DE3108924C2

DE3108924C2 - Verfahren und Einrichtung zur chromatographischen Trennung und quantitativen Analyse von Ionen

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Publication number: DE3108924C2
Application number: DE19813108924
Authority: DE
Inventors: Edward L. Milpitas Calif. Johnson; Christopher A. Castro Valley Calif. Pohl; William E. Mountain View Calif. Rich jun.; Thomas O. Palo Alto Calif. Sidebottom
Original assignee: Dionex Corp
Current assignee: Dionex Corp
Priority date: 1980-03-10
Filing date: 1981-03-09
Publication date: 1989-07-20
Also published as: AU6804981A; GB2070964A; AU546009B2; FR2496891B1; GB2070964B; FR2496891A1; DE3108924A1

Abstract

Verfahren und Einrichtung zur chromatographischen Trennung und quantitativen Analyse von Ionen gleicher Ladungen in einer Probe, z.B. von Kationen oder Anionen. Zur Analyse der anorganischen Anionen werden die Probe und ein Eluationsmittel auf eine Säule mit einem hydrophoben porösen chromatographischen Trennmedium (organisches Harz oder gebundende Phase) mit einem großen Oberflächenbereich und ohne permanent anhaftende Ionenaustauschstellen geleitet. Das Eluationsmittel (eine polare mobile Flüssigkeit) umfaßt ein organisches Kation, welches reversibel an dem Harz gebunden ist und Ionenaustauschstellen schafft, welche die Anionen zur chromatographischen Auftrennung unterschiedlich verzögern. Das Eluationsmittel umfaßt ferner ein Entwicklungsreagens der gleichen Ladung, wie das zu analysierende Ion. Das Eluationsmittel einschließlich der getrennten Anionen wird sodann durch ein Ionenaustauscherharz geführt, welches den Durchgang des Gegenions und dessen Co-Ions in ionischer Form ausschließt und sodann durch eine Leitfähigkeitszelle zur quantitativen Erfassung. Anorganische Kationen können in analoger Weise erfaßt werden. Das System kann auch für die Analyse weitgehend organischer Kationen oder Anionen (z.B. von oberflächenaktiven Stoffen) eingesetzt werden. In diesem Falle wird das interessierende organische Ion schon durch das poröse chromatographische Trennmedium stark angezogen und somit kann das Gegenion ein anorganisches Ion sein.

Description

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die polare mobile Flüssigkeitsphase eine im wesentlichen nichtionische, organische polare Verbindung in einer Menge aufweist, mit der die Verzögerungszeit der Ionen in dem Bett kontrolliert werden kann.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die polare mobile Flüssigkeitsphase ein Entwicklungsreage;-,i einschließlich eines anorganischen Entwickljngsions der gleichen Ladung wie die Ionen in einer Me ige enthält, mit der die Verzögerungszeit der Ionen in dem Bett kontrolliert werden kann, wobei das Entwicklungsion und sein Co-Ion vom Durchgang durch die zweite Säule in ionischer Form ausgeschlossen sind.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das chromatographische Harz einen Oberflächenbereich von mindestens 100 m^J/g aufweist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das chromatographische Harz einen Löslichkeits-Parameter im Bereich zwischen etwa 7,5 und 15,0 aufweist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Co-Ion des Gegenions ein Hydroxid, Borat oder Carbonat ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Säule eine Kationenaustauschersäule in der Wasserstofform ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Anionen anorganische Anionen eingesetzt werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Gegenion ein Alkylammoniumion verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Co-Ion des Gegenions Wasserstoff verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als zweite Säule eine Kationenaustauscher-Säule in der Hydroxid-Form eingesetzt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das chromatographische Bett aus einem organischen Harz besteht.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß ein chromatographisches Bett verwendet wird, welches Kohlenwasserstoffketten, gebunden an ein Substrat, enthält

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat Siliziumdioxid enthält.

15. Vorrichtung zur chromatographischen Trennung und quantitativen Analyse von Ionen in einer polaren mobilen Flüssigkeitsphase, enthaltend ein übliches Gegenion für die Ionen, gekennzeichnet durch

a) eine erste Säule mit einem porösen, hydrophoben chromatographischen Bett ohne permanent anhaftende Ionenaustauschstellen, wobei das Bett Kohlenwasserstoffketten enthält, die in der Lage sind, reversible Adsorptionsbindungen mit organischen Komponenten in der polaren mobilen Flüssigkeitsphase auszubilden,

b) eine zweite Säule mit einem Ionenaustauscherharz-Bett und

c) eine Einrichtung zur Leitfähigkeitsmessung und eine daran angeschlossene Ablesevorrichtung, wobei die Leitfähigkeitsmeßeinrichtung mindestens eine Durchfluß-Leitfähigkeitszelle umfaßt.

16. Einrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat dar ersten Säule Siliziumdioxid enthält

17. Einrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das chromatographische Bett aus einem organischen Harz besteht

Die Erfindung betrifft die quantitative Analyse von Anionen oder Kationen in einem einzigen System (wie aus dem Oberbegriff von Anspruch 15 ersichtlich). Die Umkehrphasen-Chromatographie (RPLC) ist weit verbreitet als eine Art der Trennung in der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). In der RPLC ist die mobile Phase polarer als die stationäre Phase, während in der herkömmlichen Chromatographie, wo die Vorentwicklung der RPLC durchgeführt wurde, die Verhältnisse umgekehrt sind. An Siliziumdioxid-Substraten haftende chemisch gebundene Kohlenwasserstoffketten (Alkylreste) sind eine übliche Form der stationären Phase. Die Art der Bildung derartiger stationärer Phasen und geeignete Techniken zur Durchführung der RPLC sind z. B. von N. H. C. Cooke und K. Olsen. Am. Lab., 45 (August 1979), beschrieben. Umkehrphasen-Ionenpaarchromatographie (Reversed Phase Ion Pair Chromatography) hat eine hinreichende Beliebtheit gewonnen. Bei dieser Technik wird der mobilen Phase ein Salz zugesetzt, um die chromatographischen Eigenschaften zu verbessern. Während hinsichtlich der Theorie der Trennung unterschiedliche Ansichten bestehen, werden die dort beschriebenen experimentellen Techniken allgemein angewendet Insbesondere wird die Probe in eine wässerige polare mobile Phase geführt, welche üblicherweise einen niederen Alkohol, Acetonitril oder ein anderes mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel enthält, zusammen mit einem Gegenion, welches bei der Analyse von Anionen typischerweise das Tetrabutylammoniumion (TBA) ist. Nach einer Theorie werden hydrophobe Ionenpaare ge-

