DE2433616B2

DE2433616B2 - Reagenzeinheit fuer standardmikroanalysen

Info

Publication number: DE2433616B2
Application number: DE19742433616
Authority: DE
Inventors: Gudrun Birgitta Margareta Monte-Carlo Rolfo-Fontana
Original assignee: Monega Anstalt, Vaduz
Priority date: 1974-02-07
Filing date: 1974-07-12
Publication date: 1977-09-15
Also published as: US4062652A; JPS50115587A; FR2260797B1; GB1485482A; DE2433616A1; SU695528A3; SE380100B; FR2260797A1; JPS5440039B2; DE2433616C3; SE7401658L

Description

Die Erfindung betrifft eine Reagenzeinheit für Standardmikroanalysen gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1.

Grundsätzlich hat die chemische Analyse für die Bestimmung von Art und Menge der Bestandteile einer zu untersuchenden Probe unter Anwendung chemischer oder physikalisch-chemischer Methoden insbesondere durch die Mikroanalyse eine außergewöhnlich große praktische Bedeutung in der Medizin, z. B. bei Blut- und Urinuntersuchungen, der Hygiene, dem Umweltschutz, der Nahrungsmittelkontrolle, der Landwirtschaft und in der chemisch-technischen, insbesondere pharmazeutischen Industrie neben der ganz allgemeinen Bedeutung für chemische Laboratorien erlangt.

Bei einer solchen chemischen Analyse wird jede beobachtbare Eigenschaft der Stoffe, deren Vorhandensein in einer zu untersuchenden Substanz nachgewiesen werden soll, ausgenutzt. Es handelt sich hierbei in erster Linie um besondere Reaktionsmerkmale dieser Stoffe, d. h. ob z. B. mit ihnen eine meßbare Färbung hervorgerufen werden kann oder ob die Konzentration des Stoffes durch seinen katalytischen, z. B. enzymatischen Effekt, feststellbar ist. Es kann außerdem z. B. die Farbe des Stoffes selbst, seine Löslichkeit, Dichte, elektrische Leitfähigkeit, sein Brechungsindex, Einfluß auf polarisiertes Licht usw. bestimmt werden. Die Anzahl der jeweils möglichen Analysenverfahren ist somit durch die Anzahl dieser Eigenschaften des jeweiligen Stoffes sowie durch den jeweiligen Zweck der Analyse bedingt.

Im Zusammenhang mit der Erfindung sind zunächst chemische Analysen in Flüssigkeiten von Bedeutung, d. h. solche Analysen, bei denen chemische Reaktionen in Lösungen durchgeführt werden. Hierbei werden die Volumeneinheiten von Probe und Reagenz mit Pipetten, Büretten oder anderen Meßgefäßen genau bestimmt. Die Reaktionen in der Lösung können auf verschiedene Art und Weise verfolgt werden, z. B. durch photometrisehe, spektrophotometrische, fluorimetrische, turbidimetrische, nephelometrische, polarimetrische oder andere optische Methoden. Diese Methoden sind für klinische Untersuchungen am gebräuchlichsten.

Daneben besteht ein großer Bedarf an exakt abgemessenen Reagenzeinheiten sowohl für elektrochemische Analysenmethoden, bei denen z. B. spezifische Ionenelektroden verwendet werden oder die elektrische Leitfähigkeit gemessen wird, als für solche Methoden, wie Polarographie und elektrometrische Titrierungen.

Auch für die medizinisch besonders wichtigen Analysenmethoden der Serologie, bei denen z. B. das Agglutinationsvermögen von Blutkörperchen oder der Niederschlag von Antigen-Antikörperaggregaten festgestellt wird, können Reagenzeinheiten verwendet werden. Bestimmte bakteriologische Analysen sind

ebenfalls abhängig von der exakten Dosierung der Reagenzien.

Für alle genannten Analysenmethoden werden zur Zeit meistens Reagenzien in Form von Lösungen verwendet, wobei die Reagenzlösungen durch Pipettierung zugesetzt werden. Hierbei müssen jedoch große Forderungen an das exakte Abmessen der benötigten

vlenge Reagenzlösung gestellt werden, die der zu versuchenden Probe zugesetzt wird. Als Folge der in jcn letzten jähren immer mehr zunehmenden Automatisierung der Laborarbeit wird deswegen erstrebt, die \nzah\ der Probeentnahmen bei Patienten zu begrenzen und die entnommenen Proben durch immer mehr Analysen zu untersuchen. Dies hat zwangsläufig zur Folge, daß die für jede einzelne Untersuchung zur Verfugung stehende Substanzmenge immer kleiner ausfällt, ueshalb müssen auch die Mengen der jeder Probe zuzusetzenden Reagenzlösung mit immer kleinerem Volumen in dennoch zufriedenstellender Genauigkeit abgemessen werden. Durch Verwendung geläufiger Pipettierungsverfahren können mit automatisierter Technik zur Zeit Flüssigkeitsvolumen bis herab zu ca. 30 μΙ mit einer unter ±1% liegenden Fehlergrenze abgemessen werden.

Es erscheint unmöglich, diese Werte mit herkömmlichen Vorrichtungen oder Verfahren zu unterschreiten, da durch die Kapillarwirkung, Tropfen an der Pipettenspitze. Schwankungen in nicht vermeidbaren Leckstellen usw. nicht nur praktische, sonderen auch theoretische Grenzen gesetzt sind.

