JP2010508851A - マイクロキャリアを使用した、産褥由来の細胞の生体外での拡大 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2006年11月13日出願の米国出願第60/865,558号の35U.S.C.§119(e)による利益を享受するものである。この出願は、その全体が、参照によってここに取り入れられる。
本発明は、一般的には、哺乳類の細胞の増殖と拡大(expansion)に関するものである。特に、本発明は、表面または粒子(例えばマイクロキャリア粒子、ペレットまたはビーズ)を使用して、生体外で、哺乳類の産褥由来の細胞(postpartum-derived cells)(PPDCs)の増殖および拡大を行うための方法に関するものである。
市販の細胞療法製品は、好ましくは、閉じられた無菌システムで生産される。しかしながら、市販の細胞療法製品のために使用される多くの細胞型の増殖は、足場依存性(anchorage-dependent)である。
本発明は、哺乳類細胞の増殖と拡大のための組成物と方法とを提供する。表面(例えばマイクロキャリアビーズまたは多孔性マイクロキャリアビーズ)を利用した、生体外における、産褥由来の哺乳類細胞の増殖と拡大の方法が提供される。その哺乳類細胞は、足場依存性の産褥由来の哺乳類細胞(例えば臍帯由来の細胞または胎盤由来の細胞)である。
(総説)
本発明は、哺乳類細胞の増殖と拡大とのための組成物と方法とを提供する。提供される方法は、表面(例えばマイクロキャリアビーズまたは多孔性マイクロキャリアビーズ)を利用した、生体外での、産褥由来の哺乳類細胞の増殖と拡大とのための方法である。この哺乳類細胞は、足場依存性の産褥由来の哺乳類細胞(例えば臍帯由来の細胞または胎盤由来の細胞)である。
PPDCsを単離、収集する方法は、同時係属中の米国特許出願第10/877,012号および第10/877,446号に記述されている。これらの文献は、参照によりその全体がここに取り入れられる。単離とキャリア粒子上での細胞の培養とのための産褥臍帯と胎盤とを収集するために、出産直後の胎盤と臍帯とを得る。例えば、羊膜の除去の後、(血を抜き取った)胎盤または臍の緒またはそれらの帯域を、出生サイトから、食塩水または培地(例えばDulbeccoのModified Eagle's Medium (DMEM))を含む、フラスコ、ビーカーまたは培養皿等の無菌の容器中、研究所まで輸送し得るが、本方法に限定されるわけではない。臍の緒は、組織の収集前および組織の収集中は、無菌状態に維持され取り扱われるのが好ましく、さらに、例えば70容量%エタノール水溶液で臍の緒の短時間の表面処理によって、表面殺菌し、続いて、無菌の蒸留水または等張性食塩水でリンスし得る。臍の緒は、約1〜24時間の短時間、約3〜約50℃で保存し得る。組織は、細胞の抽出前は、凍らせずに、4〜10℃に保つことが好ましい。微生物学的な汚染を減らすために、培地中に抗生物質または抗真菌剤を加え得る。細胞は、当業者に公知の任意の適切な方法により、無菌条件下、臍の緒と胎盤とから収集される。これらの例には、ディパーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン、ヒアルロニダーゼ等の酵素による消化、または解体することもしくは細かく切り刻むことが含まれる。単離された細胞または組織片(そこから細胞が増殖する)は、細胞培養を開始するのに用いられ得る。
単離された細胞は、被覆なしか、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン等の細胞外マトリックスまたはリガンドで被覆された状態で、無菌の組織培養容器へ移される。細胞を増殖するため、例えば、DMEM(高または低ブドウ糖)、McCoys 5A培地、Eagle's basal 培地、CMRL培地、Glasgow minimum essential培地、Ham's F-12培地(F12)、Iscoveのmodified Dulbecco培地、LiebovitzのL−15培地、MCDBおよびRPMI 1640等の培養培地を加える。培養培地には、例えば、ウシの胎児の血清(FBS)、馬の血清(ES)、ヒト血清(HS)、増殖因子(例えばPDGF、FGF)、エリトロポイエチンおよび、微生物汚染を制御するための一以上の抗生物質および/または抗真菌剤(例えば、ペニシリンG、ストレプトマイシン硫酸塩、アンホテリシンB、ゲンタマイシンおよびナイスタチン)等の一以上の成分が、単独で、または、とりわけ組み合わせて、補充され得る。
