DE3872361T2

DE3872361T2 - Analytisches reagenzmischungsgeraet zur ausfuehrung von aufeinanderfolgenden analytischen reaktionen.

Info

Publication number: DE3872361T2
Application number: DE8888120324T
Authority: DE
Inventors: Mohammed A Kheiri; Joseph Mammolenti; David L Morris; George V Siddons; Ronald G Sommer
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1987-12-17
Filing date: 1988-12-06
Publication date: 1992-12-24
Anticipated expiration: 2008-12-07
Also published as: IL88073A0; NO885362D0; EP0320752B1; ES2032522T3; FI885798A0; ZA888323B; FI885798A; DK702888A; DE3872361D1; JPH01197658A; NO885362L; ATE77698T1; EP0320752A1; AU2416988A; DK702888D0

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf analytische Reaktionen zum Nachweis einer Bestimmungssubstanz in einer flüssigen Testprobe. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Bestimmung eines Analyt in einer flüssigen Testprobe, wobei Reaktionen zwischen dem Analyt und Analysereagentien eingeschlossen sind, welche verschiedene Handhabungsstufen erforderlich machen, wie Zeitspannen der Inkubation und Vermischung, um eine solche Bestimmung durchzuführen.
Verschiedene analytische Verfahrensweisen entwickelten sich aus dem Bedürfnis, die Menge eines Analyt in einer flüssigen Testprobe zu bestimmen. Insbesondere sind verschiedene klinische Assays entwickelt worden, um beispielsweise therapeutische Arzneimittelgehalte in biologischen Flüssigkeiten bei Patienten zu überwachen und aufzuzeichnen, die mit diesen Arzneimitteln gegen verschiedene Krankheiten und Beschwerden behandelt wurden. In typischer Weise werden diese klinischen Assays angewandt, um Toxizität und Unangemessenheit der therapeutischen Reaktion zu bewerten und um eine Dosierungsanpassung zu ermöglichen, bis eine angemessene Reaktion erreicht ist, insbesondere dort, wo eine merkliche Überlappung zwischen toxischer und therapeutischer Konzentration für eine besondere Arznei gegeben ist.
Solche analytischen Verfahren und klinischen Assays machen allerdings oft komplizierte, teure Instrumente und gut ausgebildete, erfahrene Techniker für deren Durchführung erforderlich. Wird bei diesen Bestimmungsverfahren die Verwendung solch komplizierter Instrumente nicht unbedingt benötigt, machen diese Assays und Verfahren im weiteren dennoch häufig die Durchführung aufeinander folgender Reaktionen erforderlich. Wegen der Abfolgenatur des Assayprotokolls sind eine Anzahl zeitaufwendiger und aufeinanderfolgender Handhabungsstufen erforderlich, wie Pipettieren, Zeitspannen der Inkubation, Trennungsstufen und dgl., die Zeit kosten und unannehmbaren Fehlerquellen unterworfen sind, welche zu ungenauen Ergebnissen führen können.
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein bequemes Verfahren und eine entsprechende Vorrichtung zur Durchführung aufeinanderfolgender analytischer Reaktionen bereitzustellen, welche eine minimale Anzahl an Handhabungsstufen benötigen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine preisgünstige Vorrichtung zur Durchführung aufeinanderfolgender analytischer Reaktionen zur Verfügung zu stellen, die einfach zu handhaben ist.
Ferner ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung aufeinanderfolgender analytischer Reaktionen zur genauen Bestimmung eines Analyt aus einer flüssigen Testprobe bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein analytisches Reagensmischungsgerät zur Durchführung aufeinanderfolgender analytischer Reaktionen, wie Immunoassays, zur Verfügung, wobei ein nachweisbares Signal geliefert wird, das gemessen und mit der Menge eines in einer flüssigen Testprobe vorliegenden Analyt korreliert wird. Typischerweise schließen diese Analysereaktionen Analysereagentien ein, die aufeinanderfolgend mit einer flüssigen Testprobe kombiniert werden, dabei wird eine Anzahl von Inkubations-, Pipettier- und Vermischungsstufen benötigt, um eine solche Bestimmung durchzuführen. Sind beispielsweise zwei Analysereagentien beteiligt, ist es oft notwendig, eines der Reagentien mit der flüssigen Testprobe zu kombinieren, vermischen und inkubieren und dann das andere Reagens hinzuzufügen, woran sich entsprechende zusätzliche Vermischungs- und Inkubationsstufen anschließen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung läßt sich in dem analytischen Reagensmischungsgerät diese Vermischung und Inkubation automatisch durchführen, um ein einfaches, bequemes und zeitsparendes Verfahren zur Ausführung dieser analytischen Reaktionen an die Hand zu geben. Insbesondere umfaßt das analytische Reagensmischungsgerät eine Anordnung für Analysereagentien, enthaltend erste und zweite offene Behältnisse mit darin beaufschlagten ersten und zweiten Analysereagentien und einen Deckelteil, der mit den Behältnissen in flüssigkeitsdichter Weise verbunden ist, sowie Elemente zur Rotation des Analysereagensgeräts. Der Deckelteil schließt Elemente zur Bereitstellung einer offenen flüssigen Verbindung zwischen den ersten und zweiten Behältnissen ein, wie eine gemeinsame Kammer oder einen Kanal, um den Transfer und die Vermischung der ersten und zweiten Analysereagentien zwischen den ersten und zweiten Behältnissen zu erleichtern. Das Element zur Rotation des Analysereagensgeräts vermag die Analysereagensanordnung in Drehung zu versetzen, vorzugsweise in abwechselnden Richtungen im und gegen den Uhrzeigersinn, um die Analysereagentien zu handhaben, wobei, abhängig vom Grad der Rotation des Analysereagensgeräts, die Analysereagentien entweder in ihren jeweiligen Behältnissen verbleiben und getrennt vermischt oder dazu veranlaßt werden, durch die Elemente zur Bereitstellung einer offenen flüssigen Verbindung zu fließen und dadurch übertragen und zwischen den Behältnissen vermischt zu werden. Insbesondere ist diese Handhabung der analytischen Reagentien das Ergebnis der Drehung des Analysereagensgeräts in einer Ebene, die durch die Längsachsen der Reagensbehältnisse festgelegt ist, sowie der Drehung um eine Drehachse, die durch einen Punkt festgelegt ist, der die Ebene schneidet. Wenn es beispielsweise erwünscht ist, die Analysereagentien in ihren jeweiligen Behältnissen zu halten und getrennt zu vermischen, wird das Analysereagensgerät um die Rotationsachse um weniger als ca. 90º relativ zur senkrechten Achse gedreht, um die Analysereagentien daran zu hindern, zwischen den Behältnissen durch den Deckelteil zu fließen. Wenn es, alternativ dazu, erwünscht ist, die Analysereagentien miteinander zu vermischen, wird das Analysereagensgerät um die Rotationsachse um mehr als ca. 90º relativ zur vertikalen Achse oder, bevorzugter, um eine volle Umdrehung oder eine Reihe von Umdrehungen (360º) um die Rotationsachse gedreht, wodurch die Analysereagentien veranlaßt werden, durch den Deckelteil zu fließen und sich miteinander zwischen den Behältnissen zu vermischen.
Es sollte klar sein, daß gemäß der vorliegenden Erfindung der Deckelteil ein Element bereitstellt, um die Analysereagentien zwischen den Reagensbehältnissen zu übertragen und zu vermischen und dadurch die umständlichen von Hand ausgeführten Pipetierungsstufen auszuschließen, die andernfalls für den Transfer und das Vermischen der Analysereagentien notwendig wären. Demgemäß soll die Handhabung der Analysereagentien jede Bewegung des Analysereagensgeräts einschließen, die die Analysereagentien getrennt in ihren jeweiligen Behältnissen hält und vermischt und die, falls gewünscht, die Analysereagentien dazu veranlaßt, durch das Element zur Bereitstellung einer offenen Verbindung zu fließen.
Das analytische Reagensmischungsgerät umfaßt ferner Zeitgebungselemente, wie einen Mikroprozessor oder einen Computer, die programmiert sind, um Anzahl, Richtung und Zeitspannen dieser Drehbewegungen zu steuern, wie auch Zeitspannen stationärer Inkubationsstellungen. Vorzugsweise sind das Analysereagensgerät, das Element zur Rotation des Analysereagensgerätes und das Zeitgebungselement in einem Gehäuse untergebracht, innerhalb dessen die Analysereaktionen durchgeführt werden können.
Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine erste flüssige Reaktionsmischung im ersten Behältnis gebildet, indem man die flüssige Testprobe dem ersten Analysereagens zufügt, und der Deckelteil wird mit den Behältnissen in flüssigkeitsdichter Weise verbunden, um das Analysereagensgerät der vorliegenden Erfindung bereitzustellen. Das Gerät wird dann gedreht oder anderweitig über einen vorbestimmten Zeitraum gehandhabt, wobei die erste flüssige Reaktionsmischung im ersten Behältnis gehalten und getrennt gemischt wird, und dann wird das Gerät gedreht oder anderweitig über einen vorbestimmten Zeitraum gehandhabt, wodurch die erste flüssige Reaktionsmischung und das zweite Analysereagens den Deckelteil durch das Element für die offene flüssige Verbindung durchqueren und dadurch miteinander zwischen den Behältnissen vermischt werden, um eine entsprechende zweite flüssige Reaktionsmischung zu bilden. Nach einer vorbestimmten Zeitspanne werden das durch die zweite flüssige Reaktionsmischung gelieferte Nachweissignal oder ein daraus abgezogener Anteil gemessen und mit der Menge eines in der flüssigen Testprobe vorliegenden Analyt in Beziehung gesetzt.
Fig. 1 stellt eine aufgegliederte Frontansicht des Analysereagensgeräts dar.
Fig. 2 stellt eine aufgegliederte Seitenansicht des Analysereagensgeräts dar, genommen entlang der Linie 2-2 von Fig. 1.
Fig. 3 stellt eine Frontansicht im Querschnitt des Analysereagensgeräts dar.
Fig. 4 stellt eine Bodenansicht des Analysegeräts dar, genommen entlang Linie 4-4 von Fig. 1.
Fig. 5 stellt eine Ansicht der Oberseite des Analysereagensgeräts dar, genommen entlang Linie 5-5 von Fig. 1.
Fig. 6 stellt eine perspektivische Teilansicht des nahen Endes eines Einsatzes zur Halterung eines oder mehrerer Analysereagensgeräte dar.
Fig. 7 ist eine Perspektivsicht des analytischen Reagensmischungsgerätes, das in ein Gehäuse eingebracht ist.
Fig. 8 ist eine Querschnittsseitenansicht einer Filtrationsvorrichtung, teilweise eingebracht in ein offenes Behältnis des Analysereagensgeräts zur Entfernung eines Teils der zweiten Reaktionsmischung gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung.
Fig. 9 ist eine Querschnittsseitenansicht der in Fig. 8 gezeigten Filtrationsvorrichtung, die weiter in das offene Behältnis eingeführt ist.
Fig. 10 stellt ein Diagramm dar, das eine Dosisreaktion auf Digoxin veranschaulicht, erzeugt in einem aufeinanderfolgenden immunometrischen Assay, durchgeführt durch Anwendung des analytischen Reagensmischungsgeräts der vorliegenden Erfindung.

