WO2019138566A1 - 濾過滅菌に適したステロール含有細胞培養培地 - Google Patents

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WO2019138566A1
WO2019138566A1 PCT/JP2018/000770 JP2018000770W WO2019138566A1 WO 2019138566 A1 WO2019138566 A1 WO 2019138566A1 JP 2018000770 W JP2018000770 W JP 2018000770W WO 2019138566 A1 WO2019138566 A1 WO 2019138566A1
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medium
cholesterol
culture medium
filter
sterol
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PCT/JP2018/000770
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Inventor
一興 大隅
清水　則夫
Original Assignee
国立大学法人 東京医科歯科大学
株式会社グリンデイ
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to an additive for a cell culture medium, which comprises a sterol / TOMCD clathrate compound in which a sterol is clathrated by a trimethylated form of cyclodextrin (hereinafter sometimes referred to as "TOMCD").
  • TOMCD trimethylated form of cyclodextrin
  • the present invention also relates to a cell culture medium containing the above-described additive, a method for producing a cell culture medium using the above-described additive, and the like.
  • serum medium a medium containing serum derived from an animal such as fetal bovine serum at a ratio of 5 to 20% is used.
  • serum medium a medium containing serum derived from an animal such as fetal bovine serum at a ratio of 5 to 20% is used.
  • Ru Serum in the medium is important as a nutrient source for promoting the growth and / or proliferation of cultured cells, or a source of physiologically active substances such as hormones, and a medium containing no serum (hereinafter, "serum-free medium
  • animal cells can not grow at all or grow poorly.
  • problems that serum is very expensive, that it is a product of natural origin, there are differences in components from lot to lot, and a large amount of proteinaceous substances of unknown components is contained.
  • Patent Document 1 discloses a medium in which Pluronic F68 and dimethyl- ⁇ -cyclodextrin are added to ASF-104 medium.
  • target cells are cultured in a culture medium containing 10% serum for 8 to 24 hours, and described as (page 3, right column, lines 2 to 3). It is necessary to preculture the cells in a medium containing 10% serum, and it is not possible to culture completely under serum free conditions.
  • examples of small-scale and static culture on culture dishes have only been described, and this culture method is far from industrial substance production.
  • Non-Patent Document 1 discloses “cholesterol or plant sterol, in which cholesterol or plant sterol is included by methyl- ⁇ -cyclodextrin (hereinafter, may be described as“ MOM ⁇ CD ”or“ MOM- ⁇ -CD ”). It is disclosed to add “MOM ⁇ CD clathrate” to CD hybridoma culture medium containing glutamine.
  • Non-Patent Document 1 two kinds of clathrates having different composition ratios of MOM ⁇ CD and sterol, which are called “LTI first generation cholesterol additive” and “second generation cholesterol additive”, are prepared, and these additives It has been disclosed that one week culture of NSO cells is possible by using a serum-free medium containing C. ( Figures 2 and 4 of Non-patent Document 1). However, according to Non-Patent Document 1, in the medium (Pre-filtration) which is filter-sterilized after adding the first generation (1st Generation) cholesterol additive, most of the added cholesterol is removed by the filter for sterilization. It is clarified ( Figure 3 of Non-Patent Document 1).
  • Patent Documents 2 and 3 disclose media to which inorganic iron compounds are added instead of transferrin in ITES (insulin, transferrin, ethanolamine, sodium selenite).
  • ITES insulin, transferrin, ethanolamine, sodium selenite
  • examples of small-scale stationary culture in tissue culture flasks have only been described, and CHOs in which these media are widely used as hosts for genetic recombination It is unclear whether it can be applied to the culture of cells.
  • ITES insulin, transferrin, ethanolamine, sodium selenite
  • Cyclodextrin (CD) is a type of cyclic oligosaccharide having a cyclic structure, in which usually 5 or more molecules of D-glucose are linked via an ⁇ (1 ⁇ 4) glucosidic bond. Cyclodextrins generally used are those in which 6 to 8 molecules of glucose are bound, those in which 6 glucoses are bound are ⁇ -CD, those in which 7 glucoses are bound are ⁇ -CD, 8 molecules Glucose bound is called ⁇ -CD. It is known that CD has an effect of incorporating another molecule (guest molecule) into a pore inside the cyclic structure to clasp the guest molecule.
  • guest molecule another molecule
  • cyclodextrin The outside of the cyclic structure of cyclodextrin is hydrophilic, while the pores inside the cyclic structure are hydrophobic. It may be used to mask the odor of a guest molecule, stabilize the guest molecule, and solubilize a hydrophobic guest molecule by using such cyclodextrin inclusion action.
  • CD in particular methyl- ⁇ -cyclodextrin, has the property of removing cell membrane lipids when it comes in contact with cells, and it has become clear from experiments using animal cells that cell viability is reduced. (Non-patent documents 2 and 3).
  • post-addition method were separately filter-sterilized separately with a filter for filter sterilization, and a part of the high concentration cholesterol ⁇ MOM ⁇ CD inclusion compound was added to the basic medium under aseptic conditions (so-called “post-addition method”. Or “post-filter addition method”).
  • a step for example, a portion of the high concentration cholesterol / MOM ⁇ CD inclusion compound is treated with the basic medium after filtration sterilization of the basic medium and the high concentration cholesterol / MOM ⁇ CD inclusion compound separately, respectively. It is difficult to guarantee the sterility in the process of adding to the above, etc., and there is a problem that it is necessary to inspect the final product one by one in order to guarantee the sterility.
  • Cholesterol / MOM ⁇ CD clathrates have low filter permeability for filter sterilization (filtration performance) and are easy to cause clogging in filters for filter sterilization. Another problem is that it consumes a large number of filters for filter sterilization and increases the cost.
  • One of the problems of the present invention is to provide a more practical sterol additive that is more suitable for addition to the medium before filter sterilization (ie, filter sterilization after addition to the medium), more specifically, filtration Filter for sterilization (filtration performance) is higher, so it is more suitable for filter sterilization after addition to the medium, thus making sterol-containing medium with higher sterility more easily and more efficiently. It is an object of the present invention to provide a more suitable sterol additive. In addition, another object of the present invention is to provide a more practical sterol-containing medium more suitable for filter sterilization, more specifically, filter sterilization for filter sterilization due to higher filter permeability (filtration performance).
  • Another object of the present invention is to provide a sterol additive and a sterol-containing medium which can be filter-sterilized at a lower cost, since the amount of filter required for filter-sterilization can be reduced.
  • TOM ⁇ CD trimethyl- ⁇ -cyclodextrin
  • TOM- ⁇ -CD trimethyl- ⁇ -cyclodextrin
  • cholesterol an inclusion compound in which cholesterol is included in TOM ⁇ CD (hereinafter, such a compound may be described as “cholesterol ⁇ TOM ⁇ CD inclusion compound”) (Example 1).
  • CD in particular methyl- ⁇ -cyclodextrin
  • a medium that has been filter-sterilized after adding a cholesterol ⁇ TOM ⁇ CD inclusion compound (addition medium before filtration), and a medium that is added with a cholesterol ⁇ TOM ⁇ CD inclusion compound after filter sterilization (post-filtration addition medium) are prepared.
  • Serum-free culture of SNT-8 cells was performed using a culture medium to examine changes in cell proliferation (Example 7).
  • the culture medium to which cholesterol ⁇ MOM ⁇ CD inclusion compound or cholesterol ⁇ TOM ⁇ CD inclusion compound was added was filtered with a filter, collected for every 1 L of culture medium, and the cell proliferation ability in each culture medium was examined.
  • filtration reduced the cell proliferation ability at the 1st or 3rd eye, but when the cholesterol ⁇ TOM ⁇ CD inclusion compound was used, the cell proliferation ability even at the 4th eye was observed It was not.
  • the inventor found that the complex compound formed from the trimethylated body of CD and sterol is more suitable for addition to the medium before filter sterilization (ie, filter sterilization after addition to the medium), It has been found that the sterol-containing culture medium with higher sterility is more easily and efficiently produced more easily and efficiently, and the present invention has been completed.
  • the present invention (1) An additive for a cell culture medium containing a sterol clathrated by a trimethylated form of cyclodextrin, wherein the trimethylated form of the cyclodextrin is trimethyl- ⁇ -cyclodextrin, trimethyl- ⁇ -cyclodextrin And one or more selected from the group consisting of trimethyl- ⁇ -cyclodextrin, and the above additives, (2)
  • the above (1) to (1), wherein the sterol is one or more selected from the group consisting of cholesterol, campesterol, desmosterol, ergosterol, fucosterol, ⁇ -sitosterol, stigmasterol, and methylcholesterol.
  • the additive according to any one of (3), (5) The additive according to any one of the above (1) to (4), wherein the sterol is cholesterol, (6)
  • the weight ratio of trimethylated body of cyclodextrin to sterol is 1 to 80 parts by weight of sterol based on 1000 parts by weight of trimethylated body of cyclodextrin Listed additives, (7) The additive according to any one of the above (1) to (6), wherein the cell is a cell of animal or plant origin or a microorganism.
  • the present invention (8) A cell culture medium containing the additive according to any one of the above (1) to (7) and a basic medium, (9) The cell culture medium described in (8) above, which does not contain serum, (10) The cell culture medium according to (8) or (9) above, which contains sterol at a concentration of 0.01 to 50 mg / L.
  • the present invention (11) A method for producing a cell culture medium, which comprises the following steps (a) and (b); (A) adding the additive according to any one of the above (1) to (7) to a basal medium; (B) filtering and sterilizing the basic medium containing the additive after the step (a) to prepare a cell culture medium; (12) The method according to (11) above, which does not include the step of adding serum to a basal medium, (13) The production according to (11) or (12) above, wherein an additive is added to the basic medium in step (a) such that the concentration of sterol in the cell culture medium is 0.01 to 50 mg / L. How, (14) The process according to any one of (11) to (13), wherein in the step (b), filter sterilization is carried out using a filter having a pore size of 0.01 ⁇ m to 20 ⁇ m.
  • a more practical sterol additive more suitable for addition to the medium before filter sterilization (ie, filter sterilization after addition to the medium), more specifically, filter sterilization Filter permeability (filtration performance) is higher, so it is more suitable for filter sterilization after addition to the culture medium, and therefore, a sterol-containing culture medium with higher sterility is more easily and efficiently produced. More suitable sterol additives can be provided. Moreover, according to the present invention, a more practical sterol-containing medium can be provided which is more suitable for filter sterilization, and more specifically, filter sterilization is performed because filter permeability for filter sterilization (filter performance) is higher.
  • a sterol-containing culture medium that is more suitable and, therefore, can more easily and more efficiently be able to guarantee sterility to a high degree or can be provided. Further, according to the present invention, since the amount of filter required for filter sterilization can be reduced, it is also possible to provide a sterol additive and sterol-containing medium capable of filter sterilization at lower cost.
  • FIG. 6 shows the degree of cell proliferation when SNT-8 cells are cultured using a medium to which a cholesterol cyclodextrin inclusion compound is added.
  • 5 mg of MOM ⁇ 1000 is a 1,000-fold dilution of a solution of cholesterol ⁇ MOM- ⁇ -CD clathrate prepared by adding 5 mg of cholesterol to the MOM- ⁇ -CD solution of Example 1.
  • the results obtained when adding to the medium were as follows: MOM 40 mg ⁇ 2000 was prepared by adding 40 mg of cholesterol to the MOM- ⁇ -CD solution of Example 1 and preparing a solution of cholesterol ⁇ MOM- ⁇ -CD inclusion compound.
  • TOM 40 mg x 2000 is a 4,000-fold dilution of a solution of cholesterol TOM- ⁇ -CD inclusion compound prepared by adding 40 mg of cholesterol to the TOM- ⁇ -CD solution of Example 1 Represents the result when added to
  • the vertical axis of the figure shows the ratio of the number of cells in each case based on the number of cells in the case of using the control medium.
  • a medium of 40 mg ⁇ 2000 of MOM was used. It is a figure which shows a cell proliferative ability when culture
  • the horizontal axis represents dilution ratio
  • the vertical axis represents the ratio of the number of cells in each case based on the number of cells in the case of using a control medium.
  • a control a medium of 40 mg x 2000 of MOM was used.
  • the vertical axis of the figure shows the ratio of the total filtration amount when the total filtration amount without addition of the cholesterol-cyclodextrin inclusion compound is 1.0 as the filtration efficiency.
  • MOM MOM- ⁇ -CD solution of Example 1
  • the results when added are as follows: 40 mg of MOM was prepared by adding a 2,000-fold solution of a cholesterol ⁇ MOM- ⁇ -CD clathrate compound prepared by adding 40 mg of cholesterol to the MOM- ⁇ -CD solution of Example 1.