bildet, welche relativ unpolar sind und so durch die Säule unterschiedlich verzögert werden. Nach einer anderen Theorie wird das Gegenion, beispielsweise TBA, an der Oberfläche absorbiert und bildet eine reversible Ionenaustauschstelle auf der stationären Phase. Diese Technik wird hauptsächlich für die chromatographische Trennung und Analyse organischer Säuren und Basen angewendet Im allgemeinen werden die üblichen HPLC-Detektoren verwendet, z. B. Ultraviolett-, Fluoreszenz- und Bi3chungsindex-{Ri)-Detektoren. Jedoch sind diese typischen Nachweis-Techniken für die Analyse der durch RPLC getrennten anorganischen Substanzen ungeeignet Außerdem sind sie gegenüber nicht chromophoren organischen Molekülen mit niedrigem pK_a- oder pKb-Wert, wie oberflächenaktiven Mitteln, relativ unempfindlich.

In der US-PS 40 42 327 wird eine Umkehrphasen-Ionenpaarchromatographie unter Verwendung einer Füllung mit gebundener Phase beschrieben. Die zu analysierenden Spezies sind im allgemeinen auf organische Verbindungen beschränkt Die Füllung ist bei hohen und niedrigen pH-Niveaus instabil und läßt sich deshalb nur zur Analyse von anorganischen Anionen Lew. Kationen verwenden.

In einer neueren Veröffentlichung von F. F. Cantwell und S. Puoh, Anal. Chenu 51, Nr. 5 (Mai 1977), S. 623, wurde die Verwendung eines nicht-ionischen makroporigen Harzes (ein Copolymer aus Styrol und Divinylbenzol, welches unter dem Warenzeichen Amberlite XAD-2 vertrieben wird) als stationäre Phase für die RPLC beschrieben. Ein bedeutender Vorteil der Verwendung dieses Harzes liegt in seiner Stabilität bei extremen pH-Bereichen im Gegensatz zu einer stationären Phase auf Siliziumdioxid-Basis. Jedcch weisen die herkömmlichen Bestimmungs-Techniken, wie sie zuvor beschrieben wurden, die gleichen Nachteile auf.

Ein anderes chromatographisches System, welches als Ion-Chromatographie bezeichnet wird, wurde zur quantitativen Bestimmung von organischen und/oder anorganischen Anionen und/oder Kationen in wässerigen Proben-Lösungen verwendet. Nach dieser Technik wird die chromatographische Trennung an einer oder mehreren Säulen mit Ionenaustausch-Trennharz niedriger Kapazität durchgeführt. Sodann wird das Eluationsmittel durch eine Sperrsäule mit einem Ionenaustauscherharz hoher Kapazität geführt, welches das Eluationsmittel aus einer leitenden Form in eine nichtleitende Form überführt und damit die Hintergrund-Leitfähigkeit des chromalographischen Systems verringert. Die zu analysierenden Ionen werden aus der Sperrsäule eluiert und bilden hochleitende Ionen, die durch eine Leitfähigkeitszelle geführt werden und durch ihre Leitfähigkeit quantitativ bestimmt werden. Diese Technik ist für Ionen gut geeignet, welche aus der Sperrsäule in einer Form eluiert werden, die eine Dissoziations-Konstante mit einem Wert von mehr als 10" ^Ί aufweist. Moleküle mit geringeren Dissoziations-Konstanten sind durch die Leitfähigkeit bei chromatographischen Konzentrationsbereichen nicht bestimmbar.

Eine Begrenzung der Ionenchromatographie besteht darin, daß das Trennhar? ein herkömmliches permanent jonenaustauschstellen enthaltendes Harz sein muß. Dies legt grundsätzlich sowohl die Ionenaustauschkapazität und die Selektivität der Trennkolonne fest, da die Ionenaustauscher-Gruppen chemisch an das Substrat-Harz gebunden sind. Somii erfordert bei einer vorgegebenen Säule und einem vorgegebenen Harz eine Modifizierung der chromatograph'ischen Trennung eine chemische Modifizierung des Harzes, wie die Änderung der Ionenaustausch-Gruppen durch Einsatz eines unterschiedlichen Harz-Typs. Das ist ein zeitraubendes und teures Verfahren. Die Kapazität des Trennharzes muß gering sein, so daß Eluationsmittel mit relativ geringer Ionenstärke eingesetzt werden können, um die Lebensdauer der Sperrsäule zu maximieren. Die Trennung von hochionisierten Ionen gemäß dieser Technik ist beispielsweise in der US-PS 39 20 397 beschrieben.

ίο Aufgabe der Erfindung ist es, die besten Eigenschaften der zuvor erwähnten bekannten Umkehrphasen-Ionenpaarchromatographie und der Ionenchromatographie zu kombinieren. Diese Aufgabe wird wie aus den vorstehenden Ansprüchen ersichtlich gelöst

Insbesondere ist es eine Aufgabe der Erfindung, eine Ionenchromatographie-Technik zu schaffen, nach welcher die chromatographische Selektivität und die chromatographische Kapazität lediglich durch Änderungen in der Zusammensetzung des Eluationsmitiels und der Konzentration variiert werden können.

Diese überlegene chromatographi7"he Trenn-Technologie sollte mit dem überlegener: Errattlungs-System der Ionenchromatographie kombiniert werden, wodurch die hochselektive und empfindliche Ermittlung und quantitative Bestimmung von Ionen mit niedrigen pK_a- oder pKt,-Werten erleichtert wird. Es sollte ferner eine Optimierung der Ionentrennung über einen großen Selektivitäts-Bereich durch derartige Eluationsmittel-Änderungen ohne schnellen Verbrauch der Sperrsäule geschaffen werden.

