JP2005530480A - 脂質を含む粉末細胞培養製品およびその製造法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、一般に細胞、栄養培地、培地添加物、培地サブグループ、および緩衝剤製剤に関する。具体的には本発明は、インビトロでの細胞の培養を容易にする必要なすべての栄養因子を含む乾燥粉末栄養培地製剤、特に細胞培養培地製剤およびこれらの培地製剤の製造法を提供する。本発明は具体的には、無機または水のような極性溶媒に殆ど溶けない脂質や他の成分を混合する方法に関する。本発明はまた、細胞培養を支持するのに有用な脂質または他の成分のような添加物成分を有する乾燥粉末血清(例えば胎児ウシ血清)のような乾燥粉末培地添加物を製造する方法に関する。本発明はまた、再水和によって特別なイオンおよびpHの状態を作る乾燥粉末緩衝剤製剤に関する。本発明はまた、有機または非極性溶媒に溶解する添加剤と共に調製した滅菌乾燥粉末栄養培地、培地添加物(特に乾燥粉末血清)、培地のサブグループおよび緩衝剤製剤の調製法に関する。本発明はまた、乾燥粉末栄養培地、培地添加物、培地のサブグループ、緩衝剤製剤および本発明の方法で調製した細胞に関する。本発明はまた、これらの乾燥粉末栄養培地、培地添加物、培地のサブグループ、緩衝剤製剤を用いる、原核細胞および真核細胞の培養キットおよび方法に関する。
細胞培養培地
細胞培養培地は管理された、人工のインビトロの環境中で細胞を維持し、および/または増殖させるための栄養を提供する。細胞培養培地の特徴と組成は細胞の特別な要求性と、その細胞が培養される目的である機能に依存して変化する。重要なパラメーターには浸透圧、pHおよび栄養製剤が含まれる。培養における細胞の正常な環境は栄養物および他の培養成分が溶解または懸濁している水性培地である。特に水に難溶性の脂質または他の成分の微量を混合することが有利である。
培養培地は通常液状または粉状で製造される(例えばGIBO BRL製品2000-2001カタログ参照)。これらの形状には、それぞれ特別な利点と欠点がある。
本発明は乾燥粉末栄養培地、培地添加物、培地サブグループおよび緩衝剤を溶媒または複数の溶媒で凝集することを含む栄養培地、培地添加物、培地サブグループおよび緩衝剤粉末の製造方法を提供する。本発明はまた、液体栄養培地、培地添加物、培地サブグループまたは緩衝剤を、それらの乾燥粉末対象を製造するのに十分な条件下で噴霧乾燥することを含む粉末化栄養培地、培地添加物、培地サブグループおよび緩衝剤の製造法に関する。そのような条件は、例えば粉末化培地、培地添加物、培地サブグループまたは緩衝剤が形成されるまで、熱および溶媒の分圧を管理することを含む。粉末は1つの段階でまたは複数の段階で形成されてもよい。1つ以上の溶媒が使用される場合は、溶媒は同じポートまたはノズルを通して導入しもよく、または離れたノズルを通して導入してもよい。例えば相互に溶解する溶媒または十分混合しうる相溶性の溶媒は、出入口またはノズルを共有してもよいが、最初の溶媒に相溶性がない1つまたはそれ以上の溶媒には、離れたノズルを用いてもよい。
定義
以下の記述では、細胞培養液の分野において従来用いられている多くの用語を広く利用する。明細書および特許請求の範囲、ならびにそのような用語に与えられる範囲の明白でありかつ一貫した理解を提供するため、以下の定義を提供する。
本発明は、一般に、栄養培地、培地添加物、培地サブグループ、または緩衝液を産生する方法、およびそれにより産生される培地を対象にしている。本方法により産生される栄養培地、培地添加物、および培地サブグループは、細胞の増殖を支持するために用いられ得る任意の培地、培地添加物、または培地サブグループ(無血清または血清含有)であり、細胞は、細菌細胞、真菌細胞(特に酵母細胞)、植物細胞、または動物細胞(特に、昆虫細胞、線虫細胞、または哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞)であってよく、それらはどれも体細胞、生殖細胞、正常細胞、異常細胞、形質転換細胞、突然変異細胞、幹細胞、前駆細胞、または胚細胞であってよい。