Es ist zwar bekannt (DT-Gbm 17 77 548), zur Prüfung der Wasserhärte anstelle von Seifenlösungströpfchen schokoladentafelförmig eingeteilte Seifenstückchen in die zu prüfende Wassermenge einzugeben und durch Schütteln des Gefäßes sodann die Schaumbildung festzustellen, jedoch stellt diese Methode der Vorfabrikation von Reagenzeinheiten kein Verfahren dar, das beispielsweise in Verbindung mit medizinischen Standardmikroanalysen zur Anwendung gelangen kann, da die Erzielung der hierbei jeweils geforderten Genauigkeit besondere Schwierigkeiten bereitet, die nicht durch einfache schokoladentafelförmige Unterteilung von Reagenzeinheiten zu lösen sind.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, aus einer Reagenzmenge zur Durchführung von Standardmikroanalysen geeignete, in exakten kleinen Dosen vorgefertigte Reagenzeinheiten zu schaffen, ohne daß diesbezüglich die bisher verwendeten Zumeßvorrichtungen, wie Pipetten od. dgl., verbessert werden müssen.

Die Merkmale der zur Lösung dieser Aufgabe geschaffenen Erfindung ergeben sich aus dem kennzeichnenden Teil von Anspruch 1. Vorteilhafte Ausgestaltungen hiervon sind in den weiteren Ansprüchen aufgeführt.

Durch die Erfindung sind daher nicht nur für qualitative und quantitative Standardmikroanalysen sehr kleiner Substanzmengen exakt abgemessene Reagenzeinheiten verfügbar, sonderen es werden auch sowohl die Durchführung dieser Standardmikroanalysen erleichtert als auch die hierdurch gewonnenen Ergebnisse verbessert, da außer der exakten Dosierung jeder Mikroeinheitsdosis auch deren leichte Hantierung sowie einwandfreie Lagerungsmöglichkeit gewährleistet ist

Da jede Mikroeinheitsdosis an einem mit einem magnetisierbaren Material versehenen Träger gebunden ist, ergibt sich der Vorteil,

a) die Einheitsdosis mittels eines magnetisch wirkenden Hantierorgans ergreifen zu können,

b) die Einheitsdosis durch Unterbrechen der magnetischen Wirkung des Hantierorgans einfach in die Reagcnzlösung fallenlassen zu können, ohne daß die Gefahr einer Kontamination der Reagenzlösung besteht,

c) die Reagenzlösung in einfacher Weise dadurch

umrühren zu können, daß der Träger ohne dessen körperliche Berührung in der Reaktionslösung durch magnetische Kräfte bewegt wird, und
d) den Träger mittels des Hantierorgans aus der Reagenzlösung auf magnetischem Weg entfernen zu können, ohne die Reagenzlösung zu kontaminieren.

Zu den die Genauigkeit begrenzenden Faktoren bei herkömmlicher Pipettierung gehört die Unscharfe der Abgrenzung des eingeschlossenen Reagenzflüssigkeitsvolumens. Eine übliche Pipette besteht aus einem starren Rohr, das in vertikaler Stellung mit Lösung gefüllt wird. Die Genauigkeit des Pipettierens beruht u. a. auf den Abgrenzungen nach oben, wo sich ein Meniskus bildet, sowie nach unten, wo das Rohr zu einer Spitze ausgezogen ist, um eine schärfere Grenze zu bilden. Keine der Grenzflächen ist besonders gut definiert. Insbesondere die untere kann durch äußere Beeinflussung beim Entleeren auf verschiedenen Höhen stehenbleiben oder es bleiben Flüssigkeitsreste an der Innenwand der Pipette haften, was insbesondere bei viskosen Lösungen und raschem Entleeren der Pipette der Fall sein kann.

Auch hier erreicht die Erfindung eine Verbesserung dadurch, daß die für Standardmikroanalysen benötigten genauen Reagenzeinheiten in Einheitsdosen von 0,1-30μ1, d.h. in der Größenordnung 0,1-30μ^ vorgefertigt sind.

!m Prinzip ist die Aufteilung in Dosen ein schwieriger Vorgang. Der durch die Erfindung erreichte Effekt besteht daher auch darin, zu demjenigen Zeitpunkt an dem die Analyse erfolgen soll, eine angemessene Reagenzmenge zur Verfügung zu haben, von der von vornherein bekannt ist, daß sie mit erforderlicher Genauigkeit abgemessen ist. Beim üblichen einfachen mechanischen Pipettieren können dagegen Störungen auftreten, welche die Analyse einer gegebenenfalls teueren und schwer zu ersetzenden Probe verderben. Mit der Erfindung kann diese Gefahr jedoch umgangen werden.

Es ist eine große Erleichterung, bei der Durchführung der Analyse über die erforderlichen Reagenzien in exakten und bekannten Mengen verfügen zu können, und zwar in Form von fabrikmäßig vorfabrizierten Einheitsdosen, da diese schwierige Präzisionsarbeit dann nicht im Augenblick der Durchführung der Analyse vorgenommen werden muß. Es sind lediglich zweckentsprechende Hilfsmittel zur Entgegennahme und Verwendung der vorfabrizierten Reagenzeinheiten erforderlich. Auf diese Art und Weise wird durch die Erfindung die Analysierarbeit mit dem abgemessenen Reagenz darauf begrenzt, im voraus zubereitete Reagenzeinheiten zu verwenden, bei denen gegebenenfalls die Viskosität durch Zusatz von die Analyse nicht beeinflussenden inerten Stoffen und/oder durch femperatursenkung des Reagenz erhöht ist. Diese Maßnahme, die Konsistenz in Richtung bis zur Gelform zu erhöhen, basiert auf der neugefundenen Einsicht, daß dadurch eine schärfere Abgrenzung des Volumens beim Pipettieren erreicht und dennoch — durch Verwendung einr Kolbenpipette, d. h. Spritzpipette, — der Nachteil des Nachrinnens der viskosen Lösung an den Innenwänden vermieden werden kann.

