DE4032817A1

DE4032817A1 - Fluessigphasenchromatographie-verfahren und -geraet

Info

Publication number: DE4032817A1
Application number: DE4032817A
Authority: DE
Inventors: Kasumi Yoshida; Junkichi Miura; Yoshio Fujii; Hiroshi Satake; Masahito Ito; Masao Kamahori
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1989-10-18
Filing date: 1990-10-16
Publication date: 1991-04-25
Anticipated expiration: 2010-10-17
Also published as: US5783450A; JP2834224B2; DE4032817C2; JPH03131753A

Description

Die Erfindung betrifft ein Analyseverfahren und ein Gerät zum Analysieren einer Probe durch Flüssigphasenchromatogra phie, insbesondere ein Analyserverfahren und ein Gerät für eine Analyse, bei der nach dem Bereitstellen einer Probe unter Nutzen von Flüssigphasenchromatographie Bestandteile der Probe voneinander getrennt werden.

Flüssigphasenchromatographie weist die Eigenschaft auf, daß nach dem Trennen der in gelöster Form vorliegenden Bestand teile individuelle Bestandteile selektiv analysiert werden können. Das Verfahren verfügt auch über wichtige Analyse merkmale auf dem Gebiet klinischer Untersuchungen. Andere Arten analytischer Untersuchungen sind jedoch kompliziert und beanspruchen eine lange Analysezeit, was dem Einführen einer großen Zahl von Analyserverfahren in Routinearbeit entgegensteht, wie zur klinischen Untersuchung, bei der mehrere Proben innerhalb begrenzter Zeit verarbeitet werden müssen. Dies führt dazu, daß automatische Vorrichtungen dieser Art sich nur langsam durchsetzen.

Als Analysegebiet, auf dem ein Rückstand für solche Routine arbeit besteht, kann Analyse einer Klasse von Catecholaminen und Analyse von Prostaglandinen genannt werden. Es wurde er kannt, daß eine Klasse von Catecholaminen in der Diagnose der Abnormalität von Zelltumoren, von Kreislauforganen, des Hirnnervensystems, innerer Stoffwechselprodukte, usw. und Streß wirksam ist. Es wird daher als wichtiges Merkmal im Fall der Gruppenuntersuchung von Erwachsenenkrankheiten angesehen. Prostaglandin zeigt vielfältige physiologische Aktivität und weist verschiedene Typen auf. Dementsprechend ist es erforderlich, jeweilige Bestandteile für die Bestim mung zu trennen.

Wenn diese Analysestoffe durch Trennung mit Flüssigphasen chromatographie analysiert werden, werden eine Probe und ein Lumineszenz-Markieragens miteinander zur Reaktion gebracht, und Messung wird im allgemeinen mit einem Fluoreszenzphoto meter ausgeführt. Als Markierverfahren sind ein Vormarkier verfahren, bei dem Reaktion mit dem Markieragens vor der Trennung der Bestandteile durch eine Trennsäule vorgenommen wird, und ein Nachmarkierungsverfahren bekannt, bei dem Reaktion mit dem Markierungsagens erst nach Trennung der Be standteile durch eine Trennsäule vorgenommen wird. Beim Nachmarkierverfahren ist hochempfindliches Feststellen jedoch schwierig aufgrund der großen Diffusion der Bestand teile nach Elution aus der Trennsäule. Das Vormarkierverfah ren ist vorteilhafter, wenn ein untergeordneter Bestandteil in einer biologischen Probe gemessen wird.

Aus JP-A-61-88 148 und JP-A-60-1 43 766 sind Verfahren bekannt, bei denen eine Klasse von Catecholaminen durch ein Vormar kierverfahren markiert (Umwandlung in ein Derivat) wird und durch Chromatographie analysiert wird.

Gemäß JP-A-61-88 148 wird der Probe Aluminiumoxid zugemischt, wodurch das Catecholamin von demselben adsorbiert wird, und während der Adsorption wird Dansylchlorid zur Reaktion ge bracht, um das Catecholamin in ein Derivat umzuwandeln. An schließend wird die in ein Derivat umgewandelte Probe vom Aluminiumoxid desorbiert, und die Flüssigkeit wird durch Verdampfen konzentriert. Die so hergestellte Probe wird in einen Flüssigphasenchromatographie-Durchlauf gebracht, um die Bestandteile voneinander zu trennen und Fluoreszenz festzustellen.

Gemäß JP-A-60-1 43 766 wird nach dem Eingießen einer herge stellten Probe, wie Blutplasma oder Urin in den Durchlaß das Catecholamin markiert (nach Umwandlung in ein Derivat), wäh rend drei Arten von Reaktionsagenzien nacheinander in den Durchlaß eingeführt werden, um durch die Reaktionsschlange zu fließen. Nachdem die so verarbeitete Probe aufgefangen und in einer Konzentrationssäule konzentriert wurde, wird sie in die Trennsäule überführt und die Bestandteile werden voneinander getrennt. wobei Fluoreszenz gemessen wird.

Verfahren, wie sie in JP-A-61-92 699 und JP-A-58-1 08 457 be schrieben sind, sind als Stand der Technik bekannt, gemäß dem Prostaglandine mit dem Vormarkierverfahren markiert werden und durch Chromatographie analysiert werden. JP-A-61-92 599 schlägt vor, daß bei einem Verfahren eine Probe fluoreszenzmarkiert wird und die Bestandteile an schließend mit einer Trennkolonne getrennt werden. Dabei wird unter Nutzung der Hochgeschwindigkeits-Flüssigphasen chromatographie mit einem Fluoreszenzdetektor gemessen, wenn Prostaglandine analysiert werden. Weitere Details sind in JP-A-61-92 599 nicht beschrieben.

Gemäß JP-A-58-1 08 475 werden Prostaglandine einschließlich einer Flüssigkeit, die mit einer biologischen Probe durch Phasenverteilungschromatographie erhalten wurden, durch Trocknen verfestigt, anschließend gelöst und dann mit einem Fluoreszenz-Vormarkieragens für die Carboxylgruppe zur Reak tion gebracht, wodurch die Prostaglandine verestert werden. Die so hergestellte Probe wird in einen Flüssigchromato graphie-Durchfluß gegossen, und die Bestandteile werden von einander getrennt und mit einem Fluoreszenzdetektor gemes sen.

JP-A-61-92 599 schlägt nur die Möglichkeit der Vormarkierung vor. Bei den Verfahren gemäß JP-A-61-88 148 und JP-A-58- 1 08 457 nimmt der Ablauf zum Herstellen der in den Flüssig phasenchromatographie-Durchfluß zu gießenden Probe lange Zeit in Anspruch, und Automatisierung ist schwierig. Daher eignen sich diese Verfahren nicht für Routinearbeiten wie klinische Untersuchungen.

Beim Verfahren gemäß JP-A-60-1 43 766 wird nicht nur die Mar kierreaktion während des Flusses der Probe durch die Reak tionsschlange ausgeführt, sondern auch das Bearbeiten der Probe wird ganz im Durchfluß ausgeführt. Es können etwa zwei Stoffe pro Stunde analysiert werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Flüssigphasen chromatographie-Verfahren und -Gerät anzugeben, mit denen mehrere Proben effektiv auch dann analysiert werden können, wenn die Probe einer Markierreaktion unterworfen wird.

Der Erfindung liegt weiterhin die Aufgabe zugrunde, ein Analyseverfahren und -gerät anzugeben, bei denen die Verar beitungsfähigkeiten ausreichend für Anwendung bei Routine arbeit, wie klinischer Untersuchung, sind.

Die Tatsache, daß die Anzahl analysierter Stoffe beim Stand der Technik gering ist, ist dadurch verursacht, daß ein System verwendet wird, bei dem die nächste Probe eingegossen wird, nachdem die gesamten Analyseabläufe vom Eingießen der vorigen Probe bis zur Detektion durch Trennung abgeschlossen sind.

Um die oben genannten Aufgaben zu lösen, wird in einer Ver unreinigungsbeseitigungssäule oder einer Anreicherungssäule eine besondere markierte Probe verarbeitet, während in einer Trennsäule das Trennen von Bestandteilen einer Probe vorge nommen wird, die der vorgenannten Probe vorhergeht, und wäh rend mit einer die genannten Probe folgenden Probe einer Markierreaktion in einem Reaktionsverarbeitungsteil ausge führt wird.