マイクロキャリア培養は、足場依存性細胞(例えば足場依存性産褥細胞)の実用的な高い収量の培養を可能にする技術である。マイクロキャリアは、数mL〜1000Lを超える範囲の培養体量での細胞(例えば哺乳類の産褥細胞)の培養のために特に開発されたものである。マイクロキャリアは生物学的に不活性で、撹拌マイクロキャリア培養にとって、丈夫だが、剛体ではない基材を提供する。マイクロキャリアは、付着した細胞の顕微鏡検査を許容できるように、透明であり得る。Cytodex 3(登録商標)(GE Healthcare Life Sciences社、Piscataway、ニュージャージー州)は、架橋デキストランのマトリックスに化学的に結合した変性コラーゲンの薄層からなる。Cytodex 3(登録商標)上の変性コラーゲン層は、トリプシンおよびコラゲナーゼ等の種々のプロテアーゼによって消化され易くなっており、最大の細胞生存能力、機能および完全性を維持しつつ、マイクロキャリアから細胞を取り出す能力を与える。
〔実施例1〕
{インペラースピナーフラスコバイオリアクター中におけるマイクロキャリア上の臍帯組織に由来する産褥細胞の増殖と収穫}
この作業の目標は、インペラースピナーフラスコバイオリアクター中のマイクロキャリア上におけるヒトの臍帯組織由来の細胞(hUTCs)を播種、拡大および収穫する方法を確立することであった。マイクロキャリア上で増殖した細胞は、静置T−フラスコ法を使用して培養された細胞と同様の増殖反応速度(kinetics)と細胞表現型を示す筈である。これらの方法で培養された細胞が、その典型的表現型を維持しているかどうかを決定するための第一のステップとして、フローサイトメトリ−による細胞表面マーカーの分析が実行され、T−フラスコで培養された(hUTCs)によって表現される細胞表面マーカーと比較された。この作業の更なる目標は、本方法におけるトリプシン−EDTA(動物由来の製品)の使用を減らし、かくして、病原体を伝達する危険を減らすことである。
「細胞」。CBAT lot# 050604B継代8細胞からの細胞を解凍し、T225フラスコ中で1継代拡大した。
「細胞の収穫」。表1は、スピナーフラスコ培養体中のCytodex 3(登録商標)マイクロキャリア上、継代9から継代11に拡大させた臍帯細胞系統050604Bの、継代当たりの、収穫フラクション、細胞収量および生存能力を示したものである。
ヒトの臍帯組織由来の細胞(hUTCs)が、インペラースピナーフラスコバイオリアクター中、Cytodex3(登録商標)マイクロキャリア上で培養された。細胞は、20日で7.48回の集団倍加を達成し、平均倍加時間は69時間であった。継代あたりの細胞生存能力は、94.4%〜99.7%の範囲であった。マイクロキャリア上で培養されたhUTCsの13の細胞表面マーカーの発現の分析は、細胞培養Tフラスコで培養されたhUTCsによる細胞表面マーカーの表現と一致した。この作業は、マイクロキャリアが、バイオリアクターシステムにおけるhUTCsの播種、拡大および収穫に使用し得ることを示す最初の証拠を提供するものである。
{スピナーフラスコ中、MGSA、HAおよびPLGAマイクロキャリア上における、拡大されたヒトの臍帯組織由来の細胞(hUTCs)の増殖}
無菌的に閉ざされたシステムと共に使用されるマイクロキャリアは、潜在的に、拡大されたヒトの臍帯組織由来の細胞(hUTC)を商業的な量で生産し得る。無菌的に閉ざされたシステムは、市販の細胞製品を拡大し維持するのに必要なオペレーター操作を減少させるので、オペレーターエラー、汚染およびモニタリングを減少させる。マイクロキャリアは、細胞培養フラスコと比較してかなり大きな細胞付着表面積を提供し、それによって、より高い細胞収穫量を生じる。
(材料と方法)
「マイクロキャリアの収量の計算」。マイクロキャリアの収量は、39時間の集団倍加時間または、4日間における2.46回の倍加(静置条件における、hUTC増殖反応速度の史料データ)、を基礎として計算した。倍加方程式=(Log10(収穫量)−Logl0(播種量))/、Log10(2)を使用する。
{スピナーフラスコ中コラーゲンで被覆したMGSAマイクロキャリアおよびPLGAマイクロキャリア上での拡大されたヒトの臍帯組織由来の細胞(hUTCs)の増殖}