Das Pipettieren setzt dann eine solche Konsistenz der Lösung oder des Gels voraus, daß der Reagenzüberschuß an der unteren Pipettenspitze abgeschabt oder — bei Gelen — abgeschnitten werden kann. Man erzielt hierdurch eine scharfe Fläche, die so sicher definiert ist,

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daß auch geringe Volumen mit ausreichender Genauigkeit, d. h. mit einer durchschnittlichen Fehlergrenze unter 1 %, abgemessen werden können.

Die zum Abteilen der genauen Volumen benutzte Technik muß an die Konsistenz des Reagenz angepaßt werden. Für Reagenzlösungen bedient man sich beispielsweise eines Abtrocknens unter der Pipettenspitze, um dort überschüssige Reagenzlösung zu entfernen. Für zähflüssige Lösungen, die aus einer Spritzpipette ausgespritzt werden, hat sich ein Abschaben, beispielsweise durch eine Teflonkante, als ausreichend erwiesen. Für gelförmige Reagenzien sind beispielsweise ein umlaufendes Kreismesser oder Mikrotomschnitte vorteilhaft, wie sie bei der Herstellung mikroskopischer Präparate verwendet werden.

Bei dieser Art des Pipettierens muß dann die Spritzpipettenspitze nicht mit Verdünnungsflüssigkeit ausgespült werden. Die letztgenannte Technik war bisher als die erfolgreichste anzusehen, setzt aber eine mehrfache Verdünnung voraus, die oft unvorteilhaft ist.

Auch das Auflösen der Reagenzeinheit in der Reaktionsmischung kann mit der Erfindung beschleunigt werden.

Das Lagern und Aufbewahren der Reagenzeinheit muß jeweils an deren chemische Eigenschaften angepaßt werden. Gemeinsam ist indessen, daß die Reagenzeinheit grundsätzlich mehr oder weniger einer Trocknung ausgesetzt ist. Es kann dann beim Einsatz schwierig sein, ein rasches Auflösen der chemischen Substanz zu erreichen. Hier zeigt jedoch die Erfindung den Vorteil, daß das in den Trägern enthaltene magnetisierbare Material es auf einfache Weise ermöglicht, die Reagenzeinheiten zu bewegen, den Träger zu vibrieren, zu schütteln oder in Drehung zu versetzen, so daß sich die Reagenzeinheit rasch löst. Durch hydrophile chemische Zusätze zu einer Wasserlösung kann dieser Vorgang außerdem beschleunigt werden.

Von großer Wichtigkeit ist auch, daß die Auflösung vollständig erfolgt. In bestimmten Fällen muß die Oberfläche besonders vorbehandelt werden, darr.it sie kein Reagenz festhält. Für verschiedene Fälle stehen mehrere Methoden und Stoffe zur Verfügung, um ein vollständiges und rasches Auflösen zu erleichtern.

Mit der Erfindung kann daher auch u.a. durch Veränderung der Viskosität und Oberflächenspannung der Reagenzeinheit ein genaues Abmessen sehr kleiner Volumen ermöglicht werden, die mit besonderen Verfahren bei einzelnen Analysen Verwendung finden können, ohne daß ein Messen oder Pipettieren notwendig ist.

Der Grundgedanke ist somit, anstelle einer weiteren Verfeinerung beispielsweise der Pipetten, u.a. durch Zusätze von die Analyse nicht beeinflussenden Mitteln, die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Reagenzlösungen so zu verändern, daß ein Aufteilen in genaue Mengen erleichtert wird. Um jeweils einzelne Reagenzdosen für jede Analyse zu verwenden, ist es somit erforderlich,

a) durch Vorfabrikation die Reagenzmenge in genaue Mengen aufzuteilen,

b) die einzelnen Dosen aufzunehmen, aufzubewahren und zu hantieren,

c) eventuell die Viskosität des Reagenz zu erhöhen und schließlich

d) das in Einheitsdosen zugesetzte Reagenz in der Reaktionsmischung, in welcher der chemische Prozeß erfolgt, aufzulösen und gut zu vermischen.

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Die Verwendung bezieht sich in erster Linie auf klinisch-chemische Analysen, kann grundsätzlich aber überall dort erfolgen, wo der Analysenbedarf einen Übergang zur Verwendung fertig zubereiteter Reagenzeinheiten rechtfertigt und das Abteilen geringer Mengen für sowohl manuelle als auch mechanisierte oder automatisierte Analysenarbeit von Vorteil ist. Insbesondere bei großen Analysenmaschinen ist es wertvoll, die ansonsten erforderliche große Anzahl von Pipettierungen zu reduzieren.

Im folgenden werden einige allgemeine Gesichtspunkte zu den wesentlichen Analysenmomenten beim allgemeinen Verlauf einer chemischen Mikroanalyse erläutert, wobei die den Reagenzgläsern zugesetzten Reagenzien genau abgemessen und auf einzelnen Trägern aufgenommen sind, so daß sie einfach und sicher auf magnetischem Weg während der Analyse hantierbar sind.

