DE4335823C2 - Verfahren zur fluorimetrischen Bestimmung von Catecholaminen und/oder deren Metaboliten sowie Vorrichtung und Reagenz zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Verfahren zur fluorimetrischen Bestimmung von Catecholaminen und/oder deren Metaboliten sowie Vorrichtung und Reagenz zur Durchführung des Verfahrens

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur fluorimetrischen Bestim­ mung von Catecholaminen und/oder deren Metaboliten in einer biologischen Probe sowie eine Vorrichtung und ein Reagenz zur Durchführung des Verfahrens.
Es ist bekannt, daß bei der Bestimmung von Catecholaminen in Körperflüssigkeiten, wie Blut, Urin und Spinalflüssigkeit, Meßfehler auftreten, die auf die Anwesenheit einer Substanz zurückzuführen sind, die bei der Abtrennung und Messung des Fluorophors durch Flüssigkeitschromatographie die Fluores­ zenz-Induktionsreaktion stören. Als Lösung für dieses Problem wird ein Verfahren angegeben, bei dem N-Ethylmaleinimid der folgenden Formel zugesetzt wird (F.A.J. van der Hoorn et al., Journal of Chromatography, Bd. 487 (1989), S. 17-28).
Fig. 2 erläutert das Fluoreszenzchromatogramm eines chromato­ graphisch analysierten Harns. Es zeigt sich, daß der Peak der im Urin enthaltenen Catecholamine, wie Norepinephrin, Epine­ phrin und Dopamin, sehr klein ist. Die Hemmung der Indukti­ onsreaktion wird auch in anderen Körperflüssigkeiten, wie Blut und Spinalflüssigkeit, beobachtet.
Diese Reaktionshemmung kann verhindert werden, indem man eine Substanz zusetzt, die vorher mit der Störsubstanz reagiert und die Unterbrechung der Reaktion verhindert. Jedoch verur­ sacht das herkömmliche Additiv N-Ethylmaleinimid selbst einen Fluoreszenzpeak. Daher ist es sehr schwierig, in der biologi­ schen Probe zwischen diesem Peak und dem Peak von Cate­ cholaminen, deren Retentionszeiten nahe beim erstgenannten Peak liegen, zu unterscheiden. Somit kommt es zu Identifikationsfehlern, die dazu führen, daß sich die genaue Konzentration der Catecholamine nicht ermitteln läßt. Ein großer Peak liegt direkt im Bereich der Retentionszeit von Norepinephrin, einem Catecholamin, was insbesondere beim her­ kömmlichen N-Ethylmaleinimid der Fall ist. Es wurde festge­ stellt, daß die Bestimmung von Catecholaminen und ihren Meta­ boliten durch den Peak von 3,4-Dihydroxyphenylethylenglykol (DOPEG) einem Catecholamin-Metabolit, der sich nahe an die­ ser Stellung befindet, nachteilig beeinflußt wird.
Insbesondere ist die Konzentration von Catecholaminen in Blutplasma sehr niedrig, wodurch sich durch die Störsubstanz eine starke Beeinträchtigung des Peaks ergibt und eine Mes­ sung in einigen Fällen unmöglich wird. Ferner tritt der glei­ che Peak auch dann auf, wenn die Retentionszeit in gewissem Ausmaß verringert werden kann, was nach neueren Befunden zu Schwierigkeiten führt.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein fluorimetrisches Meßverfahren bereitzustel­ len, das den Peak von Catecholaminen und deren Metaboliten nicht beeinträchtigt. Ferner sollen erfindungsgemäß Vorrich­ tungen und Reagenzien zur Durchführung dieses Verfahrens be­ reitgestellt werden.
Zur Lösung dieser Aufgabe wurden erfindungsgemäß Substanzen zur Ausschaltung der vorgenannten Störungen untersucht, die keine fluoreszierenden Peaks erzeugen. Dabei wurde erfin­ dungsgemäß festgestellt, daß Maleinimid ohne Alkylkette die gewünschten Eigenschaften besitzt.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur fluorimetrischen Bestimmung von Catecholaminen und/oder deren Metaboliten in einer biologi­ schen Probe, wobei die Catecholamine und/oder deren Metabo­ lite in der biologischen Probe in einem Fluoreszenz-Indukti­ onsverfahren durch Behandlung mit einem die Fluoreszenz indu­ zierenden Reagenz in einen Fluoreszenzinduktor umgewandelt werden und der gebildete Fluoreszenzinduktor flüssigchromato­ graphisch abgetrennt und sodann gemessen wird, wobei Malein­ imid in einer bestimmten Menge zugesetzt wird, bevor die bio­ logische Probe fluoreszierend gemacht wird.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die biologische Probe zur Vorbehandlung in ein Probenge­ fäß gegeben, das vorher mit einer bestimmten Menge an Maleinimid versetzt ist, und anschließend wird mit einem Maleinimid-Lösungsmedium vermischt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden Maleinimid in fe­ ster Form und Maleinimid-Lösungsmedium getrennt voneinander bereitgestellt und vor dem Fluoreszenz-Induktionsverfahren der bio­ logischen Probe dem Verfahren zugesetzt.