  • the results when adding to the medium are as follows: TOM 40 mg is a solution of cholesterol and TOM- ⁇ -CD inclusion compound prepared by adding 40 mg of cholesterol to the TOM- ⁇ -CD solution of Example 1
  • FIG. 6 is a graph showing the degree of cell proliferation (the number of cells on the fourth day of culture) when SNT-8 cells are cultured using a medium to which a cholesterol cyclodextrin inclusion compound is added.
  • the black bar graph represents the result when using the culture medium to which the cholesterol cyclodextrin inclusion compound was added after filter sterilization of the culture medium ("post filtration addition”)
  • the gray bar graph represents cholesterol cyclo The results are shown when the culture medium after addition of the dextrin inclusion compound is filtered ("pre-filter addition").
  • MOM was prepared by diluting a solution of cholesterol ⁇ MOM- ⁇ -CD clathrate compound prepared by adding 5 mg of cholesterol to the MOM- ⁇ -CD solution of Example 1 to be 1,000 times.
  • 40 mg of MOM is 2,000 times the solution of cholesterol ⁇ MOM- ⁇ -CD inclusion compound prepared by adding 40 mg of cholesterol to the MOM- ⁇ -CD solution of Example 1.
  • TOM 40 mg is a solution of cholesterol TOM- ⁇ -CD inclusion compound prepared by adding 40 mg of cholesterol to the TOM- ⁇ -CD solution of Example 1 Represents the results when added to the culture medium to a 4,000-fold dilution.
  • the culture medium after addition of the cholesterol cyclodextrin inclusion compound is filtered and sterilized with a filter (“bottle top filter (Corning Inc., pore diameter 0.22 ⁇ m PES 431118)”) to continuously filter sterilize 4 L of culture medium.
  • the figure shows the degree of cell proliferation (number of cells on the fourth day of culture) when SNT-8 cells are cultured using each of the collected culture media after collecting the culture medium in a separate container every 1 L from the start of filtration. It is.
  • the vertical axis of the figure shows the ratio of the number of cells in each case based on the number of cells in the case of using the control medium.
  • a medium obtained by post-adding a solution of a cholesterol ⁇ MOM- ⁇ -CD clathrate compound to a Artemis-1 medium at a 2,000-fold dilution was used.
  • “1st L” indicates the start of filtration to 1 L when filtration sterilization of 4 L of medium containing cholesterol cyclodextrin inclusion compound is continuously filtered, and “2 L” to the next 2 L
  • the “3 L” indicates the medium up to the next 3 L
  • the “4 L” indicates the medium up to the next 4 L, respectively.
  • the additive of the present invention is an additive for a cell culture medium containing a sterol / TOMCD clathrate compound which is included with a trimethylated product (TOMCD) of cyclodextrin, wherein the trimethylated product of the cyclodextrin is
  • the additive is not particularly limited as long as it is one or more selected from the group consisting of trimethyl- ⁇ -cyclodextrin, trimethyl- ⁇ -cyclodextrin, and trimethyl- ⁇ -cyclodextrin.
  • trimethyl- ⁇ -cyclodextrin is ⁇ -cyclodextrin in which 6 molecules of glucose are cyclically bound, and one or more molecules (more preferably 3 or more) of glucose constituting it Compounds and derivatives thereof in which three hydroxyl groups at the 2-, 3- and 6-positions of a molecule, more preferably 4 molecules, more preferably 4 molecules, more preferably 5 molecules, more preferably 6 molecules are modified by methyl groups
  • trimethyl-.beta.-cyclodextrin TOM.beta.
  • CD is .beta.-cyclodextrin in which seven molecules of glucose are cyclically bound, and one or more molecules (more preferably three molecules or more) of glucose constituting it , More preferably 4 molecules or more, still more preferably 5 molecules or more, more preferably 6 molecules or more, more preferably 7 molecules
  • TOM ⁇ CD trimethyl- ⁇ -cyclodextrin
  • eight molecules of glucose are cyclically 1 or 2 or more molecules (preferably 3 molecules or more, more preferably 4 molecules or more, more preferably 5 molecules or more, more preferably 6 molecules or more of glucose) constituting the bound ⁇ -cyclodextrin
  • it means a compound and derivatives thereof in which three hydroxyl groups at the 2-position, 3-position and 6-position of 7 or more molecules, more preferably 8 molecules) are modified by methyl groups.
  • sterol / TOMCD clathrate compound (sterol / TOMCD clathrate compound in which the sterol is clathrated by the trimethylated body of cyclodextrin”)
  • all or part of the sterol (guest molecule) is CD trimethylated body (the sterol (guest molecule)
  • the host compound is a complex compound of a CD-trimethylated product and a sterol, which forms a structure incorporated in the hydrophobic pore inside the cyclic structure of the host molecule).
  • Whether the sterol is included in TOMCD is determined by using circular dichroism spectrum or NMR spectrum in the solution state, thermal analysis DSC, powder X-ray etc in the solid state, TOMCD alone, guest molecule alone, physical
  • the mixture and the CD inclusion complex can be confirmed, for example, by comparison.
  • any one or two or three of TOM ⁇ CD, TOM ⁇ CD, and TOM ⁇ CD may be used in combination as a host molecule, but TOM ⁇ CD and TOM ⁇ CD and / or TOM ⁇ CD are combined. It is more preferable to use TOM ⁇ CD alone.
  • one or more sterols selected from the group consisting of cholesterol, campesterol, desmosterol, ergosterol, fucosterol, ⁇ -sitosterol, stigmasterol, and methylcholesterol as a guest molecule, or although its derivatives can be used, it is preferable to use cholesterol.
  • a method to prepare the "sterol * TOMCD clathrate compound" in this invention For example, well-known methods, such as a kneading method, a saturated aqueous solution method, an emulsification method, the mixing grinding method, can be used.
  • a kneading method a small amount of water is added to a host molecule to make a paste, a certain amount of guest molecule is added thereto, and the mixture is thoroughly kneaded by a kneader or the like, and the guest molecule is included in the host molecule
  • a saturated aqueous solution method a saturated aqueous solution of host molecules is prepared, and then a certain amount of guest molecules are added and mixed, and stirring is carried out for 30 minutes to several days to mix guest molecules enclosed in host molecules.
  • the method to obtain by precipitation is mentioned.
  • emulsification method a 20 to 50% suspension of host molecules is prepared, and a certain amount of guest molecules is added thereto, and emulsified with a homogenizer to obtain guest molecules in which the guest molecules are included in the host molecules. ⁇
  • a method of obtaining a host molecule clathrate is included.
  • Examples of the above-mentioned mixed pulverization method include a method in which a host molecule and a guest molecule are placed in a vibration mill and then pulverized to obtain a guest molecule / host molecule clathrate compound in which the guest molecule is included in the host molecule.
  • saturated aqueous solution method, and emulsification method in the case of obtaining a solid “sterol ⁇ TOMCD clathrate compound”, dry the liquid containing sterol ⁇ TOMCD clathrate obtained by each method (preferably May be freeze-dried).
  • the storage may be performed at normal temperature but is preferably performed at a temperature of 4 ° C. or less from the viewpoint of enabling storage for a longer period of time.
  • the weight ratio of TOMCD to sterol in the “sterol / TOMCD inclusion compound” in the present invention is not particularly limited as long as cells to be cultured can be proliferated, for example, sterol relative to 1000 parts by weight of TOMCD. Is preferably in the range of 1 to 80, more preferably 5 to 80 parts by weight, more preferably 5 to 70 parts by weight, still more preferably 10 to 60 parts by weight, still more preferably 20 to 50 It can be in the range of parts by weight, particularly preferably in the range of 35 to 45 parts by weight.
  • the additive of the present invention may be in the form of a solid such as a powder, granules, or tablets, or may be in the form of a liquid such as a water solvent, a suspending agent, an emulsion, or an oil. From the viewpoint of excellent storage stability, a solid dosage form is preferable.
  • the additive of the present invention can be diluted with a medium or the like at an appropriate magnification when added to the medium.
  • the concentration of the sterol / TOMCD clathrate compound in the additive of the present invention is not particularly limited, but when the additive of the present invention is solid, it is, for example, 0.001 to 99.9% by weight, preferably 0.1 to 90% by weight, more preferably 1 to 60% by weight, and when the additive of the present invention is solid, for example, 0.001 to 25% by weight, preferably 0.1 to 20% by weight, more preferably 1 It can be up to 15% by weight.
  • the additive of the present invention may consist only of sterol / TOMCD inclusion compound, or may contain other optional components.
  • Such optional components include, in addition to solid carriers and liquid carriers (for example, water), excipients, binders, preservatives, stabilizers, emulsifiers, osmotic pressure regulators and the like.
  • the additive of the present invention can be produced using a sterol / TOMCD inclusion compound or a sterol / TOMCD inclusion compound and an optional component.
  • the additive of the present invention containing a sterol / TOMCD inclusion compound and an optional component can be prepared by mixing the sterol / TOMCD inclusion compound with an optional component.
  • animal-derived cells include, but are not limited to, for example, mammalian-derived cells, insect cells, nematode cells and the like.
  • mammalian-derived cells include, but are not limited to, for example, mammalian-derived cells, insect cells, nematode cells and the like.
  • the animal-derived cells may be any of normal cells, diseased cells, transformed cells, mutant cells, somatic cells, germ cells, germinated cells, stem cells, progenitor cells, and germ cells, and have already been established.
  • the cell line may be one obtained from a natural source.
  • the stem cells include pluripotent stem cells, somatic stem cells and the like, and examples of pluripotent stem cells include iPS cells (artificial pluripotent stem cells), ES cells (embryonic stem cells) and the like, and somatic stem cells Examples include neural stem cells, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, cardiac stem cells, liver stem cells, small intestinal stem cells and the like.
  • the additive of the present invention can be used for suspension (stirring) culture of the above-mentioned animal-derived cells as well as adhesion culture.
  • the cell culture medium of the present invention is not particularly limited as long as it contains the additive of the present invention and a basic medium.
  • the above-mentioned "basic medium” may be any medium from which cells or animals derived from animals or plants can be cultured, and examples thereof include a medium containing a carbon source and a nitrogen source, Preferably, a medium further containing mineral salts is preferably mentioned. Moreover, it is especially preferable that it is a culture medium which can carry out the serum free culture of the said animal origin cell as this "basic culture medium.” Specifically, RPMI 1640 medium (G. E. Moore et al., The Journal of the American Medical Association (J. A. M. A.), Vol. 199, p.
  • a mixed medium can be mentioned suitably, and in particular, RPMI 1640 medium or Artemis-1 medium can be mentioned particularly suitably.
  • the concentration of sterol in the cell culture medium of the present invention is not particularly limited as long as survival and / or growth of the living cells to be cultured can be enabled, but for example, within the range of 0.001 to 500 mg / L, preferably Within the range of 0.01 to 50 mg / L, more preferably within the range of 0.03 to 40 mg / L, still more preferably within the range of 0.125 to 30 mg / L, even more preferably 0.125 to 25 mg / L , More preferably within the range of 0.25 to 16 mg / L, still more preferably within the range of 0.5 to 8 mg / L, even more preferably within the range of 0.5 to 5 mg / L, more preferably
  • the upper limit of the concentration of TOMCD inclusion sterol in the culture medium is 100 mg / l in terms of sterol concentration from the viewpoint of cost.
  • the cell culture medium of the present invention may be a serum-free medium not containing serum or a serum-containing medium containing serum, but is preferably a serum-free medium.
  • the cell culture medium of the present invention includes, in addition to the additive of the present invention and the above-mentioned basic medium, a component for improving the survival and / or proliferation of living cells to be cultured, a selective drug corresponding to a specific selection marker, etc. May be further included.
  • components for improving the survival and / or proliferation of living cells to be cultured include, for example, EGF, aFGF, bFGF, HGF, IGF-1, IGF-2, NGF, interleukin (eg, interleukin 2) (Preferably recombinant human interleukin 2), colony stimulating factor, cytokines such as interferon; albumin such as bovine serum albumin, human serum albumin, etc.
  • Physiologically active substances such as prostaglandin; extracellular matrix components such as collagen, laminin, proteoglycan, glycosaminoglycan, fibronectin, vitronectin; bovine serum (fetal cow, neonatal cow or normal cow Serum), human serum, bovine serum, porcine serum, monkey serum, tailless monkey serum, rat serum, murine serum, rabbit serum, serum such as sheep serum, etc.