Die Träger enthalten somit eine Reagenzeinheit und sind so ausgeführt, daß sie eine geringe Menge der zu analysierenden Probe aufnehmen und diese zusammen mit der Reagenzeinheit ins Reagenzglas überführen können. Die Träger selbst können zum Mischen der Grundlösung, Probe und Reagenzeinheit im Reagenzglas beitragen. Dies wird auf magnetischem Weg dadurch erreicht, daß nicht nur der Träger mit magnetisierbarem Material versehen ist, sondern auch um das Reagenzglas herum eine elektrische Spule angeordnet wird, deren Feld in Größe und/oder Richtung dadurch geändert werden kann, daß es intermittierend mit pulsförmigen oder ständig wechselnden elektrischen Impulsen aktiviert wird, die auch verschiedene Länge haben können.

Im folgenden sei kurz dargelegt, wie sich die einzelnen Analysenmomente bei Verwendung der erfindungsgemäßen Reagenzeinheiten gestalten.

A. Abmessen der Proben

Das derzeit als das exakteste betrachtete und daher am meisten benutzte Verfahren zum Zusetzen eines geringen, jedoch genau abgemessenen Volumens der zu analysierenden Probe erfolgt mit einem sogenannten Dilutor. Dabei wird das gewünschte Volumen in ein schmales Röhrchen aus vorzugsweise hydrophobem Kunststoff eingesaugt und die Probe später zusammer mit einer bestimmten Menge Verdünnungsflüssigkeil ausgespritzt, die gleichzeitig das Röhrchen für dif nächste Verwendung ausspült Dieses Verfahren setz! voraus, daß einerseits eine wesentliche Verdünnunj immer erfolgt, was indessen manchmal ungünstig ist und daß andererseits mehr Zeit zur Verfügung steht, di das Ausgeben der Probe auf den Zusatz dei Verdünnungsflüssigkeit warten muß.

Durch die Erfindung wird es ermöglicht, da Abmessen der Probe ohne Zusatz anderer Flüssigkei vorzunehmen. Für das Abmessen der Proben stehen j< nach Größe der Probemenge drei Möglichkeiten zu Verfügung:

a) Für die größten Volumen, d. h. über 30 μΐ, wird eim Injektionsspritze verwendet, die beispielsweise mi Blutserum gefüllt ist und so betätigt wird, daß fü jede Analyse jeweils vorgegebene Mengen ausge teilt werden.

b) Bei kleineren Volumen wird die Probe in ei dünnwandiges Kunststoffröhrchen eingesaugt un letzteres in Stücke abgelängt, die den für di verschiedenen Analysen gewünschten Volume entsprechen.

c) für die allerkleinsten Mengen wird mit einer Schraubpipette das unbedeutende Probevolumen ausgepreßt und anschließend entweder der Bruchteil eines Tropfens von der Pipettenspitze abgeschabt oder nach Einfrieren durch Kohlensäure mit einer scharfen Kante abgeschnitten. Dies verhindert das Verschleppen von Probeflüssigkeit, was ansonsten die Präzision und Reproduzierbarkeit herabsetzt.

B. Zusatz der Reagenzeinheit
zu den Küvetten mit Grundlösung

Die Überführung der Probe in die Küvette erfolgt mit Hilfe des Trägers für die Reagenzeinheit zusammen mit letzterer.

Flüssige Reagenzien mit großem Volumen, d. h. mehr als 50 μΙ, werden mit einer herkömmlichen Spritzpipette zugesetzt, die ein Umschaltventil besitzt. Letzteres arbeitet so, daß es bei einer Kolbenbewegung in der einen Richtung ein bestimmtes Flüssigkeitsvolumen entleert und bei entgegengesetzter Kolbenbewegung Reagenz aus einem Vorratsgefäß in die Spritzpipette leitet.

Für Reagenzien in fester Form und in geringen Mengen, die leicht und rasch löslich sind, sowie bei geringen Reagenzvolumen, d. h. unter 30 μΙ, gelangen die erfindungsgemäß fertiggestellten Träger zur Anwendung, welche die mit erforderlicher Genauigkeit abgemessene Reagenzeinheit aufnehmen. Diese Reagenzeinheiten sind ohne Substanzverlust an den Träger gebunden, bis dieser in das die Grundlösung enthaltende Reaktionsgefäß gelangt.

Es ist somit wesentlich, daß zwischen den Probeflüssigkeitsbehältern, d. h. zwischen Spritzpipette und Schlauch, erfindungsgemäß ein Träger eingeführt wird, der als Zwischenglied vor der Küvette vorhanden ist. Dadurch werden Kontaminationen verhindert, die ansonsten durch Eintauchen einer Schlauch- oder Pipettenspitze in eine Lösung erfolgen könnten. Dieser Träger kann, wie bereits erwähnt, teils die geringe Probemenge aufnehmen, teils als Vorratsgefäß für Probesubstanz und Reagenz während der Überführung in die Flüssigkeit der Küvette dienen und schließlich die wichtige Funktion eines Mischers für die Lösung übernehmen, da er mit magnetisierbarem Material versehen ist.

Im folgenden werden einige Beispiele von für Analysen erforderlichen Chemikalien, die als Reagenzeinheiten verwendet werden können, sowie einige Beispiele von verschiedenen Alternativverfahren, zwischen denen im Labor gewählt werden kann, aufgeführt.

Beispiele von Reagenzien, die bei

klinischen Analysen in bestimmten Dosen für die

jeweiligen Analysen verwendet werden

Es wird vorausgesetzt, daß die nachstehenden Chemikalien oft amorphe oder mikrokristalline Form haben und sich rasch lösen. Das Auflösen kann durch Zusätze inerter und besonders leichtlöslicher Stoffe erleichtert werden.