好ましいそのような栄養培地には、細胞培養液、最も好ましくは細菌細胞培地、植物細胞培地、または動物細胞培地が含まれるが、これらに限定されない。好ましい培地添加物には、細菌、動物、または植物細胞、腺、組織、または器官の抽出物(特に、ウシ下垂体抽出物、ウシ脳抽出物、およびニワトリ胚抽出物)等の未知組成添加物、ならびに生体液(特に動物血清、および最も好ましくはウシ血清(特に、ウシ胎仔血清、新生仔ウシ血清、または通常仔ウシ血清)、ウマ血清、ブタ血清、ラット血清、マウス血清、ウサギ血清、サル血清、またはヒト血清であり、それらはどれも胎児血清であってよい)およびそれらの抽出物(より好ましくは血清アルブミンであり、最も好ましくはウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンである)が含まれるが、これらに限定されない。培地添加物にはまた、上記の未知組成培地添加物の代わりとして用いられ得る、LipoMAX(登録商標)、OptiMAb(登録商標)、Knock-Out(商標)SR(それぞれInvitrogen Corporation、カリフォルニア州カールズバッドから入手可能)等の既知組成代替物が含まれ得る。そのような添加物はまた、ホルモン、サイトカイン、神経伝達物質、脂質、付着因子、タンパク質糖を含むがこれらに限定されない既知組成成分を含んでもよい。
いかなる栄養培地、培地添加物、培地サブグループ、または緩衝液も、本発明の方法により調製され得る。本発明に従って調製され得る特に好ましい栄養培地、培地添加物、および培地サブグループには、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、または酵母細胞の増殖を支持する細胞培養液、培地添加物、および培地サブグループが含まれる。本発明に従って調製され得る特に好ましい緩衝液には、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、または酵母細胞に対して等張である平衡塩類溶液が含まれる。
本発明の方法は、上記の粉末栄養培地、培地添加物、培地サブグループ、および緩衝液の調製を提供する。これらの粉末培地、添加物、サブグループ、および緩衝液は、好ましくは凝集化により(例えば、流動床技術)および/または噴霧乾燥により調製される。
本発明の際立った利点は、脂質および通常の水性溶媒調製品中で十分に可溶性ではない成分の、乾燥粉末培地への凝集化を達成する方法である。従来、そのような成分は、最適には満たない手順で、例えば有機溶媒に溶解した濃縮物として添加されてきた。本発明の方法により、所望の非水性媒質を含む乾燥粉末培地が達成可能となる。
本発明はまた、本発明の栄養培地、培地添加物、培地サブグループ、および緩衝液を滅菌する方法と同時に、ボールミルまたは凍結乾燥等の標準的な方法で調製された粉末栄養培地、培地添加物、培地サブグループ、および緩衝液を滅菌する方法を提供する。栄養培地、培地添加物、培地サブグループ、および緩衝液は、通常大量の溶液で調製され、熱に不安定な成分を含む場合が多いため、照射または加熱による滅菌に耐えられない。したがって、栄養培地、培地添加物、培地サブグループ、および緩衝液は、一般にろ過等の汚染物質除去法により滅菌するが、それによりそのような培地、培地添加物、培地サブグループ、および緩衝液を製造するために必要な費用および時間が顕著に増加する。
したがって本発明は、再水和溶媒に易溶性でありかつ実質的に粉塵のない粉末栄養培地、培地添加物、培地サブグループ、および緩衝液を提供する。使用するには、溶媒和した培地、培地添加物、培地サブグループ、または緩衝液の特定の用途に必要とされる所望の栄養分、電解質、イオン、およびpH条件を産生するのに十分な量の溶媒中に、凝集化または噴霧乾燥した培地、培地添加物、培地サブグループ、または緩衝液を水和(または「再構成」)し得る。凍結乾燥したまたはボールミルした栄養培地、培地添加物、培地サブグループ、または緩衝液とは異なり、本培地、培地添加物、培地サブグループ、および緩衝液は速やかに溶液となり、ほとんど粉塵または不溶性物質を産生しないため、この再構成は本発明において特に容易になる。