Es sollte schließlich eine Technik zur Trennung und Ermiulung großer organischer Ionen geboten werden, die mit der herkömmlichen Ionenchromatographie schwierig durchzuführen sind und für welche die Ermittlungsgrenzen der herkömmlichen Umkehrphasen-Ionenpaarchromatographie unter Verwendung von Ultraviolett- oder Brechungsindex-Detektoren nicht geeignet ist. Insbesondere sollte ein poröses, hydrophobes chromatographisches Harz, welches gegenüber e-itrem hohen pH-Niveaus stabil ist und somit für den ausgedehnten chromatographischen Betrieb von anorganische .i Anionen ohne Zerstörung geeignet ist, als stationäre Phase einsetzbar sein.
Eine mögliche Interpretation der Vorgänge folgt. Danach bilden, anstelle, daß das Gegenion der Austauschstellen bildenden Verbindung eine reversibel absorbierte Ionenaustauschsteile bildet, das Gegenion und die Ionen reversible Ionenpaare, die auf dem chromatographischen Bett reversibel absorbiert sind und eine unterschiedliche Verzögerung und chromatographische Auflösung bewirken. Danach werden die getrennten Ionen durch die Sperrsäule und die Leitfähigkeitszelle geleitet. Diese Theorie erklärt am besten die Trennung von Organismen Molekülen mit langen Ketten, wie beispiels- weise von oberflächenaktiven Stoffen, welche die primären Adsorptior.rbindungen der Ionenpaare bilden. Tatsächlich sind anorganische Gegenionen bevorzugt bei der Analyse derartiger organischer Ionen, um die Desorption von der Säule in einer angemessenen Zeit zu erlauben.

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung einer vereinfachten erfindungsgemäßen Einrichtung;

Fig.2 bis 6 zeigen Chromatogramme, welche die Auftrennung von unterschiedlichen Ionen nach der erfindungsgemäßen Technik darstellen. "

Das erfindungsgemäße System ist sehr vielseitig und kann zur Ermittlung einer großen Anzahl starker und/ oder schwacher organischer und/oder anorganischer

Ionen eingesetzt werden, solange diese zu bestimmenden Ionen lediglich kationischer oder anionischer Natur sind. Derartige Ionen sind üblicherweise mit Gegenionen assoziiert, jedoch können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lediglich Ionen einer gemeinsamen Ladung bestimmt werden. Geeignete Proben umfassen Oberflächenwasser einschließlich Salzwasser und andere Flüssigkeiten, wie industrielle chemische Abwasserströme, Körperflüssigkeiten, wie Serum und Urin, Getränke, wie Fruchtsäfte und Weine, und Trinkwasser. Covalente molekulare Verbindungen, wie Amine, die durch Bildung von Säuresalzen in eine ionische Form überführbar sind, sind erfindungsgemäB ebenfalls analysierbar. Der hier verwendete Begriff »Ionen« umfaßt Ionen und Teile von Molekülen, welche unter den Bedingungen des vorliegenden Verfahrens ionisierbar sind.

F i g. 1 zeigt eine vereinfachte Einrichtung zur Durchführung des erfindungsgernäßen Verfahrens. Die Probe wird zweckmäßigerweise mittels einer Spritze (nicht dargestellt) beim Proben-Injektionsventil 10 in das System eingebracht. Die Probe wird mittels eines Eluationsmittels durch das System gefördert vom Vorratsbehälter 11 durch eine Pumpe 12, welche danach in die chromatographische Trennsäule 13 eines weiter unten beschriebenen Typs führt. Das Eluationsmittel aus Kolonne 13 durchläuft die Sperrsäule 14, in welcher Ionen mit den zu analysierenden Ionen entgegengesetzter Ladung im wesentlichen vom Durchlauf in ionischer Form ausgeschlossen sind. Typischerweise wird dieses durch Abziehen dieser Ionen bewirkt. Sodann fließt das Eluationsmittel durch eine Flüssigkeitsleitung zur Leitfähigkeitszelle 15. Das elektrische Signal, welches an der Zelle 15 abgegeben wird, in der die Fluktuation der ionischen Konzentration ein elektrisches Signal erzeugt, welches proportional zur Menge des ionischen Materials ist, welches durch ein Leitfähigkeits-Meßgerät 16 registriert wird, wird auf die Registrier-Emrichtung 17 gegeben, die eine sichtbare Ablesung für das Signal von der Leitfähigkeitszelle 15 schafft. Nach Durchlauf durch die Leitfähigkeitszelle wird die Flüssigkeit verworfen.

Die Art der Trennung in Säule 13 kann durch zwei unterschiedliche theoretische Mechanismen erklärt werden, die hier als »Ionenpaar-Theorie« und »Theorie des reversiblen Ionenaustausches« bezeichnet werden. Unabhängig von der vorherrschenden Theorie verwendet das System eine mobile polare Phase, welche in ihrem Charakter polarer als die stationäre Phase ist die ein Gegenion trägt, welches mit den zu bestimmenden Ionen in Wechselwirkung steht. Diese Art eines Systems wird allgemein ah ein »Umkehrphasen-Verfahren« bezeichnet. Im Anfangsstadium der Arbeit mit Umkehrphasen wurde die lonenpaar-Theorie (wie sie in dem zuvor erwähnten Artikel von Cooke und Olsen beschrieben wird) als anwendbar angesehen, während einige jüngere Veröffentlichungen der anderen Theorie den Vorzug geben, welche nachfolgend näher erläutert wird. Die Erfindung kann nach einer der beiden oder nach beiden Theorien erklärt werden und die Kombination der Verwendung des Umkehrphasen-Verfahrens zur chromatographischen Trennung zusammen mit der Ionenchromatographie-Technik zu quantitativen Bestimmung der getrennten Ionen bildet einen wesentlichen Aspekt der Erfindung.