コラーゲン被覆の付いた、合成再吸収性生体適合物質から造られた材料に付着するhUTCsの能力が、スピナーフラスコ培養体中で生存能力を維持して、静置培養体中への再播種で繁殖する能力を含めて、調査された。拡大されたhUTCsを、コラーゲン被覆または被覆なしのポリ−(D,L−ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)およびポリ(モノステアロイルグリセリド・コ−コハク酸)(MGSA)マイクロキャリア上に播種した。この細胞付きのマイクロキャリアを、5日間スピナーフラスコで培養し、トリプシン処理によって収穫し、静置培養体中に再播種した。
(材料と方法)
{スピナーフラスコ中ゼラチンで被覆したMGSAマイクロキャリア上での拡大されたヒトの臍帯組織由来の細胞(hUTCs)の増殖}
ゼラチン被覆の付いた、合成再吸収性生体適合物質から造られたマイクロキャリアに付着するhUTCsの能力が、スピナーフラスコ培養体中で生存能力を維持して、静置培養体中への再播種で繁殖する能力を含めて、調査された。拡大されたhUTCsを、ゼラチン被覆または被覆なしのポリ(モノステアロイルグリセリド・コ−コハク酸)(MGSA)材料上に播種した。本例のコントロールとして、商業的に生産されているCytodex 3(登録商標)マイクロキャリアも使用された。この細胞付きのマイクロキャリアを、5日間スピナーフラスコで培養し、トリプシン処理によって収穫し、静置培養体中に再播種した。
(材料と方法)
{SoloHillマイクロキャリアに基づくhUTC培養体の、細胞の生産と回収についての実現可能性}
拡大されたhUTCsの増殖を、SoloHill, Inc.、SoloHill Engineering, Inc.(Ann Arbor、ミズーリ州)によって製造されたマイクロキャリア上で評価した。。このマイクロキャリアビーズは、彼らのカタログ中、SoloHillの名称で販売されており、ここでは、コラーゲン被覆(カタログ番号C104−1521)、HILLEX(登録商標)II(カタログ番号H112−170)および、プロネクチン被覆である(ProNectin F,カタログ番号PF104−1521)と呼ばれている。
「試薬:全研究:
組織培養フラスコ−T−225コーニング、lot#13005020
2%の豚のゼラチン−Sigma社
培養培地−DMED低ブドウ糖、15%FBS、1ppmBME、1%ペニシリン/ストレプトマイシン
hUTC系統:Umb 120304 P6
Bellcoスピナーフラスコ−SoloHill Engineering, Inc. Bellco直刃インペラーによる100〜250実容積専用インペラー
Ni=培養開始時の細胞数(播種密度)
Nh=特定の時点における細胞の収穫量
t=時間単位で表した培養時間
PDL=集団倍加レベル
r=24時間あたりの集団倍加数
PDT=集団倍加あたりの時間
フラスコを、インキュベーターから生物学的安全フードに移し、HILLEX(登録商標)IIまたはコラーゲン被覆マイクロキャリアを重力により沈殿させた。培地を、沈殿したマイクロキャリアから取り除いた。DPBSを、ビーズパック量の2x〜4xの割合で、容器に加えて、細胞を載せたマイクロキャリアを完全にリンスした。その際、マイクロキャリアを浸しすぎて細胞を取り外さないように注意した。ついで、細胞を載せたマイクロキャリアを入れたフラスコを、40〜55rpm、室温で、15分間洗浄した。DPBSを取り除き、この洗浄ステップを繰り返した。DPBSの第二のリンス分を取り除いた後に、トリプシン(0.05%)を、マイクロキャリアパック量の1x〜2xの割合で加えた。この細胞を載せたマイクロキャリアを入れたフラスコを、40〜55rpm、室温で、15分間撹拌した。顕微鏡観察を用いて、細胞をマイクロキャリアから50〜100mLピペット中に取り出した。ピペット中で、マイクロキャリアを、穏やかに上下に動かし、細胞を完全に取り外した。マイクロキャリアを重力沈降させ、細胞を含む上澄みを、ピペットで集めた。
培養容器を、インキュベーターから生物学的安全フードに移し、容器を60rpmに設定した撹拌プレート上に置いた。培養体を撹拌モードに置き、この容器の一方のアームを通して、培養体の中間で、インペラーアセンブリに触れない所まで延在させた15mLピペットを用いて、10mLのアリコートを得た。アリコートは、15mLの円錐チューブに移した(注:細胞/mLについては、ビーズパックは、培養体から取り出された10mL量の一部である。)。マイクロキャリアを、重力によって沈殿させ、ピペットで培地を取り出した。細胞を載せたマイクロキャリアを、5mLのDPBSで二回リンスした。DPBSの二回目のリンス液を取り除いた後、トリプシン(0.05%)をマイクロキャリアパック量の1x〜2xの割合で加え、10分間掛けて定着させた。マイクロキャリアを、ピペットで穏やかに取り出し、繰り返し分配して、単一細胞の懸濁体(single cell suspension)を作製した。マイクロキャリアを、重力によって沈殿させ、細胞を含む上澄みを、ピペットで集め、細胞をカウントした。