別の局面において、本発明は、1つまたは複数の細胞を含む乾燥細胞粉末組成物を産生する方法、およびこれらの方法により産生される乾燥細胞粉末に関する。したがって、これらの方法は、細胞が保存され、使用時まで長期間保存され得る細胞を含む組成物を産生する。このようにして、本発明の方法は、凍結保存設備の必要性および細胞に毒性があるかもしれないある種の凍結保存剤の使用等の、従来の細胞保存法(例えば凍結)のいくつかの欠点を克服する。
本発明によって提供される乾燥粉末培地、培地添加物、培地サブグループ、緩衝液、および細胞は、理想的にはキットの調製に適している。そのようなキットは、バイアル、試験管、ビン、パッケージ、ポーチ、ドラム缶等の1つまたは複数の容器を含んでよい。それぞれの容器は、1つまたは複数の本発明の上記の栄養培地、培地添加物、培地サブグループ、もしくは緩衝液、またはそれらの組み合わせを含み得る。そのような栄養培地、培地添加物、培地サブグループ、または緩衝液は水和されてもまたは脱水されていてもよいが、典型的には本発明の方法により産生される脱水調製品である。そのような調製品は、本発明に従い無菌であってよい。
予想外に、本発明は、経費が削減されかつ不便さが低減した、脂質を含む栄養培地、培地添加物、培地サブグループ、緩衝液、および細胞の調製を提供する。経費の削減はいくつかの要因による。例えば、1X製剤に必要とされる大きな撹拌槽を必要としないため、はるかに小さな製造設備で本発明の培地、培地添加物、培地サブグループ、および緩衝液製剤が作製され得る。さらに、本発明の培地、培地添加物、培地サブグループ、および緩衝液製剤は、在庫費用、保存費用、および人件費が削減される「看板方式」製造技法によって必要に応じて調製され得る。培地、培地添加物、培地サブグループ、および緩衝液製剤の調製および輸送に必要な時間は、6〜8週間から1日程度にまで短縮され得る。また本発明の自動pH調製培地により、顕著な経費削減および時間節約が提供され、かつ従来の乾燥粉末または大量液体培地を用いての標準的な方法によるpH調整過程中に起こり得る、再構成培地中への汚染物質の混入の傾向が減少する。また本発明により、他の通常用いられる技法によって作製される多数のバッチでは何回もの品質管理試験が必要とされるのに対して1回のみの品質管理試験が必要とされる、非常に大量の1X培地、培地添加物、培地サブグループ、または緩衝液(例えば、1000,000リットルまたはそれ以上)を調製するために用いられ得る、栄養培地、培地添加物、培地サブグループ、または緩衝液の成分の調製が可能になる。重要なことには、個々の成分がより安定的であるため、本発明の培地、培地添加物、培地サブグループ、および緩衝液製剤はバッチ間でより一貫性がある。実験室で典型的に利用できる以上の特別な設備の必要性がほとんどなく、細胞が少量で長期間保存され得るため、本発明の乾燥細胞粉末はまた、技術的にも経済的にも有利である。さらに、本発明により調製される細胞は、細胞への毒性があるかもしれない凍結保存剤への曝露なしに保存される。改善された利便性により、培養中の細胞に脂質を供給する負担が減少することになる。乾燥培地製剤中に脂質を提供する改善法は、培養中の細胞が生理的課題または所望の課題を実施する上での性能向上をもたらすはずである。
典型的な乾燥粉末培地(DPM)の凝集
1.ベンチトップ実験室流動床装置(Stera-1;Niro, Inc./Aeromatic-Fielder; Columbia, Maryland)を使用。100〜500 gのDPMをチャンバー内に置く。装置の上に置き、ユニットをシールするためにレバーを使う。
1.ユニットをシールする(ガスケットを膨らます)。
2.予熱のためにファンを始動する。
3.入り口の空気温度が設定点に等しい時にファンを停止する。
4.ガスケットを萎め、物質を装填し、ガスケットを膨らます。
段階5〜8は1分以内に遂行しなければならない。
5.バッチを始動する。
6.ファンを始動し、フィルタークリーニングの電源を入れる。
7.ノズルの噴霧空気圧を%出力に設定する(排気に対してノズルをチェックする)。
8.液体フィードラインを接続する。