Das Verfahren wird zunächst in Obereinstimmung mit der Trennungstheorie über reversiblen Ionenaustausch beschrieben. Zur Einfachheit der Beschreibung werden zunächst anorganische Anionen in der Probe beschrieben, die getrennt und quantitativ in dem System bestimmt werden sollen. Das Eluationsmittel in dem Vorratsbehälter 11, welches die mobile polare Phase für die Probe bildet, enthält eine Ionenaustauschsteilen bildende Verbindung. Diese Verbindung umfaßt ein Gegenion mit einer zu bestimmenden den Ionen entgegengesetzten Ladung und ein Co-Ion einer den Ionen gleichen Ladung. (Nachfolgend weist der Begriff »Gegenion« in Alleinstellung auf das letztgenannte Gegenion hin, und der Begriff »Co-Ion« allein weist auf das Co-Ion des Gegenions hin.) Ein poröses hydrophobes chromatographisches Bett mit im wesentlichen keinen permanent anhaftenden Ionenaustauschstellen ist in der Trennsäule 13 enthalten. Das ist zu unterscheiden von einem herkömmlichen Ionenaustauscherharz, in welchem die Ionenaustauschstellen durch kovalente Bindung an das Harzsubstrat permanent anhaften.

Gemäß der Theorie des reversiblen Ionenaustausches ist das Gegenion von einer Art, welche reversible Adsorptionsbindungen in situ in dem chromatographischen Bett bildet und so Ionenaustauschstellen darin schafft. Auf diese Weise werden die zu trennenden Ionen unterschiedlich verzögert durch die so gebildeten Ionenaustauschstellen und werden chromatographisch in dem Eluationsmittel von diesem Bett getrennt. Die anorganischen Anionen, auf welche die vorliegende Technik angewendet werden kann, umfassen im wesentlichen alle Typen von den schwach bis stark auf dem chromatographischen Bett festgehaltenen Spezies. Beispielsweise können die folgenden Anionen getrennt werden: Fluorid, Chlorid, Nitrit, Nitrat, Chlorat, Perchlorat, Bromid, Bromat, Jodid, Jodat, Sulfat, Thiosulfat, Persulfat, Pyrosulfat, Phosphat, Pyrophosphat, Azid. Cyanid, Ferricyanid und Thiocyanat.

Vor dem Zeitpunkt der Erfindung wurde nicht angenommen, daß anorganische Anionen oder Kationen unter Anwendung einer der beiden vorstehend beschriebenen theoretischen Mechanismen getrennt werden können.

Eine Vielzahl von stationären Trennphasen für die Umkehrphasen-Chromatographie, wie von dem im Artikel von Cooke und Olsen erwähnten Typ, kann angewendet werden. Eine effektive Art eines chromatographischen Bettes, welches für die stationäre Phase eingesetzt werden kann, umfaßt an ein Substrat gebundene Kohlenwasserstoffketten. Diese Ketten besitzen typischerweise 8 bis 18 Kohlenstoffatome in ihrer Länge. Solche chemisch gebundene Alkylphasen werden üblicherweise durch Umsetzung eines Oberflächen-Siliziumdioxid-Silanols mit Organochlorsilanen hergestellt Die Art der Kette kann variiert werden in Abhängigkeit von den interessierenden Ionen. Zweckmäßigerweise liefert das Bett einheitliche Oberflächen mit organischen Ketten, so daß das Gegenion in einer einheitlichen wiederholbaren Art auf der Oberfläche absorbiert wird.

Eine typische Füllung aus phasengebundenem porösen Silikagel besteht aus Siliziumdioxid, welches mit einem organischen Material umgesetzt wurde, um darauf eine 18 Kohlenstoff umfassende Kette eines aliphatischen Restes zu tragen. Eine derartige Packung wird von der Firma Waters Associates, Ine, unter der Handelsbezeichnung Bondapak Cis vertrieben. Andere geeignete Harze werden von den Firmen Altex Corporation und Merck & Co, Ine, geliefert.

Eine besonders effektive stationäre Phase ist ein nicht-ionisches, poröses, hydrophobes, organisches Harz mit im wesentlichen keinen Ionenaustauschstellen.

Ein solches Harz ist ein Copolymer aus Styrol und Divinylbenzol, welches unter dem Warenzeichen Amberlite XAD-2 erhältlich ist und einen Oberflächenbereich von etwa 300 m²/g aufweist. Derartige Harze sind bei pH-Extremwerten, d.h. 1 bis 14, stabil im Vergleich zu den phasengebundenen Füllungen, welche zuvor beschrieben wurden und bei pH-Extremwerten weniger stabil jind.

Herkömmliche nicht-ionische, hydrophobe, poröse, organische Harze können erfindungsgemäß zur Trennung eingesetzt werden, wenn sie einen hinreichend großen Oberflächenbereich aufweisen und hinreichende hydrophobe Eigenschaften besitzen. Ein geeigneter minimaler Oberflächenbereich liegt bei Werten von etwa 10 bis 100 mVg bis zu einem maximalen Wert von 1000 mVg oder mehr, mit einem bevorzugten Bereich von etwa einem minimalen Wert von 200 bis 300 m²/g bis zu 600 m²/g. Typische Porengrößen liegen im Bereich von 30 A bis 100 A und 200 A oder höher. Derartige poröse Harze werden im allgemeinen unter Verwendung von Porogenen oder sogenannten Ausfällungsmitteln hergestellt. Geeignete Harze und Verfahren zu ihrer Herstellung sind in der US-PS 35 31 463 und in der US-PS 35 49 563 beschrieben. Das Verfahren zur Bestimmung des Oberflächenbereiches ist die Quecksilber-Porosimetrie, welche in dem Artikel »Advanced Experimental Techniques in Powder Metallurgy«, Band 5, Plenum Press (1970), beschrieben wird.

Ein wichtiges Merkmal des chromatographischen Bettes besteht darin, daß als Ergebnis seines großen Obe" 'lächenbereiches es eine entsprechend hohe Kapazität zur Bildung reversibler Ionenaustauschstellen mit den Gegenionen aufweist. Diese hohe Kapazität hat den Vorteil, daß die Menge des benötigten Füllmaterials minimiert wird. Es ist bekannt, daß die Adsorptionskapazität einer chromatographischen Füllung zum Oberflächenbereich der Füllung proportional ist.

Ein weiteres Merkmal der Füiiung besteht darin, daß sie hinreichend hydrophob ist, so daß das organische Gegenion an der Oberfläche des Harzes adsorbiert wird und dadurch chromatographisch festgehalten wird. Eine geeignete hydrophobe Stärke ist mit einem Copolymer aus Styrol und Divinylbenzol vergleichbar. In einer unterschiedlichen Art ausgedrückt, sind die bevorzugten Füllungen vernetzte Harze mit Löslichkeits-Parametern

(ausgedrückt in den Einheiten

1 / Kalorien λ
V cm^j J

von mindestens 7,5 bis zu 15,0 und typischerweise von etwa 9.