A. Reagenzchemikalien

DL-Alanin

4-Aminoantipyrin = 4-Amino-1,5-dimethyl-2-phenyI-

S-pyrazolon^-amino^-methyl-1 -propanol

Ammoniumheptamolybdat, 4 aq.

Ascorbinsäure

Bromkresolgrün = 3,3'-, 5,5'-Tetrabrom-

m-kresolsulfonphthalein Brij 35 = Polyäthylenlaurylalkohol Coffein

o-Dianisidin = 3,3'-Dimethoxybenzidin Dextransulfat EDTA = Äthylendiamintetraessigsäuredinatriumsalz Fast Red B-SaIz = 5-Nitro-2-aminomethoxybenzoldiazotat. Sigma Hydrochinon HBAB = 2-(4'-Hydroxybenzazo)-benzoesäure INT=2-(4-Jodphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid Isopropanol = 2-Propanol Prim. Kaliumphosphat = saures Kaliumphosphat See. Kaliumphosphat = phosphorsaures Kalium Dikaliumoxalat, 1 aq.

Kaliumferricyanid = Kaliumhexacyanoferrat (111) Kaliumnatriumtartrat, 4 aq.

Alphaketoglutarsäure = 2-Oxoglutarsäure Kupfersulfat, 5 aq.

Magnesiumchlorid, 6 aq.

Magnesiumsulfat, 7aq.

DL-Milchsäure, 85 Gew.-% L-Milchsäure, 98 -100 Gew.-% NAD = Nicotinamidadenindinucleotid NADH = reduziertes Nicotinamidadenindinucleotid Alphanaphthylphosphat = Natriumnaphthyl( 1 Jphosphai Natriumacetat Natriumazid Natriumbenzoat Trinatriumcitrat, 2 aq.

Natriumhydroxyd Natriumhypochlorit Natriumcarbonat Natriumnitrit Natriumdisulfit (Na₂S₂O₅) Natriumsulfit Dinatriumtetraborat, lOaq.

Neocuproin = 2,9-Dimethyl-l,10-phenantrolin Dinitrophenylhydrazin = 2,4-Dinitrophenylhydrazin Nitroprussidnatrium, 2 aq. = Dinatriumpentacyanonitrosylferrat

Nitroso-R=l-Nitroso-2-hydroxy-3,6-naphthalindinatriumsulfonat Phenol

Phenylphosphatdinatriumsalz PMS = 5-MethylphenaziniummethylsuIfat Pikrinsäure Sulfanilsäure 5-Sulfosalicylsäure, 2 aq.

TPTZ = 2,4,6-Tri(2-pyridil)-1,3,5-triazin Thymol

Zinksulfat, 7 aq.

Zitronensäure, 1 aq.

B. Standardsubstanzen

1. Zum Zubereiten von primären absoluten Standardlösungen seien folgende Beispiele genannt:

Für diese Substanzen ist extreme Exaktheit dei einzelnen Dosen erforderlich.

Calciumkarbonat Cholesterol Ferrinitrat, 9 qa. Glucose Harnsäure Harnstoff Kaliumnitrat

709 537/36

Prim. Kaliumphosphat (KH₂PO₄)

Kreatinin

Milchsäure

NADH (reduziertes Nicotinamidadenin-

dinucleotid)

Natriumnitrit

Oxalessigsäure

Pyrotraubensäure — 2-Oxapropansäure

2. Für bestimmte primäre biologische Standarde sind Kontrollanalysen erforderlich. Als Beispiele seien genannt:

Albumin,

Serumalbumin von Menschen und Tieren

Bilirubin

Enzympräparationen, u. a. Amylase,

verschiedene Esterasen,

Glucoseoxydase, Peroxydasen,

Urease, Urikase.

Hämoglobinderivate, v/ie Oxyhämoglobin,

Cyanhämoglobin.

Kombinationsstandarde für vielkanalige Analysatoren.

Apparatstandarde und Chemikalienmischungen

zur Kontrolle von speziellen Apparatfunktionen,

z. B. Photometrie (kolorimetrischer Standard).

Im Handel erhältliche Standardserumpräparate mit verschiedenen Gehalten und Enzymaktivitäten.

C. Reagenzien für Pufferlösungen

Für eine chemische Reaktion ist der Säuregrad ebenso wie die lonenkonzentration von großer Bedeutung. Der Säuregrad, d. h. pH-Wert, wird durch das Verhältnis zwischen Säure und Lauge bestimmt, wogegen die absolute Menge oder Konzentration innerhalb bestimmter Grenzen von geringerer Bedeutung ist.

Diese Reagenzien sind oft in der Grundlösung enthalten und einige Beispiele können andeuten, was gewöhnlich verwendet wird:

Zitronensäure/Natriumhydroxyd,
Barbital/Barbitalnatrium,
EDTA/Natriumhydroxyd,
GlykolI(Glycin)/Natriumhydroxyd,
primäre und sekundäre o-Phosphate
von Natrium- oder Kaliumsalzen,
Trispufferbase/Trispuffer-Hydrochlorid
sowie Essigsäure/Natriurnacetat.

Verfahrensbeispiele unter Verwendung von
Reagenzeinheiten bei chemischer Analyse

Beispiel I

Beurteilung von alternativen Möglichkeiten für die Bestimmung des Kreatiningehaltes in Blutserum mit der Pikratreaktion nach Jaffe. Die folgenden Alternativen unterscheiden sich bezüglich der Zusammensetzung der Grundlösung.