9.スクリーン上およびポンプにおいてポンプを始動する。
10バッチ時間を再設定する。
11.すべての液体を設定速度(26/分)で噴霧する。2kgの粉末に250mlまでの水を使う。
12.すべての液体が加えられた時に、ポンプにおいてまたスクリーン上でポンプを停止する。
13.空気流を乾燥値に低減する(例えば100から60に)
14.製品が所望の温度に達したならば(-40℃)、「最初の設定」スクリーンに行き、現在の「バッチ時間」よりも2-3分大きい値に「バッチの継続」を設定する。
15.バッチを停止する。
16.ガスケットを萎める。
通常の装置の設定(ベンチ、プロセスおよび製造スケール装置)
乾燥温度:60〜65℃
出口空気温度:33℃まで
ブロアウト圧:5バール
噴霧圧:1.5〜2.0バール
ブローバック ドウェル:噴霧後1、噴霧中2
ファンの容量:運転の開始時5、凝集が明らかになった後6
マグナヘリックス(Magnahelics):フィルター抵抗 150〜250、有孔制御板抵抗 50まで、空気容量:50未満
DPMの不可欠の部分としての重炭酸ナトリウムの添加
上記のように、粉末化培地の貯蔵において、脱ガスおよび緩衝剤能力の問題が生じる可能性があるために、通常、ボールミルまたは凍結乾燥による製造中にDPMに重炭酸ナトリウムは添加しない。この標準的な製造プロセスは、従って再溶解の際に、重炭酸ナトリウムの添加とpHの調整を必要とする。この方法では、これらの付加的段階は製造中に粉末化培地に直接重炭酸ナトリウム(または任意の緩衝剤塩)を添加することによって回避してもよい。
重炭酸ナトリウムの溶解度および通常の哺乳動物細胞培養培地に一般的に添加する必要量の点から、粉末には、かなり大容量の液体を注入する必要がある(上記の35 mlの水よりも著しく多い)。これはまだ可能であり、事実、例えば血清の場合のように、もしもDPMに添加されるために同様に比較的大容量の液体を要する他の成分を添加するならば好ましい。この場合、DPMが装置の中で固まらないことを確実にするために、連続して液体を添加すること、および乾燥させること等に何回も注意を払わなければならない。1分間、1分あたり6 mlを使用すること、ついで2分間乾燥させることがほぼ正しい。
流動床処理に先立って、他の培地成分と同様な仕方で重炭酸ナトリウムをDPM中に粉砕できる。しかし、粉砕の過程で、重炭酸塩は最後の成分として添加されねばならない。すべての他の培地成分は、通常通り粉砕されるべきで、ついで粉砕を停止し、最後に重炭酸塩を加え、適切な粒子サイズまでさらに粉砕する。すべての粉砕後処理は、操作上可能な限り低く(〜20から40%)設定された湿度が管理された環境で行うべきである。ついで、粉砕後、できるだけ早く流動床処理を行うべきである(もしも同日に処理しないならば、DPMは二重にラップし、水分吸着剤を入れた密閉容器内に入れる)。
緩衝塩(例えば重炭酸ナトリウム)を含み、使用者の努力なしに、再溶解した(IX)培地のpHが自動的に所望のpHになるように配合されるDPM
上記のように、商業的に利用できるすべての哺乳動物細胞培養粉末培地は、溶液が適切なpHになるようIX液を調製する時に、1つまたはそれ以上の緩衝塩(例えば重炭酸ナトリウム)を加え、pHを調整する必要がある。しかし本法は、重炭酸ナトリウムの添加(上記実施例2に示したように)およびpHの調整の必要を省く。本発明のこの態様において、1つまたはそれ以上の緩衝塩を含む乾燥粉末培地に、酸または塩基を導入する(必要に応じて)ために流動床技術が用いられる。本発明のこの態様に従って、最終的に再溶解される細胞培養培地中の所望のpHと緩衝能力によって、任意の緩衝塩またはその組み合わせ、および任意の酸または塩基を使用してもよい。
DPMそれ自身内に血清、アルブミン、Hy-Soy等の大きな分子量の添加物を含める
これまで、血清を含んだ乾燥粉末培地は商業的に利用されていない。発明者等は本法を用いて(流動床および噴霧乾燥技術により)、機能性(細胞培養)が維持された仕方で粉末に血清を加えることに成功した。
DPM製造時の粉砕技術(成分をミクロンサイズの粒子に壊す高エネルギーインプットシステム)の低減または排除