Maleinimid weist die nachstehend angegebene Formel auf:
Es kann zugesetzt werden, wenn die biologische Probe dem Fluoreszenz-Induktionsverfahren ausgesetzt wird.
Als Reagenz zur Induktion von Fluoreszenz können 1,2-Diphe­ nylethylendiamin und/oder Ethylendiamin verwendet werden.
Das Maleinimid kann die Störsubstanz nur dann ausschalten, wenn seine Konzentration in der biologischen Probe auf einen geeigneten Bereich eingestellt wird. Eine überschüssige Menge verhindert die Wirkung des Fluoreszenzinduktors, so daß 10 bis 60 mMol/Liter oder vorzugsweise 20 bis 50 mMol/Liter als Konzentration zum Einmischen in die biologische Probe empfoh­ len werden.
Die erfindungsgemäße Meßvorrichtung umfaßt eine Probenabgabe­ einrichtung, z. B. eine Spritze, mit der ein bestimmtes Volu­ men der biologischen Probe abgegeben werden kann, eine mit der Probenabgabeeinrichtung verbundene Vorbehandlungseinrich­ tung zur Vorbehandlung der biologischen Probe, eine Einrichtung um die vorbehandelte biologische Probe mit einem die Fluoreszenz induzierenden Reagenz fluo­ reszierend zu machen, eine Trennsäule zur Abtrennung des Fluoreszenzinduktors durch Chromatographie, eine Durchfluß­ zelle zum Nachweis der Fluoreszenzintensität des durch die Trennsäule abgetrennten Fluoreszenzinduktors und eine Ein­ richtung zur Zugabe einer bestimmten Menge an Maleinimid ent­ weder zur Probenabgabeeinrichtung oder zur Vorbehandlungseinrichtung für die biologische Probe. Die Meß­ vorrichtung ist vorzugsweise mit einem Prozessor zur Berech­ nung und Speicherung des Werts der Fluoreszenzintensität des durch die Durchflußzelle nachgewiesenen Fluoreszenzinduktors sowie mit einer Ausgabeeinrichtung, beispielsweise einer Ka­ thodenstrahlröhre (CRT) oder einem Drucker, versehen, um die im Prozessor gespeicherte Fluoreszenzintensität auszugeben.
Die Meßvorrichtung kann vollautomatisch mit dem CRT-Meßgerät verbunden werden, wenn eine Vorrichtung zur Steuerung von Flüssigkeitspumpen und Ventilen durch den Prozessor vorgese­ hen ist.
Das erfindungsgemäß verwendete Maleinimid ist in gelöster Form instabil. Die Lösung sollte dabei unmittelbar vor der Verwendung hergestellt werden, oder das Maleinimid sollte di­ rekt der biologischen Probe zugesetzt werden. Daher wird Maleinimid in fester Form, beispielsweise in granuliertert oder pulverisierter Form, vorher in das Gefäß, z. B. in einen Polypropylenbeutel, das als Gefäß für die biologische Probe verwendet wird, gegeben. Eine weitere bevorzugte Verfahrens­ weise besteht darin, ein Reagenz-Kit herzustellen, das ein Reagenzfläschchen mit einem Gehalt an pulverisiertem Maleinimid und ein Reagenzfläschchen mit einem Gehalt an Boratpufferlösung umfaßt. Die beiden Bestandteile werden unmittelbar vor der Verwendung vermischt und gelöst. Das Probengefäß und die Rea­ genzfläschchen unterliegen hinsichtlich Form und Material kei­ nen speziellen Beschränkungen. Sie können je nach den Gege­ benheiten des Markts ausgewählt werden, wobei Sauberkeit eine wichtige Voraussetzung ist.
Maleinimid reagiert vermutlich mit SH-Verbindungen und Amino­ säuren in der Körperflüssigkeit. Es wird angenommen, daß es SH-Verbindungen und Aminosäuren daran hindert, mit den die Fluoreszenz von Catecholaminen induzierenden Reagenzien zu reagieren, wodurch die Störung der Fluoreszenz-Induktionsre­ aktion verhindert wird. Daher kann eine Zugabe von Maleinimid nach der Fluoreszenz-Induktionsreaktion die vorstehende Wir­ kung der Störkomponenten in der biologischen Probe nicht ver­ hindern.