  • the concentration of the component in the medium can be appropriately set by those skilled in the art.
  • the concentration of interleukin preferably interleukin 2 and more preferably human recombinant interleukin 2
  • the concentration of serum albumin (preferably human serum albumin) in the medium is preferably 0.4 to 10 g / L, more preferably 0.6 to 6 g / L, and still more preferably 1 to 3 g / L.
  • the cell culture medium of the present invention may be a solid such as powder or granules, or may be a liquid such as an aqueous solution.
  • the solid cell culture medium has the merit of being superior to the storage property, and the liquid cell culture medium has the merit of being superior to the convenience.
  • the liquid cell culture medium may be a culture medium of the concentration used as it is, or may be a concentrated medium which is a concentration which is used by diluting it by a factor of 5 (for example, 5 or 10). Good.
  • the liquid cell culture medium, which is the concentration to be used as it is is highly preferable from the viewpoint of convenience, because the user of the cell culture medium can be used as it is without sterilization if sterilization is performed.
  • the cell culture medium of the present invention can be prepared, for example, by mixing the additive of the present invention, a basic medium, and optionally, optional components.
  • optional components include, in addition to solid carriers and liquid carriers (for example, water), excipients, binders, preservatives, stabilizers, emulsifiers, osmotic pressure regulators and the like.
  • a more specific method for producing the cell culture medium of the present invention is not particularly limited as long as it comprises the following steps (a) and (b). (A) adding the additive of the present invention to the basic medium; (B) a step of filter-sterilizing the basic medium containing the additive of the present invention after the step (a) to prepare a cell culture medium;
  • the concentration of sterol in the cell culture medium is, for example, in the range of 0.001 to 500 mg / L, preferably in the range of 0.01 to 50 mg / L, more preferably 0.03 to Within the range of 40 mg / L, more preferably within the range of 0.125-30 mg / L, even more preferably within the range of 0.125-25 mg / L, more preferably within the range of 0.25-16 mg / L,
  • the above basic medium is more preferably in the range of 0.5 to 8 mg / L, still more preferably in the range of 0.5 to 5 mg / L, more preferably in the range of 0.5 to 2 mg / L.
  • the additive of the present invention is added to Further, from the viewpoint of cost, the upper limit of the concentration of TOMCD inclusion sterol in the culture medium is 100 mg / L or less, 75 mg / L or less, 50 mg / L or less, 25 mg / L or less, 16 mg / L or less, 10 mg in terms of sterol concentration
  • the additive of the present invention may be added to the above basic medium so as to be at most / L, at most 8 mg / L, at most 5 mg / L, at most 4 mg / L or at most 2 mg / L.
  • the filter sterilization in the above-mentioned step (b) may be performed using any filter that can remove bacteria from the culture medium, as the upper limit of the pore size of the filter for filter sterilization.
  • the upper limit of the pore size of the filter for filter sterilization 20 ⁇ m or less, 15 ⁇ m or less, 10 ⁇ m or less, 8 ⁇ m or less, 5 ⁇ m or less, 3 ⁇ m or less, 2 ⁇ m or less, 1.5 ⁇ m or less, 1.2 ⁇ m or less, 1 ⁇ m or less, 0.8 ⁇ m or less, 0.6 ⁇ m or less, 0.45 ⁇ m
  • the following are 0.35 ⁇ m or less, 0.3 ⁇ m or less, 0.25 ⁇ m or less, and the lower limit of the pore diameter of the filter for filter sterilization is 0.01 ⁇ m or more, 0.03 ⁇ m or more, 0.05 ⁇ m or more, 0.08 ⁇ m or more, 0.1 micrometer or more, 0.15 micrometer or more, 0.2 micrometer or
  • the range of the pore size of the filter for filter sterilization all combinations of the upper limit and the lower limit mentioned above are disclosed, for example, within the range of 0.01 to 20 ⁇ m, more preferably within the range of 0.03 to 15 ⁇ m, More preferably, it is in the range of 0.05 to 10 ⁇ m, more preferably in the range of 0.08 to 5 ⁇ m, still more preferably in the range of 0.1 to 1 ⁇ m, more preferably in the range of 0.1 to 0.6 ⁇ m More preferably, it is in the range of 0.1 to 0.45 ⁇ m, more preferably in the range of 0.1 to 0.3 ⁇ m, and particularly preferably in the range of 0.2 to 0.25 ⁇ m.
  • the filter for sterilization and filtration may be used in combination with a prefilter.
  • the pore size of the prefilter is not particularly limited, but preferably is a pore size larger than the pore size of the filter for filter sterilization, for example, within the range of 1.1 to 10 times the pore size of the filter for filter sterilization described above; The range of 1 to 5 times and the range of 1.2 to 3 times may be mentioned.
  • the materials of the filter for sterilization and filtration and the prefilter are not particularly limited, and examples thereof include cellulose, nylon, hydrophilic polyether sulfone, hydrophilic PTFE (polytetrafluoroethylene), hydrophilic PVDF (polyvinylidene fluoride) and the like. It can mention suitably.
  • the filter sterilization in the step (b) may be carried out without replacing the filter for sterilization and sterilization (preferably, the filter for sterilization and sterilization as described above is used without replacing the filter for filter sterilization (preferably, bottle top filter (Corning, 0.22 .mu.m PES 431118)).
  • the culture medium of 1 L or more, 2 L or more, 3 L or more, 4 L or more, 5 L or more, 7 L or more, or 10 L or more. More specifically, when Artemis-1 medium is used as the basic medium, in the above step (b), 4 L or more of the medium is used as one filter sterilization filter (preferably, bottle top filter (Corning, pore size) It is preferable to sterilize continuously using 0.22 ⁇ m PES 431118)).
  • a filter sterilization filter preferably, bottle top filter (Corning, pore size
  • the method for producing a cell culture medium of the present invention is the “component for improving the survival and / or proliferation of a living cell to be cultured” and / or “a selective drug corresponding to a specific selection marker” as described above.
  • the method may further include the step of adding (a), the step including the step (a) and the step (a) simultaneously with the addition of the additive of the present invention in the step (a) before the step (a). It can be carried out during b) or after (b) above.
  • the method for producing a cell culture medium of the present invention does not include the step of adding serum to a basal medium.
  • the cholesterol concentration in the solution of 5 mg / MOM- ⁇ -CD is 1 mg / mL
  • the MOM- ⁇ -CD concentration is 200 mg / mL
  • the cholesterol concentration in the solution of 40 mg / MOM- ⁇ -CD is 8 mg / ML
  • the MOM- ⁇ -CD concentration is 200 mg / mL
  • the cholesterol concentration at 40 mg / TOM- ⁇ -CD is 4 mg / mL
  • the TOM- ⁇ -CD concentration is 100 mg / mL.
  • Millipore Millex GV filter (filter diameter: 3 mg of cholesterol / cyclodextrin complex compound (ie, 5 mg / MOM- ⁇ -CD, 40 mg / MOM- ⁇ -CD, 40 mg / TOM- ⁇ -CD) prepared The solution was sterilized by filtration using 33 mm, pore diameter 0.22 ⁇ m).
  • TOM- ⁇ -CD inclusion compound was prepared. When cholesterol was added below 60 mg, the solution became completely clear and cholesterol dissolved. On the other hand, when 70 mg or more of cholesterol was added, it was cloudy at a reaction temperature of 50 ° C. and was not completely dissolved. When a turbid solution containing 70 mg or more of cholesterol was left at room temperature, the solution to which 70 mg of cholesterol was added became clear, and the cholesterol was completely dissolved.
  • the solution to which 80 mg of cholesterol was added became almost clear, but the supernatant remained and cholesterol was not completely dissolved.
  • the solution to which 160 mg of cholesterol was added was cloudy at room temperature, and the cholesterol was not completely dissolved.
  • a solution to which 70 mg or less of cholesterol was added was filter-sterilized using Millipore Millex GV filter (filter diameter 33 mm, pore diameter 0.22 ⁇ m), and stored at 4 ° C. It was possible. From these results, the preferred amount of sterol (preferably cholesterol) to TOMCD is 80 parts by weight or less, preferably 70 parts by weight or less, more preferably 60 parts by weight of sterol (preferably cholesterol) to 1000 parts by weight of TOMCD. It was shown that it was below the weight part.
  • A1c + medium Add 2 mL each of A1c + medium to the wells of a 24-well microplate, and then add 1 ⁇ 10 5 cells (5 ⁇ 10 4 cells / mL) of SNT-8 cells, which are NK / T cell lines, to each well. The cells were cultured for 4 days in a 37 ° C. CO 2 incubator, and the number of cells was counted.
  • A1c + medium to which 40 mg / MOM- ⁇ -CD was added so as to be diluted 1: 2000 was used. This dilution factor in the control is the dilution factor that was previously determined before conducting the experiment.
  • the cell proliferation ability was almost equivalent to that of the control at dilutions of 2,000 to 8,000, but the cell growth ability was reduced at other dilutions, but the cells at 128,000 dilutions were lower than those added.
  • the proliferation ability was high, and the addition effect was observed. From these results, the cholesterol concentration in the cell culture medium is preferably 0.03 mg / L (cholesterol concentration at 128,000-fold dilution) to 16 mg / L (cholesterol concentration at 250-fold dilution), 0.125 mg / L.
  • L cholesterol concentration at 32000-fold dilution to 16 mg / L (cholesterol concentration at 250-fold dilution) is more preferable, and 0.25 mg / L (cholesterol concentration at 16000-fold dilution) to 16 mg / L (250 Cholesterol concentration at double dilution is more preferable, 0.5 mg / L (cholesterol concentration at 8,000-fold dilution) to 8 mg / L (cholesterol concentration at 500-fold dilution) is more preferable, 0.5 mg / L (Cholesterol concentration at 8000-fold dilution) to 4 mg / L (1 00-fold concentration of cholesterol) are more preferable when the dilution, the cholesterol concentration when the cholesterol concentration) ⁇ 2mg / L (2000-fold dilution when the 0.5 mg / L (8000-fold dilution) is more preferable.
  • Cholesterol cyclodextrin inclusion compound of the concentration determined in Example 3 was added to a culture medium obtained by adding human serum albumin (2 g / L) to RPMI-1640 medium, respectively, to prepare a medium for examination for filtration. That is, the concentration was 1,000-fold diluted for 5 mg / MOM- ⁇ -CD, 2,000-fold diluted for 40 mg / MOM- ⁇ -CD, and 4,000-fold diluted for 40 mg / TOM- ⁇ -CD. .
  • a culture medium to which no cholesterol cyclodextrin inclusion compound was added was also prepared ("no addition").
  • a silicone rubber plug was attached to the top of the filter crucible, and an 18 G needle was attached to the silicone rubber plug.
  • a Millipore Millex GV filter (filter diameter 13 mm, pore diameter 0.22 ⁇ m) was attached to an outer cylinder of a 50 mL syringe via a three-way cock, and the above-mentioned injection needle was connected with the filter.
  • the culture medium for filtration study is dispensed into the cylinder outer cylinder, and the culture medium for filtration study in the cylinder of the injection cylinder is suction-filtered through the filter cylinder via the filter at a pressure of -0.05 MPa through the suction port of the filtration cylinder. did.
  • the total filtration amount of each culture medium until the filter is clogged is shown in Table 1.
  • the time when it took 10 seconds or more to drop 10 drops was regarded as the time of clogging of the filter.
  • the ratio of the total filtration amount when the total filtration amount is 1.0 when the cholesterol cyclodextrin clathrate is not added is shown in Table 1 as the filtration efficiency, and is shown by a black bar graph in FIG.
  • the cholesterol / TOM- ⁇ -CD inclusion compound increased the total filtration amount by a factor of 3 or more as compared with the cholesterol / MOM- ⁇ -CD inclusion compound
  • the Cholesterol ⁇ TOM- ⁇ -CD inclusion compound is more suitable for filtration sterilization after addition to the culture medium, because it has higher filtration performance (filter permeability) than cholesterol ⁇ MOM- ⁇ -CD inclusion compound. Therefore, it has been shown that it is more suitable to produce a sterol-containing medium with a higher degree of sterility, more conveniently and more efficiently.
  • the cholesterol ⁇ TOM- ⁇ -CD clathrate is cholesterol ⁇ MOM- ⁇ , even if the medium to which the cholesterol ⁇ cyclodextrin inclusion compound is added is Artemis-1 medium. Compared to the CD inclusion compound, the total filtration amount was increased more than twice. From this, it was found that the cholesterol ⁇ TOM- ⁇ -CD inclusion compound exhibits higher filtration performance (filter permeability) than the cholesterol ⁇ MOM- ⁇ -CD inclusion compound regardless of the type of medium to be added. . Therefore, cholesterol ⁇ TOM- ⁇ -CD inclusion compound is more suitable for filter sterilization after addition to the culture medium, and therefore more easily and more efficiently produces sterol-containing culture medium with higher sterility guarantee It was shown to be more suitable.