上記のように、通常乾燥粉末培地は粉砕工程で生産されるが、これには労力を要し、また多くの問題がある。本発明の方法は、これらの労力および技術上の制約を克服する流動床技術を用いる乾燥粉末培地の製造を提供する。
通常、粉砕されたGPMは、重炭酸ナトリウム(追加のボールミルは必要なく、供給者から受け取ったまま直接)と混合される(重炭酸ナトリウム2g/Lで、RPM 1640)。この混合物を20分間混合する。粉末を流動床チャンバー内に置き、上記のように自動pH制御で、重炭酸ナトリウムを含む培地に対して流動化される。
重炭酸ナトリウムを粉砕GPMと共に直接チャンバー内に置き、短時間混合し、ついで凝集する。これによって別のユニットでの混合が省略できる。
DPM化学品のすべてを直接流動床チャンバーに加え、予備的に混合後、凝集するか、いくつかのより粗い「粘着物」等を回転粉砕機で短時間粉砕処理後、混合と最終の凝集のために流動床内に置く。
同じDPM内に上記のすべての特性を有する方法
本発明者らは、「貯蔵寿命期限切れ」の重炭酸ナトリウムの粉砕したDPMへの添加と自動pH制御を組み合わせた。
1. DPM(粉砕された)に炭酸ナトリウム(供給者からの粉末)を加える。
2.成分を混合する(外部ユニットまたは流動床のいずれかで混合)
3.別の容器中で、1LのDPM(重炭酸ナトリウムを含む)を水(IX)で再溶解し、溶液のpHを7.5に調整するのに必要な1N HCLまたは1N NaOHの量を決定する。リットル基準で、凝集される粉末の量を知ることによって(つまりL等量)、上記の計算量で凝集される全部の粉末についての1N HCLまたは1N NaOHの量を計算する。この量を流動床装置を介して加える(注入ノズル)。(DPMは「液体」でないが、水分が工程に含まれているので、血清を加えた時に、重炭酸塩が遊離するような酸性のpHではなく、できるだけ中性に近い粉末であることが重要である。pH7.6またはそれ以上では、重炭酸ナトリウムの濃厚溶液はCO2を発生しないが、より低いpHでは、CO2ガスを発生する。)
4.添加物の割合と凝集されるgに基づく、血清の添加。
5.上記(3)からの同じ1Xの1Lを用いて、所望のpHにpHを調整するのに必要な1N HCLまたは1N NaOHの量を決定する(例えば7.2)。この情報を使って、血清で凝集した粉末の重量に使用される量を計算する(g/Lの仕様を知って)。この量を流動床装置を介して加える(注入ノズル)
6.粉末培地を滅菌するためにγ線照射が用いられる。
流動床処理による100%血清粉末の製造(噴霧乾燥を刺激するための)
方法
1)ベンチトップ実験室流動床装置(Strea-1)を使用した。粉末化血清の製造には、チャンバー内には何も置かない。ユニットを遮蔽するためにレバーを用いる。
通常の装置の設定
乾燥温度:60〜65℃
出口空気温度:33℃まで
ブローアウト圧:5バール
噴霧圧:2.0〜2.5バール
ブローバックドウェル(Blow back dwell):噴霧間、2
ファンの能力:運転中8〜9
マグナヘリックス(Magnahelics):フィルター抵抗150〜250、有孔制御板抵抗〜50、空気容量50未満
噴霧乾燥による100%血清粉末の製造
流動床処理の代替法として、噴霧乾燥技術による乾燥粉末化血清の製造の可能性を検討した。乾燥粉末化血清を調製するために、直径3フィートの実験室噴霧乾燥器(Mobile Monitor Spray Drier;NIRO,Columbia,Maryland)を用いた。液体FBSを噴霧乾燥器に吸引し、空気ディスペンサー(air dispenser)の中央に位置するSchlick 940ノズルを通して噴霧し、乾燥空気を装置の最上部の空気ディスペンサーを通して噴霧器に導入した。噴霧乾燥は、次の条件下で行った:入口空気温度=200℃; 出口空気温度=70℃;、ノズルの噴霧空気圧=2.0バール、空気流=80.0kg/時間、噴霧速度=65 g/分。これらの方法を開発中に、最初60℃の出口温度を用いた;しかしこの温度はあまりに低いことが判ったため、噴霧速度を、至適な出口温度であることが判った約70℃を達成するためのレベルに、調製し直した。噴霧乾燥後、粉末化血清を装置のサイクロンで集め、プロセス空気を装置内で再循環する前に、排気フィルターを通して濾過した。