Analysegerät

Indem nun auf Fig. 1 und 2 Bezug genommen wird, umfaßt das Analysegerät 10 der vorliegenden Erfindung einen Deckelteil 11, erste und zweite Behältnisse 12 bzw. 13, die an ihren oberen Enden offen sind und erste und zweite Analysereagentien (nicht gezeigt) darin enthalten, einen Behälter 14 für die Behältnisse sowie einen Einsatzrahmen 15 für den Behälter für die Behältnisse, welche, wie in Fig. 3 gezeigt, zusammengebaut werden können. Vorzugsweise sind die Behältnisse 12 und 13 an ihren oberen Enden mit Gewinden versehen, um mit Gewinden versehene Verschlußteile (nicht gezeigt) aufnehmen zu können, um ein Verschütten der darin enthaltenen Analysereagentien vor dem Zusammenbau des Analysegeräts 10 zu verhindern, zu welchem Zeitpunkt die Verschlußkappen entfernt werden.
Indem nun auf Fig. 3 Bezug genommen wird, schließt der Gefäßbehälter 14 erste und zweite Hohlräume 16 und 17 mit Abmessungen ein, die geringfügig größer als die Abmessungen der Behältnisse 12 und 13 sind, in welche die Behältnisse 12 und 13 aufgenommen werden. Der Gefäßbehälter 14 ist angepaßt, um vom Einsatzrahmen 15 aufgenommen zu werden, dessen innere Abmessungen geringfügig größer als die Abmessungen des Beählters 14 sind. Der Einsatz 15 schließt einen Pflock 18 ein, der in eine Bohrung 19 im unteren Teil 20 des Gefäßbehälters 14 paßt (Fig. 4). Da der Gefäßbehälter 14 nur mit dem in die Bohrung 19 eingeführten Pflock 18 durch Einsatz 15 sauber aufgenommen werden kann, sind die Orientierung der Behältnisse 12 und 13 im Gefäßbehälter 14 und daher die jeweils enthaltenen Analysereagentien gesichert.
Der Deckelteil 11 des Gerätes 10 umfaßt einen unteren Basisteilbereich 21 mit ersten und zweiten Schulteröffnungen 22 und 23 sowie eine offene Kammer 24, die durch eine kuppelförmige Aussenwand 25 abgeschlossen ist. Wäscher 26 und 27 werden in die Schulterstücke 28 und 29 der Öffnungen 22 und 23 eingebracht und passen auf und an die oberen Enden der Behältnisse 12 bzw. 13. Die Öffnungen 22 und 23 öffnen sich in die offene Kammer 24 und stehen in direkter Verbindung miteinander durch die offene Kammer 24, um ein Element zum Flüssigkeitsdurchfluß zwischen den ersten und zweiten Behältnissen 12 und 13 bei entsprechender Anbringung bereitzustellen. Wie weiter unten in größerem Detail beschrieben wird, durchqueren die in die ersten und zweiten ofenen Behältnisse 12 und 13 gegebenen Analysereagentien die offene Kammer 24 nur, wenn das Gefäß 10 mittels Drehung hinreichend gedreht wird.
Der Deckeltel 11 weist ferner erste und zweite Schlitze (30 und 31) Fig. 5 auf, die an den entgegengesetzten Enden des Basisteils 21 angeordnet sind. Die Schlitze 30 und 31 sind passend verbindbar mit ersten und zweiten Zackenstücken 32 bzw. 33 des Einsatzes 15, um den Deckelteil 11 auf den ersten und zweiten Behältnissen 12 und 13 in einer flüssigkeitsdichten Weise wieder ablösbar zu befestigen. Insbesondere (Fig. 6) wird das erste Zackenstück 32 an seinem unteren Ende an eine vertiefte Schulter 34 montiert, die am oberen Ende der Seitenwand 35 des Einsatzes 15 angebracht ist, um eine sprungartige Seitenbewegung zu ergeben, wenn Druck auf die Aussenoberfläche ausgeübt wird. In ähnlicher Weise wird das gleiche Zackenstück 33 an seinem unteren Ende an das obere Ende der Seitenwand 36 des Einsatzes 15 montiert und daran befestigt, so daß sich nur eine geringe oder keine Seitenbewegung ergibt. Die Zackenstücke 32 und 33 schließen Flanschteile 37 und 38 an ihren oberen Enden ein und weisen Abmessungen auf, welche nur geringfügig kleiner und deshalb zur Einführung in die Schlitze 30 und 31 des Deckelteils 11 befähigt sind. Es sollte klar sein, daß der Abstand zwischen den Schlitzen 30 und 31 geringfügig größer als der Abstand zwischen den Zackenstücken 32 und 33 des Einsatzes 15 ist. Um den Deckelteil 11 auf den Behältnissen 12 und 13 zu befestigen, werden das Zackenstück 33 zuerst mit dem Schlitz 31 zusammengebracht und dann der Flansch 38 durch den Schlitz 31 geführt, wodurch die Unterseite 39 von Flansch 38 auf der Oberseite 40 des Basisteils 21 des Deckelteils ruht. Um das Zackenstück 32 mit Schlitz 30 zusammenzubringen, wird Druck auf die Aussenseite des Zackenstücks 32 mit z.B. einem Finger ausgeübt und eine Bewegung nach innen ausgeführt, bis Flansch 37 vom Zackenstück 32 mit Schlitz 30 zusammengebracht ist, dann wird das ganze entsprechend eingereiht. Läßt der auf der Aussenseite des Zackenstücks 32 ausgeübte Druck nach, bewegt sich das Zackenstück 32 nach aussen, um in seine bezüglich des Schlitzes 30 unverbundene Position zurückzukehren, wodurch die Aussenseite von Zackenstück 32 gegen die entfernte Innenseite 41 von Schlitz 30 drückt, um einen nach aussen gerichteten Druck dagegen auszuüben, und die Unterseite 44 von Flansch 37 ruht auf der Oberseite 45 des Basisteils 21. Es sollte klar sein, daß der durch die Aussenseite von Zackenstück 32 gegen die entfernte Innenseite 41 von Schlitz 30 ausgeübte Druck zur Seitenbewegung des Deckelteils 11 führt, wodurch ein ähnlicher Druck durch die nahe Innenseite 46 von Schlitz 31 gegen die Innenseite 47 von Zackenstück 33 ausgeübt wird. Demzufolge wird der Deckelteil 11 auf den Behältnissen 12 und 13 in einer flüssigkeitsdichten Weise befestigt. Wenn es nötig ist, den Deckelteil 11 zu entfernen, wird auf ählniche Weise Druck auf die Aussenseite von Zackentück 32 angewandt, um den dadurch ausgeübten Druck freizusetzen und das Zackenstück 32 mit Schlitz 30 zusammenzubringen, und der Deckel wird dadurch, wie oben beschrieben, herausgezogen.
Es sollte klar sein, daß, obwohl das Analysegerät 10 wie vorstehend beschrieben worden ist, Abänderungen durchgeführt werden können, ohne von den Lehren der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Beispielsweise können einer oder beide der Behältnisse 12 und 13 in den Gefäßbehälter 14 als integrale Bestandteile davon geformt werden. Alternativ dazu, kan der Einsatz 15 angepaßt werden, um die Behältnisse 12 und 13 aufzunehmen, und zar ohne die Verwendung des Gefäßbehälters 14, wobei der Deckelteil 11 an den Zackenstücken 32 und 33 des Einsatzes 15 mit den dazwischen angeordneten Behältnissen 12 und 13 wie oben beschrieben befestigt wird. Darüber hinaus können Gestalt und Abmessung der Behältnisse 12 und 13 wie auch die entsprechende Gestalt und die Abmessungen der Hohlräume 16 und 17 im Gefäßbehälter 14 variieren und sind nicht unbedingt auf deren Gestalt und Abmessungen, wie sie aufgezeigt wurden, beschränkt. Ausserdem kann der Einsatz 15 angepaßt werden, um mehr als eines der Analysegerät 10 (Fig. 7) aufzunehmen, um die gleichzeitige Durchführung von Analysereaktionen unter Einschluß einer Anzahl von flüssigen Testproben zu ermöglichen, wie weiter unten in größerem Detail beschrieben wird. Alternativ dazu, kann das Analysgerät 10, wenn mehr als 2 Analysereagentien zur Durchführung einer besonderen Analysereaktion benötigt werden, modifiziert werden, um zusätzliche Reagensbehältnisse aufzunehmen, wobei der entsprechende Deckelteil 11 angepaßt wird, um eine offene Verbindung mit und zwischen diesen zusätzchen Reagensbehältnissen und den Behältnissen 12 und 13, wie oben beschrieben, herzustellen.