  • Each cholesterol cyclodextrin inclusion compound is diluted 1: 1,000 (5 mg / MOM- ⁇ -CD) and 2,000 times (40 mg / MOM- ⁇ -) in Artemis-1 medium containing 250 ILU / mL of rhIL-2.
  • Storage medium (CD) 4,000-fold diluted (40 mg / TOM- ⁇ -CD) was added to 4 L each and a storage bottle (bottle top filter (Corning, 0.22 ⁇ m PES 431118) attached) was prepared. It was suction filtered with a negative pressure of ⁇ 0.04 MPa in Corning, 1 L 431433).
  • the Alc + medium supplemented with 5 mg / MOM- ⁇ -CD was able to filter all 4 L although the filtration rate was reduced.
  • the A1c + medium to which 40 mg / MOM- ⁇ -CD was added was clogged at 1.3 L and filtration of the entire 4 L could not be performed. All 4 L of A1c + medium supplemented with 40 mg / TOM- ⁇ -CD could be filtered without clogging.
  • the cell proliferation ability in each filtered medium was measured by the method using SNT-8 cells in the same manner as in Example 3. The results are shown in FIG.
  • the number of cells in the case of using a control medium is used using a culture medium obtained by adding a solution of cholesterol ⁇ MOM- ⁇ -CD clathrate compound to Artemis-1 medium at 2,000-fold dilution. As the standard ("1").
  • the cell proliferation ability decreased from 3 L
  • the cell proliferation ability was 1 L It has fallen.
  • TOM- ⁇ -CD has higher filtration performance than MOM- ⁇ -CD, and is less likely to cause clogging of the filter for filter sterilization. Therefore, it was shown that TOM- ⁇ -CD requires a smaller amount of filter for filter sterilization as compared to MOM- ⁇ -CD, and can be filter-sterilized at lower cost.
  • TOM- ⁇ -CD is more suitable for filtration sterilization after addition to the culture medium because of its high filtration performance, and therefore, sterol-containing culture medium with higher sterility is more easily and more efficiently performed. It was shown to be more suitable for production.
  • a more practical sterol additive more suitable for addition to the medium before filter sterilization (ie, filter sterilization after addition to the medium), more specifically, filter sterilization Filter permeability (filtration performance) is higher, so it is more suitable for filter sterilization after addition to the culture medium, and therefore, a sterol-containing culture medium with higher sterility is more easily and efficiently produced. More suitable sterol additives can be provided. Moreover, according to the present invention, a more practical sterol-containing medium can be provided which is more suitable for filter sterilization, and more specifically, filter sterilization is performed because filter permeability for filter sterilization (filter performance) is higher.
  • a sterol-containing culture medium that is more suitable and, therefore, can more easily and more efficiently be able to guarantee sterility to a high degree or can be provided. Further, according to the present invention, since the amount of filter required for filter sterilization can be reduced, it is also possible to provide a sterol additive and sterol-containing medium capable of filter sterilization at lower cost.

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Abstract

濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）がより高く、濾過滅菌前の培地への添加により適した、より実用的なステロール添加剤等を提供すること。シクロデキストリンのトリメチル化体とステロールとを用いて包接化合物を作製することにより、濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）がより高く、濾過滅菌前の培地への添加により適した、より実用的なステロール添加剤を提供することができる。かかるステロール添加剤は、所望のステロール濃度となるように培地に添加した後に濾過滅菌することに適しており、滅菌性がより高度に保証された培地を簡便かつ効率的に作製することができる。

Description

濾過滅菌に適したステロール含有細胞培養培地
　本発明は、ステロールがシクロデキストリンのトリメチル化体（以下、「ＴＯＭＣＤ」と記載する場合がある）によって包接されたステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物を含有する細胞培養培地用添加剤に関する。また、本発明は、上記添加剤を含む細胞培養培地や、上記添加剤を用いる細胞培養培地の作製方法等に関する。
　一般的に、動物細胞をインビトロで培養する際には、ウシ胎仔血清等の動物由来の血清を５～２０％の割合で含む培地（以下、「血清培地」と称する場合がある）が使用される。培地中の血清は、培養細胞の成長及び／又は増殖を促進するための栄養源、又はホルモン等の生理活性物質の供給源として重要であり、血清を全く含まない培地（以下、「無血清培地」と称する場合がある）中では動物細胞は全く増殖できないか、増殖が不十分なことが多い。しかし、血清は非常に高価であること、天然由来製品であるためにロット毎に成分の違いがあること、成分の不明なタンパク質性の物質が多量に含まれること等の問題がある。特に、細胞培養によって医薬品として使用するための組換えタンパク質／ペプチド（例えば、抗体等）を製造する場合には、血清培地を用いると血清由来の不純物の除去に関する煩雑な工程や試験が安全性評価のために必要となるため、実用的な無血清培地の開発が望まれている。
　現在、組換えタンパク質の作製においては、チャイニーズ ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が最も広く利用されている。これまでに、血液凝固第VIII因子産生ＣＨＯ細胞用の無血清培地として、特許文献１にＡＳＦ－１０４培地にプルロニックＦ６８及びジメチル－α－シクロデキストリンを添加した培地が開示されている。しかし、この培地を使用する場合は「まず、１０％血清を含んだ培地で対象となる細胞を８～２４時間培養し、（第３頁右欄第２行～３行）」と記載されているとおり、１０％血清含有培地で細胞を前培養する必要があり、完全に無血清条件下での培養とはならない。また、カルチャーディッシュ上のスモールスケールのしかも静置培養での例が記載されているのみで、工業的物質生産には程遠い培養法である。一方、よりラージスケールの組換え型哺乳類タンパク質の作製においては、マウス骨髄腫（ＮＳ０）細胞が利用されることが多い。非特許文献１には、コレステロール又は植物ステロールがメチル－β－シクロデキストリン（以下、「ＭＯＭβＣＤ」又は「ＭＯＭ－β－ＣＤ」と記載する場合がある）によって包接された、「コレステロール又は植物ステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物」を、グルタミンを含むＣＤハイブリドーマ培地に添加することが開示されている。非特許文献１においては、「ＬＴＩ第１世代コレステロール添加物」及び「第２世代コレステロール添加物」と呼ばれる、ＭＯＭβＣＤとステロールの構成比の異なる２種類の包接化合物が作製され、これらの添加物を含有する無血清培地を使用することによってＮＳ０細胞の１週間の培養が可能であることを開示している（非特許文献１のFigure ２及び４）。しかし、非特許文献１には、第１世代（1st Generation）コレステロール添加物を加えた後に濾過滅菌した培地（Pre-filtration）においては、添加したコレステロールの殆どが濾過滅菌用フィルターによって取り除かれてしまうことが明らかにされている（非特許文献１のFigure ３）。また、同様の実験を、第２世代（2nd Generation）コレステロール添加物を用いて行った場合でも、濾過滅菌用フィルターにより１５％程度のコレステロールが除去されてしまうことが示されている（非特許文献１のFigure ３）。このように、コレステロールがＭＯＭβＣＤによって包接された、コレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物には、濾過滅菌用フィルター透過性（すなわち、濾過性能）が低いという課題があった。
　さらに、マウスハイブリドーマ培養用の無血清培地として、特許文献２及び３には、ＩＴＥＳ（インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム）中のトランスフェリンの代わりに無機鉄化合物を加えた培地が開示されているが、これらの場合においても、ティシュカルチャーフラスコでのスモールスケールの静置培養での例が記載されているに過ぎず、また、これらの培地が遺伝子組換え用の宿主として汎用されるＣＨＯ細胞の培養に適用できるか否かは不明である。以上のように、動物細胞による生理活性ペプチド／タンパク質の工業的生産に有用な、安価かつ生産性の高い工業用無血清培地は未だ提供されていないのが実情である。
　シクロデキストリン（ＣＤ）とは、通常、５分子以上のＤ－グルコースがα（１→４）グルコシド結合によって結合し、環状構造をとった環状オリゴ糖の一種である。一般的に用いられるシクロデキストリンは、６～８分子のグルコースが結合したものであり、６分子のグルコースが結合したものがα－ＣＤ、７分子のグルコースが結合したものがβ－ＣＤ、８分子のグルコースが結合したものがγ－ＣＤと呼ばれている。ＣＤは、その環状構造の内部の空孔に他の分子（ゲスト分子）を取り込んでゲスト分子を包接する作用を有することが知られている。シクロデキストリンの環状構造の外側は親水性であるのに対し、環状構造の内側の空孔は疎水性である。このようなシクロデキストリンの包接作用を利用して、ゲスト分子の匂いをマスキングしたり、ゲスト分子を安定化したり、疎水性のゲスト分子を可溶化するために用いられることがある。しかし、ＣＤ、特にメチル－β－シクロデキストリンは、細胞に接触させると細胞膜の脂質を除去する性質があり、細胞の生存率が低下することが、動物細胞を用いた実験により明らかとなっていた（非特許文献２及び３）。
特開平４－３１６４８４号公報 特開平４－５１８９１号公報 特開平３－１８０１７５号公報
Gorfien et al., Biotechnol. Prog. 2000, 16, 682-687 Joel et.al., Neurotoxicology. 2007, 28(3): 613-621 Laura et. al., Journal of Controlled Release 2008, 126: 10-16