1)マイクロキャリア。HILLEX(登録商標)II(H)、コラーゲン被覆(C)またはプロネクチン−被覆(PF)(各グループ)
2)各グループ内の撹拌条件
50〜60rpmの定常撹拌、または、断続撹拌(50〜60rpmで3分間の撹拌オン、30分間の撹拌オフを24時間まで)でその後定常撹拌。
3)インペラー。HILLEX(登録商標)IIマイクロキャリア培養体用の専用インペラー。その他の二つのマイクロキャリアグループのためのBellcoインペラー。
・50mLの培地あたり225cm2の総表面積
・3.0x106細胞/225cm2
・pH7.4
・37℃/5%CO2
・CBATシリアルhUTC系統120304、継代8
「観察」:HILLEX(登録商標)II培養体は、定常的な撹拌と断続的なオン/オフサイクルとの両方で、細胞の一様な分布と、単一のマイクロキャリアが細胞で密集した状態とを示した。コラーゲン被覆マイクロキャリア培養体は、定常的な撹拌で、細胞の一様な分布と、単一のマイクロキャリアが細胞で密集した状態とを示した。コラーゲン被覆マイクロキャリアの最初の24時間の断続的なサイクルの培養体では、マイクロキャリアが凝集し、凝集物の周りに細胞が増殖し、細胞数が劇的に減少した。これらの培養条件を使ったプロネクチン被覆マイクロキャリア培養体は、両方のグループで不充分であった。
・CBATシリアルhUTC系統120304、継代9
・55〜60rpmでの定常的撹拌
・150mLのHayflick培地あたり675cm2(3×225cm2)の表面積
・37℃/5%CO2
・pH7.4
・培養時間
・培養体の接種のための一つの細胞懸濁体のプール
(培養中88時間後の細胞放出核カウントおよび細胞増殖指標の結果)
・フェノールレッドの入ったHayflick培地中に懸濁した細胞
・フェノールレッドなしのHayflick培地中に懸濁した細胞
・CBATシリアルhUTC系統120304、継代10
・55〜60rpmでの定常的撹拌
・50mLの完全なHayflick培地あたり225cm2の表面積
・37℃/5%CO2
・pH7.4
・時点d2、d3およびd4(開始後の時間単位で表現)
・フェノールレッドの入ったHayflick培地中に懸濁した細胞
・フェノールレッドなしのHayflick培地中に懸濁した細胞
・CBATシリアルhUTC系統120304、継代8
・675cm2あたり9.0×106個の細胞
・55〜60rpmでの定常的撹拌
・150mLの完全なHayflick培地あたり675cm2
・37℃/5%CO2
・pH7.4
・CBATシリアルhUTC系統120304、継代9
・接種のための一つの細胞懸濁体のプール
・55〜60rpmでの定常的撹拌
・フェノールレッド入りの50mLのHayflick培地あたり225cm2
・37℃/5%CO2
・pH7.4
・培養時間;69時間および92時間
・225cm2あたり150×104個の細胞
{Wave Bioreactor System中のCytodex 3(登録商標)マイクロキャリア上での、拡大したヒトの臍帯組織由来の細胞(hUTCs)の増殖}
無菌的に閉ざされたシステムと共に使用されるマイクロキャリアは、潜在的に、拡大されたヒトの臍帯組織由来の細胞(hUTC)を商業的な量で生産し得る。無菌的に閉ざされたシステムは、市販の細胞製品を拡大し維持するのに必要なオペレーター操作を減少させるので、オペレーターエラー、汚染およびモニタリングを減少させる。マイクロキャリアは、細胞培養フラスコと比較してかなり大きな細胞付着表面積を提供し、それによって、より高い細胞収量を生じる。
「細胞」。hUTC系統120304、継代9
「マイクロキャリア」。Cytodex 3(登録商標)(GE Healthcare Life Sciences社、カタログ番号17−0485)マイクロキャリアビーズを、少なくとも3時間、PBSで水和し、オートクレーブ処理した。
「マイクロキャリアの移動と器材設置」。細胞が付着したマイクロキャリアを、250mLのスピナーフラスコから収穫し、50mLの培地中に再懸濁した。この溶液を、1Lの培地と、2.4gの水和してオートクレーブ処理した細胞を含まないCytodex 3(登録商標)マイクロキャリアとを入れた、2LのWaveバイオリアクターバッグ(カタログ番号 CELLBAG2L/S-NU)に加えた。Waveバッグを、Wave Biotech 2/10EHシステム上に置いた。Waveバッグは、5%CO2−大気を使用し、製造者のスペックに従って膨らませた。システムの加熱パッドは、37℃に設定した。