Drehvorrichtung

Erfindungsgemäß wird die Handhabung der in die Behältnisse 12 und 13 gegebenen Analysereagentien mit einer Vorrichtung zur Drehung des Analysereagensgerätes 10 durchgeführt, wodurch die Analysereagentien, abhängig vom Grad der Drehung des Analysegeräts 10 relativ zur Senkrechten, entweder in den Behältnissen 12 und 13 gehalten und getrennt vermischt oder zwischen den Behältnissen 12 und 13 durch die offene Kammer 24 des Deckelteils 11 übertragen und vermischt werden können. Insbesondere dreht die Vorrichtung zur Rotation des Analysereagensgerätes 10 das Gerät 10 in einer Ebene, die durch die Längsachsen der Behältnisse 12 und 13 festgelegt ist, und um eine Drehachse, die durch einen Punkt, der die Ebene durchschneidet, festgelegt ist. Demzufolge wird das Gerät 10, um die Analysereagentien in ihren jeweiligen Behältnissen 12 und 13 zu halten und deren vorzeitige Vermischung zu verhindern, um die Drehachse um weniger als ca. 90º relativ zur Senkrechten, vorzugsweise um ca. 60º, relativ zur Senkrechten, gedreht. Alternativ dazu, wird das Gerät 10, wenn es erwünscht ist, das erste oder zweite der Analysereagentien zum Durchfluß durch die offene Kammer 24 in das eine oder andere der Behältnisse 12 oder 13 zu veranlassen, um dadurch deren Vermischung zu ergeben, um mehr als ca. 90º relativ zur Senkrechten, vorzugsweise mehr als ca. 180º, noch bevorzugter um 360º relativ zur Senkrechten, gedreht.
Vorzugsweise wird das Analysereagensgerät 10, wenn es erwünscht ist, die Analysereagentien, wie oben beschrieben, getrennt zu halten und zu vermischen, in abwechselnden Drehrichtungen im und gegen den Uhrzeigersinn gedreht, um dabei das Gerät um weniger als ca. 90º relativ zur Senkrechten in der jeweiligen Richtung hin- und herschwingen zu lassen. In ähnlicher Weise läßt man das Gerät 10, wenn es erwünscht ist, die Analysereagentien, wie oben beschrieben, zu übertragen und zu vermischen, um mehr als ca. 90º relativ zur Senkrechten in der jeweiligen Richtung hin- und herschwingen, vorzugsweise um eine oder mehrere vorbestimmte Umdrehungszahlen, d.h. um 360º in der jeweiligen Richtung.
Es sollte klar sein, daß der Grad der Drehung des Analysegeräts im Hinblick auf die Durchführung der angestrebten Handhabung der Analysereagentien und der flüssigen Testprobe, wie oben beschrieben, natürlich von deren Volumen abhängt, wie auch von den Innenabmessungen oder dem Flüssigkeitsaufnahmevermögen der Behältnisse 12 und 13. Demgemäß soll der relative Drehgrad des Analysereagensgeräts 10 nicht auf die hier beschriebenen Drehgrade beschränkt sein, sondern er kann jederzeit von einem Fachmann auf der Grundlage der vorstehenden Überlegungen bestimmt werden, ohne von den Lehren der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Erfindungsgemäß umfaßt die Vorrichtung zur Drehung des Analysereagensgerätes 10 einen Antriebsmechanismus, wie z.B. einen Stufenmotor und eine Antriebswelle, welche die vorher beschriebenen Drehbewegungen zu veranlassen vermögen. Insbesondere ist dieser Antriebsmechanismus (nicht gezeigt) an eine Schaftwelle 48 gekuppelt, die an der nahen Seitenwand 49 des Einsatzes 15 (Fig. 6) angeordnet ist, wie durch den Antriebsschaft des Antriebsmechanismus. Die Achse der Schaftwelle 48 durchschneidet die Ebene, die durch die Längsachsen der Behältnisse 12 und 13 festgelegt ist, um die wie oben beschriebene Rotationsachse zu ergeben, um die das Gerät 10 gedreht wird. Es sollte klar sein, daß die durch die Schaftwelle 48 gegebene Rotatioansachse nicht auf Lage oder Ort der Schaftwelle 48 am Einsatz 15, wie dies gezeigt ist, beschränkt ist. Insbesondere kann der Schnittpunkt der Ebene, d.h. die Rotationsachse, an jeden Punkt entlang der Ebene liegen, die durch die Längsachsen der Behältnisse 12 und 13 festgelegt ist, natürlich vorausgesetzt, daß die gewünschte Drehung des Analysereagensgeräts 10 dennoch durchgeführt werden kann, um Vermischung und Transfer der Analysereagentien zwischen den Behältnissen 12 und 13, wie oben beschrieben, zu veranlassen.
Die Drehbewegungen des Geräts 10 können durch Zeitgebungselemente (nicht gezeigt), wie ein programmierter Computer, Mikroprozessor und dgl., gesteuert werden, um den Antriebsmechanismus bei einer vorbestimmten Geschwindigkeit, vorzugsweise zwischen ca. 10 und 45 U.p.m., noch bevorzugter zwischen 15 und ca. 30 U.p.m., anzutreiben, wie auch zur Steuerung von Richtung- und Zeitablauf des Drehmechanismusvorgangs. Wie der Fachmann verstehen wird, soll diese vorbestimmte Geschwindigkeit nicht wie hierin beschrieben beschränkt sein, sie hängt von den Erfordernissen der besonderen durchzuführenden Analysereaktion ab. Vorzugsweise ist der Antriebsmotor dazu befähigt, an vorbestimmten Positionen umzudrehen und anzuhalten, und kann durch einen Sensor (nicht gezeigt) überwacht werden, wie einem auf dem Fachgebiet bekannten Sensor, um die Drehstellung des Antriebsmotors und des Antriebsschafts zu erfassen. Der Sensor liefert Information an den Steuerstromkreis des Zeitgebungselements zum Zweck der Bestimmung der Anfangspositon des Antriebsmechanismus, d.h. aufrechte Stellung des Geräts 10, wie in Fig. 3 gezeigt, und zur Bestimmung des Grades der Drehung des Geräts 10 relativ zur Anfangsstellung sowie zur Bestimmung, ob eine fehlerhafte Drehstellung während des Drehablaufs eingetreten ist. Demgemäß sind Antriebsmechanismus und Zeitgebungselement, abhängig von der besonderen, durchzuführenden Analysereaktion, dazu befähigt, die notwendige Anzahl und Richtung der Drehbewegungen des Geräts 10 über einen vorbestimmen Zeitraum zu ergeben, wie auch Zeiträume einer Nicht-Bewegung, in denen eine oder mehrere stationäre Positionen des Geräts 10 erwünscht sind, um die Analysereagentien inkubieren zu lassen.
Indem nun auf Fig. 7 Bezug genommen wird, umfaßt das analytische Rreagensmischungsgerät 50 der vorliegenden Erfindung vorzugsweise das Analysereagensgerät 10, den Antriebsmechanismus und das Zeitgebungselement, welche in einem Schutzgehäuse 51 untergebracht sind. Insbesondere sind Antriebsmechanismus und Zeitgebungselement innerhalb eines Körpers 52 des Gehäuses 51 und das Analysereagensgerät 10 innerhalb einer Zugriffsfläche 53 des Gehäuses 51 unterhalb eines Zugriffsdeckels 54 angeordnet. Vorzugsweise kann der Zugriffsdeckel 54 durchsichtig und elektromechanisch gesteuert werden, um eine Verschlußautomatik während des Betriebs der Vorrichtung 50 bereitzustellen. Es sollte klar sein, daß der Einsatz 15 wie geziegt abgeändert werden kann, um Analysereaktionen, unabhängig, an einer Anzahl von flüssigen Testproben gleichzeitig durchzuführen. Ist es beispielsweise erwünscht, Analysereaktionen gleichzeitig an vier flüssigen Testproben durchzuführen, umfaßt das Analysereagensgerät 10 den Einsatz 15 mit vier Sätzen von Zackenstücken 32 und 33, vier Deckelteilen 11, vier Sätzen von Behältnissen 12 und 13 sowie vier Behältnishalterungen 14, angeordnet wie oben beschrieben. Der Einsatz 15 schließt ferner eine zweite Schaftwelle 55 ein, die an der entfernten Seitenwand 56 des Einsatzes 15 angeordnet ist und in derselben Rotationsachse der an der nahen Seitenwand 49 (Fig. 6) des Einsatzes 15 angeordneten Schaftwelle 48 liegt, und welche an der inneren Oberfläche 57 der Seitenwand 58 des Gehäuses 51 rotierbar montiert ist.
Das Gehäuse 51 kann ferner ein Schaltbrett 59 einschleißen, das angebracht werden kann, um z.B. Schalter und Anzeigelämpchen zur Steuerung und Überwachung der Betriebsweise der analytischen Reagensmischungsvorrichtung 50 aufzunehmen.