　上述の通り、これまでの研究から、無血清培地にコレステロールを安定的に添加するために、コレステロールがＭＯＭβＣＤによって包接された、コレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物を使用できることが知られていた（非特許文献１）。しかし、コレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物は濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）が低く、特に、培養培地中のコレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物が培養培地として通常用いられる程度の低い濃度であると、濾過滅菌用フィルターで濾過する際にそのほとんどが除去されてしまう場合があることから、所望のコレステロール濃度を含有する培地を作製するためには、基本培地と、高濃度のコレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物とを、それぞれ別々に濾過滅菌用フィルターで濾過滅菌し、その高濃度のコレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物の一部をその基本培地に無菌条件下で添加することが行われていた（いわゆる「後添加法」又は「濾過後添加法」）。この後添加法では、基本培地と、高濃度のコレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物とをそれぞれ別々に濾過滅菌した後の工程（例えば、その高濃度のコレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物の一部をその基本培地に添加する工程等）で無菌性を保証することが難しく、無菌性を保証するためには最終製品を一つ毎に検査する必要があるという課題があった。また、コレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物は、濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）が低く、濾過滅菌用フィルターに目詰まりを生じさせ易いため、後添加法であっても他の添加法であっても、濾過滅菌用フィルターを多く消費し、コストがかさむという課題もあった。
　本発明の課題の１つは、濾過滅菌前の培地への添加（すなわち、培地へ添加後の濾過滅菌）により適した、より実用的なステロール添加剤を提供すること、より詳細には、濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）がより高いため、培地へ添加後の濾過滅菌により適しており、したがって、滅菌性がより高度に保証されたステロール含有培地をより簡便かつより効率的に作製することにより適したステロール添加剤を提供することにある。また、本発明の他の課題は、濾過滅菌により適した、より実用的なステロール含有培地を提供すること、より詳細には、濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）がより高いため、濾過滅菌により適しており、したがって、より簡便かつより効率的に、滅菌性をより高度に保証することができる又は保証されたステロール含有培地を提供することにある。また、本発明の他の課題は、濾過滅菌に必要なフィルター量がより少なくて済むため、より低コストで濾過滅菌が可能なステロール添加剤やステロール含有培地を提供すること等にもある。
　本発明者は、上記課題を解決すべく試行錯誤を行い、トリメチル－β－シクロデキストリン（以下、「ＴＯＭβＣＤ」又は「ＴＯＭ－β－ＣＤ」と記載する場合がある）とコレステロールとを用いて、コレステロールがＴＯＭβＣＤに包接された包接化合物（以下、かかる化合物を「コレステロール・ＴＯＭβＣＤ包接化合物」と記載する場合がある）を作製した（実施例１）。そして、コレステロール・ＴＯＭβＣＤ包接化合物を添加した培地と、コレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物を添加した培地とで、濾過用フィルターで濾過した際の濾過性能（フィルター透過性）を比較したところ、コレステロール・ＴＯＭβＣＤ包接化合物を添加した培地は、コレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物を添加した培地と比較して濾過滅菌用フィルターの目詰まりが生じにくく、２倍以上の量（ｍＬ）の培地を同一の濾過用フィルターで濾過できることが明らかとなった（実施例５、６）。背景技術でも述べたように、ＣＤ、特にメチル－β－シクロデキストリンは、細胞に接触させると細胞膜の脂質を除去する性質があり、細胞の生存率が低下することが、動物細胞を用いた実験により明らかとなっていたこと（非特許文献２及び３）等を考慮すると、コレステロール・ＴＯＭβＣＤ包接化合物を添加した培地がこのように優れた濾過性能を有することは、当業者にとって非常に意外な結果であった。
　また、コレステロール・ＴＯＭβＣＤ包接化合物を添加した後に濾過滅菌した培地と（濾過前添加培地）、濾過滅菌後にコレステロール・ＴＯＭβＣＤ包接化合物を添加した培地（濾過後添加培地）とを作製し、これらの培地を用いてＳＮＴ－８細胞の無血清培養を行い、細胞増殖能の変化を調べた（実施例７）。その結果、コレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物を用いた場合は、濾過前添加培地では濾過後添加培地と比較して、細胞数が１６％以上低下したが、コレステロール・ＴＯＭβＣＤ包接化合物を用いた場合は濾過性能が高く、驚くべきことに、濾過前添加培地において、濾過後添加培地とほぼ同程度以上の細胞増殖能が維持されることが明らかとなった（実施例７）。
　また、コレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物又はコレステロール・ＴＯＭβＣＤ包接化合物を添加した培地をフィルターで濾過し、培地１Ｌ毎に採取して、それぞれの培地での細胞増殖能を調べたところ、コレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物を用いた場合は、濾過して１Ｌ目又は３Ｌ目で細胞増殖能の低下が認められたが、コレステロール・ＴＯＭβＣＤ包接化合物を用いた場合は４Ｌ目でも細胞増殖能の低下は認められなかった。
　以上のように、本発明者は、ＣＤのトリメチル化体とステロールとから形成される錯体化合物が、濾過滅菌前の培地への添加（すなわち、培地へ添加後の濾過滅菌）により適しており、滅菌性がより高度に保証されたステロール含有培地をより簡便かつより効率的に作製することにより適していること等を見いだし、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、
（１）シクロデキストリンのトリメチル化体によって包接されたステロールを含有する細胞培養培地用添加剤であって、前記シクロデキストリンのトリメチル化体が、トリメチル－α－シクロデキストリン、トリメチル－β－シクロデキストリン、及びトリメチル－γ－シクロデキストリンからなる群より選択される１又は２以上である、前記添加剤や、
（２）細胞培養培地が血清を含まない細胞培養培地である、上記（１）に記載の添加剤や、
（３）シクロデキストリンのトリメチル化体がトリメチル－β－シクロデキストリンである、上記（１）又は（２）に記載の添加剤や、
（４）ステロールが、コレステロール、カンペステロール、デスモステロール、エルゴステロール、フコステロール、β－シトステロール、スチグマステロール、及びメチルコレステロールからなる群より選択される１又は２以上である、上記（１）～（３）のいずれかに記載の添加剤や、
（５）ステロールがコレステロールである、上記（１）～（４）のいずれかに記載の添加剤や、
（６）シクロデキストリンのトリメチル化体とステロールの重量比が、シクロデキストリンのトリメチル化体１０００重量部に対して、ステロール１～８０重量部である、上記（１）～（５）のいずれかに記載の添加剤や、
（７）細胞が、動物若しくは植物由来の細胞、又は微生物である、上記（１）～（６）のいずれかに記載の添加剤に関する。
　また本発明は、
（８）上記（１）～（７）のいずれかに記載の添加剤と基本培地とを含む、細胞培養培地や、
（９）血清を含まない、上記（８）に記載の細胞培養培地や、
（１０）０．０１～５０ｍｇ／Ｌの濃度でステロールを含有する、上記（８）又は（９）に記載の細胞培養培地に関する。
　さらに本発明は、
（１１）以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、細胞培養培地の作製方法；
（ａ）上記（１）～（７）のいずれかに記載の添加剤を基本培地に添加する工程；
（ｂ）上記工程（ａ）の後に、添加剤を含む基本培地を濾過滅菌し、細胞培養培地を調製する工程；や、
（１２）血清を基本培地に添加する工程を含まない、上記（１１）に記載の作製方法や、
（１３）細胞培養培地におけるステロールの濃度が０．０１～５０ｍｇ／Ｌとなるように、工程（ａ）において、基本培地に添加剤を添加する、上記（１１）又は（１２）に記載の製造方法や、
（１４）工程（ｂ）において、孔径が０．０１μｍ～２０μｍのフィルターを用いて濾過滅菌を行う、上記（１１）～（１３）のいずれかに記載の製造方法に関する。
　本発明によれば、濾過滅菌前の培地への添加（すなわち、培地へ添加後の濾過滅菌）により適した、より実用的なステロール添加剤を提供することができ、より詳細には、濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）がより高いため、培地へ添加後の濾過滅菌により適しており、したがって、滅菌性がより高度に保証されたステロール含有培地をより簡便かつより効率的に作製することにより適したステロール添加剤を提供することができる。また、本発明によれば、濾過滅菌により適した、より実用的なステロール含有培地を提供することができ、より詳細には、濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）がより高いため、濾過滅菌により適しており、したがって、より簡便かつより効率的に、滅菌性をより高度に保証することができる又は保証されたステロール含有培地を提供することができる。また、本発明によれば、濾過滅菌に必要なフィルター量がより少なくて済むため、より低コストで濾過滅菌が可能なステロール添加剤やステロール含有培地を提供することもできる。
コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加した培地を用いてＳＮＴ－８細胞を培養したときの細胞増殖の程度を示す図である。図中、ＭＯＭ ５ｍｇの×１０００は、実施例１のＭＯＭ－β－ＣＤ溶液に、コレステロールを５ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＭＯＭ－β－ＣＤ包接化合物の溶液を１，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表し、ＭＯＭ ４０ｍｇの×２０００は、実施例１のＭＯＭ－β－ＣＤ溶液に、コレステロールを４０ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＭＯＭ－β－ＣＤ包接化合物の溶液を２，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表し、ＭＯＭ ４０ｍｇの×４０００は、実施例１のＭＯＭ－β－ＣＤ溶液に、コレステロールを４０ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＭＯＭ－β－ＣＤ包接化合物の溶液を４，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表し、ＴＯＭ ４０ｍｇの×２０００は、実施例１のＴＯＭ－β－ＣＤ溶液に、コレステロールを４０ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＴＯＭ－β－ＣＤ包接化合物の溶液を２，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表し、ＴＯＭ ４０ｍｇの×２０００は、実施例１のＴＯＭ－β－ＣＤ溶液に、コレステロールを４０ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＴＯＭ－β－ＣＤ包接化合物の溶液を４，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表す。図の縦軸は、コントロールの培地を用いた場合における細胞数を基準としたときの、各場合における細胞数の割合を示す。コントロールとしては、ＭＯＭ ４０ｍｇの×２０００の培地を用いた。 実施例１で作製したコレステロール・ＴＯＭ－β－ＣＤ包接化合物の溶液が所定の希釈倍率となるように添加した培地を用いてＳＮＴ－８細胞を培養したときの細胞増殖能を示す図である。図中、横軸は希釈倍率を表し、縦軸はコントロールの培地を用いた場合における細胞数を基準としたときの、各場合における細胞数の割合を示す。なお、コントロールとしては、ＭＯＭ ４０ｍｇの×２０００の培地を用いた。 コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加した培地の濾過効率を示す図である。図の縦軸は、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加しなかった場合の総濾過量を１．０としたときの、総濾過量の割合を濾過効率として示した。図中、ＭＯＭ ５ｍｇは、実施例１のＭＯＭ－β－ＣＤ溶液に、コレステロールを５ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＭＯＭ－β－ＣＤ包接化合物の溶液を１，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表し、ＭＯＭ ４０ｍｇは、実施例１のＭＯＭ－β－ＣＤ溶液に、コレステロールを４０ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＭＯＭ－β－ＣＤ包接化合物の溶液を２，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表し、ＴＯＭ ４０ｍｇは、実施例１のＴＯＭ－β－ＣＤ溶液に、コレステロールを４０ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＴＯＭ－β－ＣＤ包接化合物の溶液を４，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表す。また、黒色の棒グラフは、培地としてＲＰＭＩ－１６４０培地を用いた場合の結果を表し、灰色の棒グラフは、培地としてＡｒｔｅｍｉｓ－１培地を用いた場合の結果を表す。 コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加した培地を用いてＳＮＴ－８細胞を培養したときの細胞増殖の程度（培養４日目の細胞数）を示す図である。図中、黒色の棒グラフは、培地を濾過滅菌した後、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加した培地を用いた場合（「濾過後添加」）の結果を表し、灰色の棒グラフは、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加した後の培地をフィルター濾過した場合（「濾過前添加」）の結果を表す。また、図中、ＭＯＭ ５ｍｇは、実施例１のＭＯＭ－β－ＣＤ溶液に、コレステロールを５ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＭＯＭ－β－ＣＤ包接化合物の溶液を１，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表し、ＭＯＭ ４０ｍｇは、実施例１のＭＯＭ－β－ＣＤ溶液に、コレステロールを４０ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＭＯＭ－β－ＣＤ包接化合物の溶液を２，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表し、ＴＯＭ ４０ｍｇは、実施例１のＴＯＭ－β－ＣＤ溶液に、コレステロールを４０ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＴＯＭ－β－ＣＤ包接化合物の溶液を４，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表す。 コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加した後の培地をフィルター（「ボトルトップフィルター（コーニング社、孔径０．２２μｍ　ＰＥＳ　４３１１１８）」）で濾過して得られた４Ｌの培地を連続的に濾過滅菌して、濾過開始から１Ｌ毎に培地をそれぞれ別の容器に回収し、回収した各培地を用いてＳＮＴ－８細胞を培養したときの細胞増殖の程度（培養４日目の細胞数）を示す図である。図の縦軸は、コントロールの培地を用いた場合における細胞数を基準としたときの、各場合における細胞数の割合を示す。コントロールとしては、Ａｒｔｅｍｉｓ－１培地にコレステロール・ＭＯＭ－β－ＣＤ包接化合物の溶液を２，０００倍希釈となるように後添加した培地を用いた。図中、「１Ｌ目」は、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加した４Ｌの培地を連続的に濾過滅菌したときの濾過開始～１Ｌまでの培地を、「２Ｌ目」はその次の２Ｌまでの培地を、「３Ｌ目」はその次の３Ｌまでの培地を、「４Ｌ目」はその次の４Ｌまでの培地をそれぞれ示す。