Wird die Erfindung von einem anderen Gesichtspunkt aus be schrieben, ist festzustellen, daß der gesamte analytische Ablauf vom Herstellen der Probe bis zum Ermitteln durch Trennung in drei Prozeßabschnitte unterteilt ist: Eine Probe und ein Reagens werden in einem ersten Prozeßabschnitt mit einander gemischt, um die Probe vorzubereiten; die vorberei tete Probe wird in einem zweiten Prozeßabschnitt in einer Verunreinigungsbeseitigungssäule eingeschlossen, und schließlich wird in einem dritten Prozeßabschnitt die aus der Verunreinigungsbeseitigungssäule zugeführte Probe in Bestandteile aufgeteilt und die voneinander getrennten Bestandteile werden durch einen Detektor festgestellt. Die genannten drei Prozeßabschnitte laufen gleichzeitig parallel so ab, daß für eine Probe die drei Prozeßabschnitte nachein ander durchlaufen werden.

lm folgenden wird der Ablauf von Analysen gemäß der Erfin dung erläutert.

Bei einer biologischen Probe, die ein Material wie eine Klasse von Catecholaminen oder Prostaglandine enthält, in der mehrere Bestandteile mit ähnlichen physikalischen Eigenschaften vorliegen, ist es von guter Wirkung, indivi duelle Bestandteile durch Trennung mit Chromatographie zu messen. Zum Beispiel sind bei einer Klasse von Catechol aminen Adrenalin, Norepinephrin, Dopamin usw. vorhanden, während in Prostaglandinen Thrombokisantin B , Prostaglandin E , 6-Ketoprostaglandin F und Prostaglandin E usw. gemeinsam vorhanden sind. Durch Trennen mit Chromatographie wird es möglich, die Bestandteile mit unterschiedlicher Konzentration zu erhalten.

Es ist jedoch schwierig, eine Klasse von Catecholaminen und Prostaglandinen als solche festzustellen. Dementsprechend wird gemäß der Erfindung ein Markieragens mit der Probe zur Reaktion gebracht, um diese zu markieren (in ein Derivat um zuwandeln), bevor Bestandteilstrennung mit einer Chromato graphietrennsäule vorgenommen wird. Verunreinigungen, wie allgemeine Verunreinigungen, und überschüssiges Reaktions agens werden anschließend mit einer Vorsäule entfernt, so daß sich die Meßgenauigkeit nicht verringert. Danach erfährt die in Derivate umgewandelte Probe in einer Trennsäule eine Trennung, und der Abfluß aus der Trennsäule wird mit einem Detektor gemessen. Wenn z. B. ein Fluoreszenzmarkieragens zur Derivatbildung verwendet wird, wird ein Fluoreszenzde tektor als Detektor verwendet. Es wird die durch Derivatbil dung erzielte Eigenschaft des zu untersuchenden Bestand teiles zu dessen Feststellen genutzt. Der Detektor wird aus einer Anzahl von Meßeinrichtungen ausgewählt wie einem Ad sorptionsmeßgerät oder einem Leitfähigkeitsdetektor, ab hängig von der Ausbildung der Markierung.

Bei diesem Verfahren werden jeweilige Proben einer Reihe von Verarbeitungen unterworfen, wie dem Mischen mit einem Deri vatbildungsreagens, dem Ausführen der Derivatreaktion, dem Überführen in die Vorsäule und dem Trennen und Ermitteln der Bestandteile. Mit diesem Verarbeitungsablauf ist es gegen wärtig schwierig, die Verarbeitungszeit unter 10 Minuten zu halten, selbst wenn verschiedene Geräte genutzt werden. Wenn der Analyseablauf für eine Folgeprobe begonnen wird, nachdem der gesamte Analyseablauf für eine Vorprobe abgeschlossen ist, ist es unmöglich, mehr als sechs Proben innerhalb einer Stunde zu verarbeiten.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist der gesamte Analyseab lauf vom Vorbereiten der Messung bis zum Trennen der Probe in drei Prozeßabschnitte unterteilt, um die Probe in einem jeweiligen Prozeßabschnitt zu verarbeiten, um dadurch einen höheren Wirkungsgrad zu erzielen. Dabei wird im zweiten Pro zeßabschnitt, der der mittlere Prozeßabschnitt ist, eine besondere Probe, die bereits in ein Derivat umgewandelt wurde, in eine Vorkolonne eingeschlossen. lm dritten Prozeß abschnitt erfolgen die Bestandteiltrennung und Ermittlung für eine Probe vor der vorstehend genannten Probe, während im ersten Prozeßabschnitt der Derivatbildungsprozeß für eine Probe vor der oben genannten Probe ausgeführt wird.

Dadurch wurde es möglich, mindestens zehn Proben pro Stunde zu analysieren, wodurch es möglich ist, einen solchen Ablauf zu Routinearbeit, wie es klinische Untersuchung darstellt, einzusetzen.

Die Grenzen zwischen den Prozeßabschnitten sind nicht notwendigerweise immer dieselben, sondern sie können in gewisser Weise abhängig von den Derivatbildungsbedingungen und Bestandteiltrennbedingungen variiert werden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt der Start der Derivatbildungsreaktion einer Probe in einer Vorbereitungseinheit außerhalb des Durchflußsystems. Hierbei wird die Probenverarbeitung in einem Gefäß ausgeführt. Im Gefäß erfolgt Mischen der Probe und eines Derivatbildungs agens. Die Derivatbildungsreaktion der Probe erfolgt also in einem Zustand ohne Fließen der Flüssigkeit und ohne Diffu sion der Probe. Wenn die Reaktion im Gefäß unzureichend ist, oder wenn Zeitbegrenzung besteht, ist es nach dem Mischen der Probe und des Reagens im Gefäß möglich, die gemischte Flüssigkeitsprobe in eine Zumeßzuführung zu füllen und dort die Reaktion fortzusetzen, jedoch erfolgt auch hier die Derivatbildungsreaktion weiterhin unter einem Zustand, in dem die Probe keiner Diffusion unterworfen ist.

Beim Rühren der Probe und des Reagens muß nicht notwendiger weise ein Rühren erfolgen, sondern es ist nur erforderlich, daß die Probe und das Reagens im Gefäß einander zugemischt werden, damit sie dort gemeinsam vorliegen. Das teilweise Eingießen von Probenflüssigkeit aus einem Gefäß in ein Reak tionsgefäß oder ein Mischgefäß in der Herstelleinrichtung und das teilweise Eingießen von Reagens aus einem Gefäß in das Reaktionsgefäß oder das Mischgefäß kann durch eine be wegliche Pipettierdüse erfolgen. Um den Mechanismus zu ver einfachen, ist es vorteilhaft, wenn nur eine Pipettierdüse vorhanden ist.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung befindet sich die Vorsäule stromaufwärts von der Trennsäule. Flüssig keit zum Übertragen der Probe und zum Auswaschen der Vorsäu le werden dieser Vorsäule über ein Umschaltventil zugeführt. Die Vorsäule wird im folgenden gelegentlich als Verunreini gungsbeseitigungssäule oder als Anreichungssäule bezeichnet. Wenn die Probe in diese Vorsäule eingeführt ist, wird eine Verunreinigung, wie eine allgemeine Verunreinigung oder überschüssiges Agens, was ein Hauptfaktor für Verringern der Meßgenauigkeit ist, aus der Vorsäule mit Hilfe einer Über tragungs- und Waschflüssigkeit entfernt, und die zu unter suchende Substanz wird festgehalten. Wenn diese Funktion angesprochen ist, wird die Vorsäule als Verunreinigungsbe seitigungssäule bezeichnet.

In die Vorsäule wird üblicherweise eine Probe eingeführt, deren Menge größer ist als die Kapazität der Vorsäule. Die zugeführte Probenmenge wird durch eine Zumeß- oder Dosier leitung mit vorgegebenem Volumen bestimmt. Wenn die mit Reaktionsagens versehene Probe durch die Transport- und Waschflüssigkeit in die Vorsäule eingeführt ist, wird der zu untersuchende Stoff in der Vorsäule festgehalten und sammelt sich dort an, während die Probe einfließt. Wenn an schließend ein Eluat der Vorsäule zugeführt wird, wird die in der Vorsäule festgehaltene Substanz desorbiert und in die Trennsäule übertragen. Da das Volumen der Probenflüssig keit beim Desorbieren von der Vorsäule geringer ist als das in die Vorsäule eingeführte Flüssigkeitsvolumen, bedeutet dies, daß die in die Trennsäule eingeführte Probe angerei cherter ist. Wenn diese Funktion ins Auge gefaßt wird, wird die Vorsäule als Anreicherungssäule bezeichnet.

Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird das Aufnehmen von Probenflüssigkeit im zweiten Prozeßab schnitt in vorgegebenen Zeitabständen wiederholt, wobei die Länge der Verarbeitungszeit im zweiten Prozeßabschnitt als Bezug dient. Die Abläufe im ersten Prozeßabschnitt und im dritten Prozeßabschnitt sind so korreliert, daß die Proben verarbeitung (einschließlich des Herstellens der Probe) pa rallel zum Verarbeiten im zweiten Prozeßabschnitt erfolgt.

Infolge der realisierten Parallelverarbeitung mehrerer Pro ben, wie vorstehend beschrieben, wird es möglich, eine mitt lere Analysezeit zu erzielen, die innerhalb von 6 Minuten liegt, wodurch die Anzahl analysierter Proben pro Zeitein heit gegenüber dem Stand der Technik vergrößert ist.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von durch Figuren veranschaulichten Ausführungsbeispielen näher beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1 eine allgemeine schematische Darstellung zum Veran schaulichen eines erfindungssgemäßen Geräts und Verfahrens;

Fig. 2 ein Flußdiagramm zum Beschreiben des Analyseablaufs im Verfahren bzw. Gerät gemäß Fig. 1;

Fig. 3A und 3B Diagramme von Betriebsprogrammen, die die zeitliche Steuerung von Teilen beim Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 1 veranschaulichen;

Fig. 4 eine Draufsicht auf einen automatischen Proben nehmer, wie er in Fig. 1 vorhanden ist;

Fig. 5A eine Vorderansicht des Geräts gemäß Fig. 1;

Fig. 5B eine Layout-Seitenansicht zu Fig. 5A;

Fig. 6 ein Blockdiagramm des Steuerungssystems des Geräts gemäß Fig. 1;

Fig. 7 ein Diagramm von Analyseergebnissen für eine Klasse von Catecholaminen;

Fig. 8 ein schematisches Blockdiagramm für einen Hauptteil eines ersten abgeänderten Ausführungsbeispiels;

Fig. 9 ein schematisches Blockdiagramm eines Hauptteils eines zweiten geänderten Ausführungsbeispiels;

Fig. 10A und 10B Diagramme von Betriebsprogrammen, die die zeitliche Steuerung von Teilen beim Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 9 veranschaulichen.

Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird ein erster Prozeßabschnitt im wesentlichen als automatischer Probennehmer betrieben. Hier wird das Verarbeiten zur Deri vatbildung einer Probe ausgeführt. In einem zweiten Prozeß abschnitt werden Funktionen in einer Vorsäule in einer Lei tung in der Mitte ausgeführt, zum Beseitigen von Verunreini gungen und zur Probenanreicherung. In einem dritten Prozeß abschnitt wird das Trennen von Bestandteilen und Detektieren der Probe mit Hilfe einer Trennsäule vorgenommen.

Dabei wird im zweiten Prozeßabschnitt ein Prozeßrundlauf da durch bewerkstelligt, daß ein Ventil umgeschaltet wird und die in eine Dosierleitung eines Probeneinführventils einge füllte Probe durch eine Transport- und Waschflüssigkeit in die Vorsäule überführt wird, in der Anreicherung und Verun reinigungsbeseitigung erfolgen. Anschließend wird das Säulenumschaltventil umgeschaltet, um die Probe durch Eluieren und Übertragen derselben in die Trennkolonne zu dissoziieren. Dann wird das Säulenumschaltventil wieder umgeschaltet, um die vorbereitete Flüssigkeit der Vorsäule aufzunehmen, wodurch der Zustand wiederhergestellt wird, in dem die Möglichkeit besteht, eine folgende Probe aufzuneh men.

Der Analyseablauf wird dadurch ausgeführt, daß der Ablauf im ersten Prozeßabschnitt für eine Probe im automatischen Pro bennehmer in Zeitintervallen eines Zyklus im zweiten Prozeß abschnitt erfolgt und daß das Verarbeiten in den drei Pro zeßabschnitten parallel mit mehreren Proben erfolgt, die aufeinanderfolgend analysiert werden. Die Verarbeitungs schritte schreiten so fort, daß dann, wenn eine erste Probe zur Bearbeitung in den zweiten Prozeßabschnitt nach Ab schließen der Verarbeitung im ersten Prozeßabschnitt über führt wird, die Bearbeitung einer folgenden zweiten Probe im ersten Prozeßabschnitt begonnen wird, und dann, wenn die erste Probe zur Bearbeitung im dritten Prozeßabschnitt nach Vervollständigen der Bearbeitung im zweiten Prozeßabschnitt transportiert wird, die folgende zweite Probe zur Bearbei tung in den zweiten Prozeßabschnitt transportiert wird und das Bearbeiten einer dritten Probe im ersten Prozeßabschnitt begonnen wird.

Was die analytische Prozeßverarbeitungszeit mit dem Gerät für die oben beschriebenen Analyseschritte betrifft, so wird die gesamte Zeit für die drei Prozesse für eine erste Analyse beansprucht, jedoch werden dann folgende Analyseer gebnisse im Abstand der Programmzykluszeit erhalten, d. h. in den Zeitintervallen im zweiten Prozeßabschnitt, wodurch es möglich ist, die Analyseverarbeitungszeit bei kontinuier licher Analyse erheblich zu verringern. Es ist nicht erfor derlich, Details der Funktionsabläufe in einem jeweiligen Prozeßabschnitt anzugeben. Da jedoch ein Analyseprogramm wiederholt abläuft, wobei die für den zweiten Prozeßab schnitt erforderliche Zeit die Zykluszeit ist, ist es wünschenswert, die Zeitverteilung der jeweiligen Prozesse zu berücksichtigen, um ein gut zum Prozeß passendes Programm zu finden. Es ist auch wünschenswert, daß die erforderliche Zeit für jeweilige Prozeßabschnitte innerhalb der oben genannten Zykluszeit liegt. In diesem Fall kann die Analyse durch paralleles Verarbeiten des zu analysierenden Stoffes in jedem Prozeßabschnitt erfolgen. Es besteht jedoch die Möglichkeit, daß die Derivatbildungszeit länger ist als die oben genannte Zykluszeit, da die Derivatbildungszeit u.a. vom zu analysierenden Gegenstand abhängt. Diesem Fall wird durch ein Verfahren begegnet, gemäß dem mehrere Reaktions plätze geschaffen werden. Wenn z. B. fast die doppelte Zeit beansprucht wird, ist es möglich, eine Analysenprobe nach der anderen in jedem Zyklus zu verarbeiten.

Für den dritten Zyklus besteht das Erfordernis, daß die Zeit, die dafür erforderlich ist, daß ein abgetrennter Bestandteil durch den Detektor läuft und gemessen wird, innerhalb der Zeitspanne des oben genannten einen Zyklus liegt. Elektrische Verarbeitung wie arithmetische Anzeige der Daten muß nicht notwendigerweise in einem Zyklus enthal ten sein.

1,2-Diphenylethylendiamin (DPE) kann z. B. als Fluoreszenz markieragens als Derivatbildungsreagens für eine Klasse von Catecholamin verwendet werden. Eine hergestellte Lösung eines Fluoreszenzmarkieragens enthält DPE mit 60 mM, Kalium ferrizyanid mit 2 mM, Acetonitril zu 40% u. a. Darüber hinaus wird eine Flüssigkeit mit Acetonnitril, Methanol und einer wäßrigen Lösung im Verhältnis 5 : 2 : 4 z. B. für das Eluat verwendet, das der Trennsäule zum Trennen der Klasse von Catecholaminen zugeführt wird. In diesem Fall sind Lithiumnitrat mit 50 mM und Dodecylnatriumsulfat mit 10 mM in der wäßrigen Lösung enthalten.

