JPWO2017195888A1 - 固体培地での微生物の増殖能を増強する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明によれば、シクロデキストリンに包接された、炭素数5以上の脂肪酸を用いる。具体的には、かかるシクロデキストリン包接脂肪酸を含有する培地で微生物を培養することにより、微生物の増殖能を増強することができる。
Description
(a)界面活性剤とオレイン酸がエマルションを形成しているため、そのエマルションを滅菌濾過法で無菌化することは困難である点。
(b)液体状の培地が固化する間にエマルションの分布が偏るため、オレイン酸が均一に懸濁した固体培地を作製することが困難である点。
(c)高濃度のオレイン酸をエマルション化するには高濃度の界面活性剤が必要になるところ、界面活性剤はそれ自体が微生物に対して毒性を発揮するため、高濃度のオレイン酸を含有する固体培地を作製することが困難である点。
(1)シクロデキストリンに包接された、炭素数5以上の脂肪酸を含有する培地で微生物を培養する工程を含むことを特徴とする微生物の増殖能を増強する方法や、
(2)培地が固体培地であり、微生物の増殖能が固体培地での微生物の増殖能であることを特徴とする上記(1)に記載の微生物の増殖能を増強する方法や、
(3)シクロデキストリンが、メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、α−シクロデキストリン及びγ−シクロデキストリンから選択される1種又は2種以上であることを特徴とする上記(1)又は(2)に記載の微生物の増殖能を増強する方法や、
(4)炭素数5以上の脂肪酸が、炭素数5〜30の範囲内の脂肪酸からなる群から選択される1種又は2種以上であることを特徴とする上記(1)〜(3)のいずれかに記載の微生物の増殖能を増強する方法や、
(5)脂肪酸が、オレイン酸、パルミトレイン酸、シス−バクセン酸、カプロレイン酸、リンデル酸、ミリストレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ミード酸、ジホモリノレン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸及びネルボン酸から選択される1種又は2種以上であることを特徴とする上記(4)に記載の微生物の増殖能を増強する方法や、
(6)培地が固体培地である場合は、培地中の炭素数5以上の脂肪酸の合計濃度が0.075〜500μg/mLの範囲内であり、培地が液体培地である場合は、培地中の炭素数5以上の脂肪酸の合計濃度が0.05〜500μg/mLの範囲内であることを特徴とする上記(1)〜(5)のいずれかに記載の微生物の増殖能を増強する方法や、
(7)シクロデキストリンに包接された、炭素数5以上の脂肪酸におけるシクロデキストリンと脂肪酸の重量比が、シクロデキストリン100重量部に対して脂肪酸0.2〜45重量部の範囲内であることを特徴とする上記(1)〜(6)のいずれかに記載の微生物の増殖能を増強する方法や、
(8)微生物が、真正細菌、古細菌及び真核生物からなる群から選択されることを特徴とする上記(1)〜(7)のいずれかに記載の微生物の増殖能を増強する方法に関する。
(9)シクロデキストリンに包接された、炭素数5以上の脂肪酸を含有する培地で微生物を培養する工程を含むことを特徴とする微生物を増殖する方法に関する。
(10)シクロデキストリンに包接された、炭素数5以上の脂肪酸を含有する微生物の増殖能の増強剤に関する。
背景技術に記載したように、非特許文献16の変異株は、変異原メチルニトロニトロソグアニジンを用いて取得された株であるため、fabB遺伝子以外に多数の変異を含み、遺伝的背景が複雑で未知の部分も多い。そこで、大腸菌の野生株MG1655からfabB遺伝子だけを欠損させた変異株(fabB遺伝子欠損株:ΔfabB)の取得を試みた。
(エマルション化オレイン酸含有培地におけるΔfabB株の増殖能 1)
エマルション化オレイン酸含有培地(固体培地及び液体培地)におけるΔfabB株の増殖能を調べるために、Triton X-100でエマルション化したオレイン酸0.01〜20μg/mLを含む、脂肪酸不含の合成液体培地(M9−CAGlc培地;0.6% Na2HPO4、0.3% KH2PO4、0.1% NH4Cl、0.1% NaCl、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2、0.5% カザミノ酸、0.4% D−グルコース)(以下、「エマルション化オレイン酸含有液体培地」という)、又は合成固体培地(以下、「エマルション化オレイン酸含有固体培地」という)を用いて細胞増殖レベルを解析した。細胞増殖レベルは、増殖可能細胞数を指標とした。増殖可能細胞数の算出方法は、上記の「発明を実施するための形態」に記載した方法を用いた。なお、0.01〜20μg/mL(オレイン酸濃度) エマルション化オレイン酸含有液体培地は、1% Triton X-100に2mg/mL オレイン酸を添加して、激しく撹拌した後、M9−CAGlc培地で100〜200000倍(オレイン酸の最終濃度20〜0.01μg/mL)希釈することにより調製した。また、エマルション化オレイン酸含有固体培地は、エマルション化オレイン酸含有液体培地に1.5%となるようにアガロースを添加して調製した。また、コントロールとしてΔfabB株をエマルション化オレイン酸不含の培地中で培養する実験や、野生株(MG1655株)をエマルション化オレイン酸含有又は不含の培地中で培養する実験も行った。