Fig. 1 ist ein Blockdiagramm, das die erfindungsgemäße Meßvor­ richtung zur Bestimmung von Catecholaminen und deren Meta­ boliten zeigt.
Fig. 2 zeigt ein Chromatogramm von in Urin enthaltenen Ca­ techolaminen, wobei keine Entfernung von Störsubstanzen er­ folgt ist.
Fig. 3 zeigt ein Chromatogramm von in Urin enthaltenen Ca­ techolaminen unter Zugabe von Maleinimid.
Fig. 4 zeigt ein Chromatogramm von in Urin enthaltenen Ca­ techolaminen unter Zugabe von herkömmlichem N-Ethylmalein­ imid.
Fig. 5 zeigt einen Graph, der die Beziehung zwischen der Kon­ zentration der Maleinimidlösung und deren Einfluß auf die prozentuale Ausschaltung der Störung bei Messung in einer Urinprobe zeigt.
Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert.
Beispiel 1
Es werden 50 ml Urin einer gesunden Person gewonnen. 1,0 ml Urinprobe wird im Vorbehandlungsverfahren auf 1/100 verdünnt. Sodann wird davon 1,0 ml entnommen und mit 100 µl 200 milli­ molarer Maleinimidlösung (pH-Wert 7,3) versetzt. Anschließend werden 400 µl einer 1%igen, mit Schwefelsäure angesäuerten Acetonitrillösung von 1,2-Diphenylethylendiamin und 400 µl eines wäßrigen Lösungsgemisches von Kaliumhexacyanofer­ rat(III) und Ammoniummolybdat zugesetzt. Hierauf wird 5 Minu­ ten auf 50°C erwärmt, wodurch der Fluoreszenzinduktor gebil­ det wird.
100 ml der den Fluoreszenzinduktor enthaltenden Probenlösung werden mit einer Mikrospritze in die Einlaßöffnung 6 einer Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie-Vorrichtung gege­ ben. Diese Vorrichtung ist mit der mit Methacrylatharz ge­ füllten Vorbehandlungssäule 5 und mit einer Trennsäule 7 ver­ bunden und weist die in Fig. 1 gezeigte Anordnung auf. Dabei wird der Fluoreszenzinduktor der Catecholamine an der Vorbe­ handlungssäule 5 adsorbiert.
Das Schaltventil 3 wird so eingestellt, daß das Elutionsmit­ tel 4, das ein Lösungsmittelgemisch aus Methanol und Acetoni­ tril umfaßt, in die Vorbehandlungssäule 5 und die Trennsäule 7 geleitet wird. Der an der Vorbehandlungssäule 5 adsorbierte Fluoreszenzinduktor wird eluiert und in der Trennsäule 7 ab­ getrennt.
Die nach der Abtrennung des Fluoreszenzinduktors anfallenden Bestandteile werden in die Durchflußzelle 10 geleitet. Die Fluoreszenzintensität wird mittels des Fluorimeters 8 bei einer Anregungswellenlänge von 350 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 500 nm gemessen. Die vom Fluorime­ ter erfaßte Fluoreszenzintensität wird im Speicher des Pro­ zessors 9 aufgezeichnet. Die aufgezeichneten Daten werden mit dem Drucker 11 ausgedruckt.
Fig. 2 zeigt ein Chromatogramm, das erhalten wird, wenn keine Maleinimidlösung zugesetzt wird, während in Fig. 3 das Chro­ matogramm bei Zusatz von Maleinimidlösung dargestellt ist. Die Peaks von Norepinephrin und Dopamin sind äußerst klein, wenn keine Maleinimidlösung zugesetzt wird. Dagegen zeigt sich bei Zugabe der Maleinimidlösung, daß beide Peaks ohne Störung die genaue Konzentration wiedergeben.
Fig. 4 zeigt das entsprechende Chromatogramm bei Zugabe von N-Ethylmaleinimid in der gleichen Konzentration. Der Peak überlappt sich mit dem von 3,4-Dihydroxyphenylethylenglykol (DOPEG), der geringfügig vor dem großen Peak von Norepine­ phrin auftritt. Bei Zugabe von Maleinimid tritt keine derartige Peaküberlappung auf. Erfindungsgemäß wurde festge­ stellt, daß der DOPEG-Peak die genaue Konzentration wieder­ gibt.