Verfahren

Die Analysereagensmischungsvorrichtung 50 der vorliegenden Erfindung läßt sich zur Durchführung aufeinanderfolgender analytischer Reaktionen zwischen einem Analyt in einer flüssigen Testprobe und Analysereagentien, insbesondere Immunoassays, verwenden, wobei ein nachweisbares Signal geliefert wird, das gemessen und mit der Menge an in der flüssigen Testprobe vorliegendem Analyt in Zusammenhang gebracht wird. Sobald die flüssige Testprobe dem ersten Behältnis 12 des wie oben beschriebenen Analysereagensgeräts 10 zugefügt ist, lassen sich insbesondere in der Analysereagensmischungsvorrichtung 50 der vorliegenden Erfindung die gewünschten Vermischungs- und Inkubationsstufen wie vorher beschrieben durchführen. Sobald die Flüssigtestprobe zugefügt und der Deckelteil 11 wie oben beschrieben befestigt sind, besteht demzufolge die einzige zusätzliche Stufe danach in der Messung des Nachweissignals, das durch die zweite flüssige Reaktionsmischung gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren geliefert wird. Diese Messung kann mit der Reaktionsmischung stattfinden, die in einem Behältnis verbleibt, oder indem man alles oder mindestens einen Teil der Mischung herausnimmt und die Messung ausserhalb des Reagensgerätes durchführt. Es sollte klar sein, daß die Dreh- und Inkubationsperioden, einschließlich deren geordneter Abfolge und Zeitdauer, abgeändert werden können, um eine gewünschte Analysereaktion durchzuführen, die eine besondere Reihenfolge und/oder Zeitdauer von z.B. verschiedenen Mischungs - und Inkubationsstufen benötigt.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung läßt sich die Analysereagensmischungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung besonders gut zur Durchführung eines sequentiellen immunometrischen Assay verwenden, der die Bindung zwischen dem Analyt, einem markierten Reagens, enthaltend ein mit einer nachweisbaren chemischen Gruppe markiertes Anti-Analyt-Antikörperreagens und einer immobilisierten Form des Analyt oder eines bindenden Analogs davon einschließt. Gemäß dieses Assay wird die Menge des markierten Antikörperreagens, die an den Analyt aus der flüssigen Testprobe oder daran gebunden ist, was an die immobilisierte Form des Analyt gebunden ist, bestimmt und zur Menge an in der flüssigen Testprobe vorliegendem Analyt in Beziehung gebracht.
Die Antikörperkomponente des Antikörperreagens kann ein ganzer Antikörper, wie jede der Klassen und Unterklassen bekannter Immunoglobuline, z.B. IgG, IgM und dgl., oder monovalente und divalente Antikörperfragmente von IgG sein, gewöhnlich bekannt als Fab und Fab', bzw. F(ab')&sub2;. Vorzugsweise ist der Antikörper gewöhnlich ein divalentes Antikörper-Fragment (F(ab')&sub2;) oder noch bevorzugter ein monovalentes Antikörperfragment (Fab oder Fab'). Divalente und monovalente IgG Antikörperfragmente können gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren erhalten werden, und zwar unter Anwendung proteolytischer Standardabbauverfahren mit Pepsin oder Papain.
Die nachweisbare chemische Gruppe des markierten Reagens kann jedes Material mit einer nachweisbaren physikalischen oder chemischen Eigenschaft sein. Diese Materialien sind auf dem Gebiet der Immunoassays gut entwickelt, und im allgemeinen kann jede in diesen Verfahren verwendbare Markierung in der vorliegenden Erfindung angewandt werden. Beispielsweise sind solche chemischen Gruppen mit nachweisbaren physikalischen Eigenschaften jene Gruppen, die auf der Basis ihrer eigenen physikalischen Eigenschaften nachgewiesen werden, welche eine chemische Reaktion oder Wechselwirkung mit einer anderen Chemikalie oder Substanz nicht benötigen, um ein nachweisbares Signal zu liefern, wie fluoreszierende Mittel, phosphoreszierende Moleküle, Chromophore, Radioisotope, Spinmarkierungen oder elektroaktive Gruppen. Chemische Gruppen mit nachweisbaren chemischen Eigenschaften sind jene Gruppen, die auf der Basis ihrer eigenen chemischen Reaktivität oder Wechselwirkung mit einer Nachweiskomponente dafür nachgewiesen werden, um ein nachweisbares Signal zu liefern. Diese chemischen Gruppen mit nachweisbaren chemischen Eigenschaften erzeugen kein nachweisbares Produkt oder liefern sonst ein nachweisbares Signal, bevor sie mit dieser Nachweiskomponente wechselwirken, und sie schließen enzymatisch aktive Gruppen, wie Enzyme, Enzymsubstrate, Coenzyme, Enzyminhibitoren und -aktivatoren, chemilumineszente Spezies, chemische Katalysatoren, Metallkatalysatoren, Enzymtunnelsubstanzen, Fluorophorquencher oder Energietransferpaare und spezifisch bindbare Liganden wie Biotin oder ein Hapten ein.
Die immobilisierte Form des Analyt oder Bindungsanalogs davon ist eine abtrennbare, vorzugsweise filtrierbare Spezies, enthaltend den Analyt oder ein Bindungsanalog davon, immobilisiert an einer festen Unterlage, wie einem unlöslichen Teilchen, und zwar gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren. Geeignete unlösliche Teilchen liegen im allgemeinen in der Form einer Perle oder Mikrokugel vor, obwohl andere Konfigurationen angewandt werden können, die dazu befähigt sind, von einem jeden markierten Reagens abgetrennt zu werden, das an den Analyt aus der flüssigen Testprobe wie oben beschrieben gebunden ist.
Zur Durchführung dieses immunometrischen Assay unter Anwendung der Analysereagensmischungsvorrichtung 50 der vorliegenden Erfindung werden das erste offene Behältnis 12 mit dem markierten Reagens und das zweite offene Behältnis 13 mit der immobilisierten Form des Analyt, entweder in flüssiger oder trockener Form, z.B. lyophilisiert, versehen. Es wird eine erste flüssige Immunoassayreaktionsmischung im ersten offenen Behältnis 12 gebildet, und zwar in einer stationären, im wesentlichen aufrechten Stellung, indem man die flüssige Testprobe zufügt, dann wird der Deckelteil 11 mit den ersten und zweiten offenen Behältnissen 12 und 13, wie oben beschrieben, verbunden. Das Analysereagensgerät 10 wird dann rotiert, vorzugsweise in abwechselnden Drehrichtungen in und gegen den Uhrzeigersinn, und zwar ca. 5 bis ca. 300 Sekunden, vorzugsweise ca. 30 bis ca. 180 Sekunden, lang, um Analyt und markiertes Reagens im ersten Behältnis 12 zu halten und gesondert zu vermischen, und dann wird in einer stationären, im wesentlichen aufrechten Stellung ca. 5 bis ca. 600, vorzugsweise ca. 180 bis ca. 420, Sekunden lang inkubiert. Das Gerät 10 wird dann gedreht, vorzugsweise in abwechselnden Drehrichtungen im und gegen den Uhrzeigersinn, und zwar ca. 5 bis ca. 600, vorzugsweise ca. 180 bis ca. 420, Sekunden lang, wodurch die erste Reaktionsmischung die offene Kammer 24 des Deckelteils 11 durchquert und in das zweite Behältnis 13 fließt, das die immobilisierte Form des Analyt enthält, um eine zweite flüssige Reaktionsmischung davon zu bilden. Die zweite Reaktionsmischung wird dann zwischen dem ersten und zweiten Behältnis 12 und 13 durch die offene Kammer 24 durch anschließende Rotationsbewegungen des Geräts 10 vermischt.