{3LのBioreactor System中のCytodex 3(登録商標)マイクロキャリア上での、拡大したヒトの臍帯組織由来の細胞(hUTCs)の増殖}
無菌的に閉ざされたシステムと共に使用されるマイクロキャリアは、潜在的に、拡大されたヒトの臍帯組織由来の細胞(hUTC)を商業的な量で生産し得る。無菌的に閉ざされたシステムは、市販の細胞製品を拡大し維持するのに必要なオペレーター操作を減少させるので、オペレーターエラー、汚染およびモニタリングを減少させる。マイクロキャリアは、細胞培養フラスコと比較してかなり大きな細胞付着表面積を提供し、それによって、より高い細胞収量を生じる。
(材料と方法)
細胞。hUTC系統Umb120304、継代9。
「マイクロキャリア」。Cytodex 3(登録商標)(GE Healthcare Life Sciences社、カタログ番号17−0485)マイクロキャリアビーズを、PBSで少なくとも3時間水和し、オートクレーブ処理した。
「装置」。インペラー撹拌付きの3Lの閉ざされたバイオリアクターシステムを使用した。システムパラメータ(pH、酸素圧、温度、インペラーrpm)は、BioStat B-DCU(B. Broun International社)で調節した。
「培地の追加」。ブドウ糖読み取り値が低いため、15日目に、500mLの培地をシステムに加えた。
{ウシの胎児の減量(reduced)血清増殖培地中のhUTCの拡大}
本研究の目標は、連続的に培養した、拡大したヒトの臍帯組織由来の細胞(hUTC)の、増殖反応速度と細胞表面マーカーとを、15%のウシの胎児の血清(FBS)を含む標準の増殖培地または、7.5%のFBSを含む、減量血清増殖培地で、比較することであった。減量血清培地中のhUTC細胞療法製品の生産は、動物性由来製品の使用を減少させることによって、製品の安全性を高めるものである。減量血清培地の使用は、生産コストを下げ、ガス吹き込みバイオリアクターでの泡立ちの可能性を減少させるものでもある。
「細胞」。拡大したヒトの臍の緒組織細胞(hUTC)の低温保存した分離株12034、集団倍加数(PD)12。
(結果)
{3Lのバイオリアクター中HILLEX IIマイクロキャリア上のhUTCの拡大}
本研究の目標は、HILLEX IIマイクロキャリアに付着したヒトの臍帯組織由来の細胞(hUTC)を、ベンチスケールのバイオリアクターで複数の集団倍加に渡って拡大させるものであった。ベンチスケールのバイオリアクターで、複数の集団倍加に渡ってHILLEX II上でhUTCを拡大させる能力は、細胞療法用途におけるhUTCの大規模な生産へのスケールアップのためのモデルバイオプロセシングシステムに役立つものである。500mLのスピナーフラスコ中HILLEX IIマイクロキャリア上で約70%の密集度に拡大された、hUTC分離株CNTO 2476を用いて、更なる培地とHILLEX IIマイクロキャリアとを入れた3Lのバイオリアクターに接種した。細胞は、バイオリアクターで5日間培養し、アリコートを取って、途中(mid-run)の細胞カウントを計算した。
「細胞」。拡大したヒトの臍の緒組織細胞(hUTC)の低温保存した分離株CNTO 2476ロット25126078PD7を使用した。
(結果)
{12〜24g/Lの濃度のHILLEX IIマイクロキャリア上のhUTCの拡大}
本研究の目標は、スピナーフラスコ中複数のマイクロキャリア濃度で、HILLEX IIマイクロキャリアに付着した、拡大したヒトの臍帯組織由来の細胞(hUTC)を、連続的に培養することであった。種々のマイクロキャリア濃度でマイクロキャリア上のhUTCを拡大する能力により、細胞療法用途のためのhUTCの大規模生産について、より大きな柔軟性とオプションとが与えられよう。低温保存したhUTC分離株120304を解凍し、これを用いて、12、16、20または24g/Lの濃度でHILLEX IIマイクロキャリアを入れたスピナーフラスコに直ちに接種し、複数継代に渡って連続的に培養した。
「細胞」。拡大したヒトの臍の緒組織細胞(hUTC)の低温保存した分離株12034集団倍加数(PD)12。
(結果)
{連続スピナーフラスコ培養におけるマイクロキャリア上のhUTCの拡大}