Monodancylcadaverin (MDC) kann als Fluoreszenzmarkieragens als Derivatbildungsagens für Prostaglandine verwendet werden. Die hergestellte Lösung des Fluoreszenzmarkieragens enthält MDC mit 6 mM, Diethylphosphorocyanitat (DEPC) usw. Eine Flüssigkeit aus Wasser, Tetrahydrofuran und Acetnitril kann als Eluat zum Abtrennen von Prostaglandinen verwendet werden. Es ist wünschenswert, daß die Anregungswellenlänge des Fluoreszenzdetektors 340 nm und die Fluoreszenzwellen länge 520 nm ist.

Die vorliegende Erfindung ist anwendbar, wenn eine einzige Trennsäule verwendet wird. ln diesem Fall ist nur eine ein fachere Struktur erforderlich als dann, wenn mehrere Teile von Trennsäulen verwendet werden. Biologische Proben, auf die die vorliegende Erfindung vorzugsweise angewandt wird, sind Blutplasma, Blutserum, Urin usw.

Ein Beispiel eines automatischen erfindungsgemäßen Analyse gerätes für Catecholamine wird nun unter Bezugnahme auf die Zeichnungen erläutert.

Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm, das den Gesamtaufbau eines automatischen Catecholamin-Analysegerätes zeigt. Das Gerät weist einen Herstellbereich 26 mit verschiedenen Ge fäßen und einem Teilgießmechanismus und einem Anreicherungs- und Trennbereich 44 auf, der das Anreichern und Abtrennen einer Probe in einem Durchfluß ausführt. Anschließend wird der Herstellbereich 26 als automatischer Probennehmer be zeichnet, und der Anreicherungs- und Trennbereich 44 wird als analytischer Bereich bezeichnet. Ein Probengestell 27 befindet sich auf einem Probentisch 28 des automatischen Probennehmers 26. Das Probengestell 27 hält mehrere Proben gefäße mit Proben von Blutplasma. Darüber hinaus sind auf dem Probengestell 27 ein Reaktionsreagensgefäß 30 für Fluo reszenzmarkierung, ein Gefäß 31 für eine interne Bezugsflüs sigkeit und ein Gefäß 32 für eine Bezugsprobe angeordnet. Nahe dem Probentisch 28 sind bei diesem automatischen Probennehmer 26 ein Reaktionsgefäß 33, ein Düsenwaschtank 34, ein Ablauf 35 und ein Injektionsteil 36 an festen Stellen angeordnet.

Eine Teileinfülldüse 38 dient zum teilweisen Einfüllen einer Probe und eines Reagens in das Reaktionsgefäß 33 durch Pi pettieren und durch Transfusion von Proben mit abgeschlosse ner Reaktion aus dem Reaktionsgefäß 33 in den Injektionsteil 36. Ein Antriebsmechanismus mit Antrieb in XYZ-Richtung kann die Teileingießdüse 38 in allen Raumrichtungen frei zu den Stellungen der Gefäße und Einfüllöffnungen des Probennehmers bewegen. Das obere Ende der Teileingießdüse 38 ist an eine Teileingießpumpe 41 und einen Waschflüssigkeitstank 42 über eine feine Leitung 39 wie eine Kunststoffleitung über ein Dreiwegeventil 40 angeschlossen. Die Teileingießpumpe 41 verwendet eine durch einen Pulsmotor angetriebene Einspritz pumpe. Ein Block 80 für konstante Temperatur dient zum Auf rechterhalten der Temperatur des Reaktionsgefäßes 33 auf einem vorgegebenen Wert. Weiterhin ist im Probentisch 28 eine Kühlung vorhanden, um die Proben und die Reagenzien auf dem Probengestell 27 während der Analyse auf niedriger Temperatur zu halten.

Ein Analyseteil 44 weist ein Vorsäulendurchflußsystem zum Ausführen der Anreichung der Proben und zum Beseitigen von Verunreinigungen, ein Trennsäulendurchflußsystem zum Trennen der Probenbestandteile und einen Meß- und Arithmetikbereich auf. Im Vorsäulendurchflußsystem wird eine Transport- und Waschflüssigkeit aus einem Flüssigkeitstank 45 mit konstan ter Fließgeschwindigkeit durch eine Pumpe 46 zugeführt und fließt durch ein Probeneinlaßventil 47 in eine Vorsäule 48. Am Probeneinlaßventil 47 ist eine Dosierleitung 49 vorhan den, um eine vorgegebene Menge von Probenflüssigkeit abzu messen, wie sie vom Ausguß 36 des automatischen Probenneh mers her zugeführt wird.

Im Trennsäulendurchflußsystem wird Eluat aus einem Eluattank 50 mit konstanter Fließgeschwindigkeit durch eine Pumpe 51 zugeführt und fließt über ein Säulenumschaltventil 52 in eine einzige Trennsäule 53. Durch Umschalten des Säulenum schaltventils 52 fließt das Eluat durch die Vorsäule 48 und überträgt die dort bearbeitete Probe in die Trennsäule 53. Der Meß- und Arithmetikteil weist ein Fluoreszenzphotometer 54 zum Messen der Fluoreszenzintensität von Probenbestand teilen auf, die aus der Trennsäule 53 abfließen. Weiterhin sind ein A/D-Wandlerteil 55 zum Ausführen arithmetischer Verarbeitung und zum Anzeigen von Meßergebnissen, ein Steuerteil 56, ein Drucker 57, eine Kathodenstrahlröhre 58, usw. vorhanden. Das Fluoreszenzphotometer 54 weist eine Durchflußzelle 59 auf. Umschaltventile 60 und 61 sind vorhanden, um Flüssigkeit aus den Pumpen 46 und 51 abzulas sen, falls erforderlich.

Erfindungsgemäße Analyse wird mit folgendem Ablauf ausge führt:

1) Fluoreszenzmarkierung einer Probe in einem automatischen Probennehmer.
2) Anreicherung und Verunreinigungsbeseitigung in einer Vorsäule.
3) Trennung und Messung von Probenbestandteilen durch eine Trennsäule.

Es wird nun ein Ablauf von Analyseschritten unter Bezugnahme auf das Flußdiagramm von Fig. 2 beschrieben.

Waschen des Reaktionsgefäßes

Nach dem Start der Analysevorgänge in einem Schritt 101 wird das Reaktionsgefäß 33 in einem Schritt 102 gewaschen. Dabei wird die Düse 38 in die Position des Reaktionsgefäßes 33 ge fahren, und Waschflüssigkeit aus einem Waschflüssigkeitstank 42 wird durch Betätigen der Pumpe 41 in das Reaktionsgefäß gegossen. Es wird ein größeres Volumen eingegossen, als es dem Volumen des Reaktionsgefäßes 33 entspricht. Überschüssi ge Waschflüssigkeit fließt über und fließt durch den Abfluß 35 in ein Abflußrohr 43 ab. Dann wird die Düse 38 zum Boden des Reaktionsgefäßes 33 abgesenkt, um die Waschflüssigkeit im Gefäß aufzusaugen. Anschließend wird die Düse 38 zum Ab lauf 35 bewegt, um die aufgesaugte Flüssigkeit abzugeben. Vor diesem Vorgang ist es erforderlich, etwas an Luft in die Spitze der Düse 38 vorab einzusaugen, damit aufgesaugte verunreinigte Waschflüssigkeit nicht in frische Waschflüs sigkeit in der Düse diffundiert. (Das Ansaugen von Luftbla sen zum Erzeugen einer Grenze vor dem Aufsaugen ist erfor derlich, wenn Proben und Reagenzien aufgesaugt werden, wie folgt, jedoch wird im folgenden die diesbezügliche Erläute rung weggelassen, um die Erläuterung nicht zu komplex zu gestalten.) Das Waschen des Reaktionsgefäßes 33 wird dadurch abgeschlossen, daß die vorgegebenen Abläufe mehrfach wieder holt werden (z. B. dreimal).

Teilweises Eingießen einer Probe

In einem Schritt 103 wird teilweises Eingießen einer Probe in das Reaktionsgefäß 33 ausgeführt. Die Düse 38 wird zur Position des Gefäßes 31 für die interne Referenzflüssigkeit bewegt und abgesenkt, um eine vorgegebene Menge der Flüssig keit aufzusaugen. Anschließend wird die Düse zum Ort des Gefäßes 29 für die zu analysierende Probe bewegt, um eine vorgegebene Probenmenge anzusaugen. Anschließend wird die Düse 38 zum Ort des Reaktionsgefäßes 33 bewegt, um dort die Probe und die interne Bezugsflüssigkeit, die angesaugt und gehalten wurden, teilweise einzugießen. Die interne Bezugs flüssigkeit ist eine solche, wie sie zum Korrigieren von Änderungen im Erholungsvorgang der Säule und dergleichen verwendet wird. Isoproterenol wird beim Ausführungsbeispiel als Bezugsmaterial verwendet.