Es sollte klar sein, daß die Zeiträume, während denen die ersten und zweiten Reaktionsmischungen gedreht und inkubiert werden, schwanken, abhängig von der Natur und/oder den Assayerfordernissen der besonderen, eingesetzten Analysereagentien, wie z.B. der Bindungskinetik eines besonderen Antikörpers und Analyts, die in einem Immunoassay eingesetzt werden. Sie sollen deshalb nicht auf die oben beschriebenen Zeiträume beschränkt sein. Wie dies für einen Fachmann klar ist, werden beispielsweise zur Durchführung eines wie oben beschriebenen immunometrischen Assay der Analyt und das markierte Reagens, d.h. die erste flüssige Reaktionsmischung , über einen hinreichenden Zeitraum vermischt und inkubiert, um die Bindung von im wesentlichen allem vorliegenden Analyt an das markierte Reagens zu ermöglichen. In ähnlicher Weise werden die erste flüssige Reaktionsmischung und die immobilisierte Form des Analyt, d.h. die zweite flüssige Reaktionsmischung, enthaltend den an das markierte Reagens gebundenen Analyt, freies oder ungebundenes markiertes Reagens und die immobilisierte Form des Analyt, einen hinreichenden Zeitraum lang vermischt, um die Bindung von im wesentlichen allem freien markierten Reagens an die immobilisierte Form des Analyt zu ermöglichen, um jeweils auftrennbare freie und gebundene Spezies davon zu ergeben.
Sobald die Vorrichtung 10 den gewünschten Zeitraum lang, wie oben beschrieben, gedreht worden ist, wird deren Drehung in einer im wesentlichen aufrechten Position angehalten. Der Deckelteil 11 wird dann abgenommen und es werden mindestens ein Teil der zweiten flüssigen Reaktionsmischung herausgenommen und das nachweisbare Signal entweder von der freien Spezies oder der gebundenen Spezies des markierten Reagens gemäß bekannter Verfahren gemessen und mit der Menge an in der flüssigen Testprobe vorliegendem Analyt korreliert. Wenn beispielsweise die Dichte der Partikel der immobilisierten Form des Analyt wesentlich größer als die Dichte des flüssigen Anteils der zweiten flüssigen Reaktonsmischung ist, scheidet sich die immobilisierte Form des Analyt aus der Mischung ab, um inen Überstand zu ergeben, enthaltend die gebundene Spezies des markierten Reagens. Alternativ dazu, können die zweite flüsige Reaktionsmischung oder mindestens ein Anteil davon, entfernt und zentrifugiert werden, um einen Überstand zu ergeben, enthaltend die gebundene Spezies der markierten Reagens.
Vorzugsweise wird die gebundene Spezies des markierten Reagens von der freien Spezies des markierten Reagens unter Verwendung einer Filtrationsvorrichtung (Fig. 8 und 9) abgetrennt, enthaltend einen hohlen,zylindrischen Rohrteil 61 und einen Gummikolben oder Stopfen 62, welche in die nahe Öffnung des Rohrteils 61 eingepaßt sind. Der Stopfen 62 enthält einen Körper 63 mit einem geringfügig größeren Aussendurchmesser als der Innendurchmesser des Rohrteils 61, wodurch ein flüssigkeitsdichter Verschluß bei dessen Einführung geschaffen wird, sowie einen ringförmigen, sich radial erstreckenden Lippen- oder Flanschteil 64 am nahen Ende davon. Der Aussendurchmesser des Flanschteils 64 ist geringfügig größer als der Innendurchmesser des Behältnisses 13, enthaltend die zweite Reaktionsmischung, um einen flüssigkeitsdichten Verschluß bei dessen Einführung zu ergeben. Der Stopfen 62 schließt eine achsiale Bohrung 65 ein, die sich sowohl an den nahen als auch den entfernten Enden des Stopfens 62 öffnen, und in welche ein verlängertes, zylindrisches, poröses Filterstück 66 durch Pressung eingepaßt ist, das einen Ausssendurchmesser aufweist, der geringfügig größer als der Innendurchmesser der achsialen Bohrung 65 ist. Der poröse Filterteile 66 ist im wesentlichen undurchdringlich für die immobilisierte Form des Analyt und permeabel für den flüssigen Anteil und die gebundene Sepzies der zweiten Reaktionsmischung. Vorzugsweise enthält der Filterteil 66 ein nicht-faseriges Material aus z.B. einem synthetischen Harz wie Polyethylen, Propypropylen oder Polyvinyliden und weist eine Vielzahl von zusammenhängenden Leerräumen auf, welche Durchgangswege oder zusammenhängende Durchgangsporen in allen Richtungen festlegen.
Insbesondere werden die gebundenen und freien Spezies durch Verwendung der Filtervorrichtung voneinander abgetrennt, indem man deren nahes Ende in das offene Behältnis 13 einführt, enthaltend die zweite flüssige Reaktionsmischung 67 (Fig. 8), und das Filterstück 66 durch die zweite Reaktionsmischung 67 zum unteren Ende des Beältnisses 13 (Fig. 9) führt. Demzufolge wird die freie Spezies, die an die immobilisierte Form des Analyt 68 gebunden ist, zwischen dem unteren Ende des Behältnisses 13 und dem nahe Ende des Filterstücks 66 eingefangen und ein Filtrat 69, enthaltend die gebundene Spezies des markierten Reagens und den flüssigen Anteil der zweiten flüssigen Reaktionsmischung, fällt innerhalb des Rohrteils 61 an. Das Filtrat 69 oder mindestens ein Anteil davon werden herausgenommen, z.B. mit einer Pipette, und das nachweisbare Signal, das durch die nachweisbare chemische Gruppe des markierten Reagens der gebundenen Spezies geliefert wird, wird gemessen und mit der Menge an in der flüssigen Testprobe vorliegendem Analyt korreliert.
Es sollte klar sein, daß die zweite flüssige Reaktionsmischung, abhängig von der Richtung am Ende der Drehbewegung des Analysereagensgeräts 10, am Ende entweder im ersten Behältnis 12 oder dem zweiten Behältnis 13 enthalten ist. Wird das Analysereagensgerät 10 am Ende gedreht, wodurch die zweite flüssige Reaktionsmischung am Ende stattdessen im ersten Behältnis 12 enthalten ist und daraus entnommen wird, ist demzufolge der Aussendurchmesser des Flanschteils 64 ähnlich größer als der Innendurchmesser des ersten Behältnisses 12, um bei dessen Einführung wie oben beschrieben, einen flüssigkeitsdichten Verschluß zu ergeben.
Die nachweisbare chemische Gruppe der gebundenen Spezies kann gemäß bekannter Verfahren nachgewiesen und gemessen werden und hängt von der besonderen, eingesetzten chemischen Gruppe ab. Vorzugsweise ist bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens die nachweisbare chemische Gruppe des markierten Reagens ein Enzym, und es wird eine Enzymsubstratindikatorverbindung, enthaltend z.B. ein Chromogen, das mit einer enzymatisch spaltbaren Gruppe derivatisiert ist, zu dessen Nachweis eingesetzt. Typischerweise wird eine solche enzymatisch spaltbare Gruppe durch das Enzym des markierten Reagens gespalten, um ein nachweisbares chromogenes Produkt zu erzeugen, das z.B. mit einem Reflektionsphotometer gemessen und mit der Menge an in der flüssigen Testprobe vorliegendem Analyt korreliert werden kann. Im allgemeinen kann eine solche Enzymsubstratverbindung dem Filtrat zugefügt werden, wobei, in der Gegenwart des markierten Reagens, dessen Enzym mit der chromogenen Enzymsubstratverbindung in Wechselwirkung tritt, um ein nachweisbares Signal in der Form eines Farbwechsels des Filtrats zu liefern. Alternativ dazu, kann der Filterteil 61 der Filtrationsvorrichtung mit einer löslichen Form der Enzymsubstratindikatorverbindung beaufschlagt werden, wodurch bei Einführung der Filtrationsvorrichtung in und durch die zweite flüssige Reaktionsmischung, wie oben beschrieben, die Enzymsubstratindikatorverbindung in Lösung gebracht wird, und es wird dadurch ermöglicht, daß eine Wechselwirkung mit einer jeden der im Filtrat 69 vorliegenden Spezies eintritt, um das nachweisbare Signal zu liefern.
Vorzugsweise wird die Enzymsubstrat-Indikatorverbindung oder eine jede andere Nachweiskomponente für eine besondere chemische Gruppe mit einer nachweisbaren chemischen Eigenschaft in eine Trägermatrix eingelagert, wie einem saugfähigen Material, und zwar gemäß bekannter Verfahren. Demgemäß wird ein Anteil des Filtrats 69 aus dem Rohrteil 61 der Filtrationsvorrichtung entnommen und auf eine solche Trägermatrix aufgebracht, wobei das Enzym des im Filtrat 69 vorliegenden markierten Reagens mit der Enzymsubstratindikatorverbindung in Wechselwirkung tritt, um das nachweisbare Signal, wie oben beschrieben, zu liefern. Das nachweisbare Signal kann visuell beobachtet und/oder mit einem geeigneten bekannten Instrument gemessen werden, wie einem Reflektionsphotometer.