自動的にpH調整された培養培地の製造
粉末培地に重炭酸ナトリウムを決して含めない1つの理由は、空気中の水分でさえ、CO2が遊離する原因となるパウチ(pouch)の酸性条件をもたらす可能性があるからである。パウチは膨張し「枕」と呼ばれるものを作る。流動床処理では、装置内の水分は、工程の終了に先立って、本質的に無視できるレベルに低減される。発明者らは、重炭酸ナトリウムを含むRPMI-1640を作ったが、「枕」の形成の証拠は見られなかった。
培養培地の溶出速度に対する凝集の影響
培養培地の凝集の培地の溶出速度に対する影響を検討するために、Opti-MEM I(商標)はたはDMEMを水またはFBS(Opti-MEM I は2%だけ、DMEMは2%または10%)で凝集した。凝集培地の水の中での再溶解時に、凝集Opti-MEM Iの溶出時間は、標準粉末Opti-MEM I(図5A)の溶出よりもより速く起きた;結果は水およびFBSで凝集したOpti-MEM Iで同じであった。水で凝集したDMEMは、標準粉末DMEMよりもより速く水に溶出したが、FBSで凝集したDMEMはそうでなかった(図5B)。
再溶解した凝集培養培地中での細胞増殖および継代培養
培養培地の使用の多くで、血清またはアルブミンのような高分子の添加が必要である。これらの分子は溶液の形であってよく、またはアルブミンの場合は粉末であってもよい。しかし、粉末培地の均質性を確保するために、これらのタンパク質は通常粉末としてではなく、バルク粉末培地の再溶解後に、液体培地に液体として加えられる。これには、例えば性能を長期に亘って維持するために、血清を冷蔵庫に貯蔵しなければならないような、幾つかの不便がある。これは、汚染の機会を増し、血清が無菌で加えられなければならないために、経費と不便が増す。血清の添加後に濾過を行うと、他の処理段階が必要になる。従って、血清を粉末培地の必要不可欠な部分として提供することができるという利点がある。
噴霧乾燥血清粉末で添加物した培養培地中の細胞の増殖
実施例7に示した実験の結果として、実施例8に記載したように調製した2%または10%の噴霧乾燥FBS、または2%または10%の液体FBSを含むDMEMに平面培養し、細胞の増殖速度と継代回復を検討した。細胞は培地10 ml中に1 x 105の密度で3重の25cm2のフラスコに接種した。生きた細胞密度を3日目から7日目に測定し、各細胞系を2回試験した。結果を図11〜13に示した。
凝集培地の性能に対する照射の影響
最近、特にバイオテクノロジー産業において、バイオ生産に使用する培地および培地成分(添加物を含む)の生物学的純度についての関心が挙がっている。γ線照射は通常熱または毒性ガス曝露に馴染まない一定の液体および粉末によく作用することが知られている。従って、水またはFBSで凝集した培養培地をコバルト線源で25 kGyで数日間γ線照射し、各種の細胞型の増殖速度を検討した。
粉末培地添加物の性能に対する照射の影響
滅菌培地添加物の製造における本法の有効性を示すために、凍結乾燥ヒトholo-トランスフェリンを-70℃または室温でコバルトγ線源に25 kGyで約3日間曝露することで照射した。ついで293の細胞を照射したトランスフェリンまたは照射されない対照のトランスフェリン(-70℃または室温で貯蔵された)で添加物した培地中で培養し、細胞の増殖を、標準のトランスフェリンを含む培養培地またはトランスフェリンを含まない培地の増殖と比較した。
粉末化血清の生化学的特性に対する照射の影響
血清への照射の影響をさらに測定するために、噴霧乾燥粉末FBSを-70℃または室温で25 kGyで照射し、血清中の各種の生化学構成物の濃度を商業的に分析した。対照として、非照射噴霧乾燥FBSおよび液体FBSも分析した。結果を表2に示す。
粉末化血清の性能に対する照射の影響