Das erfindungsgemäße Meßverfahren stellt einen wichtigen Bei­ trag bei der Aufklärung von Erscheinungen, die sich mit dem Konzentrationsverhältnis von DOPEG und Norepinephrin und mit Neurozytomen befassen, dar. Da in diesem Bereich eine große Anzahl von Peaks auftritt, ist es bevorzugt, daß das zuge­ setzte Reagenz selbst keine Peaks aufweist.
Fig. 5 erläutert die Beziehung zwischen der Konzentration der Maleinimidlösung und der Ausschaltung der Störung bei Messung in einer Urinprobe. Wie ersichtlich, verursacht die Zugabe einer übermäßigen Menge an Maleinimid eine Beschränkung der Fluoreszenz-Induktionsreaktion, so daß die Konzentration der Maleinimidlösung vorzugsweise auf 10 bis 60 mMol/Liter, ange­ geben als Wert zum Zeitpunkt des Mischvorgangs, eingestellt werden soll. Wenn eine Hochpräzisionsmessung erforderlich ist, ist eine Konzentration von 20 bis 50 mMol/Liter bevor­ zugt.
Beispiel 2
5 ml Blut einer gesunden Person werden in einem Blutsammel­ röhrchen gewonnen. Unmittelbar danach wird das Blutplasma mit einer Zentrifuge abgetrennt. 1,5 ml davon werden in ein wei­ teres Röhrchen übertragen. Sodann wird das Blutplasma in ein Zentrifugensystem mit Ultrafiltrationsröhrchen (Fraktionierung des Molekulargewichts) gegeben. Im Vorbehand­ lungsverfahren wird Protein durch zentrifugale Abtrennung bei etwa 10 000 U/min abgetrennt. 1,0 ml Blutplasma, aus dem das Protein entfernt worden ist, wird in ein weiteres Teströhr­ chen gegeben und mit 100 µl 200 millimolarer Maleinimidlösung (pH-Wert 7,3) versetzt. Anschließend werden 400 ml einer 1%­ igen, mit Schwefelsäure angesäuerten Acetonitrillösung von 1,2-Diphenylethylendiamin und 400 µl eines wäßrigen Lösungs­ gemisches von Kaliumhexacyanoferrat(III) und Ammmoniummolyb­ dat zugesetzt. Sodann wird 5 Minuten auf 50°C erwärmt, um den Fluoreszenzinduktor zu bilden.
Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 wird eine Hochgeschwin­ digkeits-Flüssigchromatographie-Vorrichtung zur Abtrennung und Messung verwendet. Peaks, die bei Zugabe von N-Ethyl­ maleinimid auftreten, treten nicht in Erscheinung. Die Aus­ schaltung der Störwirkung betrug wie bei Urin fast 100%. Es ist sehr wahrscheinlich, daß sich die störende Komponente von der im Urin enthaltenen störenden Komponente unterscheidet.
Maleinimid war auch hier in der Lage, die Störung der Fluo­ reszenz-Induktionsreaktion auszuschalten.
Beispiel 3
Blutplasma wird zur Entfernung von Protein der gleichen Vor­ behandlung wie in Beispiel 2 unterzogen. Maleinimid und Lö­ sungsmedium werden in getrennten Glasfläschchen in verschlos­ senem Zustand aufbewahrt und unmittelbar vor der Verwendung vermischt und zugesetzt. Das Maleinimid läßt sich in ver­ schlossenem Zustand mehr als 6 Monate aufbewahren. Nach Auf­ lösung des Maleinimids erzielt man die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 2. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß sich auch dann stabile Ergebnisse erzielen lassen, wenn die beiden Substanzen über lange Zeit hinweg getrennt aufbewahrt werden.
Beispiel 4
Eine Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie-Vorrichtung der in Fig. 1 gezeigten Art wird zur Durchführung der Messung von Beispiel 1 mit einem selbsttätigen Probennehmer verbun­ den. Das Fläschchen mit der Maleinimidlösung und das Proben­ fläschchen werden mit selbsttätigen Probennehmerdüsen verse­ hen. Ein bestimmtes Volumen dieser Lösungen wird angesaugt und in das Mischfläschchen gegeben, wo ein Mischvorgang stattfindet. 200 µl einer 1%-igen, mit Schwefelsäure ange­ säuerten Acetonitrillösung von 1,2-Diphenylethylendiamin und 200 µl eines Lösungsgemisches von Kaliumhexacyanoferrat(III) und Ammoniummolybdat werden zu 500 µl des Probengemisches gegeben. Zur Bildung eines Fluoreszenzinduktors wird 5 Minu­ ten auf 50°C erwärmt. Sodann wird gemäß Beispiel 1 eine Tren­ nung in der Trennsäule vorgenommen. Man kommt zu identischen Ergebnissen wie in Beispiel 1.