Düsen waschen

In einem Schritt 104 wird die Düse 38 gewaschen. In diesem Fall wird die Düse 38 zum Abfluß 35 bewegt, die Waschflüs sigkeit wird ausgegeben, und die interne Referenzflüssigkeit und Verschmutzung auf der Innenwand der Düse aufgrund der Probe werden abgewaschen. Danach wird die Probe zum Wasch tank 34 bewegt, in diesen abgesenkt, und Waschflüssigkeit wird ausgegeben, um das Äußere an der Spitze der Düse 38 zu waschen.

Teileingießen und Mischen mit dem Reagens

In einem Schritt 105 wird ein Reagens zur Flüssigkeit im Reaktionsgefäß 33 hinzugefügt. Die Düse 38 wird zum Ort des Gefäßes 30 mit dem Reaktionsreagens bewegt, eine vorgegebene Menge des Derivatbildungsreagens wird in die Düse eingesaugt und dann in das Reaktionsgefäß 33 gegeben, um dort mit der Probe und der internen Bezugsflüssigkeit gemischt zu werden, die zuvor eingefüllt wurden. Abweichend vom Vorstehenden kann Mischen dadurch erfolgen, daß zunächst Luft in die Düse gesaugt wird, und die Düse in das Gefäß eingetaucht wird, um dort Luft auszugeben, oder daß das Gefäß mechanisch oder elektrisch von außen bewegt wird, usw. Wenn sich jedoch die Flüssigkeiten einfach mischen und die zugegebene Menge ver hältismäßig groß ist, ist Mischen manchmal dadurch möglich, daß lediglich das Zugeben mit hoher Geschwindigkeit erfolgt.

Reaktion

In einem Schritt 106 beginnt die Fluoreszenzmarkierreaktion, gemäß der Derivatbildung in ein Fluoreszenzmaterial für eine Klasse von Catecholaminen erfolgt. Die Mischflüssigkeit von Probe und Derivatbildungsreagens (im folgenden als Proben flüssigkeit bezeichnet) im Reaktionsgefäß 33 wird für vor gegebene Zeit sich überlassen, welches Gefäß auf konstanter Temperatur wärmeisoliert gehalten hat, damit die Reaktion für die Fluoreszenzmarkierung abläuft.

Probeneinführung in eine Dosierleitung

In einem Schritt 107 wird Reaktionsflüssigkeit aus dem Reak tionsgefäß 33 in die Dosierleitung 49 eingeführt. Die Pro benflüssigkeit, in der Derivatbildung im wesentlichen abge schlossen ist, wird aus dem Reaktionsgefäß 33 durch die Düse 38 aufgesaugt, die Düse wird zur Eingießstelle 36 bewegt, in diese eingeführt, und dann wird Probenflüssigkeit in die Dosierleitung 49 eingegeben, während das Probenzuführventil 47 in der Stellung gemäß Fig. 1 bleibt. Wenn dieses dann nach dem Füllen der Dosierleitung 49 in Probenflüssigkeit umgeschaltet wird, wird die an das Umschaltventil 52 ange schlossene Dosierleitung 49 an Durchflußleitungen 62 und 63 angeschlossen, und eine vorgegebene Menge von Probenflüssig keit wird durch Fließen von Transport- und Waschflüssigkeit in die Vorsäule 48 übertragen.

Konzentriervorgang

In einem Schritt 108 werden das Festhalten einer Klasse von in Derivate umgewandelten Catecholaminen in der Vorsäule 48 und Abtrennen von Verunreinigungen und überschüssigem Reagens ausgeführt, und die Probenflüssigkeit wird gleich zeitig angereichert. Wenn die Probenflüssigkeit durch Fließen der Transport- und Waschflüssigkeit in die Vorsäule 48 eingeführt wird, wird die Probe durch Adsorption festge halten und in der Vorsäule 48 angesammelt. Dabei laufen Verunreinigungen und überschüssiges Reagens, also Verunrei nigungen, die die Messung stören, durch die Vorsäule, und sie werden über eine Ausgangsöffnung 64 ausgegeben.

Probenübertragung

In einem Schritt 109 wird die festgehaltene Probe, aus der Verunreinigungen entfernt sind, von der Vorsäule 48 desor biert und in die Trennsäule 53 eingeführt. Wenn das Säulen umschaltventil 52 von dem in Fig. 1 mit durchgezogenen Linien eingezeichneten Zustand in den mit gestrichelten Linien eingezeichneten Zustand überführt wird. wird die Vorsäule 48 zwischen den Leitungen 65 und 66 angeschlossen, Eluat fließt durch die Vorsäule 48 und die in dieser ange reicherte Probe wird dissoziiert und an die Trennsäule 53 gegeben, wodurch der Trennvorgang startet. Wenn das Säulen umschaltventil 52 wieder umgeschaltet wird, wenn die ganze Probe zur Leitung 66 übertragen ist (es gilt der Zustand mit ausgezogenen Linien in der Figur), fließt das Eluat direkt zur Trennsäule 53, also nicht durch die Vorsäule 48, und Transport- und Waschflüssigkeit fließt in die Vorsäule 48.

Trennung

In einem Schritt 110 fließt weiterhin das Eluat in die Trennsäule 53, und die Trennung von Bestandteilen einer Klasse von Catecholaminen findet statt. Norepinephrin (NE), Epinephrin (E) oder Adrenalin und Dopamin (DA) bilden ein Bestandteilsband, das aus der Trennsäule ausfließt.

Vorsäulenregenerierung

Parallel zur Trennung von Probenbestandteilen im Schritt 110 wird in einem Schritt 111 Transport- und Waschflüssigkeit in die Vorsäule 48 gegeben, um einen Zustand wiederherzustel len, in dem die nächste Probe aufgenommen werden kann.

Messung

In einem Schritt 112 wird Eluat von der Trennsäule 53 mit dem Fluoreszenzphotometer 54 begutachtet. Die Probenbestand teile, die getrennt wurden und aus der Trennsäule 53 aus fließen, fließen aufeinanderfolgend in die Durchflußzelle 59 des Fluoreszenzphotometer 54, und die Fluoreszenzintensitä ten von jeweiligen getrennten Bestandteilen werden ermit telt, und Anreicherungen der jeweiligen Bestandteile werden durch arithmetisches Verarbeiten erhalten.

Datenanzeige und Ausgabe

In einem Schritt 113 werden im Schritt 112 erhaltene Daten ausgegeben und durch einen Drucker 57, eine Kathodenstrahl röhre 58 oder dergleichen angezeigt. In einem Schritt 114 wird bestimmt, ob alle Proben vom automatischen Probennehmer 26 verarbeitet wurden. Sind noch welche übrig, erfolgt erneut der Ablauf ab Schritt 102; andernfalls folgt ein Schritt 115, mit dem die Analysefunktion des Gerätes abge schlossen wird.

Im vorigen wurde der Ablauf von einer einzigen zu analysieren den Probe beschrieben. Im folgenden werden Schritte zum kontinuierlichen erfindungsgemäßen Verarbeiten mehrerer zu analysierender Proben beschrieben. Die Fig. 3A und 3B zeigen ein Beispiel eines Analyseprogramms hierfür.

Die Ordinate in den Figuren zeigt Funktionsteile des Ana lyseablaufs, wie er vorstehend beschrieben wurde, wobei ein Aufteilen in Prozesse 1, 2 und 3 erfolgt. Der erste Prozeß zeigt prinzipiell die Funktion des automatischen Probenneh mers zum Umwandeln der Probe in ein Derivat. Der zweite Prozeß zeigt die Funktion der Probenkonzentration durch eine Vorsäule, und der dritte Prozeß zeigt die Funktion der Trennung und der Messung der Probenbestandteile durch die Trennsäule. Zwischen den jeweiligen Prozessen bestehen Grenzen, so daß eine geeignete zeitliche Verteilung zwischen den jeweiligen Prozessen in Programmpunkten erzielbar ist.