乾燥粉末血清の細胞の増殖を支持する能力に対するγ線照射の影響を検討するために、種々の条件下で照射された粉末乾燥FBSを培養培地の試料に用い、培養培地を添加物し、付着細胞および懸濁細胞を、これらの培地中で3継代まで増殖させた。モデル懸濁細胞として、SP2/0およびAE-1のハイブリドーマ系を用い、典型的な付着細胞としてVEROおよびBHK培養を用いた。細胞を試験血清または対照血清(噴霧乾燥されたが、照射されていない)を含む培地中で、上記の実施例14で概説した一般手順に従って、3継代まで培養した。各継代点で、細胞を収穫し、継代培養し、アリコートのmL当たりの生存細胞数を上記のように計測した。各点での結果を、液体FBSで添加物した培地中で得られた生存細胞数の割合として表し、図17A、17B、17Cおよび17Dに示した。
脂質(特にステロールと脂肪酸)は真核細胞の高密度培養に重要な栄養物である。乾燥形培地に脂質成分を含めることが技術的に挑戦されている。脂質の添加物は通常、粉末の再溶解と濾過後に、別に添加供給され、バイオ医薬製造設備中での、操作と誤りの機会を増す。Advanced Granulation Technology(AGT(商標))は顕著な利点のある新規な乾燥形培地形式である。単一の顆粒化培地内で、緩衝剤、成長因子および微量元素を含めるために、複合製剤のすべての成分が組み入れられている。得られた埃が少ない、自動pH製剤は単に水に加えるだけで、完全な再溶解されたIX培地が得られる。乾燥培地形式で使用可能な脂質をデリバーするために、AGT工程と共に、サイクロデキストリン技術およびナトリウム塩および脂質の水-アルコール溶液を使用をしてもよい。
(3日または4日毎に継代培養した細胞)
1=凝集工程(の一部として)中にサイクロデキストリン・脂質複合体の噴霧によって加えられた脂質を含むCDハイブリドーマ顆粒化(凝集)培地
2= 再構成後サイクロデキストリン・脂質補給添加物として加えられた脂質を含むCDハイブリドーマ培地
3=脂質が添加されていないCDハイブリドーマ培地
結論:サイクロデキストリン・脂質噴霧を使用する顆粒化技術によって供給された脂質は1X再構成培地に添加物として加えられたサイクロデキストリン・脂質を用いて加えられた脂質に匹敵する。
Claims (41)
- その中に溶解された少なくとも1つの脂質を含む溶媒を用いて栄養培地粉末、培地添加物粉末、栄養培地サブグループ粉末、または緩衝液粉末を凝集化する段階を含み、該溶媒が少なくとも1つの該脂質が該栄養培地粉末、培地添加物粉末、栄養培地サブグループ粉末、または緩衝液粉末へ取り込まれるよう送達される、凝集化栄養培地粉末、凝集化培地添加物粉末、凝集化栄養培地サブグループ粉末、または凝集化緩衝液粉末を生産する方法。
- 凝集化する段階が流動床凝集化を含む、請求項1記載の方法。
- 溶媒が液相である、請求項1または2記載の方法。
- 溶媒が固相である、請求項1または2のいずれか一項記載の方法。
- 脂質が、改変されない場合と比較して溶媒中での溶解度が増加するように改変された脂質である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 脂質が塩の形である、請求項5記載の方法。
- 脂質が1つまたは複数の水酸基を有する、請求項5記載の方法。
- 脂質がシクロデキストリンと錯体を形成する、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 溶媒が混合液である、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 混合液が液体の混合物である、請求項9記載の方法。
- 混合液が少なくとも1つの極性溶媒を含む、請求項9記載の方法。
- 混合液が少なくとも1つの非極性溶媒を含む、請求項9記載の方法。
- 混合液が少なくとも1つの有機溶媒を含む、請求項9記載の方法。
- 混合液が20%〜95%の有機溶媒を含む、請求項9記載の方法。
- 混合液が、(a)少なくとも1つの極性溶媒および(b)少なくとも1つの有機溶媒または少なくとも1つの非極性溶媒からなる群より選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項9記載の方法。
- 混合液が、(a)少なくとも1つの極性溶媒および(b)少なくとも1つの有機溶媒または少なくとも1つの非極性溶媒が1%〜99%の割合の溶媒を含む、請求項15記載の方法。