　本発明の添加剤としては、シクロデキストリンのトリメチル化体（ＴＯＭＣＤ）によって包接されたステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物を含有する細胞培養培地用の添加剤であって、前記シクロデキストリンのトリメチル化体が、トリメチル－α－シクロデキストリン、トリメチル－β－シクロデキストリン、及びトリメチル－γ－シクロデキストリンからなる群より選択される１又は２以上である、前記添加剤であれば特に制限されない。ここで、上記「トリメチル－α－シクロデキストリン（ＴＯＭαＣＤ）」とは、６分子のグルコースが環状に結合したα－シクロデキストリンであって、それを構成するグルコースの１又は２分子以上（好ましくは３分子以上、より好ましくは４分子以上、さらに好ましくは５分子以上、より好ましくは６分子）の２位、３位及び６位の３つの水酸基がメチル基によって修飾された化合物及びその誘導体を意味し、上記「トリメチル－β－シクロデキストリン（ＴＯＭβＣＤ）」とは、７分子のグルコースが環状に結合したβ－シクロデキストリンであって、それを構成するグルコースの１又は２分子以上（好ましくは３分子以上、より好ましくは４分子以上、さらに好ましくは５分子以上、より好ましくは６分子以上、さらに好ましくは７分子）の２位、３位及び６位の３つの水酸基がメチル基によって修飾された化合物及びその誘導体を意味し、上記「トリメチル－γ－シクロデキストリン（ＴＯＭγＣＤ）」とは、８分子のグルコースが環状に結合したγ－シクロデキストリンであって、それを構成するグルコースの１又は２分子以上（好ましくは３分子以上、より好ましくは４分子以上、さらに好ましくは５分子以上、より好ましくは６分子以上、さらに好ましくは７分子以上、より好ましくは８分子）の２位、３位及び６位の３つの水酸基がメチル基によって修飾された化合物及びその誘導体を意味する。
　上記「ステロールがシクロデキストリンのトリメチル化体によって包接されたステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物（ステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物）」とは、ステロール（ゲスト分子）の全部又は一部が、ＣＤトリメチル化体（ホスト分子）の環状構造の内側の疎水性の空孔に取り込まれた構造を形成する、ＣＤトリメチル化体とステロールの錯体化合物を意味する。ステロールがＴＯＭＣＤに包接されているかどうかは、溶液状態においては円二色性スペクトルやＮＭＲスペクトルを用い、固体状態においては熱分析ＤＳＣ、粉末Ｘ線などで、ＴＯＭＣＤ単独、ゲスト分子単独、物理的混合物とＣＤ包接体を比較するなどして確認することができる。本発明においては、ホスト分子として、ＴＯＭαＣＤ、ＴＯＭβＣＤ、及びＴＯＭγＣＤのいずれか１つ、又は、これらのうちの２又は３つを併用してもよいが、ＴＯＭβＣＤと、ＴＯＭαＣＤ及び／又はＴＯＭγＣＤとを組み合わせることが好ましく、ＴＯＭβＣＤを単独で用いることがさらに好ましい。また、本発明においては、ゲスト分子として、コレステロール、カンペステロール、デスモステロール、エルゴステロール、フコステロール、β－シトステロール、スチグマステロール、及びメチルコレステロールからなる群より選択される１又は２以上のステロール又はその誘導体を用いることができるが、コレステロールを用いることが好ましい。
　本発明における「ステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物」を調製する方法としては、特に制限されず、例えば混練法、飽和水溶液法、乳化法、混合粉砕法等の公知の方法を用いることができる。上記の混練法としては、ホスト分子に少量の水を添加してペースト状にし、そこに一定量のゲスト分子を添加して混練機等でよく練って、ゲスト分子がホスト分子に包接されたゲスト分子・ホスト分子包接化合物を得る方法が挙げられる。上記の飽和水溶液法としては、ホスト分子の飽和水溶液を作製し、その後一定量のゲスト分子を添加・混合し、３０分間～数日間、攪拌混合して、ホスト分子に包接されたゲスト分子を沈殿させて得る方法が挙げられる。上記の乳化法としては、ホスト分子の２０～５０％懸濁液を作製し、そこに一定量のゲスト分子を添加し、ホモジナイザーで乳化させて、ゲスト分子がホスト分子に包接されたゲスト分子・ホスト分子包接化合物を得る方法が挙げられる。上記の混合粉砕法としては、ホスト分子とゲスト分子を振動ミルに入れ、粉砕して、ゲスト分子がホスト分子に包接されたゲスト分子・ホスト分子包接化合物を得る方法が挙げられる。なお、上述の混練法、飽和水溶液法、乳化法において、固体状の「ステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物」を得る場合は、それぞれの方法で得られるステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物を含む液体を乾燥（好ましくは凍結乾燥）すればよい。保存は、常温であってもよいが、より長期間の保存を可能にする観点から、４℃以下の温度で行うことが好ましい。
　また、本発明における「ステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物」中の、ＴＯＭＣＤとステロールの重量比としては、培養対象となる細胞を増殖し得る限り特に制限さないが、例えば、ＴＯＭＣＤ１０００重量部に対してステロールを１～８０の範囲内、好ましくは５～８０重量部の範囲内、より好ましくは５～７０重量部の範囲内、さらに好ましくは１０～６０重量部の範囲内、さらにより好ましくは２０～５０重量部の範囲内、特に好ましくは３５～４５重量部の範囲内とすることができる。
　本発明の添加剤は、粉剤、顆粒剤、錠剤等の固体の剤型であってもよいし、水溶剤、懸濁剤、乳剤、油性剤等の液体の剤型であってもよいが、保存性に優れている観点から、固体の剤型であることが好ましい。
　本発明の添加剤は、培地に添加する際に培地等で適当な倍率で希釈することができる。したがって、本発明の添加剤におけるステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物の濃度は特に制限されないが、本発明の添加剤が固体の場合は、例えば０．００１～９９．９重量％、好ましくは０．１～９０重量％、より好ましくは１～６０重量％が挙げられ、本発明の添加剤が固体の場合は、例えば０．００１～２５重量％、好ましくは０．１～２０重量％、より好ましくは１～１５重量％が挙げられる。
　本発明の添加剤は、ステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物のみから成っていてもよいし、他の任意成分を含んでいてもよい。かかる任意成分としては、固体の担体や液体の担体（例えば水）のほか、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、乳化剤、浸透圧調整剤などが挙げられる。本発明の添加剤は、ステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物、又は、ステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物と任意成分を用いて製造することができる。ステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物と任意成分を含んでいる本発明の添加剤は、ステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物と任意成分を混合すること等によって作製することができる。
　本発明の添加剤は、動物若しくは植物由来の細胞、又は微生物の培養において使用することができるが、特に動物由来細胞の培養に適用することが好ましい。ここで、上記「動物由来細胞」としては、特に制限されないが、例えば、哺乳動物由来細胞、昆虫細胞、線虫細胞等を挙げることができ、なかでも、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＡＥ－１細胞、ＳＰ２／０細胞、Ｌ５．１細胞、ＳＮＴ－８細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ－１２７細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞等の哺乳動物由来細胞を特に好適に例示しすることができる。また、上記動物由来細胞は、正常細胞、疾患細胞、形質転換細胞、変異細胞、体細胞、生殖細胞、発芽細胞、幹細胞、前駆細胞、及び胚細胞のいずれであってもよく、また、既に確立された細胞系であっても、天然源から採取されたものであってもよい。上記幹細胞としては、多能性幹細胞、体性幹細胞等が挙げられ、多能性幹細胞としては、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）等が挙げられ、体性幹細胞としては、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、心臓幹細胞、肝臓幹細胞、小腸幹細胞等が挙げられる。本発明の添加剤は、上記動物由来細胞の浮遊（撹拌）培養にも、接着培養にも用いることができる。
　また、本発明の細胞培養培地としては、上記本発明の添加剤と基本培地とを含むものであれば特に制限されない。上記「基本培地」としては、動物若しくは植物由来の細胞、又は微生物の培養が可能な培地であればどのようなものであってもよく、例えば、炭素源、窒素源を含む培地が挙げられ、好ましくはさらに無機塩類を含む培地が好ましく挙げられる。また、かかる「基本培地」としては、上記動物由来細胞の無血清培養が可能な培地であることが特に好ましい。具体的には、上記基本培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（G. E. Moore ら、ザ  ジャーナル  オブ  ザ  アメリカンメディカル  アソシエイション（J. A. M. A.）、第１９９巻、第５１９頁(１９６７)）、Ａｒｔｅｍｉｓ－１培地（日本テクノサービス株式会社製）、イーグルＭＥＭ培地（H.Eagle、サイエンス（Science）、第１３０巻、第４３２頁（１９５９））、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）培地（R.DulbeccoおよびG.Freeman、バイロロジー（Virology）、第８巻、第３９６頁（１９５９））、イスコフ培地（N. Iscove アンド F. Melchers、 ジャーナル  エクスペリメンタル  メソッズ（J. Exp. Med.）、第１４７巻、第９２３頁(１９７８)）、ハムＦ１２培地（R. G. Ham、 プロシーディングス  オブ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス（Proc. Nat. Acad. Sci.、）、第５３巻、第２８８頁(１９６５)）、Ｌ－１５培地（A. Leibovitz、 アメリカン  ジャーナル  オブ  ハイジーン（Amer. J. Hyg.）、第７８巻、第１７３頁(１９６３)）、Ｅ－ＲＤＦ培地（極東製薬）、ＵＣ－１０２培地（日水製薬）、ＵＣ－２１２培地（日水製薬）、ダイゴＴ培地（日本製薬、特開昭６０－１４５０８８号）、ＴＬ－２培地（Y. Shintani ら、アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Appl. Microbiol. Biotechnol.）、第２７巻、第５３３頁(１９８８)）、又は、これらを適当な比率で混合した培地を好適に挙げることができ、なかでも、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡｒｔｅｍｉｓ－１培地を特に好適に挙げることができる。
　本発明の細胞培養培地におけるステロールの濃度としては、培養対象となる生物細胞の生存及び／又は増殖を可能にし得る限り特に制限されないが、例えば、０．００１～５００ｍｇ／Ｌの範囲内、好ましくは０．０１～５０ｍｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは０．０３～４０ｍｇ／Ｌの範囲内、さらに好ましくは０．１２５～３０ｍｇ／Ｌの範囲内、さらにより好ましくは０．１２５～２５ｍｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは０．２５～１６ｍｇ／Ｌの範囲内、さらに好ましくは０．５～８ｍｇ／Ｌの範囲内、さらにより好ましくは０．５～５ｍｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは０．５～２ｍｇ／Ｌの範囲内が挙げられ、また、コストの観点から、培地中のＴＯＭＣＤ包接ステロールの濃度の上限を、ステロール濃度換算で１００ｍｇ／Ｌ以下、７５ｍｇ／Ｌ以下、５０ｍｇ／Ｌ以下、２５ｍｇ／Ｌ以下、１６ｍｇ／Ｌ以下、１０ｍｇ／Ｌ以下、８ｍｇ／Ｌ以下、５ｍｇ／Ｌ以下、４ｍｇ／Ｌ以下又は２ｍｇ／Ｌ以下としてもよい。また、本発明の細胞培養培地は、血清を含まない無血清培地であっても、血清を含む血清含有培地であってもよいが、無血清培地であることが好ましい。