1. Grundlösung, 500 μΙ, mit alkalischem Pikrat, dem 40 μ! Blutserum zugesetzt werden.

Diese Alternative ist am gebräuchlichsten bei Analysen in größeren Serien und also insbesondere bei Automation. Ein Nachteil ist im wesentlichen die schlechte Haltbarkeit des Reagenz, das die ganze Zeit einer Zersetzung ausgesetzt ist. Die erforderliche Genauigkeit entscheidet, ob das Reagenz täglich nur einmal oder aber mehrmals neu zubereitet werden muß. Möglichst soll das Reagenz ständig frisch zubereitet sein.
2. Grundlösung in Form von 500 μΐ 0,15 M NaOH, der nach Vermischung eine Reagenzeinheit von 2,3 ±0,01 mg Pikrinsäure zugesetzt wird, die sich durch intensives Mischen rasch auflöst und dann mit dem Kreatinin reagiert.

Ό 3. Grundlösung in Form von 500 μΐ reinem Wasser, dem durch die Reager.zeinheit teils 40 μΐ Blutserum und teils 3±0,015mg NaOH zugesetzt werden. Durch intensives Mischen wird das Natriumhydroxyd aufgelöst und mit der Serumprobe vermischt. Danach wird eine Reagenzeinheit mit 2,3 ±0,01 mg Pikrinsäure zugesetzt.

In sämtlichen Fällen erfolgt die Photometrie bei nm Wellenlänge. Es kann entweder eine sogenannte kinetische Bestimmung durchgeführt, d. h. der erste Teil der Reaktionszeit als bester Ausdruck für den Kreatingehalt verwendet werden oder auf herkömmliche Weise die Bildung rötlicher Farbe nach einer bestimmten, etwas längeren Zeit abgelesen werden, wobei jedoch verschiedene nichtspezifische Nebenreaktionen mit anderen Stoffen als Kreatinin mehr oder weniger Einfluß ausüben.

Beurteilung

Die Alternativen 2 und 3 sind unter den angegebenen Verhältnissen aus analytischen Gesichtspunkten am besten, erfordern aber Reagenzeinheiten und gründliches Mischen. Die Wahl zwischen Alternative 2 und 3 ist meist abhängig davon, ob Grundlösung mit 0,15 M NaOH verwendet wird (für andere Analysen, die gleichzeitig ausgeführt werden). Praktische und wirtschaftliche Gründe dürften dann hierfür sprechen Reines Wasser Wellenlänge, ja ein gewöhnlicher Zusatz

Beispiel II

Bestimmung der Enzymaktivität bei sogenannter alkalischer Phosphatase in Blutserum.

Unter den verschiedenen, für die Bestimmung dieser Enzymaktivität verwendbaren Methoden wurde gewählt, die Menge Phenol zu bestimmen, die enzymatisch aus Phenylphosphat unter genormten Bedingunger während einer bestimmten Zeit frei wird, wonach die Reaktion unterbrochen wird und sich rotes Chinon durch chemische Reaktion mit 4-Aminoantipyrin (AAP] und Kaliumferricyanid bildet.

Folgende Alternativen stehen zur Verfügung.

1. Gewöhnlich verfährt man so, daß zu 400 μΐ einei Grundlösung mit Borat/Carbonat-Puffer und Magnesiumzusatz zwecks optimaler Enzymwirkung und mit0,44±0,002 mgNatriumphenylphosphatal: Substrat 6 μΙ Blutserum zugesetzt werden. Nach Durchmischen läßt man das Enzym eine bestimmte Zeit einwirken, wonach 0,61 ±0,006 mg AAF zugesetzt werden, beispielsweise in 50 μΙ Wasser sowie 4.8 mg Kaliumferricyanid, beispielsweise ir 50 μΐ Wasser.

2. Zu einer Grundlösung mit Borat/Carbonat-Puffei und Magnesiumaktivator werden eine Reagenzeinheit von 6μΙ Blutserum und 0,4 ±0,002 mg Natriurnphenylphosphat zugegeben. Nach Inkubierung werden eine Reagenzeinheit mit 0,61 ±0,006 mg AAP und eine Reagenzeinheit mit 4,8 mg Kaliumferricyanid zugesetzt, eventuell in der gleicher Reagenzeinheit.

In beiden Fällen erfolgt die Bestimmung durch Photometric bei 505 nm Wellenlänge. Die Aktivität wird in Einheiten auf der Basis der bei der Reaktion freigemachten Menge Phenol angegeben.

5 Beurteilung

Die letztgenannte Alternative ist überlegen, da das kritische Reagenz aus Natriumphenylphosphat in Lösung besteht, was schlecht haltbar ist.

Dagegen ist die Pufferlösung haltbar, und es ist ^|0 vorteilhaft, das Enzymsubstrat gesondert und in trockener Form vorliegen zu haben. Außerdem besteht der Vorteil, nicht davon abhängig zu sein, daß bei der Analyse die Pipettierung vollständig glückt und genau wird. "5

Die Mengen, um die es sich gewöhnlich bei Analysen handelt, wobei das Reaktionsvolumen bei der abschließenden Messung etwa 0,5 ml (500 μΐ) beträgt, liegen in der Größenordnung zwischen ca. 0,5 — 50 mg. Dies bedeutet, daß der absolute Fehler gelegentlich hoch- -*° stens 1 μ^ beispielsweise 0,20 mg ±0,001 mg (200 ±1 μg) sein darf.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Reagenzeinheiten bedeutet demgemäß im Prinzip, daß die Genauigkeit schon bei der Herstellung erreicht wird *5 und nicht erst bei der Analyse.