- 混合液が、少なくとも1つの有機溶媒または少なくとも1つの非極性溶媒を40%〜60%含む、請求項16記載の方法。
- 混合液が、(a)少なくとも1つの極性溶媒を50%および(b)少なくとも1つの有機溶媒または少なくとも1つの非極性溶媒を50%含む、請求項16記載の方法。
- 混合液が、水、ならびにジメチルスルホキシド、アルコール、エーテル、およびケトンからなる群より選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項9記載の方法。
- 混合液が、ジメチルスルホキシド、アルコール、エーテル、およびケトンからなる群より選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項9記載の方法。
- 混合液が約40%〜60%のエタノールを含む、請求項20記載の方法。
- 混合液が約50%のエタノールを含む、請求項20記載の方法。
- 溶媒が、非極性溶媒および有機溶媒からなる群より選択される少なくとも2つの溶媒の混合液を含む、請求項9記載の方法。
- 送達が、制御された温度、制御された湿度、および溶媒の制御された分圧の少なくとも1つを含む条件下で行われる、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
- 脂質が、リノール酸、リポ酸、アラキドン酸、パルミチン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸、リノレン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、ビタミンA、ビタミンE、ビタミンK、プロスタグランジン、およびステロールからなる群より選択される、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
- ステロールが植物または動物ステロールである、請求項25記載の方法。
- ステロールがコレステロールである、請求項25記載の方法。
- 請求項1〜27記載の方法に従って調製される、凝集化栄養培地粉末、凝集化培地添加物粉末、凝集化栄養培地サブグループ粉末、または凝集化緩衝液粉末。
- (a)溶媒を用いて請求項28記載の凝集化粉末を再構成し、溶液を形成する段階、および(b)細胞の培養に好ましい条件下で、細胞を溶液に接触させる段階を含む、細胞を培養する方法。
- 細胞が、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、線虫細胞、鳥類細胞、両生類細胞、爬虫類細胞、および哺乳動物細胞からなる群より選択される細胞である、請求項29記載の方法。
- 細胞が哺乳動物細胞である、請求項29記載の方法。
- 細胞が、CHO細胞、COS細胞、VERO細胞、BHK細胞、AE-1細胞、SP2/0細胞、L5.1細胞、PerC6細胞、293細胞、およびハイブリドーマ細胞からなる群より選択される、請求項31記載の方法。
- 哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項31記載の方法。
- 非凝集化栄養培地粉末と比較して粉塵が減少した、請求項28記載の粉末。
- 非凝集化栄養培地粉末と比較してより完全な溶解度を有する、請求項28記載の粉末。
- 非凝集化栄養培地粉末と比較して不溶性物質の少ない、請求項28記載の粉末。
- 非凝集化栄養培地粉末と比較してより早く溶解する、請求項28記載の粉末。
- 栄養培地粉末が血清を含まない、請求項28記載の粉末。
- 栄養培地粉末が哺乳動物成分を含まない、請求項28記載の粉末。
- 栄養培地粉末が動物成分を含まない、請求項28記載の粉末。
- 3、4、7、10、14、28、30、60、または90日目における細胞の増殖が、脂質を添加した液体培地における同一時点の細胞の増殖と比較して50%〜120%である、請求項29記載の方法。
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