　本発明の細胞培養培地は、本発明の添加剤及び上記基本培地の他に、培養対象の生物細胞の生存及び／又は増殖を向上させるための成分や、特定の選択マーカーに対応する選択薬剤等をさらに含むものであってもよい。上記「培養対象の生物細胞の生存及び／又は増殖を向上させるための成分」としては、例えば、ＥＧＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＮＧＦ、インターロイキン（例えばインターロイキン２、好ましくはヒト組み換え型インターロイキン２）、コロニー刺激因子、インターフェロン等のサイトカイン；ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン等のアルブミン；インスリン、トランスフェリン、β－エストラジオール、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、亜セレン酸、プロスタグランジン等の生理活性物質；コラーゲン、ラミニン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン等の細胞外マトリックス成分；ウシ血清（胎児ウシ、新生児ウシまたは正常ウシ血清）、ヒト血清、ウシ血清、ブタ血清、サル血清、尾なしサル血清、ラット血清、ネズミ血清、ウサギ血清、ヒツジ血清等の血清；を好適に挙げることができ、上記「特定の選択マーカーに対応する選択薬剤」としては、例えば、メソトレキセート、ミコフェノール酸またはネオマイシン誘導体であるＧ４１８等を好適に挙げることができる。なお、「培養対象の生物細胞の生存及び／又は増殖を向上させるための成分」を用いる場合、培地中のその成分の濃度は、当業者であれば適宜設定することができる。例えば、インターロイキン（好ましくはインターロイキン２、より好ましくはヒト組み換え型インターロイキン２）の培地中の濃度としては、好ましくは５０～１２５０ＩＵ／ｍＬ、より好ましくは１２５～５００ＩＵ／ｍＬ、さらに好ましくは２００～３００ＩＵ／ｍＬが挙げられる。また、血清アルブミン（好ましくはヒト血清アルブミン）の培地中の濃度としては、好ましくは０．４～１０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．６～６ｇ／Ｌ、さらに好ましくは１～３ｇ／Ｌが挙げられる。
　本発明の細胞培養培地は、粉末、顆粒等の固体であってもよいし、水溶液等の液体であってもよい。固体の細胞培養培地は、保存性により優れているというメリットを有しており、液体の細胞培養培地は、簡便性により優れているというメリットを有している。液体の細胞培養培地は、そのまま使用する濃度の培地であってもよいし、何倍（例えば５倍、１０倍）かに希釈して使用するような濃度である濃縮タイプの培地であってもよい。そのまま使用する濃度である、液体の細胞培養培地は、滅菌を行っておくと、その細胞培養培地のユーザーは改めて滅菌することなくそのまま使用することができるため、簡便性の観点から非常に好ましい。
　本発明の細胞培養培地は、本発明の添加剤と、基本培地と、必要に応じてさらに任意成分とを混合すること等によって作製することができる。かかる任意成分としては、固体の担体や液体の担体（例えば水）のほか、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、乳化剤、浸透圧調整剤などが挙げられる。
　本発明の細胞培養培地のより具体的な作製方法としては、以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含むものであれば特に制限されない。
（ａ）上記本発明の添加剤を上記基本培地に添加する工程；
（ｂ）上記工程（ａ）の後に、上記本発明の添加剤を含む上記基本培地を濾過滅菌し、細胞培養培地を調製する工程；
　上記工程（ａ）においては、細胞培養培地におけるステロールの濃度が、例えば、０．００１～５００ｍｇ／Ｌの範囲内、好ましくは０．０１～５０ｍｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは０．０３～４０ｍｇ／Ｌの範囲内、さらに好ましくは０．１２５～３０ｍｇ／Ｌの範囲内、さらにより好ましくは０．１２５～２５ｍｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは０．２５～１６ｍｇ／Ｌの範囲内、さらに好ましくは０．５～８ｍｇ／Ｌの範囲内、さらにより好ましくは０．５～５ｍｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは０．５～２ｍｇ／Ｌの範囲内となるように、上記基本培地に本発明の添加剤を添加することが好ましい。また、コストの観点から、培地中のＴＯＭＣＤ包接ステロールの濃度の上限が、ステロール濃度換算で１００ｍｇ／Ｌ以下、７５ｍｇ／Ｌ以下、５０ｍｇ／Ｌ以下、２５ｍｇ／Ｌ以下、１６ｍｇ／Ｌ以下、１０ｍｇ／Ｌ以下、８ｍｇ／Ｌ以下、５ｍｇ／Ｌ以下、４ｍｇ／Ｌ以下又は２ｍｇ／Ｌ以下となるように、上記基本培地に本発明の添加剤を添加してもよい。
　さらに、上記工程（ｂ）における濾過滅菌は、培地から菌を除去することが可能なフィルターであればどのようなものを使用して行ってもよいが、かかる濾過滅菌用フィルターの孔径の上限として、例えば、２０μｍ以下、１５μｍ以下、１０μｍ以下、８μｍ以下、５μｍ以下、３μｍ以下、２μｍ以下、１．５μｍ以下、１．２μｍ以下、１μｍ以下、０．８μｍ以下、０．６μｍ以下、０．４５μｍ以下、０．３５μｍ以下、０．３μｍ以下、０．２５μｍ以下が挙げられ、濾過滅菌用フィルターの孔径の下限として、０．０１μｍ以上、０．０３μｍ以上、０．０５μｍ以上、０．０８μｍ以上、０．１μｍ以上、０．１５μｍ以上、０．２μｍ以上が挙げられる。濾過滅菌用フィルターの孔径の範囲としては、先に挙げた上限と下限のすべての組合せを開示するが、例えば、０．０１～２０μｍの範囲内、より好ましくは０．０３～１５μｍの範囲内、さらに好ましくは０．０５～１０μｍの範囲内、より好ましくは０．０８～５μｍの範囲内、さらに好ましくは０．１～１μｍの範囲内、より好ましくは０．１～０．６μｍの範囲内、さらに好ましくは０．１～０．４５μｍの範囲内、より好ましくは０．１～０．３μｍの範囲内、特に好ましくは０．２～０．２５μｍの範囲内が挙げられる。また、上記工程（ｂ）においては、上記濾過滅菌用フィルターと、プレフィルターとを組み合わせて使用してもよい。プレフィルターの孔径は、特に制限されないが、濾過滅菌用フィルターの孔径よりも大きい孔径が好ましく挙げられ、例えば、上記の濾過滅菌用フィルターの孔径の１．１～１０倍の範囲内、１．１～５倍の範囲内、１．２～３倍の範囲内が挙げられる。
　上記濾過滅菌用フィルター及びプレフィルターの材質は特に制限されず、例えば、セルロース系、ナイロン系、親水性ポリエーテルスルホン、親水性ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）、親水性ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）等を好適に挙げることができる。また、上記工程（ｂ）における濾過滅菌は、上記濾過滅菌用フィルター（好ましくは、ボトルトップフィルター（コーニング社、孔径０．２２μｍ　ＰＥＳ　４３１１１８））を交換することなく（同一の上記濾過滅菌用フィルターを用いて）、１Ｌ以上、２Ｌ以上、３Ｌ以上、４Ｌ以上、５Ｌ以上、７Ｌ以上、又は１０Ｌ以上の培地を継続的に滅菌することが好ましい。より具体的には、基本培地としてＡｒｔｅｍｉｓ－１培地を用いた場合には、上記工程（ｂ）において、４Ｌ以上の培地を一つの濾過滅菌用フィルター（好ましくは、ボトルトップフィルター（コーニング社、孔径０．２２μｍ　ＰＥＳ　４３１１１８））を用いて継続的に滅菌することが好ましい。
　また、本発明の細胞培養培地の作製方法は、上述のような「培養対象の生物細胞の生存及び／又は増殖を向上させるための成分」及び／又は「特定の選択マーカーに対応する選択薬剤」を添加する工程をさらに含むものであってもよく、かかる工程は、上記工程（ａ）の前、上記工程（ａ）における本発明の添加剤の添加と同時、上記工程（ａ）と上記（ｂ）の間、又は上記（ｂ）の後に実施することができる。また、本発明の細胞培養培地の作製方法は、血清を基本培地に添加する工程を含まないことが好ましい。
　以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。
[コレステロール・シクロデキストリン包接化合物の作製]
　メチル－β－シクロデキストリン（ＭＯＭ－β－ＣＤ：和光純薬）を蒸留水に溶かして５ｍＬとし、２００ｍｇ／ｍＬのメチル－β－シクロデキストリン含有液を調製した。他方、トリメチル－β－シクロデキストリン（ＴＯＭ－β－ＣＤ：和光純薬）を蒸留水に溶かして１０ｍＬとし、１００ｍｇ／ｍＬのトリメチル－β－シクロデキストリン含有液を調製した。
　前述のＭＯＭ－β－ＣＤ溶液に、コレステロール（シグマ、Ｃ３０４５）を５ｍｇ加え、時々激しく撹拌しながら５０℃で３０分間加温して、コレステロール・ＭＯＭ－β－ＣＤ包接化合物（「５ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤ」又は「ＭＯＭ ５ｍｇ」とも表す。）を作製した。同様に、前述のＭＯＭ－β－ＣＤ溶液に、コレステロール（シグマ、Ｃ３０４５）を４０ｍｇ加えて、コレステロール・ＭＯＭ－β－ＣＤ包接化合物（「４０ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤ」又は「ＭＯＭ ４０ｍｇ」とも表す。）を作製した。同様にＴＯＭ－β－ＣＤ溶液に、コレステロールを４０ｍｇ（４０ｍｇ／ＴＯＭ－β－ＣＤ）加えてコレステロール・ＴＯＭ－β－ＣＤ包接化合物（「４０ｍｇ／ＴＯＭ－β－ＣＤ」又は「ＴＯＭ ４０ｍｇ」とも表す。）を作製した。なお、５ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤの溶液におけるコレステロール濃度は、１ｍｇ／ｍＬであり、ＭＯＭ－β－ＣＤ濃度は２００ｍｇ／ｍＬであり、４０ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤの溶液におけるコレステロール濃度は、８ｍｇ／ｍＬであり、ＭＯＭ－β－ＣＤ濃度は２００ｍｇ／ｍＬであり、４０ｍｇ／ＴＯＭ－β－ＣＤにおけるコレステロール濃度は、４ｍｇ／ｍＬであり、ＴＯＭ－β－ＣＤ濃度は１００ｍｇ／ｍＬである。
　作製した３種類のコレステロール・シクロデキストリン包接化合物（すなわち、５ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤ、４０ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤ、４０ｍｇ／ＴＯＭ－β－ＣＤ）をそれぞれ、ミリポア社マイレクスＧＶフィルター（フィルター径３３ｍｍ、孔径０．２２μｍ）を用いて濾過滅菌した。
　１ｇのＴＯＭ－β－ＣＤを蒸留水に溶かして１０ｍＬとし、コレステロール（シグマ、Ｃ３０４５）をそれぞれ５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇおよび１６０ｍｇ加え、実施例１と同様にコレステロール・ＴＯＭ－β－ＣＤ包接化合物を作製した。コレステロールを６０ｍｇ以下で添加した場合、溶液は完全に透明となり、コレステロールは溶解した。一方、コレステロールを７０ｍｇ以上添加した場合は、反応温度５０℃では白濁して完全には溶解しなかった。コレステロール添加量７０ｍｇ以上の白濁した溶液を室温に放置したところ、７０ｍｇのコレステロールを添加した溶液は透明になり、コレステロールは完全に溶解した。８０ｍｇのコレステロールを添加した溶液はほぼ透明になったが浮遊物が残存し、コレステロールは完全には溶解しなかった。１６０ｍｇのコレステロールを添加した溶液は室温でも白濁しており、コレステロールは完全には溶けきらなかった。７０ｍｇ以下のコレステロールを添加した溶液を、ミリポア社マイレクスＧＶフィルター（フィルター径３３ｍｍ、孔径０．２２μｍ）を用いて濾過滅菌し、４℃で保管したが、いずれも析出物は観察されず培地に添加可能であった。これらの結果から、ＴＯＭＣＤに対するステロール（好ましくはコレステロール）の好ましい使用量は、ＴＯＭＣＤ１０００重量部に対して、ステロール（好ましくはコレステロール）を８０重量部以下、より好ましくは７０重量部以下、さらに好ましくは６０重量部以下であることが示された。
[コレステロール・シクロデキストリン包接化合物の好適な希釈倍率の決定]
　実施例１で濾過滅菌して得られた各コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を、ヒト組み換え型ＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）を２５０ＩＵ／ｍＬを含むＡｒｔｅｍｉｓ－１培地（日本テクノサービス株式会社、茨城県牛久市）に添加した。５ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤについては、１，０００倍希釈になるように培地に添加し、４０ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤについては、２，０００倍と４，０００倍希釈になるようにそれぞれ培地に添加した。同様に、４０ｍｇ／ＴＯＭ－β－ＣＤについては、２，０００倍と４，０００倍（４０ｍｇ）希釈になるようにそれぞれ培地に添加した（Ａ１ｃ＋培地）。Ａ１ｃ＋培地を２４穴マイクロプレートのウェルにそれぞれ２ｍＬずつ加え、次いで、その各ウェルにＮＫ／Ｔ細胞株であるＳＮＴ－８細胞を１×１０５細胞（５×１０４細胞／ｍＬ）ずつ加え、３７℃のＣＯ２インキュベータ内で４日間培養し、細胞数を計測した。コントロールには、４０ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤを２，０００倍希釈になるように添加したＡ１ｃ＋培地を用いた。コントロールにおけるこの希釈倍率は、実験を行う前に予め決定していた希釈倍率である。
　これらの実験の結果、５ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤについては１，０００倍希釈、４０ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤについては２，０００倍希釈、４０ｍｇ／ＴＯＭ－β－ＣＤについては４，０００倍希釈の場合に、最も良い細胞増殖能が得られた（図１）。
[コレステロール包接ＴＯＭ－β－ＣＤの使用可能な希釈倍率の検討]