本研究の目標は、商業的なマイクロキャリアに付着した、拡大したヒトの臍帯組織由来の細胞(hUTC)を、スピナーフラスコで連続的に、複数回の集団倍加に渡って培養することであった。マイクロキャリア上のhUTCを、複数回の集団倍加に渡って拡大する能力は、細胞療法用途のためのhUTCの大規模な生産のための、モデルシステムのスケールアップに役立つものである。二つのhUTC分離株である、研究条件下、単離され、拡大され、低温保存された120304−と、GMT条件下、単離され、拡大され、低温保存されたCNTO 2476−と、を評価した。商業的なマイクロキャリアCytodex 1またはHILLEX IIも評価した。低温保存した細胞を解凍し、これを用いてスピナーフラスコ培養体に直ちに接種した。細胞は、集団倍加数が約30になるまで、複数継代に渡って連続的に培養された。hUTCsは、T225フラスコでも、コントロールとして静的に培養された。
「細胞」。拡大したヒトの臍の緒組織細胞(hUTC)の低温保存した分離株12034集団倍加数(PD)12およびhUTC分離株CNTO2476ロット25126078PD22を使用した。
(結果)
{3Lのバイオリアクター中のCytodex 1マイクロキャリア上でのhUTCの拡大}
本研究の目標は、ベンチスケールのバイオリアクターでCytodex 1マイクロキャリアに付着したヒトの臍帯組織由来の細胞(hUTC)を複数の集団倍加に渡って拡大させるものであった。ベンチスケールのバイオリアクターで、複数の集団倍加に渡ってCytodex 1上でhUTCを拡大させる能力は、細胞療法用途におけるhUTCの大規模な生産へのスケールアップのためのモデルバイオプロセシングシステムに役立つものである。500mLのスピナーフラスコ中Cytodex 1マイクロキャリア上で約70%の密集度に拡大された、hUTC分離株CNTO 2476を用いて、更なる培地とCytodex 1マイクロキャリアとを入れた3Lのバイオリアクターに接種した。細胞を、バイオリアクターで6日間培養し、3日目のアリコートを取って、途中(mid-run)の細胞カウントを計算した。
「細胞」。拡大したヒトの臍の緒組織細胞(hUTC)の低温保存した分離株CNTO 2476ロット25126078PD7を使用した。
(結果)
Claims (30)
- 足場依存性産褥細胞を培養する方法において、
少なくとも一つの足場依存性産褥細胞を提供することと、
前記産褥細胞を増殖させるための細胞増殖培地を提供することと、
前記足場依存性産褥細胞の付着のための少なくとも一つのキャリア粒子を提供することと、
前記細胞の付着と増殖とを許容する条件下で前記増殖培地の存在下、前記足場依存性産褥細胞を前記キャリア粒子に接触させ、これによって、前記足場依存性産褥細胞を培養することと、
を含む、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記細胞が臍帯由来の細胞である、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記細胞が胎盤由来の細胞である、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記キャリア粒子が生物活性剤を含む、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記足場依存性産褥細胞と共培養される第二の細胞型を更に含む、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記キャリア粒子がマイクロキャリアである、方法。 - 請求項6に記載の方法において、
前記マイクロキャリアが、コラーゲン、デキストラン、セルロース、ガラス、セラミック、金属、ポリスチレン、ポリ(モノステアロイルグリセリド・コ−コハク酸)、ポリ−D,L−ラクチド−コ−グリコリドおよびヒアルロン酸ナトリウムからなる群から選ばれる材料を含む、方法。 - 請求項6に記載の方法において、
前記マイクロキャリアがタンパク質を含まない、方法。 - 請求項6に記載の方法において、
前記マイクロキャリアが、ポリ(モノステアロイルグリセリド・コ−コハク酸)、ポリ−D,L−ラクチド−コ−グリコリド、ヒアルロン酸ナトリウム、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、リジン、n−イソプロピルアクリルアミド、ビトロネクチンまたはコラーゲンで被覆されている、方法。 - 請求項6に記載の方法において、
前記マイクロキャリアが、肌理のある表面またはプラズマ被覆された表面を含む、方法。 - 請求項6に記載の方法において、