Bezüglich der anionischen Analyse sind geeignete Ioneriaustauschstellen bildende Verbindungen: Tetrabutylammoniumhydroxid, Mono-, Di-, Tri- und Tetra-alkylammoniumhydroxid. Die Gegenionen für die Analyse anorganischer Anionen müssen die den Anionen entgegengesetzte Ladung tragen und von einer Art sein, welche fähig ist, reversible Adsorpiionsbindungen mit dem chromatographischen Bett zu bilden. Das bedeutet, daß derartige Gegenionen organische Ketten umfassen müssen, insbesondere Alkylketten, von hinreichender Länge für eine einfache Adsorption an der Säule, wie es zu schwer ist, sie in einer angemessenen Zeit zu entfernen. Ein anderer Parameter der Ionenaustauschstellen bildenden erfindungsgemäßen Verbindung liegt darin, daß sie die Eigenschaft besitzen muß, im wesentlichen von dem Durchfluß durch die Sperrsäule 14 in ionischer Form ausgeschlossen zu sein. V/ie weiter unten erläutert wird, umfaßt bei einem zu untersuchenden Anion die Sperrsäule ein Kationenaustauscherharz und das Gegenion, das so beschaffen ist, daß es durch die Säule 14 entfernt oder abgestreift werden kann. Das Co-lon des Gegenions passiert die Säule, jedoch in im wesentlichen nicht ionisierter Form. Derartige Co-Ionen umfassen das Carbonat-, Borat- und Hydroxidion, welche alle schwach ionisierte Säuren oder Wasser in der Sperrsäule bilden. In den Fällen jedoch, in welchen Siliziumdioxid

ίο das chromatographische Bett bildet, besitzt das Hydroxidion eine begrenzte Verwendbarkeit aufgrund der Auflösung von Siliziumdioxid bei höheren pH-Niveaus. Das Ausmaß der Absorption des Gegenions bestimmt die Säulen-Kapazität, welche auf die gewünschte Retentionszeit für eine spezielle Probe zugeschnitten werden kann, durch Kontrolle der Menge der organischen polaren Flüssigkeit. Beispielsweise wurde experimentell gefunden, daß der Absorptionsgrad von Tetrabutylammoniumhydroxid (TBAH) beträchtlich steigt, wenn der Uehait an organischer poiarer Flüssigkeit (beispielsweise Acetonitril) abnimmt. Die Größe der TBAH-Adsorption ist relativ gering (beispielsweise 0,023 meq./ml für 100% Wasser als Eluationsmittel). Verglichen mit der Austauscherkapazität eines lonenaustauscherharzes (beispielsweise 0,5 bis 1,5 meq./ml). Somit ist die Kapazität einer Umkehrphasen-Säule in dieser Art begrenzt. Typischerweise ist die Kapazität eines Systems, welches 0,004 Molar TBAH enthält, auf etwa 2 bis 4 Mikrogramm jeder ionischen Komponente pro Einspritzung begrenzt.

Für die Analyse von Kationen muß die Ionenaustauscherstellen bildende Verbindung von einem Typ sein, welcher aus einem Gegenion und einem Co-Ion gebildet wird, welche derartige Eigenschaften aufweisen, daß sie im wesentlichen vom Durchlauf durch die Anionenaustauscherharz-Sperrsäule in Hydroxidform ausgeschlossen sind. Geeignete Gegenionen zu diesem Zweck umfassen: Laurylschwcfelsäure, Ci —C»-Alky!schwefelsäure oder Alkylsulfonsäure. Die Gegenionen werden in der Säule zurückgehalten, während das Co-Ion, Wasserstoff, in Form von Wassermolekülen aus der Sperrkolonne 14 entfernt wird.

Die mobile Phase umfaßt die Probe und das Gegenion in einer polaren wässerigen Flüssigkeit. Die polare Natur der Flüssigkeit unterstützt die Ionisierung und Auflösung der ionischen Komponenten des Systems in der mobilen Phase.

Eine andere bevorzugte Komponente der mobilen Phase ist eine im wesentlichen nicht-ionische, organisehe, polare Verbindung in einer Menge, die dazu dient, selektiv die Verzögerungszeit der Ionen in dem Bett in kontrollierter Art zu verringern. Diese organische, polare Verbindung ist im wesentlichen nicht-ionisch, so daß sie nicht die Ionenleitfähigkeits-Messung stört. Zum einen dient die organische Verbindung als eine mobile anziehende Kraft für die Gegenionen und somit für die interessierenden Ionen, um ein Gleichgewicht einzurichten, welches diese Ionen aus der chromatographischen Säule entfernt und sie selektiv in die mobile Phase zur Trennung überführt Zum anderen tritt die organische, polare Flüssigkeit mit dem organischen Gegenion in Konkurrenz um die zugänglichen Adsorptionsbindungs-Stellen auf der stationären Phase, um eine Verringerung ihrer Kapazität zu verursachen. In isdem FaI-Ie verringert eine höhere Konzentration einer derartigen organischen, polaren Verbindung die Verzögerungszeit Geeignete organische, polare Verbindungen umfassen niedere Alkohole, wie Methanol und Ethanol,

Acetonitril, oder irgendein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel.

Die Konzentration und die Art der organischen, polaren Verbindung können in einem bemerkenswerten Ausmaße variiert werden, um die gewünschte Verzögerungszeit zu modifizieren, in Abhängigkeit von den zu analysierenden Isnen. Geeignete Konzentrationen einer derartigen organischen polaren Flüssigkeit können von 0 bis 100% variiert werden, wobei die höheren Konzentrationen bei stärker festgehaltenen Gegenionen verwendet werden. An der oberen Grenze können Löslichkeits-Probleme für die interessierenden Ionen bestehen, und so ist es bevorzugt, Wasser in der mobilen Phase zu verwenden.