Allen Chemikalien, die zu den Reagenzien gehören und von denen Beispiele in den Gruppen A, B und C aufgeführt wurden, ist gemeinsam, daß die erfindungsgemäß geschaffenen Reagenzeinheiten eine sichere Möglichkeit darstellen, diese zu jedem beliebigen Zeitpunkt in genauer Menge zur Verfügung zu haben.

Darüber hinaus lassen sich für bestimmte Chemikalien spezifische Vorteile erzielen. Eine der grundlegenden Regeln ist, daß Chemikalien in konzentrierten Lösungen oder in fester Form größere Haltbarkeit aufweisen. Für Reagenzeinheiten läßt sich dieses Prinzip noch mehr ausnutzen als für die derzeit gebräuchlichen Methoden, bei denen starke »Stammlösungen« verwendet werden, aus denen bei Bedarf die erforderlichen Gebrauchslösungen zubereitet werden.

In manchen Fällen, insbesondere bei teueren Reagenzien, ist diese erhöhte Haltbarkeit besonders wesentlich und besser als die gebräuchliche Technik, Lösungen zuzubereiten und diese tiefgefroren aufzubewahren, z. B. NADH.

Für alle Standardsubstanzen ist die Präzision der Reagenzmenge von entscheidender Bedeutung (Gruppe B), was die Bedeutung der Haltbarkeitsgesichtspunkte noch erhöht

In vielen Fällen ist es von Vorteil, die Reagenzkomponenten getrennt aufzubewahren, z. B. Pikrinsäure und Natronlauge bei Kreatininbestimmung.

Viele Lösungen, z. B. Acetat- oder Phosphatpufferlösungen, sind in neu zubereitetem Zustand vorteilhaft τ, da diese Lösungen rasch durch Bakterienzuwachs verderben können. Für Reagenzeinheiten mit beispielsweise den in Gruppe C genannten Reagenzien, benötigt man daher kein Konservierungsmittel, soweit solche überhaupt möglich sind, ohne die chemische Reaktion zu stören.

Die fabrikmäßige Herstellung der Reagenzeinheiten ergibt daher nicht nur eine gleichmäßige Qualität, sondern auch eine verbesserte Haltbarkeit und größere Stabilität Man kann außerdem damit rechnen, in verschiedenen Laboratorien nunmehr gleiche Ergebnisse zu erhalten. Derzeit kann man nämlich —wahrscheinlich aufgrund geringer Unterschiede in beispielsweise der Reinheit des Wassers, der Sorgfalt beim Reinigei von Gefäßen usw. — verschiedene Ergebnisse erhalten obgleich die Laboratorien die gleichen Analysenmetho den, die gleichen Chemikalien und die gleichet Meßinstrumenttypen verwenden. Einheitliche Reagenz einheiten ergeben eine bedeutend verbesserte Gleich mäßigkeit und die Möglichkeit, Ergebnisse zu verglei chen und Korrekturmöglichkeiten zu finden.

Die Erfindung wird im folgenden anhand dei Zeichnung weiter erläutert. Es zeigen

Fig. 1, 2 und 3 perspektivisch schematisch verschiedene Verfahren zur Herstellung der Reangenzeinheiten,

F i g. 4 perspektivisch einen Träger in Form eines Röhrchens für die Reagenzeinheiten,

F i g. 5 im Schnitt ein Röhrchen zur Aufnahme der auf einem Träger angeordneten Reagenzeinheiten gemäß F i g. 1 oder 2 und

F i g. 6 eine Anzahl von in einer Kassette zusammengefaßten und jeweils in einem der Röhrchen gemäß F i g. 4 enthaltenen Reagenzeinheiten.

Gemäß F i g. 1 wird die Reagenzmenge aus der Mündung 2 einer senkrecht angeordneten Spritzpipette 1 tropfenweise ausgegeben, indem beispielsweise ein nicht dargestellter Synchronmotor den Kolben der Spritzpipette 1 mit vorgegebener Geschwindigkeit nach unten drückt. Die einzelnen Tropfen fallen auf ein in Pfeilrichtung unter der Mündung 2 der Spritzpipette 1 entlanglaufendes Band 3 und bilden dort Einheitsdosen 4. Das Band 3 kann aus Kunststoff bestehen und enthält magnetisierbares Material. Die gebildeten Einheitsdosen 4 werden getrocknet oder eingefroren und das Band 3 anschließend in einzelne Träger mit Einheitsdosen abgelängt, beispielsweise durch eine Messerschneide oder ein Kreismesser.

F i g. 2 zeigt eine ähnliche Anordnung, jedoch mit dem Unterschied, daß mit dem Mundstück 22 einer Pipette 21 ein Reagenzstrang 24 auf einen bandförmigen Träger 23 ausgepreßt wird. Dieser enthält ebenfalls magnetisierbares Material und wird anschließend durch eine nicht dargestellte Schneidanordnung in der angedeuteten Weise in genaue Einheitslängen aufgeteilt, die Einheitsdosen mit genauen Reagenzmengen ergeben.