(エマルション化オレイン酸含有培地におけるΔfabB株の増殖能 2)
参考例2で調製したエマルション化オレイン酸含有培地に含まれるTriton X-100が、ΔfabB株の増殖能に影響を与えるかどうか調べた。具体的には、0.1μg/mL エマルション化オレイン酸含有液体培地におけるTriton X-100濃度が、20〜1000μg/mLとなるように培地を調製し、ΔfabB株の細胞増殖レベル(増殖可能細胞数)を解析した。
[参考例4]
参考例3の結果から、Triton X-100でエマルション化したオレイン酸を培地に添加する方法では、Triton X-100が大腸菌の増殖レベルを低下させる効果を有するため、培地中のオレイン酸は、最大でも20μg/mLの濃度でしか添加することができない。そこで、オレイン酸を培地に添加する方法として、Triton X-100でオレイン酸をエマルション化する方法に代えて、メチル−β−シクロデキストリンでオレイン酸を抱接する方法を検討した。それに先立ち、まず、メチル−β−シクロデキストリンがMG1655株の増殖能に与える影響を調べた。
参考例4の結果から、大腸菌の増殖能は6000μg/mLのメチル−β−シクロデキストリンによっても低下しないことが示された。そこで、オレイン酸を培地に添加する方法として、Triton X-100でオレイン酸をエマルション化する方法に代えて、メチル−β−シクロデキストリンでオレイン酸を抱接する方法を試みた。
固体培地上でコロニー形成能が低下した大腸菌変異株は脂肪酸合成酵素FabB遺伝子欠損株であった。そこで、各種微生物の野生株を用いた際に、脂肪酸合成酵素阻害剤を添加することにより、コロニー形成能等の増殖能が低下するかどうかを、増殖可能細胞数を指標に検討した。CFUは微生物を液体培養して得られた培養液の一部を固体培地に播種し、培養して形成されたコロニー数を計測し、MPNは前述の培養液を常法にしたがって希釈して菌数を計測した。
脂肪酸合成酵素阻害剤の添加により低下した細菌のコロニー形成能等の増殖能が、シクロデキストリン包接脂肪酸の添加により回復するかどうかを検討した。シクロデキストリン包接脂肪酸としては、上記実施例1で作製したシクロデキストリン包接オレイン酸を用いた。
Claims (10)
- シクロデキストリンに包接された、炭素数5以上の脂肪酸を含有する培地で微生物を培養する工程を含むことを特徴とする微生物の増殖能を増強する方法。
- 培地が固体培地であり、微生物の増殖能が固体培地での微生物の増殖能であることを特徴とする請求項1に記載の微生物の増殖能を増強する方法。
- シクロデキストリンが、メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、α−シクロデキストリン及びγ−シクロデキストリンから選択される1種又は2種以上であることを特徴とする請求項1又は2に記載の微生物の増殖能を増強する方法。
- 炭素数5以上の脂肪酸が、炭素数5〜30の範囲内の脂肪酸からなる群から選択される1種又は2種以上であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の微生物の増殖能を増強する方法。
- 脂肪酸が、オレイン酸、パルミトレイン酸、シス−バクセン酸、カプロレイン酸、リンデル酸、ミリストレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ミード酸、ジホモリノレン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸及びネルボン酸から選択される1種又は2種以上であることを特徴とする請求項4に記載の微生物の増殖能を増強する方法。
- 培地が固体培地である場合は、培地中の炭素数5以上の脂肪酸の合計濃度が0.075〜500μg/mLの範囲内であり、培地が液体培地である場合は、培地中の炭素数5以上の脂肪酸の合計濃度が0.05〜500μg/mLの範囲内であることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の微生物の増殖能を増強する方法。
- シクロデキストリンに包接された、炭素数5以上の脂肪酸におけるシクロデキストリンと脂肪酸の重量比が、シクロデキストリン100重量部に対して脂肪酸0.2〜45重量部の範囲内であることを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の微生物の増殖能を増強する方法。
- 微生物が、真正細菌、古細菌及び真核生物からなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の微生物の増殖能を増強する方法。
- シクロデキストリンに包接された、炭素数5以上の脂肪酸を含有する培地で微生物を培養する工程を含むことを特徴とする微生物を増殖する方法。
- シクロデキストリンに包接された、炭素数5以上の脂肪酸を含有する微生物の増殖能の増強剤。
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