Eine weitere Komponente der mobilen Flüssigkeitsphase ist ein Entwicklungsmittel, welches ein anorganisches Entwicklungsion mit der gleichen Ladung, wie die Ionen, umfaßt. Dieses Ion ist in einer Menge zugegen, um selektiv die Verweilzeit der Ionen in dem chromatogfaphisehen Gen zu verringern. Das Entv/ick'.up.gsion und sein Co-Ion (im weiteren als »Co-Ion des Entwicklungsions« bezeichnet) müssen von einem Typ sein, der im wesentlichen vom Durchgang durch die Sperrsäule 14 ausgeschlossen ist. Geeignete Entwicklungsionen umfassen Borat- und Carbonat-Ionen. Diese beiden Ionen werden durch eine Sperrkolonne in Wasserstoffionenform zu ihren entsprechenden Säuren umgesetzt, welche lediglich schwach ionisiert sind und deswegen keine die Leitfähigkeitszelle wesentlich störende Überlagerung schaffen. In ähnlicher Weise wird das Co-Ion des Entwicklungsions entweder durch die Säule abgezogen oder liegt in seiner Wasserstoffionenform vor, welches die gewünschte Form der Ionen für die Bestimmung in der Leitfähigkeitszelle ist.

Die gleichen Grundsätze werden für die analytische Bestimmung von Kationen angewandt. In diesem Falle umfassen geeignete Entwicklungsmitte! eine Vielzahl von Mineralsäuren, deren Anionen durch die Sperrsäule 14 abgezogen werden, um Wasser zu bilden.

Das Entwicklungsmittel übt eine ähnliche Funktion aus, wie Entwicklungsmitte! im herkömmlichen Ionenaustausch-Trennungen, in welchen die Ionenaustauschstellen permanent an dan Harzsubstrat anhaften. Das bedeutet, daß die Entwicklungsmittel eine zum Gleichgewichtszustand hin wirkende Kraft ausüben und dadurch die interessierenden Ionen aus der stationären Phase verschieben, wodurch die Verzögerungszeit verringert wird.

Das pH-Niveau der Eluationslösung ist ein anderer Parameter, welcher auf die chromatographische Trennung Einfluß nehmen und auf die interessierenden Ionen zugeschnitten werden kann. Das vorliegende poröse Harz ist bei extremen pH-Niveaus stabil.

Wie bei der polaren organischen Flüssigkeit, können Art und Konzentration des Entwicklungsmittels variiert werden in Abhängigkeit von der gewünschten Verzögerungszeit Jedoch kann bei hohen Konzentrationen die Sperrsäule schnell erschöpft sein. Wenn auch das Entwicklungsmittel im allgemeinen zur Modifizierung von Selektivität und Kapazität des Trennbettes geeigneter als die polare organische Flüssigkeit ist, so müssen seine Art und Konzentration sorgfältig überdacht werden, um eine übermäßige Erschöpfung des Sperrharzes zu vermeiden.

Den vorstehenden Ausführungen ist zu entnehmen, daß einer der bedeutsamen Vorteile des Systems seine Fähigkeit ist, das Entwicklungsmittel, die pdare organische Flüssigkeit und das Gegenion zu variieren, um die Systemtrennung der spezifischen, zu analysierenden ionischen Spezies anzupassen.

Die Sperrsäulo 14 ist in ihrer Funktion der Abstreifsäule 11 in Fig. i der US-PS 39 20 297 analog. Die Regeln des Betriebs dieser Säule, deren detaillierte Beschreibung und Verhältnisse und funktionale Merkmale bezüglich der Trennsäule sind dort beschrieben, worauf hiermit Bezug genommen wird. In dem vorliegenden System besitzt die Säule 14 eine relativ hohe spezifische Ionenaustausch-Kapazität. Dies ist so, weil die hauptsächliche Funktion dieser Sperrsäule die Verhinderung des Durchganges des Entwicklungsmittels und der lonenaustauschstellen bildenden Verbindung in stark ionisierter Form ist, während sie den Durchgang der Ionen, die in der Trennsäule 13 abgetrennt worden ist, ohne wesentliche Unterbrechung zuläßt. Geeignete Ionenaustauscherharze für die Analyse von Anionen sind Polystyrol oder modifiziertes, mit Divinyibenzol, welches Kerngruppen trägt, vernetztes Polystyrol, wobei das Divinylhenzol reaktive Austauscherstellen schafft. Die starken Kationenaustauscherharze umfassen typischerweise aromatische Kerne enthaltende Sulfonsäure oder Sulfonatreste entlang der Polymerketten, während die schwachen Ionenaustauscherharze Carboxylatreste tra-

gen.

Die starken Basen-Anionenaustauscherharze tragen Kern-Chlormethylreste, die quaterniert worden sind. Die schwachen Basenaustauscherharze tragen am aromatischen Kern primäre, sekundäre oder tertiäre Aminreste.

Die Natur des Harzes in der Sperrsäule 14 wird durch die Ionenaustauschsteilen bildende Verbindung und das zu unterdrückende Entwicklungsmittel ermittelt. Zur Anionen-Analyse ist ein geeignetes Harz ein hochvernetztes Polystyrol mit Sulfonsäure-Resten in der Wasserstoffionenform. Die hohe Vernetzung gewährleistet, daß die Ionenaustausch-Effekte gegenüber der chromatographischen Durchdringung in das Harz überwiegen. Das Gegenion und das Co-Ion des Entwickiungsions werden durch Ionenaustausch in der Sperrsäule modifiziert und bilden Produkte, welche aus der Säule in im wesentlichen nicht-ionisierter molekularer Form eluiert werden und welche somit die Bestimmung in der Leitfähigkeitszelle nicht überlagern.

Der Ausfluß aus der Sperrkolonne 14 wird durch die Leitfähigkeitszelle 15 geleitet und nachfolgend zu den Abfallprodukten. Das elektrische Signal von der Leitfähigkeitszelle wird zum Leitfähigkeitsmeßgerät 16 gegeben, und die Ausgabe wird zu der Registrier-Einrichtung 17 geleitet.