Testkit und Vorrichtung

Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Testkit zur Verfügung, das alle wesentlichen Elemente umfaßt, die benötigt werden, um ein gewünschtes aufeinanderfolgendes Analysereaktionsverfahren durchzuführen, bei dem man das Analysereagensgerät der vorliegenden Erfindung, wie vorstehend beschrieben, anwendet. Das Testkit liegt in einer handelsüblichen verpackten Form vor, und gewöhnlich sind schriftliche Anleitungen zur Durchführung des besonderen Analysereaktionsverfahens mitenthalten.
Das Testkit umfaßt das Analysereagensgerät 10 mit den notwendigen Analysereagentien in den wie oben beschriebenen ersten und zweiten offenen Behältnissen 12 und 13. Vorzugsweise schließt das Testkit mehrere Analysereagensgeräte 10 zur Durchführung der gewünschten Analysereaktionen ein, wobei die darin enthaltenen Analysereagentien an einer Vielzahl flüssiger Testproben zur Anwendung gelangen. Die Analysereagensmischungsvorrichtung 50, umfassend das Element für die Rotation des Gerätes 10 sowie das Zeitgebungselement, untergebracht in einem Gehäuse 51, das angepaßt ist, um eines oder mehrere der Analysereagensgeräte 10 aufzunehmen, kann getrennt oder zusammen mit einem oder mehreren Analysereagensgeräten 10 verpackt werden. Das Analysereagensgerät 10, einschließlich der Behältnisse 12 und 13, ist vorzugsweise aus billigen Materialien hergestellt, um deren Entsorgung nach der beabsichtigten Verwendung zu erlauben.
Noch bevorzugter ist das Analysereagensgerät 10 besonders angepaßt zur Durchführung immunometrischer Assays, wobei ein markiertes Reagens, vorzugsweise ein an ein monovalentes Fab'-Antikörperfragment gekuppeltes Enzym, im ersten Reagensbehältnis 12 und der Analyt unter Bestimmung oder ein bindendes Analog davon, das an ein unlösliches Teilchen gekuppelt ist, im zweiten Reagensbehältnis 13 enthalten sind. Vorzugsweise schließt das Testkit zur Durchführung dieser immunometrischen Assays auch Indikatorelemente, wie einen Teststreifen, umfassend eine saugfähige Reagenseinlage, beaufschlagt mit einem Indikator für das markierte Reagens, vorzugsweise ein mit einer enzymatisch spaltbaren Gruppe derivatisiertes Chromogen, und die Filtrationsvorrichtung, wie oben beschrieben, ein.
Das Analysereagensgerät 10 wird mit Kappenstücken (nicht gezeigt) verpackt, die mit den ersten und zweiten Behältnissen 12 und 13 zusammengebracht sind, vorzugsweise mit Windungen versehen, um ein Verschütten zu verhindern. Diese können schnell entfernt werden. Ferner kann eines der Reagensbehältnisse, im allgemeinen das zweite Reagensbehältnis 13, durch einen Wegbrechverschluß oder -deckel bedeckt oder sonst geschützt sein, um einen Schutzmechanismus zu liefern, um einen Anwender des Testkit daran zu hindern, die flüssige Testprobe dem falschen Behältnis zuzufügen, und welche im Anschluß an die Zugabe der flüssigen Testprobe zum richtigen Reagensbehältnis leicht und schnell entfernt werden können.
Insbesondere wird die vorliegende Erfindung nun durch das folgende Beispiel veranschaulicht:

Beispiel 1

Automatische Durchführung eines sequentiellen Immunoassays für Digoxin

Ein sequentieller immunometrischer Assay für die Bestimmung von Digoxin wurde automatisiert durchgeführt, und zwar unter Anwendung der Analysereagensmischungsvorrichtung 50, umfassend das Analysereagensgerät 10, angeschlossen an einen Stufenmotor, gesteuert durch einen Programmierten Epson HX-40 Computer (Epson, Torrance, CA, USA), sowie die folgenden Reagentien.

(a) Immobilisierte Digitoxigenin-Reagenspartikel

Eine immobilisierte Form von Digitoxigenin (Digoxin-Bindungsanalog) wurde gemäß des Verfahrens der US-PS 4.822.747 mit dem Titel "Im wesentlichen stabiles immobilisiertes Haptenreagens zur Verwendung in Immunometrischen Assays" hergestellt. Gemäß dieses Verfahrens wurde Digitoxigenin in wasserfreiem Pyridin mit 4-Dimethylaminopyridin und p-Nitrophenylchlorformat behandelt, um 3-Digitoxigeninyl-p-nitrophenylcarbonat zu erhalten, das dann mit einer Carboxygruppe funktionalisiert wurde, und zwar unter Verwendung von 6-Aminocapronsäure und Triethylamin in wasserfreiem Pyridin, um 3-0-(5-Carboxypentan-1-carbamoyl)digitoxigenin zu erhalten. Das Carboxy-funktionalisierte Digitoxigenin wurde dann in wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (DMF) mit Triethylamin, N-Hydroxysuccinimid und N,N-Dicyclohexylcarbodiimid behandelt, um 3-0-(5-Carboxypentan-1-carbamoyl)digitoxigenin (aktiviertes Digitoxigenin) zu erhalten.
Das immobilisierte Reagens, enthaltend das aktivierte Digitoxigenin kovalent gebunden an die äusseren Amingruppen von Aminoethyl-derivatisierten Polyacrylamidgelpartikeln, wurde hergestellt, indem man zuerst eine Suspension von 2g Aminoethyl-BIO-GELR-P-2-Harz (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA; Lot No. 28945, 1.39 meq. Amin-funktionelle Gruppen/g Trockengewicht Harz) in 10 ml DMF bildete, welche bei Raumtemperatur 48 h lang inkubiert wurde. Ein Anteil von 0,01 ml des Überstands von dem Aminoethyl-derivatisierten BIO-GELR-P-2-Harz in der DMF-Lösung wurde entfernt und durch 0,01 ml des aktivierten Digitoxigenins ersetzt, um eine Reaktionslösung zu bilden, enthaltend 0,05 uMol aktiviertes Digitoxigenin pro g Trockengewicht Harz. Das Ganze wurde an einem Rotationsmischer (Ende-über-Ende-Rührung) bei Raumtemperatur 48 h lang schonend vermischt, mit einer Pufferlösung und Wasser gewaschen und dann durch Lyophilisierung getrocknet.