Die Abszisse zeigt die Zyklusnummer und die Zeit, die beim Abarbeiten des Analyseprogramms verstreicht. Das Programm arbeitet so, daß die jeweiligen Funktionen im ersten, zweiten und dritten Prozeß in einem Zyklus einen Kreislauf bilden.

Fig. 3A stellt den Analysezustand für die n-te Analyseprobe als mittlere Probe dar. Durchgezogene dicke Linien zeigen den Bearbeitungszustand. Durchgezogene feine Linien zeigen die Zustände für die (n+1)-te Analyseprobe und die (n-1)-te Analyseprobe, während gestrichelte Linien den Zustand einer (n-1)-ten und einer (n+2)-ten Analysenprobe zeigen. Fig. 3B veranschaulicht die Funktion des Umschaltventils. Ein "Do sier-Zustand" a des Probeneinführventils 47 ist ein Zustand, in dem Probenflüssigkeit von der Eingießöffnung 36 in die Dosierleitung 49 eingeführt werden kann, d. h. der Zustand von Fig. 1. Ein "Einführungs"-Zustand b ist der Zustand, in dem das Ventil umgeschaltet ist und die Dosierleitung 49 mit dem Vorsäulendurchfluß verbunden ist. Ein "Verbindungs"- Zustand c des Säulenumschaltventils 52 ist eine Stellung, in der die Vorsäule 48 mit dem Trennsäulendurchfluß verbunden ist, während ein "Parallelverarbeitungs"-Zustand d eine Stellung ist, in der Trennung ausgeführt wird und Transport- und Waschflüssigkeit fließt, d. h. der Zustand mit ausgezo genen Linien in Fig. 1. Die jeweiligen Umschaltventile arbeiten wiederholt in jedem Zyklus.

Der Analyseablauf beginnt mit der Anfangsanalyse für eine erste Analyseprobe (eine Analyseprobe, die als erste analy siert wird) in einem ersten Zyklus. Dann wird die Analyse von Proben vom automatischen Probennehmer in Folge Zyklus für Zyklus ausgeführt. Fig. 3A zeigt die Ablaufzustände vom n-ten bis zum (n+1)-ten Zyklus. Dies heißt, daß die Anylse einer n-ten Analyseprobe (einer Analyseprobe, die als n- analysiert wird) im n-ten Zyklus startet und an ihr der Ablauf des ersten Prozesses ausgeführt wird. Dabei schreiten der Ablauf des zweiten Prozesses an der (n-1)-ten Analyse probe, bei der Analyse vorgestartet wurde, parallel zur vorgenannten Analyse ab, und es schreitet der Ablauf des dritten Prozesses der (n-2)-ten Analyseprobe fort. Im (n+1)-ten Zyklus erreicht die n-te Analyseprobe den Ablauf des zweiten Prozesses, und es beginnt der erste Prozeßablauf für eine folgende (n+1)-te Analyseprobe. Parallel dazu wird der Ablauf des dritten Prozesses an der (n-1)-ten Analyse probe ausgeführt. Darüber hinaus werden im (n+2)-ten Zyklus der Ablauf des dritten Prozesses der n-ten Analyseprobe und der Ablauf des zweiten Prozesses der (n-1)-ten Analyseprobe ausgeführt, und der Ablauf des ersten Prozesses für eine folgende (n+2)-te Analyseprobe wird begonnen.

Gemäß den Analyseschritten des oben beschriebenen Ablaufs ist die Gesamtanalyseverarbeitungszeit des vorliegenden Gerätes die Gesamtzeit für den ersten, zweiten und dritten Prozeß, d. h. die Zeit für drei Zyklen, wenn nur eine Analyseprobe analysiert wird. Es ist jedoch möglich, mit jedem Zyklus eine Analyseprobe zu Ende zu analysieren, wenn mehrere solche Proben aufeinanderfolgend analysiert werden. Da die Zeit für einen Zyklus beim Ausführungsbeispiel 5 Minuten beträgt, ist die Verarbeitungszeit pro Analyseprobe 5 Minuten.

Da es wünschenswert ist, eine Kapazität von mindestens zehn Analysen pro Stunde bei der Chromatographie einer Klasse von Catecholaminen zu erreichen, ist es erforderlich, daß die Zeit für einen Zyklus innerhalb des Bereichs von 6 Minuten liegt.

Fig. 4 ist eine Draufsicht auf den automatischen Probenneh mer 26 des Ausführungsbeispiels gemäß Fig. 1. Im abnehmbaren Probengestell 27 auf dem Probentisch 28 sind Einführlöcher 70 für Probengefäße in Matrixform mit insgesamt 50 Positio nen vorhanden, 10 Spalten und 5 Zeilen, und Probengefäße mit zu analysierenden Proben werden in die Löcher gesteckt und so angeordnet. Auf dem Probengestell 27 befindet sich ein Ort für das Reaktionsreagens 30, die interne Bezugsflüssig keit 31 und die Bezugsprobe 32 sowie weiterhin Einsetzlöcher 71a, 71b und 71c zum Einsetzen von Gefäßen für eilige Analysen, damit dringende Unterbrechungsmessungen während der Analyse ausgeführt werden können. Darüber hinaus sind das Reaktionsgefäß 32, der Düsenwaschtank 34, der Abfluß 35 und die Eingießöffnung 36 zur Dosierleitung 39 an festen Stellen an der Seite des Probengestells 27 vorhanden. Die Teileingießdüse 38 wird durch einen Halteteil 5 gehalten, der auf einer Welle 4 eines verschiebbaren Körpers 3 hin- und herschiebbar ist, wobei Verschiebungen nach links-recht, vor-zurück und auf-ab, also in X-, Y- und Z-Richtung frei mit Hilfe eines Antriebsmechanismus 37 möglich ist. Ein Positionieren kann jederzeit an Positionen der oben be schriebenen Gefäße oder Öffnungen erfolgen, um die erforder lichen Abläufe auszuführen.

Ein Analyseablauf beginnt damit, daß das Probengestell 27 angebracht wird, auf dem zu analysierende Proben und Reagen zien auf dem Probentisch 28 des automatischen Probennehmers 26 angeordnet werden, und ein Analysestartschalter an einer Bedienkonsole 77 durch eine Bedienperson betätigt wird.

Die Fig. 5A und 5B zeigen Aufbaulayoutzeichnungen für ein Gerät der beschriebenen Ausführungsform. Das Gerät hat ver tikale Anordnung, mit einem Aufbau, der alle für die Analyse erforderlichen Einheiten beinhaltet.

Das Gerät ist in zwei Stufen unterteilt, wobei der automati sche Probennehmer 26, das Fluoreszenzphotometer 54 und eine Säulenkonsole 72 in der oberen Stufe angeordnet sind. Die Vorsäule 48, die Trennsäule 53, das Probeneinführventil 47 und das Säulenumschaltventil 52 befinden sich auf der Säu lenkonsole 72. Die Temperatur der Trennsäule 53 wird mit Hilfe eines Konstanttemperaturblocks so geregelt, daß die Temperatur während der Analyse konstant bleibt. Anbringen und Wegnehmen des Probengestells 27 am bzw. vom automati schen Probennehmer 26 erfolgt durch Öffnen und Schließen eines Deckels 74. Oberhalb vom Fluoreszenzphotometer 54 ist ein Floppy-Disk-Laufwerk 75 zum Speichern von Meßdaten vorhanden.

In der unteren Stufe des Gerätes befindet sich der Waschflüs sigkeitstank 42, der Tank 45 für Transport- und Waschflüs sigkeit, der Eluattank 50, die Teileingießpumpe 41, die Pumpe 46 zum Zuführen von Transport- und Waschflüssigkeit und die Pumpe 51 zum Zuführen von Eluat. Von hier wird Flüssigkeit zugeführt, wie sie für eine Analyseeinheit auf der oberen Stufe des Gerätes erforderlich ist. Darüber hinaus ist im hinteren Teil der unteren Stufe ein elek trisches System 76 angeordnet, mit z. B. einer Spannungs quelle, Platinen und dergleichen. Der Drucker 57, die Kathodenstrahlröhre 58 und die Steuerkonsole 77 zum Ausfüh ren von Eingabeabläufen für Analyse mit dem vorliegenden Gerät sind an der Oberfläche des Gerätes angebracht.