Der Trenn-Mechanismus wird in Abhängigkeit von der Natur der zu analysierenden Ionen geändert Wenn die Probe der Ionen in ihrer Natur mehr hydrophob (organisch) wird, so wird angenommen, daß der überwiegende Mechanismus eine Konkurrenz-Adsorption zwischen derartigen Ionen und dem Gegenion in dem Eluationsmittel an der Oberfläche der stationären Phase in Säule 13 darstellt. So treten beispielsweise Alkylketten mit steigender Länge in den Ionen in diese Konkurrenz ein. Das führt zu einer unakzeptabel langen Verzögerung und zu einer schlechten Auflösung. Diesem Problem kann vorgebeugt werden durch Wechsel des Gegenions zu einem stärker hydrophilen anorganischen Ion. Im allgemeinen ist es, wenn die Probe der Ionen stärker hydrophob wird, bevorzugt, Gegenionen einzusetzen, welche weniger hydrophob sind, um die chromatographische Trennung der Ionen zu optimieren. Beispielsweise kann das Ammoniumion als Gegenion für

die Analyse anionischer Weichmacher eingesetzt werden, während das Perchloration Sls Gegenion für Trennungen kationischer oberflächenaktiver Stoffe verwendet werden kann. Die Sperrsäule ist von grundlegender Bedeutung, um die Hintergrund-Leitfähigkeit des Gegenions zu verringern.

Bei der Analyse derart stark hydrophober Ionen überwiegt wahrscheinlich der lonenpaar-Mechanismus. In diesem Falle bilden das Gegenion und die Ionen keine reversiblen lonenaustauschstellen, sondern reversible lonenpaare, die wiederum reversible Adsorptionsbindungen mit dem chromatographischen Bett zur unterschiedlichen Verzögerung der Ionen auf dem Bett bilden. Es wird angenommen, daß dies ein wesentlicher Faktor ist, bei der chromatographischen Trennung.

Es wird betont, daß die Auswahl der Gegenionen in bedeutsamer Weise den Grad der Adsorption der Ionenpaare auf der stationären Phase beeinflußt. Je stärker organisch ein Gegenion ist, d. h. je länger die Kohgewandelt werden kann.

Das Eluationsmittel kann für den gesamten Ablauf festgelegt werden. In der Alternative dazu ist das System besonders angepaßt an die Verwendung von sich kontinuierlich ändernden Konzentrationen der Reagenzien, aiso an eine üblicherweise als Gradienten-System bezeichnete Anordnung. In der Alternative xönnen stufenweise Änderungen in der Konzentration auch verwendet werden,

ίο Ein weiteres Merkmal der Erfindung liegt in der Stabilität des beschriebenen organischen Harzes. Es eignet sich zur langzeitigen Benutzung ohne Zerstörung bei der Analyse von Anionen. Auch die Co-Ionen für die Anionen-Analyse können starke Anionen sein, wie Hydroxid, die leicht in einer Sperrsäule unterdrückt werden können, was für die Leitfähigkeits-Ermittlung von Bedeutung ist. Das steht im Gegensatz zu den typischen Co-Ionen, welche in Füllungen mit gebundener Phase vorkommen und welche nicht unterdrückbar sind.

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ienstofikcttc in dem Molekül ist, desto fester wird das Gegenion festgehalten und somit das Ionenpaar. Somit ist es für anorganische Ionen vorteilhaft, stark organische Gegenionen-Verbindungen zu verwenden, z. B. Verbindungen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen in der Kette. Umgekehrt ist es, wie nachfolgend beschrieben wird, für stark organische Ionen, wie oberflächenaktive Stoffe, bevorzugt, als Gegenion anorganische Verbindungen zu verwenden, um übermäßige Verzögerungszeiten zu verhindern.

Die Verfahrensschritte, welche nach der Trennung gemäß der Ionenpaar-Theorie durchzuführen sind, sind die gleichen, die vorstehend unter Bezugnahme auf die Theorie des reversiblen Ionenaustausches beschrieben wurden. Das bedeutet, daß nach der chromatographischen Trennung das Eluationsmittel durch die Sperrsäule 14 geführt wird und sodann durch die Leitfähigkeitszelle 15 zur Messung mittels eines Leitfähigkeits-Meßgerätes 16 und zum sichtbaren Ausdruck auf der Registrier-Einrichtung 17.

Es ist ein besonderer Fortschritt der Erfindung, eine Technik zur Analyse von anionischen oberflächenaktiven Stoffen zur Verfügung zu stellen. Während die Techniken der Infrarot-Spektroskopie und der kernmagnetischen Resonanz einige Informationen bezüglich anionischer oberflächenaktiver Stoffe liefern, sind sie doch von begrenztem Wert bei der Bestimmung der Größe und der Molekulargewichtsverteilung. Auch ist die lonenchromatographie nicht in der Lage, organische oberflächenaktive Stoffe zu analysieren.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist die Feststellung, daß die Ionenpaar-Chromatographie (oder die reversible Ionenaustausch-Chromatographie) effektiv für anorganische Anionen oder Kationen eingesetzt werden kann.

Ein den gesamten Bereich betreffender bedeutsamer Vorteil des beschriebenen Systems (sowohl bei der Methode des reversiblen lonenaustausches als auch bei der Methode der gepaarten Ionen) ist die Fähigkeit, die Kapazität (Anzahl der an der Oberfläche der Säule adsorbierten Gegenionen) und die Selektivität (relative Verzögerung der Ionen, die durch derartige Gegenionen an der Säule zurückgehalten werden) zu modifizieren durch Variation der Konzentration und des Typs des Gegenions, des Entwicklungsreagens und der polaren organischen Flüssigkeit, um eine Anpassung des zu analysierenden Probentyps zu erreichen. Das System ist derart flexibel, daß die gleiche stationäre Phase zur Trennung zur Analyse von Kationen oder Anionen um

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Trennung von mehreren anorganischen Anionen unter Verwendung einer Füllung aus einem porösen chromatographischen organischen Harz. Eine 4 mm χ 250 mm große Säule aus korrosionsbeständigem Stahl, die mit einem porösen Harz beschickt wurde, welches dem Harz XAD-2 Amberlite ähnelt, jedoch einen Oberflächenbereich von 400 m²/g aufweist, wurde mit einem Eluationsmittel äquilibriert, welches aus 0,002 M Tetrabutylammoniumhydroxid und 0,002 M Natriumcarbonat gelöst in 15/85 (v/v) Acetonitril/Wasser bestand. Die Fließgeschwin-

digkeit betrug 1,5 ml/min. Mach der Äquilibrierung wurde der Ausfluß aus dieser Säule auf eine 4 mm χ 250 mm große Säule mit einem Kationenaustauscherharz, welches unter dem Warenzeichen Dowex50WX-16 vertrieben wird, in der Wasserstofform geleitet und sodann in einen Leitfähigkeits-Detektor der Firma Dionex Corp. eingeführt. Es wurden 100 μΐ einer Lösung, die 3 ppm F-, 4 ppm Cl~, 10 ppm NO2"", 50 ppm PO4-³, 10 ppm Br-, 30 ppm NO3- und 50 ppm SO4- enthielt, eingespritzt. Fig.2 zeigt, daß al,¹«: sieben Anionen in weniger als 12 Minuten getrennt wmuen.