　実施例１で作製したコレステロール・ＴＯＭ－β－ＣＤ包接化合物を、ヒト組み換え型ＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）を２５０ＩＵ／ｍＬを含むＡｒｔｅｍｉｓ－１培地に２５０倍希釈から１２８，０００倍希釈まで添加し、ＳＮＴ－８細胞を用いて細胞増殖能を測定した。コントロールはコレステロール・ＭＯＭ－β－ＣＤ包接化合物を２、０００倍希釈になるように添加したヒト組み換え型ＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）を２５０ＩＵ／ｍＬを含むＡｒｔｅｍｉｓ－１培地を用いた。コントロールを１とした時の各希釈倍率の細胞増殖能を図２に示した。２，０００倍から８，０００倍希釈では細胞増殖能はコントロールとほぼ同等であったが、それ以外の希釈倍率では細胞増殖能は低下したものの、１２８，０００倍希釈でも無添加に比べて細胞増殖能は高く、添加効果は認められた。これらの結果から、細胞培養培地におけるコレステロール濃度は０．０３ｍｇ／Ｌ（１２８，０００倍希釈のときのコレステロール濃度）～１６ｍｇ／Ｌ（２５０倍希釈のときのコレステロール濃度）が好ましく、０．１２５ｍｇ／Ｌ（３２０００倍希釈のときのコレステロール濃度）～１６ｍｇ／Ｌ（２５０倍希釈のときのコレステロール濃度）がより好ましく、０．２５ｍｇ／Ｌ（１６０００倍希釈のときのコレステロール濃度）～１６ｍｇ／Ｌ（２５０倍希釈のときのコレステロール濃度）がさらに好ましく、０．５ｍｇ／Ｌ（８０００倍希釈のときのコレステロール濃度）～８ｍｇ／Ｌ（５００倍希釈のときのコレステロール濃度）がより好ましく、０．５ｍｇ／Ｌ（８０００倍希釈のときのコレステロール濃度）～４ｍｇ／Ｌ（１０００倍希釈のときのコレステロール濃度）がさらに好ましく、０．５ｍｇ／Ｌ（８０００倍希釈のときのコレステロール濃度）～２ｍｇ／Ｌ（２０００倍希釈のときのコレステロール濃度）がより好ましい。
［コレステロール・シクロデキストリン包接化合物添加培地の濾過性能 １（ＲＰＭＩ－１６４０培地）］
　ＲＰＭＩ－１６４０培地にヒト血清アルブミン（２ｇ／Ｌ）を加えた培地に、実施例３で決定した濃度のコレステロール・シクロデキストリン包接化合物をそれぞれ添加し、濾過検討用培地を作製した。すなわち、５ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤについては１，０００倍希釈、４０ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤについては２，０００倍希釈、４０ｍｇ／ＴＯＭ－β－ＣＤについては４，０００倍希釈の濃度とした。また、コントロールとして、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加しなかった培地も作製した（「無添加」）。濾過鍾の上部にシリコンゴム栓を取り付け、シリコンゴム栓に１８Ｇの注射針を取り付けた。三方コックを介して５０ｍＬの注射筒の外筒にミリポア社マイレクスＧＶフィルター（フィルター径１３ｍｍ、孔径０．２２μｍ）を取り付け、該フィルターと前述の注射針を連結した。注射筒外筒に濾過検討用培地を分注し、濾過鍾の吸引口を介して－０．０５ＭＰａの圧力で注射筒の外筒中の濾過検討用培地をフィルターを介して濾過鍾中に吸引濾過した。フィルターが目詰まりするまでの各培地の総濾過量を表１に示した。なお、フィルターの目詰まりの判定は、１０滴滴下する時間が１０秒以上かかるようになった時点をフィルターが目詰まりした時点と判定した。また、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加しなかった場合の総濾過量を１．０としたときの、総濾過量の割合を濾過効率として表１に示すと共に、図３に黒い棒グラフで示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１や図３の結果から分かるように、コレステロール・ＴＯＭ－β－ＣＤ包接化合物は、コレステロール・ＭＯＭ－β－ＣＤ包接化合物と比較して、総濾過量が３倍以上に増加していた。このことから、コレステロール・ＴＯＭ－β－ＣＤ包接化合物は、コレステロール・ＭＯＭ－β－ＣＤ包接化合物よりも濾過性能（フィルター透過性）が高いため、培地へ添加後の濾過滅菌により適しており、したがって、滅菌性がより高度に保証されたステロール含有培地をより簡便かつより効率的に作製することにより適していることが示された。
［コレステロール・シクロデキストリン包接化合物添加培地の濾過性能 ２（Ａｒｔｅｍｉｓ－１培地）］
　コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加する培地をＲＰＭＩ－１６４０培地からＡｒｔｅｍｉｓ－１培地に代えたこと以外は、実施例５に記載の方法と同様の方法で、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物の濾過性能を検討した。各培地の総濾過量を表２に示した。また、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加しなかった場合の総濾過量を１．０としたときの、総濾過量の割合を濾過効率として表２に示すと共に、図３に灰色の棒グラフで示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２や図３の結果から分かるように、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加する培地がＡｒｔｅｍｉｓ－１培地であっても、コレステロール・ＴＯＭ－β－ＣＤ包接化合物は、コレステロール・ＭＯＭ－β－ＣＤ包接化合物と比較して、総濾過量が２倍以上に増加していた。このことから、コレステロール・ＴＯＭ－β－ＣＤ包接化合物は添加する培地の種類によらず、コレステロール・ＭＯＭ－β－ＣＤ包接化合物よりも高い濾過性能（フィルター透過性）を示すことが分かった。そのため、コレステロール・ＴＯＭ－β－ＣＤ包接化合物は、培地へ添加後の濾過滅菌により適しており、したがって、滅菌性がより高度に保証されたステロール含有培地をより簡便かつより効率的に作製することにより適していることが示された。
［濾過滅菌したコレステロール含有培地の細胞増殖能 １］
　上記実施例６の濾過滅菌により得られた各培地にｒｈＩＬ－２を２５０ＩＵ／ｍＬ添加し、実施例３と同様にＳＮＴ－８細胞を用いて細胞増殖能を測定した。その結果を図４に示す。なお、実施例６で得られた培地では、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を培地に添加した後に濾過滅菌を行っており、すなわち、濾過前にコレステロール・シクロデキストリン包接化合物を培地に添加した（「濾過前添加」）。一方、コントロールの培地として、培地を濾過した後、その培地にコレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加した「濾過後添加」）。
　図４から、５ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤを１，０００倍希釈して用いた場合は、濾過後添加に比べて濾過前添加は、細胞増殖能が１６％程度減少し、４０ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤを２，０００倍希釈して用いた場合は、３４％程度減少したのに対し、４０ｍｇ／ＴＯＭ－β－ＣＤを４０００倍希釈して用いた場合は細胞増殖能がほぼ変わらず、むしろわずかに向上した。これらの結果は、ＭＯＭ－β－ＣＤは、ＴＯＭ－β－ＣＤと比較して濾過性能が低く、濾過滅菌用フィルターでろ過される割合が高いため、濾過前添加のときは培地中のＭＯＭ－β－ＣＤ濃度がより多く低下していると考えられる。このように、ＴＯＭ－β－ＣＤは濾過性能が高いため、培地へ添加後の濾過滅菌により適しており、したがって、滅菌性がより高度に保証されたステロール含有培地をより簡便かつより効率的に作製することにより適していることが示された。
［濾過滅菌したコレステロール含有培地の細胞増殖能 ２］
　ｒｈＩＬ－２を２５０ＩＵ／ｍＬを含むＡｒｔｅｍｉｓ－１培地に各コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を１，０００倍希釈（５ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤ）、２，０００倍希釈（４０ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤ）、４，０００倍希釈（４０ｍｇ／ＴＯＭ－β－ＣＤ）になるように添加した培地を各４Ｌ作製し、ボトルトップフィルター（コーニング社、孔径０．２２μｍ　ＰＥＳ　４３１１１８）を取り付けたストレージボトル（コーニング社、１Ｌ　４３１４３３）で－０．０４ＭＰａの陰圧で吸引濾過した。５ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤを添加したＡ１ｃ＋培地は、濾過速度は低下したものの４Ｌ全て濾過することができた。一方、４０ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤを添加したＡ１ｃ＋培地は１．３Ｌで目詰まりを起こし４Ｌ全量の濾過は行えなかった。４０ｍｇ／ＴＯＭ－β－ＣＤを添加したＡ１ｃ＋培地は目詰まりすることなく４Ｌ全て濾過することができた。
　濾過した各培地での細胞増殖能を、実施例３と同様にＳＮＴ－８細胞を用いた方法で測定した。その結果を図５に示す。なお、コントロールとしては、Ａｒｔｅｍｉｓ－１培地にコレステロール・ＭＯＭ－β－ＣＤ包接化合物の溶液を２，０００倍希釈となるように後添加した培地を用い、コントロールの培地を用いた場合における細胞数を基準（「１」）とした。図５から分かるように、５ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤを添加したＡ１ｃ＋培地では３Ｌ目から細胞増殖能が低下し、４０ｍｇ／ＭＯＭ－β－ＣＤを添加したＡ１ｃ＋培地では１Ｌ目で細胞増殖能が低下した。一方、４０ｍｇ／ＴＯＭ－β－ＣＤを添加したＡ１ｃ＋培地では、４Ｌ目でも細胞増殖能の低下は認められなかった（図５）。これらの結果から、ＴＯＭ－β－ＣＤは、ＭＯＭ－β－ＣＤよりも濾過性能が高く、濾過滅菌用フィルターの目詰まりを起こしにくいことが示された。したがって、ＴＯＭ－β－ＣＤは、ＭＯＭ－β－ＣＤと比較して、濾過滅菌に必要なフィルター量が少なく、より低コストで濾過滅菌が可能であることが示された。このように、ＴＯＭ－β－ＣＤは濾過性能が高いため、培地へ添加後の濾過滅菌により適しており、したがって、滅菌性がより高度に保証されたステロール含有培地をより簡便かつより効率的に作製することにより適していることが示された。
　本発明によれば、濾過滅菌前の培地への添加（すなわち、培地へ添加後の濾過滅菌）により適した、より実用的なステロール添加剤を提供することができ、より詳細には、濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）がより高いため、培地へ添加後の濾過滅菌により適しており、したがって、滅菌性がより高度に保証されたステロール含有培地をより簡便かつより効率的に作製することにより適したステロール添加剤を提供することができる。また、本発明によれば、濾過滅菌により適した、より実用的なステロール含有培地を提供することができ、より詳細には、濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）がより高いため、濾過滅菌により適しており、したがって、より簡便かつより効率的に、滅菌性をより高度に保証することができる又は保証されたステロール含有培地を提供することができる。また、本発明によれば、濾過滅菌に必要なフィルター量がより少なくて済むため、より低コストで濾過滅菌が可能なステロール添加剤やステロール含有培地を提供することもできる。

Claims (14)

  1. 　シクロデキストリンのトリメチル化体によって包接されたステロールを含有する細胞培養培地用添加剤であって、前記シクロデキストリンのトリメチル化体が、トリメチル－α－シクロデキストリン、トリメチル－β－シクロデキストリン、及びトリメチル－γ－シクロデキストリンからなる群より選択される１又は２以上である、前記添加剤。
  2. 　細胞培養培地が血清を含まない細胞培養培地である、請求項１に記載の添加剤。
  3. 　シクロデキストリンのトリメチル化体がトリメチル－β－シクロデキストリンである、請求項１又は２に記載の添加剤。
  4. 　ステロールが、コレステロール、カンペステロール、デスモステロール、エルゴステロール、フコステロール、β－シトステロール、スチグマステロール、及びメチルコレステロールからなる群より選択される１又は２以上である、請求項１～３のいずれかに記載の添加剤。
  5. 　ステロールがコレステロールである、請求項１～４のいずれかに記載の添加剤。
  6. 　シクロデキストリンのトリメチル化体とステロールの重量比が、シクロデキストリンのトリメチル化体１０００重量部に対して、ステロール１～８０重量部である、請求項１～５のいずれかに記載の添加剤。
  7. 　細胞が、動物若しくは植物由来の細胞、又は微生物である、請求項１～６のいずれかに記載の添加剤。
  8. 　請求項１～７のいずれかに記載の添加剤と基本培地とを含む、細胞培養培地。
  9. 　血清を含まない、請求項８に記載の細胞培養培地。
  10. 　０．０１～５０ｍｇ／Ｌの濃度でステロールを含有する、請求項８又は９に記載の細胞培養培地。
  11. 　以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、細胞培養培地の作製方法。
    （ａ）請求項１～７のいずれかに記載の添加剤を基本培地に添加する工程；
    （ｂ）上記工程（ａ）の後に、添加剤を含む基本培地を濾過滅菌し、細胞培養培地を調製する工程；
  12. 　血清を基本培地に添加する工程を含まない、請求項１１に記載の作製方法。
  13. 　細胞培養培地におけるステロールの濃度が０．０１～５０ｍｇ／Ｌとなるように、工程（ａ）において、基本培地に添加剤を添加する、請求項１１又は１２に記載の製造方法。
  14. 　工程（ｂ）において、孔径が０．０１μｍ～２０μｍのフィルターを用いて濾過滅菌を行う、請求項１１～１３のいずれかに記載の製造方法。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GORFIEN, STEPHEN ET AL.: "Growth of NSO Cells in Protein-Free, Chemically Defined Medium", BIOTECHNOLOGY PROGRESS, vol. 16, no. 5, 1 September 2000 (2000-09-01), pages 682 - 687, XP002350529 *
NISHINO, JUZIRO ET AL.: "Interaction of Heptakis (2, 3, 6-Tri-0-methyl)-B-cyclodextrin with Cholesterol in Aqueous Solution", CHEM. PHARM. BULL., vol. 52, no. 12, December 2004 (2004-12-01), pages 1405 - 1410, XP055625465 *
WU, YUN ET AL.: "The Use of Electrohydrodynamic Spraying to Disperse Hydrophobic Compounds in Aqueous Media", AEROSOL SCIENCE AND TECHNOLOGY, vol. 43, no. 9, 2009, pages 902 - 910, XP055625463 *

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