt oder die Zufuhrmenge variiert werden, um die Reaktionszeit zu steuern. Nach Ablauf einer bestimmten Zeitspanne wird die Adsorptionssäule 8 mit der Einstellösung 12 gewaschen, und das Flüssigkeitsweg-Umschaltventil 7 wird so umgeschaltet, daß die Desorptionslösung 1 durch die Adsorptionssäule 8 fließt. Die Catecholaminderivate werden von der Adsorptionssäule 8 desor biert und gelangen in die Trennsäule 3, wo die Derivate in die jeweiligen Komponenten aufgetrennt werden. Das Konzentrations profil dieser einzelnen Komponenten wird mit dem Detektor 6 ermittelt.

Fig. 4 zeigt Chromatogramme, bei denen Blutserum in das vor stehend beschriebene Analysengerät eingespritzt werden und Catecholamine unter Verwendung einer mit einem Kationenaustauscherharz gepackten Ad sorptionssäule und von 1,2-Diphenylethylendiamin als Deriva tisierungsreagens nachgewiesen wird. Die Messung wird bei einer Papiervorschubgeschwindigkeit von 10 mm/min und der Fluoreszenz-Aufzeichnungsempfindlichkeit 10 in einem Bereich von 10 mV durchgeführt. Die Peaks 1 bis 4 entsprechen den nachstehend aufgeführten Komponenten:

Peak 1: Norepinephrin
Peak 2: Epinephrin
Peak 3: Dopamin
Peak 4: Isoproterenol

Aus den Meßergebnissen geht hervor, daß Catecholamine mit ho her Empfindlichkeit nachgewiesen werden können.

Die nachstehenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung des erfindungsgemäßen biochemischen Tests und des Analysengeräts.

Beispiel 1

Es wird eine Probe verwendet, die durch Versetzen von norma lem Blutserum mit Catecholaminen hergestellt worden ist. Die Catecholamine werden in Mengen von 5 pg an der Adsorptions säule 8 adsorbiert und nachgewiesen. Die erhaltenen Chromato gramme sind in Fig. 5 angegeben. Die Bedingungen sind die gleichen wie in der vorstehend beschriebenen Ausführungsform.

Beispiel 2

Die Analyse wird auf die vorstehend beschriebene Weise durch geführt mit der Abänderung, daß Modell-Blutserum mit Konzen trationen von 90 pg/ml Epinephrin, 340 pg/ml Norepinephrin und 50 pg/ml Dopamin verwendet werden. Die Reproduzierbarkeit der Messung wird untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zu sammengestellt. In dieser Tabelle sind zu Vergleichszwecken auch die gemäß dem Stand der Technik erzielten Werte gemäß Fig. 2 angegeben.

Tabelle I

Die Werte von Tabelle I geben auch die Variationskoeffizien ten an, die durch den Konzentrationsvorgang an der Adsorp tionssäule verursacht werden. Es ist festzustellen, daß bei der erfindungsgemäßen Verfahrensweise eine höhere Meßgenauig keit als beim Verfahren gemäß dem Stand der Technik erzielt werden kann.

Anschließend wird ein Test der zweiten bevorzugten Ausführungs form durchgeführt, wobei mit dem Derivatisierungsreagens ein Reaktionsbeschleuniger verwendet wird und ein Analysengerät eingesetzt wird, das mit einer in einem Ofen befindlichen Ad sorptionssäule ausgerüstet ist. Der Ofen wird auf einer Tem peratur von nicht mehr als 30°C gehalten. Als Derivatisierungs reagens mit einem Gehalt an einem Reaktionsbeschleuniger wird ein Lösungsgemisch aus 10 mMol/Liter 1,2-Diphenylethylendiamin (Derivatisierungsreagens), 20 mMol/Liter Ammoniummolybdat (Reaktionsbeschleuniger), 0,5 mMol Galliumhexacyanoferrat(III) (Oxidationsmittel) und 40% Acetonitril verwendet. Die Adsorp tionssäule wird auf einer Temperatur von 20°C gehalten. Der folgende Test wird unter den Bedingungen der vorstehend be schriebenen Ausführungsform durchgeführt.

Eine Probe (1 ml) mit einem Gehalt an 5, 10, 20 bzw. 40 pg Norepinephrin, Epinephrin, Dopamin bzw. Isoproterenol wird in die Analysenvorrichtung eingespritzt. Die erhaltenen Chromato gramme sind in Fig. 6 angegeben. Die Bedingungen entsprechen der vorstehend beschriebenen Ausführungsform, bei einer Fluoreszenz-Aufzeichnungsempfindlichkeit von 10 in einem Aufzeichnungsbereich von 10 mV und bei einer Papiervorschub geschwindigkeit von 10 mm/min. Es ergeben sich folgende Peaks 1 bis 4.

Peak 1: Norepinephrin
Peak 2: Epinephrin
Peak 3: Dopamin
Peak 4: Isoproterenol

Aus Fig. 6 geht hervor, daß sich die Catecholamine innerhalb kurzer Zeit mit hoher Empfindlichkeit nachweisen lassen.