(b) Markiertes Reagens

Es wurde ein Enzym-Antikörper-Konjugatpräparat (0,3 nM in 50 mM Natriumphosphat, 50 mM Natriumchlorid, nM Magnesiumchlorid, 100 ug / ml Rinderserumalbumin und 0,02% Natriumazid, pH 7.4) , enthaltend ein einzelnes monovaltenes Anti-Digoxin-Antikörperfragment (Fab'), gekuppelt an eine einzelne beta-D-Galactosidaseenzymkomponente, als das markierte Reagens verwendet. Das monovalente Antikörperfragment war abgeleitet von einem monoclonalen, für Digoxin spezifischen Antikörper (siehe z.B. Porter, Biochem. J., Vol 73, p. 119 (1959) und Nisonoff , Methods Med. Res., Vol. 10, p. 132 (1964)) und mit beta-D-Galactosidase markiert (siehe z.B. Ishikawa, J.Biochem., Vol. 96, p. 659 (1984); Kato et al., J. Immunol, Vol. 116, p. 1554 (Juni 1976); und Yushitake et al., Euro. J. Biochem., Vol. 101, p. 395 (1977)). Das monovalente Antikörperfragment-beta-D-galactosidasekonjugat wurde elektrophoretisch an einem Polyacrylamidgel (Polyacrylamidgelelektrophorese) gereinigt, um ein im wesentlichen eines Konjugatpräparat zu ergeben, enthaltend einer einzelne Fab'-Komponente und eine einzelne beta-D-Galactosidasekomponente, wie beschrieben in US-Patentanmeldung mit der Anmeldenummer 939,640 vom 09.12.1986 mit dem Titel "Im wesentlichen reines Enzym-Antikörper-Monokonjugatpräparat". Gemäß dieses Verfahrens wurde ein Polyacrylamidgelgradient an senkrechter Platte (5 bis 8% T, 2%C) hergestellt, indem man der Reihe nach eine 5% T, 2%C Gellösung (40% T, 2%C Acrylamid) und eine 8% T, 2%C Gellösung (40% T, 2%C Acrylamid und Sucrose) aufgoß, um einen linear ansteigenden Konzentrationsgradient zu ergeben. Die beta-D-Galactosidasekomponente wurde mit der Antikörperkomponente zur Reaktion gebracht, um eine Reaktionsmischung zu ergeben, enthaltend als getrennt wanderungsfähige Spezies eine freie beta-D-Galactosidasekomponente und Konjugate, enthaltend eine oder mehrere der beta-D-Galactosidasekomponenten, gekuppelt an eine oder mehrere der Antikörperkomponenten. Die Reaktionsmischung wurde auf den Gelgradient aufgebracht, wobei die Konjugate und die freie beta-D-Galactosidasekomponente voneinander in daran unterschiedene Konzentrationszonen aufgetrennt und das im vorliegenden Immunoassay verwendete Konjugat von seiner jeweiligen Konzentrationszone isoliert wurden.

(c)Chromogene Enzymsubstrat-Indikatorverbindung

Die chromogene Indikatorverbindung wurde gemäß des Verfahrens der US-PS 4.810636 mit dem Titel "Chromogene Acridinon-Enzymsubstrate" hergestellt. Gemäß dieses Verfahrens wurde ein 7-Hydroxy-9, 9-dimethyl-9H-acridin-2-on-Chromogen, abgeleitet von einem 7-Hydroxy-1,3-dichlor-9,9-dimethyl-9H-acridin-2-on-Intermediat, mit Acetobromgalactose und Silberoxid in Ethylacetat/Chinolin zur Reaktion gebracht, um ein 7-(Tetra-0-acetyl-beta-D-galactopyranosyloxy)-9,9- dimethyl-9H-acridinon herzustellen, das dann mit Natriummethoxid in Methanol hydrolysiert wurde, um die gewünschte 7-beta-D-Galactopyranosyloxy-9, 9-dimethyl-9H- acridin-2-on-Indikatorverbindung, die hier verwendet wird, zu erhalten.

Assayverfahren

Zur Durchführung des Assay wurden das Enzym-Antikörper-Konjugatpräparat (750 ul) in ein Glasröhrchen 12 (15 mm Durchmesser x 28 mm Höhe) und das immobilisierte Digitoxigeninreagens (30 mg) in ein Kunststoffröhrchen 13 (12 mm Aussendurchmesser und 8.5 mm Innendurchmesser x 37 mm Höhe) gegeben. Das Glasröhrchen 12 und das Kunststoffröhrchen 13 wurden in die Hohlräume 16 bzw. 17 der Behältnishalterung 14 gegeben, und es wurde eine erste flüssige Reaktionsmischung gebildet, indem man 30 ul einer menschlichen Serumtestprobe, enthaltend Digoxin, in das Glasröhrchen 12 mit dem markierten Reagens zufügte. Das analytische Reagensgerät 10 wurde zusammengebaut, indem man den Behältnishalter 14 in den Behältnishaltereinsatz 15 einsetzte und den Deckelteil 11 wie oben beschrieben damit befestigte. Die Schaftwelle 48 des Behältnishaltereinsatzes 15 wurde an den Stufenmotor angeschlossen, mit dem Analysereagensgerät 10 und den Röhrchen 12 und 13 in einer stationären, aufrechten Position.
Der Antriebsmotor, unter Steuerung des programmierten Computers, vermischte die Testprobe und das markierte Reagens im Glasröhrchen 12 durch Drehung (30 Upm in abwechselnden Drehrichtungen in und gegen den Uhrzeigersinn) des Analysereagensgeräts 10 um 57º relativ zur Senkrechten. Nach einer Minute hörten die Drehbewegungen des Analysereagensgeräts auf, und das Analysereagensgerät 10 wurde in einer stationären aufrechten Position 5 Minuten lang inkubiert. Während der Vermischungs- und Inkubationszeiträume wurden die gebundenen Spezies des markierten Reagens gebildet, enthaltend Digoxin, gebunden an das markierte Reagens. Nach 5 Minuten wurde die erste flüssige Reaktionsmischung in dem Glasröhrchen 12, enthaltend die Testprobe und das markierte Reagens, mit dem immobilisierten Reagens in dem Kunststoffröhrchen 13 durch Drehung des Analysereagensgeräts 10 (in abwechselnden Drehrichtungen jeweils in und gegen den Uhrzeigersinn) für 5 volle Umdrehungen in jeder Richtung 4 Minuten lang vermischt. Diese abwechselnden Drehbewegungen liessen die erste flüssige Reaktionsmischung im Glasröhrchen 12 die offene Kammer 24 des Deckelteils 11 durchqueren und in das Kunststoffröhrchen 13 gelangen, enthaltend das immobilisierte Reagens, um die zweite flüssige Reaktionsmischung damit zu bilden. Demgemäß vermischte sich durch die fortgesetzten abwechselnden Drehbewegungen die zweite Reaktionsmischung zwischen dem Glasröhrchen 12 und dem Kunststoffröhrchen 13 durch die offene Kammer 24 hindurch, wodurch ein jedes des freien oder ungebundenen markierten Reagens, d.h. nicht gebunden an Digoxin, an das immobilisierte Reagens gebunden und durch es immobilisiert wurde. Nach 4 Minuten hörten die abwechselnden Drehbewegungen des Analysereagensgeräts 10 nach einer abschließenden Drehrichtung gegen den Uhrzeigersinn auf, wodurch die zweite flüssige Reaktionsmischung in das Kunststoffröhrchen 13 übertragen wurde und am Ende dort verblieb.
Der Deckelteil 11 wurde entfernt, und es wurde eine Filtervorrichtung, wie vorher beschrieben (25 um poröses Kunststofffilterteil 66, 9,5 mm Aussendurchmesser des Flanschteils 64, Porex Technologies, Fairburn, CA, USA), in das Kunststoffröhrchen 13 eingeführt, und durch die zweite flüssige Reaktionsmischung zum unteren Ende des Kunststoffröhrchens 13 geführt, um ein Filtrat zu bilden, enthaltend die gebundene Spezies des markierten Reagens im Rohrteil 61 der Filtrationsvorrichtung. Das an das immobilisierte Reagens gebundene markierte Reagens, für das das Filterstück 66 undurchlässig war, blieb zwischen dem Filterstück 66 und dem unteren Ende des Kunststoffröhrchens 13. Ein Anteil (30 ul) des Filtrats wurde mit einer Pipette herausgenommen und auf einen mit dem Substrat beaufschlagten Reagensstreifen aufgebracht.
Die Geschwindigkeit der Farbbildung, die sich aus der Wechselwirkung zwischen der beta-D-Galactosidase und dem Acridinon-beta-D-galactopyranosid ergab, wurde bei 630 nm zwischen ca. 60 bis 80 Sekunden nach Probenaufgabe auf den Reagensseiten gemessen, um die beta-D-Galactosidaseaktivität des mit dem Konjugat markierten Reagens aus dem Filtrat, d.h. die gebundene Spezies, zu bestimmen. Die Reaktivitätsmessungen (Tabelle 1) wurden an einem SeralyzerR-Reflektionsphotometer (Miles Inc., Elkhart, IN, USA) vorgenommen, das mit einem HP-85 Computer (Hewlett-Packard Company, Palo Alto, CA, USA) durch Mehrfachanschluß verbunden war.
Die sich ergebende Dosisreaktion auf Digoxin auf Basis der in Tabelle 1 angegebenen Meßdaten ist in Fig. 10 gezeigt. Tabelle 1 Digoxinkonzentration (ng/ml) Reaktivität x 10³

Claims

1. Analyesreagensmischungsvorrichtung zur Durchführung aufeinanderfolgender Analysereaktionen, gekennzeichnet, durch

(a) ein Analysereagensgerät, umfassend erste und zweite offene Behältnisse mit ersten und zweiten darin enthaltenen Analysereagentien, sowie einen Deckelteil, verbunden mit den genannten Behältnissen, wobei der genannte Deckelteil Elemente zur Bereitstellung einer offenen flüssigen Verbindung zwischen den genannten ersten und zweiten Behältnissen umfaßt; und

(b) ein Element zur Drehung des genannten Geräts, wodurch eine Flüssigkeit, die mindestens einem der Behältnisse zugeführt wird, entweder (i) mit dem Reagens im genannten Behältnis gehalten und gesondert vermischt oder (ii) zwischen den genannten Behältnissen durch das genannte Element zur Bereitstellung einer offenen flüssigen Verbindung hindurch übertragen und vermischt werden kann.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Drehelement das genannte Gerät in einer Ebene dreht, die durch die Längsachsen der genannten Behältnisse festgelegt ist.