Bei Verwendung von nicht-fluoreszierendem Maleinimid bei der Durchführung der Vorbehandlung vor der Messung von Cate­ cholaminen und ihren Metaboliten geht das Maleinimid eine Re­ aktion mit im Meßmedium vorhandenen Störsubstanzen ein, wo­ durch eine Störung durch diese Substanzen verhindert wird. Dieses Verfahren ermöglicht die Messung mit einer höheren Präzision als sie auf herkömmliche Weise möglich war, ohne daß das Maleinimid selbst einen Peak hervorruft.

Claims (10)

1. Verfahren zur fluorimetrischen Bestimmung von Catecholaminen und/oder deren Metaboliten in einer biologi­ schen Probe, wobei die Catecholamine und/oder deren Metabo­ lite in der biologischen Probe in einem Fluoreszenz-Indukti­ onsverfahren durch Behandlung mit einem die Fluoreszenz indu­ zierenden Reagenz in einen Fluoreszenzinduktor umgewandelt werden und der gebildete Fluoreszenzinduktor flüssigchromato­ graphisch abgetrennt und sodann gemessen wird, wobei Malein­ imid in einer bestimmten Menge zugesetzt wird, bevor die bio­ logische Probe fluoreszierend gemacht wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die biologische Probe in ein Probengefäß gebracht wird, das vorher mit einer bestimmten Menge an Maleinimid versetzt und mit einem Lö­ sungsmedium vermischt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß Maleinimid in fester Form und ein Lösungsmedium hierfür getrennt voneinander bereitgestellt und dann ver­ mischt werden, bevor die biologische Probe fluoreszierend ge­ macht wird.
4. Verfahren zur fluorimetischen Bestimmung von Catecholaminen und/oder deren Metaboliten nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Maleinimid in einer solchen Menge zugesetzt wird, daß die Konzentration nach dem Mischen mit der biologi­ schen Probe 10 bis 60 mMol/l beträgt.
5. Verfahren zur fluorimetrischen Bestimmung von Catecholaminen und/oder deren Metaboliten nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Maleinimid in einer solchen Menge zugesetzt wird, daß die Konzentration nach dem Mischen mit der biologi­ schen Probe 20 bis 50 mMol/l beträgt.
6. Verfahren zur fluorimetrischen Bestimmung von Catecholaminen und/oder deren Metaboliten nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Fluoreszenz-Induktionsreagenz mindestens einen der Bestandteile Ethylendiamin und 1,2-Diphenylethylen­ diamin enthält.
7. Vorrichtung zur fluorimetrischen Bestimmung von Catecholaminen und/oder de­ ren Metaboliten in einer Lösung einer biologischen Probe, ge­ kennzeichnet durch
  • 1) eine Probenabgabeeinrichtung mit der ein bestimmtes Volu­ men der biologischen Probe abgegeben werden kann,
  • 2) eine mit der Probenabgabeeinrichtung verbundene Vorbehand­ lungseinrichtung zur Vorbehandlung der biologischen Probe,
  • 3) eine Einrichtung, um die vorbehan­ delte biologische Probe mit einem die Fluoreszenz induzieren­ den Reagenz fluoreszierend zu machen und somit einen Fluores­ zenz-Indikator bereitzustellen,
  • 4) eine Trennsäule zur Adsorption und Abtrennung des Fluores­ zenzinduktors durch Chromatographie,
  • 5) eine Nachweiseinrichtung zum Nachweis der Fluoreszenzin­ tensität des durch die Trennsäule abgetrennten Fluoreszenzin­ duktors,
wobei die Vorrichtung mit einer Einrichtung zur Zugabe einer bestimmten Menge an Maleinimid entweder zur Probenabgabeein­ richtung oder zur Vorbehandlungseinrichtung für die biologi­ sche Probe versehen ist.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch einen Prozessor zur Berechnung und Speicherung der erfaßten Fluoreszenzintensität des Fluoreszenzinduktors und eine Ausgabeeinrichtung zur Ausgabe der im Prozessor gespeicherten Fluoreszenzintensität.
9. Reagenz zur fluorimetrischen Bestimmung von Catecholaminen und/oder deren Metaboliten in einer Lösung einer biologischen Probe gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das einen Reagenziensatz mit einem die Fluoreszenz induzierenden Stoff und einem Fluoreszenz- Indikator umfaßt, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Maleinimid in fester Form und einem Lösungsmedium für das Maleinimid, wobei die beiden Reagenzien vor der Verwendung vermischt werden können.
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