Wie vorstehend erläutert, lassen sich erfindungsgemäß die ge suchten Komponenten, wie Catecholamine und dgl., nach Adsorp tion an der Adsorptionssäule mit dem Derivatisierungsreagens umsetzen. Die Temperatur der Derivatisierungsreaktion kann gesteuert werden. Daher bewirkt das erfindungsgemäße Verfahren eine Verkürzung der Reaktionszeit für die Derivatisierungs reaktion, eine genaue Steuerung und eine verbesserte Testge nauigkeit, da Verunreinigungen und nicht-umgesetzte Komponen ten und dgl. herausgewaschen werden.

Claims

1. Verfahren zur Durchführung von biochemischen Tests, gekennzeichnet durch

- eine erste Stufe, bei dem Probenmaterial zur Herstel lung einer Probe vorbereitet oder eingestellt wird;
- eine zweite Stufe, bei der die Probe auf eine mit einem Adsorptionsmittel gepackte Säule aufgesetzt und über diese Säule gegeben wird, um die gesuchte Komponente an der Adsorptionssäule zu adsorbieren;
- eine dritte Stufe, bei der ein Derivatisierungsreagens zugeführt wird, um Derivate der gesuchten Komponenten zu bilden;
- eine vierte Stufe, bei der eine Desorptionslösung in die Adsorptionssäule eingeführt wird, um die Derivate der gesuchten Komponenten, die in der Adsorptionssäule festgehalten sind, zu desorbieren;
- eine fünfte Stufe, bei der die Derivate der gesuchten Komponenten in die jeweiligen Komponenten aufgetrennt werden; und
- eine sechste Stufe, bei der ein Konzentrationsprofil der jeweiligen aufgetrennten Komponenten ermittelt wird, um ein Nachweissignal auszugeben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur der Adsorptionssäule derart eingestellt wird, daß die Geschwindigkeit der Derivatisierungsreak tion der gesuchten Komponenten in der Adsorptionssäule gesteuert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den gesuchten Komponenten in der Probe um Catecholamine handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zusammen mit dem Derivatisierungsreagens ein Reaktions schleuniger zugesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nach der dritten Stufe der Adsorptionssäule eine Regene rationslösung zugeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Adsorptionssäule eine einstufige Säule und keine ro tierende Säule verwendet wird.

7. Verfahren zur Durchführung von biochemischen Tests, ge kennzeichnet durch

- eine erste Stufe, bei dem Probenmaterial zur Herstel lung einer Probe mit einem Gehalt an Catecholaminen vor bereitet oder eingestellt wird;
- eine zweite Stufe, bei der die Probe auf eine mit einem Adsorptionsmittel gepackte Säule aufgesetzt und über die Säule gegeben wird, um die Catecholamine an der Ad sorptionssäule zu adsorbieren;
- eine dritte Stufe, bei der ein Derivatisierungsreagens und ein Reaktionsbeschleuniger zugeführt werden;
- eine vierte Stufe, bei der eine Desorptionslösung in die Adsorptionssäule eingeführt wird, um die in der Adsorptionssäule festgehaltenen Catecholaminderivate zu desorbieren;
- eine fünfte Stufe, bei der die Catecholaminderivate in die jeweiligen Komponenten aufgetrennt werden; und
- eine sechste Stufe, bei der eine Konzentrationsänderung der jeweiligen aufgetrennten Komponenten festgestellt wird, um ein Nachweissignal auszugeben.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß 1,2-Diphenyläthylendiamin als Derivatisierungsreagens und ein Salz eines Metalloxids als Reaktionsbeschleuniger ver wendet werden.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Salz eines Metalloxids um ein Wolframat, Niobat oder Chromat handelt.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß nach der dritten Stufe eine Regenerationslösung in die Ad sorptionssäule eingeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Regenerationslösung um eine wäßrige Lösung eines neutralen Mineralsalzes handelt.

12. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Adsorptionssäule eine einstufige Säule und keine ro tierende Säule verwendet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorptionssäule auf einer Temperatur von nicht mehr als 30°C gehalten wird.

14. Analysenvorrichtung zur Durchführung von biochemischen Tests, gekennzeichnet durch eine Pumpe zum Zuführen einer Probe, eine Trennsäule zum Abtrennen der gesuchten Kom ponenten von der Probe und einen Detektor zum Nachweis einer Konzentrationsänderung der jeweiligen Komponenten in dem von der Trennsäule abgegebenen Eluat, wobei in einem Flüssigkeitsweg, der die Pumpe mit der Trennsäule verbindet, ein Flüssigkeitsweg-Umschaltventil vorgesehen ist und die mit einem Adsorptionsmittel gepackte Säule über dieses Flüssigkeitsweg-Umschaltventil verbunden ist.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorptionssäule in einem auf konstanter Temperatur gehaltenen Behälter eingeschlossen ist.

16. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Adsorptionsäule um eine einstufige Säule handelt.