Fig. 6 zeigt ein Diagramm eines Steuerungssystems für das Ausführungsbeispiel. Analysesteuerung durch das Gerät des oben beschriebenen Ausführungsbeispiels erfolgt mit Hilfe eines Steuerteiles 56 als zentralem Teil, mit Hilfe von Ein gaben über die Steuerkonsole 77. Wenn ein Spannungsschalter eingeschaltet ist, wird zunächst eine Temperaturregeleinheit 78 aktiviert, und die Lichtquelle des Fluoreszenzphotometers 54 wird eingeschaltet. Wenn anschließend ein Analysevorbe reitungsschalter eingeschaltet wird, beginnen die Pumpe 46 und die Pumpe 51 mit dem Zuführen von Flüssigkeit. Wenn ein Analysestartschalter nach dem Anbringen des Probengestells 27 auf dem automatischen Probennehmer 26 angebracht ist, beginnen der automatische Probennehmer 26, das Probenzuführ ventil 27 und das Säulenumschaltventil 52 ihre Funktion. Ein analytischer Ablauf erfolgt dann mit den Analyseschritten des Ablaufs, wie er unter Bezugnahme auf die Fig. 2 erläutert wurde. Meßergebnisse werden mit dem Drucker 57 ausgedruckt und ebenfalls auf der Kathodenstrahlröhre 58 angezeigt, nach Datenverarbeitung im Steuerteil nach Eingabe der Signale vom Fluoreszenzphotometer 54 über den A/D-Wand ler 55.

Fig. 7 zeigt ein Beispiel eines Analyseergebnisses für eine Klasse von Catecholaminen mit dem Gerät gemäß dem Ausfüh rungsbeispiel. Numerische Werte an den verschiedenen Meß spitzen zeigen die Zurückhaltezeit, d. h. die Zeitspanne von Beginn der Trennung bis zum Zeitpunkt, zu dem ein jeweiliger getrennter Bestandteil den Detektor erreicht. Beim vorlie genden Gerät ist der Trennstart der Zeitpunkt, zu dem das Säulenumschaltventil 52 umgeschaltet wird und begonnen wird, die in der Vorsäule 48 angereicherte Probe in die Trennsäule 53 zu übertragen. Der erste Peak bei 0,48 Sekunden ist ein Peak, der detektiert wird, da die in die Vorsäule eingefül lte Transportflüssigkeit vor der getrennten und ablaufenden Probe den Detektor erreicht. Die in der Trennsäule 53 getrennten Bestandteile laufen in der Reihenfolge Norepine phrin (NE), Epinephrin (E) und Dopamin (DA) aus, wobei schließlich Isoprotenerol ausläuft und detektiert wird, das als internes Bezugsmaterial hinzugefügt wurde. Konzentratio nen der jeweiligen Bestandteile werden aus der jeweiligen Peakfläche erhalten.

Beim vorliegenden Analysebeispiel wurde die Probentrennung in etwas mehr als 4 Minuten nach dem Start der Trennung abgeschlossen, d. h. nach dem Umschalten des Säulenumschalt ventils 52. Bei diesem Analysebeispiel ist Trennung also mit 1/5 der Zykluszeit möglich, die zuvor erreichbar war, wie oben erläutert.

Wenn das vorliegende Gerät bei Routinearbeit eingesetzt wird, werden Ausgaben durch Drucken einer Analysenummer und Angaben und Konzentrationen zu den analysierten drei Be standteilen auf dem Drucker 57 und der Kathodenstrahlröhre ausgegeben. Ein Druckerausdruck eines Chromatogramms, wie desjenigen von Fig. 7, kann, falls erforderlich, erfolgen. Beim Ausführungsbeispiel ist nur eine Vorsäule vorhanden, jedoch können gelegentlich mehrere Vorsäulen genutzt werden. Zum Beispiel gibt es ein Verfahren gemäß dem zwei Teile in Reihe genutzt werden, um die Funktion des Abtrennens von wasserlöslichen Verunreinigungen und die Funktion des Abtrennens hydrophober Verunreinigungen, usw. aufzuteilen.

Die Fig. 8 und 9 zeigen abgeänderte Beispiele zum Veranscha ulichen konkreter Abläufe der Derivatbildung. Das erste abgeänderte Beispiel gemäß Fig. 8 veranschaulicht ein Verfahren, bei dem zwei Reaktionsgefäße vorhanden sind. Die Ausgestaltung ist so, daß sich zwei Reaktionsgefäße 79a und 79b am automatischen Probennehmer befinden, wobei jedes Gefäß mit Hilfe eines Temperaturblocks 80 für konstante Temperatur wärmeisoliert ist. Waschflüssigkeit, die beim Waschen überläuft, fließt in einen Abfluß 81. Dieses System wird verwendet, wenn die Derivatbildung mit dem automati schen Probennehmer ausgeführt wird, d. h. wenn der erste Prozeß länger als ein Zyklus dauert, weil die Reaktion so viel Zeit benötigt. Dies bedeutet, daß es möglich ist, das Verarbeiten für eine Analyseprobe mit jedem Zyklus abzu schließen, indem Probenflüssigkeit und Reagens abwechselnd in die zwei Reaktionsgefäße eingegossen werden, mit Zeitin tervallen eines Zyklus, damit mit der Reaktion begonnen werden kann. Wenn die Reaktion länger als zwei Zyklen beansprucht, ist es erforderlich, die Anzahl der Reaktions gefäße entsprechend zu erhöhen.

Beim zweiten abgeänderten Beispiel gemäß Fig. 9 wird dafür gesorgt, daß die Reaktion in der Dosierleitung zum Proben einführventil abläuft. Ein Gefäß 82 am automatischen Proben nehmer wird als Mischgefäß verwendet, das eine Probe mit einem Reagens vermischt. Die Reaktionsflüssigkeit, die durch das Mischen mit ihrer Reaktion begonnen hat, wird über die Eingießöffnung mit Hilfe der Teileingießdüse 38 in die Dosierleitung 83 gegeben, wo die Flüssigkeit für gewisse Zeit ohne Zirkulation belassen wird, wie sie ist, damit die Reaktion weiter abläuft. In diesem Fall wird die Dosierlei tung 83 mit Hilfe eines Konstanttemperaturblocks 84 auf einer vorgegebenen Temperatur gehalten. Ein Trennventil 85 ist am Ausgang vorhanden, damit sich die Flüssigkeit während der Reaktion nicht bewegt. Dieses System kann nicht für Langzeitreaktionen verwendet werden, da die zulässige Reaktionszeit vom Betätigungsintervall des Probeneinlaßven tils 87 abhängt. Da jedoch die Dosierleitung 88 durch Aufwickeln einer synthetischen Kunststoffleitung oder dergleichen in Spulenform gebildet ist, ist Temperaturrege lung einfach, und für den Anbringungsort besteht Freiheit. Daher besteht z. B. der Vorteil, daß das System einstückig mit dem Konstanttemperaturblock der Trennsäule ausgebildet werden kann.

Die Fig. 10A und 10B veranschaulichen ein Programmbeispiel für das zweite abgeänderte Beispiel gemäß Fig. 9. Es ist dahingehend dasselbe wie das Programm gemäß Fig. 3 gemäß dem oben beschriebenen Ausführungsbeispiel, daß der Prozeß grob gesprochen in einen Prozeß 1 mit dem automatischen Proben nehmer zur Derivatbildung, einen Prozeß 2 mit der Anreiche rung durch die Vorsäule und einen Prozeß 3 untergliedert ist, mit der Trennung und der Messung durch die Trennsäule. Jedoch liegen die Grenzen zwischen den Abschnitten der jeweiligen Prozesse etwas anders. Das vorliegende Programm läuft so ab, daß der erste Prozeß alles abdeckt, bis Proben flüssigkeit in die Dosierleitung 83 des Probeneinlaßventils 87 eingefüllt wird. Der zweite Prozeß deckt alles ab dem Start der Reaktion in der Dosierleitung bis zur Anreicherung der Probe durch die Trennsäule ab. Der dritte Prozeß beginnt mit der Übertragung der Probe in die Trennsäule. Auf Art und Weise wird der analytische Ablauf grob in die Funktionen der automatischen Probennahme, der Vorsäulenakti vität und der Trennsäulenaktivität gegliedert. Die jeweili gen Abläufe können auch kontinuierlich mit Analyseproben ablaufen, die mit dem Beispiel gemäß den Fig. 9 und 10 durch ein wiederholt abgearbeitetes Programm analysiert werden. Jedes der oben beschriebenen abgeänderten Beispiele zeigt, daß die Reaktionsorte fest angeordnet sind. Jedoch bestehen auch Verfahren, bei denen nicht wiederverwendbare Gefäße verwendet werden, abweichend vom obigen. Bei einem solchen Verfahren wird eine Anzahl von Reaktionsgefäßen auf dem automatischen Probennehmer angeordnet, die der Anzahl der Proben entspricht. Für jede Analyseprobe wird dafür gesorgt, daß die Reaktion in einem zugeordneten Reaktionsgefäß abläuft. Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß es nicht erforderlich ist, ein Reaktionsgefäß nach dem anderen zu waschen und Proben und Reagenzien aufeinanderfolgend mit zeitlichem Abstand in die mehreren Gefäße zu geben. Selbst wenn die Reaktion lange Zeit beansprucht, ist es möglich, Probenflüssigkeit, in der sich ein Derivat gebildet hat, einem analytischen Teil in Zeitintervallen des oben genann ten Zyklus zuzuführen. Dadurch, daß aber Reaktionsgefäße in einer Anzahl bereitgestellt werden müssen, die der Anzahl von Proben entspricht, besteht der Nachteil, daß der automa tische Probennehmer eine große Abmessung bekommt.