Es ist auch möglich, aufrechtstehende Trägerröhrchen 43 gemäß Fig.4 in einer Reihe hintereinander anzuordnen und anstelle des Trägerbandes 3 oder 23 an der Spritzpipette 1 gemäß F i g. 1 oder aber unter der Mündung 32 der Spritzpipette 31 gemäß Fig.3 vorbeilaufen zu lassen. Im letztgenannten Fall wird das gelförmige Reagenz durch ein in Pfeilrichtung hin und her bewegliches Messer 35 in dünne Scheiben 36 zerschnitten, die in die aufrechtstehenden Trägerröhrchen 43 fallen, deren oberer Deckel 46 offen, deren unterer Deckel 44 jedoch verschlossen ist. Es ist auch möglich, anstelle des Messers 35 die scharfe Oberkante 45 der Trägerröhrchen 43 die in Gelform ausgepreßte Reagenzeinheit 36 abschaben zu lassen. Nachdem die einzelnen Trägerröhrchen 43 auf diese Art und Weise mit Reagenzeinheiten gefüllt sind, wird der obere Deckel 46 verschlossen. Die Trägerröhrchen 43 können sodann in eine Kassette 67 gemäß Fig.6 eingefüllt werden.

In die Wände der Trägerröhrchen 43 sind Eisendrähte 47 oder anderes magnetisierbares Material eingebettet, das es ermöglicht, die Trägerröhrchen 43 nach Einführen in ein Reagenzglas durch dieselben in einer Analysenmaschine umgebende elektromagnetische Spulen in eine Auf- und Abwärtsbewegung in der Grundlösung zu versetzen, so daß die Reagenzeinheit

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im Trägerröhrchen 43 in der Grundlösung aufgelöst wird. Selbstverständlich müssen die Deckel 44, 46 des Trägerröhrchens 43 vorher geöffnet werden, bevor man es in das Reagenzglas fallen läßt, in dem die Reaktion erfolgen soll.

F i g. 5 zeigt eine Einheitsdosis, wobei in ein Röhrchen 53, in dessen Wände Eisendrähte 57 eingebettet sind, eine auf einem Träger angeordnete Fteagenzeinheit gemäß F i g. 1 oder 2 eingeführt ist.

Die in Figo dargestellte Kassette 67 mit darin angeordneten Trägerröhrchen 43 ist mit einer versiegelbaren Öffnung 68 versehen. In der Kassette 67 .st e.ne durch Federn 69 beaufschlagte Ausgabeanordnung 70 vorgesehen durch die bei Bedarf die Trägerröhrchen 43 aus der Öffnung 68 ausgegeben werden können. Die Kassette 67 kann mit eine. Schutzgasatmosphäre gefüllt sehi beispielsweise mit Stickstoffgas, getrockneter Luft oder mit einer Äthylenoxydatmosphare.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Reagenzeinheit für Standardmikroanalysen, die insbesondere durch Vorfabrikation aus einer Reagenzmenge vorbereitet ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzmenge mit einem Fehler unter 1% in für eine einzige Analyce vorgesehene genaue Reagenzeinheiten von jeweils einer Einheitsdosis (4,36) bis zu 30 μΐ, d. h. bis zu ca.

30 μ& aufgeteilt ist und daß jede Mikroeinheitsdosis (4, 36) an einen Träger (3, 23, 43, 53) gebunden ist, der mit einem magnetisierbaren Material (47, 57) versehen ist.

2. Reagenzeinheit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das magnetisierbare Material in Form wenigstens eines Drahtes (47, 57) in Längsrichtung des Träger.,, insbesondere in der Wand eines Trägerröhrchens (43, 53), vorgesehen ist.

3. Reagenzeinheit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das magnetisierbare Material in Hülsenform in der Wand eines röhrenförmigen Trägers angebracht ist.

4. Reagenzeinheit nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz an den Träger dadurch gebunden ist, daß es aus einer stark konzentrierten Lösung oder einer ganz oder teilweise festen Substanz besteht, der ein löslichkeitsfördernder Stoff zugesetzt ist.

5. Reagenzeinheit nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz inerte Stoffe mit viskositätserhöhender Wirkung enthält, wie Agar-Agar, Pektin, Gelatine oder Zellulosederivat.

6. Reagenzeinheit nach einem der Ansprüche

1-5, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz durch Überführen in feste Form mittels Temperatursenkung an den Träger gebunden ist.

7. Reagenzeinheit nach einem der Ansprüche 1 - 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzdosis (4) in einem begrenzten Bereiche eines bandförmigen, insbesondere als Kunststoffstreifsn ausgeführten Trägers (3) vorliegt.

8. Reagenzeinheit nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzdosis aus einer genau abgeschnittenen Länge eines Reagenzstranges (24) auf dem bandförmigen Träger (23) besteht.

9. Reagenzeinheit nach einem der Ansprüche 1 —7, dadurch gekennzeichnet, daß der das Reagenz enthaltende Träger die Form eines Röhrchens, insbesondere eines Kunststoffröhrchens, aufweist, in dessen Wand ein schmaler Kanal zur Aufnahme einer Probesubstanz angebracht ist.

10. Reagenzeinheit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägerröhrchen (43) mit Endverschlüssen in Form von mit dem Trägerröhrchen (43) verbundenen Deckeln (44,46) versehen ist.

11. Reagenzeinheit nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger oder die Deckel in einer schalenförmigen Versenkung mit einem inert absorbierenden Mittel zur Aufnahme der Probesubstanz für die Analyse versehen sind.

12. Reagenzeinheit nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Reagenz enthaltende Träger in ein Röhrchen (53) eingeführt sind, in dessen Wand magnetisierbare oder permanentmagnetische Drähte (57) oder Hülsen angebracht sind.