前記マイクロキャリアが、微少電流を有するか、または常磁性である、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記キャリア粒子が多孔性マイクロキャリアである、方法。 - 請求項12に記載の方法において、
前記多孔性マイクロキャリアが、コラーゲン、デキストラン、セルロース、ガラス、セラミック、金属、ポリスチレン、ポリ(モノステアロイルグリセリド・コ−コハク酸)、ポリ−D,L−ラクチド−コ−グリコリドおよびヒアルロン酸ナトリウムからなる群から選ばれる材料を含む、方法。 - 請求項12に記載の方法において、
前記多孔性マイクロキャリアがタンパク質を含まない、方法。 - 請求項12に記載の方法において、
前記多孔性マイクロキャリアが、ポリ(モノステアロイルグリセリド・コ−コハク酸)、ポリ−D,L−ラクチド−コ−グリコリド、ヒアルロン酸ナトリウム、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、リジン、n−イソプロピルアクリルアミド、ビトロネクチンまたはコラーゲンで被覆されている、方法。 - 請求項1121に記載の方法において、
前記多孔性マイクロキャリアが、肌理のある表面またはプラズマ被覆された表面を含む、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記細胞が、CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD117、CD141、PDGFr−α、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DR、HLA−DPおよびHLA−DQのうちの一つ以上のマーカーについての静置培養で増殖した細胞と表現型が同一である、方法。 - 請求項17に記載の方法において、
前記細胞が、CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD117、CD141、PDGFr−α、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DR、HLA−DPおよびHLA−DQのマーカーのそれぞれについての静置培養で増殖した細胞と表現型が同一である、方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記細胞の表現型が、CD10+、CD13+、CD31−、CD34−、CD44+、CD45−、CD73+、CD90+、CD117−、CD141−、PDGFr−α+、HLA−A+、HLA−B+、HLA−C+、HLA−DR−、HLA−DP−およびHLA−DQ−、を含む、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
約20日で少なくとも約5回の集団倍加数をもたらす、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
集団倍加時間が約100時間未満である、方法。 - 請求項21に記載の方法において、
前記集団倍加時間が約70時間未満である、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記足場依存性産褥細胞の付着と増殖とを許容する条件が、約37℃の温度を含む、方法。 - 請求項23に記載の方法において、
前記条件が、スピナーフラスコまたはバイオリアクターを更に含む、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記細胞増殖培地が、約7〜約15%の血清濃度を含む、方法。 - 組成物において、
請求項1に記載の方法に従って増殖した産褥由来の細胞を含む、組成物。 - 請求項26に記載の組成物において、
前記細胞の表現型が、CD10+、CD13+、CD31−、CD34−、CD44+、CD45−、CD73+、CD90+、CD117−、CD141−、PDGFr−α+、HLA−A+、HLA−B+、HLA−C+、HLA−DR−、HLA−DP−およびHLA−DQ−を含む、組成物。 - バイオリアクターにおいて、
請求項26に記載の細胞を含む、バイオリアクター。 - 細胞療法のための組成物において、
請求項26に記載の細胞を含む、細胞療法のための組成物。 - 組成物において、
請求項6に記載の方法に従って増殖したヒトの臍帯組織に由来する細胞を含む、組成物。
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