3. Vorrichtung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Drehelement dazu befähigt ist, das genannte Gerät um weniger als 90º relativ zur Senkrechten in abwechselnden Richtungen im und gegen den Uhrzeigersinn zu drehen, wodurch die genannte Flüssigkeit mit dem Reagens im genannten Behältnis gehalten und gesondert vermischt wird.

4. Vorrichtung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Drehelement dazu befähigt ist, das genannte Gerät um mehr als ca. 90º relativ zur Senkrechten in abwechselnden Richtungen in und gegen den Uhrzeigersinn zu drehen, wodurch die genannte Flüssigkeit zwischen den genannten Behältnissen durch das genannte Element zur Berteitstellung einer offenen und flüssigen Verbindung hindurch übertragen und vermischt wird.

5. Vorrichtung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Drehelement zur Drehung des genannten Geräts das genannte Gerät um 360º relativ zur Senkrechten, vorzugsweise für eine vorbestimmte Anzahl von Umdrehungen in abwechselnden Richtungen im und gegen den Uhrzeigersinn, dreht.

6. Vorrichtung gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte erste Analysereagens ein erstes Immunoreagens ist, enthaltend ein markiertes Reagens, enthaltend ein Glied eines spezifischen Bindungspaares, das mit einer nachweisbaren chemischen Gruppe markiert ist, vorzugsweise ein mit einer nachweisbaren chemischen Gruppe markiertes Anti-Analyt-Antikröperreagens, und daß das genannte zweite Analysereagens ein zweites Immunoassayreagens ist, enthaltend eine immobilisierte Form eines anderen Glieds des genannten spezifischen Bindungspaares, vorzugsweise eine immobilisierte Form des genannten Analyt oder eines Bindungsanalogs davon, vorzugsweise immobilisiert an einem in Wasser suspendierbaren Teilchen.

7. Vorrichtung gemäß jedem Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet durch ein Zeitgebungselement zur Steuerung der Drehbewegungen des genannten Geräts über vorbestimmte Zeiträume, wobei das genannte Zeitgebungselement vorzugsweise mit genanntem Drehelement zusammenwirkt, um (i) das genannte Gerät um weniger als ca. 90º relativ zur Senkrechte in abwechselnden Richtungen im und gegen den Uhrzeigersinn einen vorbestimmten Zeitraum lang aufeinanderfolgend zu drehen, (ii) das genannte Gerät in einer im wesentlichen aufrechten, stationären Stellung einen vorbestimmten Zeitraum lang zu halten und (iii) das genannte Gerät um mehr als ca. 90º relativ zur Senkrechten in abwechselnden Richtungen im und gegen den Uhrzeigersinn einen vorbestimmten Zeitraum lang zu drehen.

8. Verfahren zur Durchführung aufeinanderfolgender Analysereaktionen zwischen einem Analyt in einer flüssigen Testprobe und Analysereagentien, wobei man die Vorrichtung eines jeden der Ansprüche 1 bis 7 verwendet, wobei ein nachweisbaren Signal geliefert wird, das gemessen und mit der Menge an in der flüssigen Testprobe vorliegendem Analyt korreliert wird, wobei das genannte Verfahren durch die folgenden Stufen gekennzeichnet ist, wobei man:

(a) eine erste flüssige Reaktionsmischung bildet, indem man die genannte flüssige Testprobe dem genannten ersten Analytreagens im genannten ersten Behältnis des genannten Analysereagensgerätes zufügt;

(b) den genannten Deckelteil mit den genannten ersten und zweiten Behältnissen des genannten Analysereagensgeräts verbindet;

(c) das genannte Gerät einen vorbestimmten Zeitraum lang dreht, wodurch die genannte erste flüssige Reaktionsmischung im genannten ersten Behältnis gehalten und gesondert vermischt und das genannte zweite Analysereagens im genannten zweiten Behältnis gehalten werden;

(d) das genannte Gerät einen vorbestimmten Zeitraum lang dreht, wodurch die genannte erste Reaktionsmischung das genannte Element zur Bereitstellung einer offenen flüssigen Verbindung des genannten Deckelteils durchquert, um eine zweite flüssige Reaktionsmischung zu bilden, enthaltend genannte erste flüssige Reaktionsmischungen und genanntes zweites Analysereagens; und

(e) mindestens einen Anteil der genannten zweiten flüssigen Reaktionsmischung herausnimmt und das gelieferte nachweisbare Signal mißt.

9. Verfahren zur Durchführung eines aufeinanderfolgenden immunometrischen Assays zur Bestimmung eines Analyt in einer flüssigen Testprobe, wobei man die Vorrichtung eines jeden Anspruchs 1 bis 7 verwendet, wobei der genannte Assay eine Bindung zwischen dem Analyt, einem mit einer nachweisbaren chemischen Gruppe markierten Anti-Analyt-Antikörperreagens und einer immobilisierten Form des Analyt oder eines Bindungsanalogs davon einschließt, wobei die Menge an markiertem Antikörperreagens, das nicht an die immobilisierte Form des Analyt oder Analogs gebunden wird, bestimmt und zur Menge an in der flüssigen Testprobe vorliegendem Analyt in Beziehung gesetzt wird, wobei das genannte Verfahren durch die folgenden Stufen gekennzeichnet ist, wobei man:

(a) eine erste flüssige Immunoassayreaktionsmischung bildet, indem man die genannte flüssige Testprobe dem genannten markierten Antikörperreagens im genannten ersten Behältnis des genannten Analysereagensgerätes zufügt;

(b) den genannten Deckelteil mit den genannten ersten und zweiten Behältnissen des genannten Analysereagensgerätes verbindet;

(c) das genannte Gerät um weniger als ca. 90º relativ zur Senkrechten in einer Ebene, die durch die Längsachse der genannten Behältnisse festgelegt ist, einen vorbestimmten Zeitraum lang in abwechselnden Richtungen im und gegen den Uhrzeigersinn dreht, wodurch genannte erste flüssige Reaktionsmischung im genannten ersten Behältnis gehalten und gesondert vermischt und genannter immobilisierter Analyt oder dessen Bindungsanalog in genanntem zweiten Behältnis gehalten werden;

(d) genannte Vorrichtung in genannter Ebene für eine vorbestimmte Anzahl von vollständigen Umdrehungen in abwechselnden Richtungen im und gegen den Uhrzeigersinn einen vorbestimmten Zeitraum lang dreht, wodurch genannte erste flüssige Immunoassayreaktionsmischung das genannte Element zur Bereitstellung einer offenen Verbindung des genannten Deckelteils durchquert, um eine zweite flüssige Immunoassayreaktionsmischung zu bilden, enthaltend genannte erste flüssige Immunoassayreaktionsmischung und genannte immobilisierte Form eines genannten Analyt oder dessen Analogs; und

(e) mindestens einen Anteil der genannten zweiten flüssigen Immunoassayreaktionsmischung, enthaltend den markierten Antikörper, der nicht an die immobilisierte Form des Analyt oder dessen Analog gebunden worden ist, herausnimmt und das davon gelieferte nachweisbare Signal misst.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß genannte immobilisierte Form des Analyt oder Analogs ein filtrierbares Teilchen enthält, vorzugsweise ein in Wasser suspendierbares Teilchen, und wobei Stufe (f) beinhaltet, daß man ein Filterelement durch genannte zweite flüssige Immunoassayreaktionsmischung führt, um markierten Antikörper, der mit genanntem filtrierbaren Teilchen assoziiert worden ist, von markiertem Reagens abzutrennen, das in Lösung verbleibt, um ein Filtrat davon zu bilden, einen Anteil des sich ergebenden Filtrats herausnimmt und das dabei gelieferte nachweisbare Signal misst.