Vorstehend wurde ein automatisches Analysegerät für Cate cholamine als Ausführungsbeispiel der Erfindung beschrieben. Darauf ist die Erfindung jedoch nicht begrenzt. Sie kann vielmehr zur Analyse verschiedener Materialien eingesetzt werden, wie zum Analysieren von Aminosäuren, Gallensäure oder anderen Guanidinen außer Catecholaminen. Darüber hinaus müssen die Derivatbildung und die Detektorausgestaltung nicht auf das Verwenden einer Fluoreszenzphotometriemethode ausgerichtet sein, sondern es kann auch Ausrichtung auf Verwenden eines Photometers für ultraviolettes oder sichtba res Licht durch Enzymaktivität erfolgen, oder ein UV-Aktivi tätsverfahren kann ausgeführt werden. Darüber hinaus kann die Derivatbildung bei konkreten Verfahren auch abgeändert werden, z. B. nach Reaktionsort, Schritten des Bedienablaufs oder Zusammensetzung des Programms.

Mit der Erfindung ist der erkennbare Effekt erreichbar, daß die analytische Verarbeitungszeit mit einem automatischen Analysegerät mit Flüssigphasenchromatographie, was bisher eine lange Zeitspanne einschließlich der Derivatbildung von Proben und der Probenanreicherung durch Verarbeiten in einer Vorsäule erforderte, stark verringert werden kann, wodurch das Ausführen von Routinearbeit, z. B. klinischer Untersu chung in einem Krankenhaus automatisiert werden kann.

Claims

1. Flüssigphasenchromatographieverfahren, dadurch gekenn zeichnet, daß dann, während eine Säule für Verunreinigungs entfernung eine markierte spezielle Probe verarbeitet, Trennung von Bestandteilen einer Probe, die der speziellen Probe vorangeht, in einer Trennsäule ausgeführt wird, und dafür gesorgt wird, daß eine Markierreaktion einer Probe, die der speziellen Probe folgt, in einem Reaktionsbearbei tungsteil abläuft.

2. Analyseverfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungsreaktion in einem Gefäß dadurch gestartet wird, daß eine Probe und ein Markierreagens in das Gefäß durch eine Teileingießeinrichtung gegeben werden, wodurch die Flüssigkeiten miteinander gemischt werden.

3. Analysemethode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungsreaktion in einem Gefäß ausgeführt wird, das die Probe und ein Markierreagens aufnimmt, und in einer Dosierleitung, in die Flüssigkeit aus diesem Gefäß eingelei tet wird.

4. Analyseverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß ein gesam ter analytischer Ablauf vom Herstellen der Probe bis zum Messen durch Trennung in drei Prozeßabschnitte unterteilt wird, wobei eine Ausgangsprobe und ein Reagens im ersten Prozeßabschnitt gemischt werden, um die weiterzuverarbeiten de Probe herzustellen, die hergestellte Probe im zweiten Prozeßabschnitt in einer Säule zum Beseitigen von Verun reinigungen festgehalten wird und im dritten Prozeßabschnitt die von der Säule zum Abtrennen der Verunreinigungen zuge führte Probe in ihre Bestandteile aufgeteilt wird und die aufgeteilten Bestandteile durch einen Detektor festgestellt werden, wobei die Abläufe der drei Prozeßabschnitte parallel und gleichzeitig erfolgen, wobei eine Probe einen der drei Abschnitte nach dem anderen durchläuft.

5. Analyseverfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe eine solche ist, die eine Klasse von Catechol aminen enthält, daß das Reagens ein solches ist, das eine Klasse von Catecholaminen in Derivate umwandelt, und daß der Detektor ein Fluoreszenzdetektor ist.

6. Analyseverfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Abläufe im zweiten Prozeßabschnitt und im dritten Prozeßabschnitt innerhalb von 6 Minuten ausgeführt werden.

7. Flüssigphasenchromatographie-Analysegerät, bei dem eine in ein Derivat umgewandelte Probe in einer Säule (48) zum Beseitigen von Verunreinigungen festgehalten wird und die festgehaltene Probe in eine Trennsäule (53) übertragen wird, in der Bestandteile der Probe voneinander getrennt werden, gekennzeichnet durch

- eine Zubereitungseinrichtung (36), die eine Ausgangsprobe und ein Derivatbildungsreagens in einem Gefäß (33) mischt, um eine Derivatbildungsreaktion zu starten;
- eine Festhalteeinrichtung mit einem Leitungsumschaltventil (47) und einer Säule (48) zum Beseitigen von Verunreini gungen, zum Leiten der von der Zubereitungseinrichtung (26) empfangenen Probe zur Säule (48) zum Beseitigen von Verunreinigungen mit Hilfe einer Transportflüssigkeit, die über das Leitungsumschaltventil (47) zugeführt wird,
- und eine Trenn- und Meßeinrichtung, die die Bestandteile der von der Festhalteeinrichtung empfangenen Probe vonein ander mit Hilfe einer Trennsäule (53) trennt, und die Be standteile mit einem Detektor (54) mißt;
- wobei die Funktionen der Zubereitungseinrichtung (26), der Festhalteeinrichtung und der Trenn- und Meßeinrichtung so miteinander korreliert sind, daß die Probe jeweils pa rallel mit anderen Proben verarbeitet wird.

8. Flüssigphasenchromatographie-Analysegerät gekennzeichnet durch

- eine Zubereitungseinrichtung (26), die eine Probe und ein Derivatbildungsreagens in ein Gefäß (33) überträgt und auch die mit dem Derivatbildungsreagens gemischte Probe vom Gefäß (33) in eine Dosierleitung (49) überträgt,
- eine Verunreinigungsbeseitigungseinrichtung, die eine Ver unreinigung in der gemischten Probe mit Hilfe einer Säule (48) zum Beseitigen von Verunreinigungen beseitigt;
- eine Trennsäule (53) , die die Bestandteile der Probe von einander trennt, wie sie von der Säule (48) zum Beseitigen von Verunreinigungen übertragen wird;
- und eine Steuereinrichtung (46), die die Funktion der Ein richtung zum Beseitigen von Verunreinigungen so steuert, daß die Funktionen des Aufnehmens und des Weitergebens einer Probe an die Trennsäule (53) wiederholt werden, und die die Funktion der Zubereitungseinrichtung (26) so steuert, daß sie die Probe und das Reagens an das Gefäß (33) überträgt, während die Funktion eines Zyklus der Ein richtung zum Beseitigen von Verunreinigungen ausgeführt wird.

9. Analysegerät nach Anspruch 8, gekennzeichnet durch ein Leitungsumschaltventil (52) zwischen der Dosierleitung (49) und der Säule (48) zum Beseitigen von Verunreinigungen, das so betätigt wird, daß die Probe in der Dosierleitung (49) in die Säule (48) zum Beseitigen von Verunreinigungen geleitet wird, nachdem eine vorgegebene Zeitspanne nach dem Zuführen der gemischten Probe in die Dosierleitung (49) verstrichen ist.