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt die Trennung von anorganischem Sulfat und organischen anionischen oberflächenaktiven Stoffen. Eine 4 mm χ 250 mm große Säule aus korrosionsbeständigem Stahl wurde mit einem anderen Ansatz des Harzes nach Beispiel 1 beschickt Die Säule wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/ min äquilibriert mit einem Eluationsmittel aus 0,01 M Ammoniumhydroxid in 38/62 (v/v) Acetonitril/Wasser. Nach der Äquilibrierung wurde der Ausfluß aus der Säule auf eine 4 mm χ 100 mm große Säule eines Kationenaustauscherharzes, in Form eines sulfonierten Harzes (Durchmesser ±1 μ) in der Wasserstofform, wie es von der Firma Dionex Corp. unter dem Warenzeichen DC 6 A vertrieben wird, und sodann zu einem Leitfähigkeits-Detektor geleitet. Eine Lösung, welche

35 ppm lineare Alkylbenzolsulfonate (LAS) mit einer Alkyl-Kettenlänge von 9 bis 14 Kohlenstoffatomen enthielt, wurde durch eine äquilibrierte Säule geleitet. Das Chromatogramm in F i g. 3 zeigt deutlich, daß die Probe

13 14

mindestens 10 Komponenten enthielt

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die Trennung von organischen s
Kationen. Ein gepumpter Strom von 5 mM Hexansulfonsäure wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von
3.0 ml/min auf eine 4 χ 250 mm große Säule aus porösem Harz, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde, geleitet 10

Der Ausfluß aus dieser Säule wurde auf eine Anionenaustauschersäule geleitet, welche aus einer
3 χ 250 mm großen Dowex-1-XlO-Säule in Hydroxidionen-form bestand und wurde nachfolgend in eine LJ.'tä.-higkeitszelle geführt Fig.4 zeigt die Ergebnisse, di> is
erhalten wurden, wenn 20 μΐ einer Lösung, die 25 mg/I

von jeweils NH₄ ⁺, HOCH₂CH₂NH₃* und (CHa)₃NH- *

enthielt, in die Säule eingespritzt wurde. „ i.

Beispiel 4 20 |

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung einer einzelnen |

Säule zur Trennung von Anionen oder Kationen durch Ii

^f einfachen Wechsel des Eluationsmittels. Eine I

a 4 χ 250 mm große Säule, die mit dem porösen Harz nach 25 f

Beispiel 1 gefüllt war, wurde wie in Beispir' 3 beschrie- |

ben zur Trennung eines Gemisches von 15 mg/1 von f

jeveiis NH₄". CH₃NH₃^, HOCH₂CH₂NH₃ ⁺, 1

(CH₃)₃NH₂* und (CH₃J₃NH⁺ eingesetzt Die Ergebnis- |

se sind in F i g. 5 dargestellt 30 |

Diese Säule wurde sodann mit einem gepumpten |

Strom von Wasser gewaschen, bis der pH-Wert des |

Ausflusses neutral war. Sodann wurde die Säule mit |

einem gepumpten Strom von 1 g/l Tetrabutylammoni- I

umhydroxid in Wasser mit einer Fließgeschwindigkeit 35 j

νοη 2 ml/min behandelt. Es wurde etwa 1 1 durch die I

Säule gepumpt. J

Sodann wurde ein gepumpter Strom mit einer Fließ- s

geschwindigkeit von 0,7 ml/min von 1 mM Tetrabuty- 2

lammoniumhydroxid und 5% (v/v) Acetonitril auf die 40 "J

Säule geleitet, welche zuvor mit Tetrabutylammonium- '{

bromid, wie vorstehend beschrieben behandelt wurde. |

Der Ausfluß aus der Säule mit porösem Harz wurde auf I

eine Abstreifsäule gegeben in Form einer 6 χ 250 mm I

großen Dowex-50W-XI6-Säule in der Wasserstoff^- 45 |

nenform und wurde nachfolgend in die Leitfähigkeits- \

zelle geleitet Es wurden 20 Mikroliter eines Gemisches | aus 4 mg/1 F-, 5 mg/ϊ Cl-. 10 mg/", NO₂-, 20 mg/1 Br-
und 30 mg/1 NO₃- eingespritzt. Die Ergebnisse sind in

Fig.6 dargestellt Es ergab sich eine ausgezeichnete 50 t

Auflösung der Anionen durch die vorstehend zur Tren- h

nung von Kationen eingesetzten Säule. I

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Trennung von Anionen oder Kationen in einer polaren mobilen Flüssigkeitsphase, dadurch gekennzeichnet, daß

a) das Eluationsmittel als polare mobile Flüssigkeitsphase enthaltend eine Ionenaustauschstellen bildende Verbindung durch eine erste Säule mit einem porösen, hydrophoben chromatographischen Bett mit im wesentlichen keinen permanent anhaftenden Ionenaustauschstellen geleitet wird, wobei die Ionenaustauschstellen bildende Verbindung ein Gegenion mit einer den Ionen entgegengesetzten Ladung und ebenfalls ein Co-lon mit einer den Ionen gleichen Ladung umfaßt,

b) das Eluationsmittel aus der ersten Säule durch eine za-tite Säule mit einem Austauscherharz eines Tvps. der im wesentlichen den Durchgang der Gegenionen und Co-Ionen in ionischer Form ausschließt, geführt wird.