JP2006500941A - 細胞培養 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)各々が1以上の細胞を含む細胞ユニットの群の第一の組を提供し、前記群を所望の培養条件に暴露するステップと、
(b)前記群の1以上をサブ分割して、細胞ユニットの群のさらなる組を作るステップと、
(c)前記さらなる群をさらなる所望の培養条件に暴露するステップと、
(d)任意選択により、必要に応じて、ステップ(b)〜(c)を繰り返し反復するステップと、
(e)細胞が暴露された培養条件の所与の細胞ユニットに対する効果を評価するステップと
を含む、細胞に対する複数の培養条件の効果を決定する方法を提供する。
(a)各々が1以上の細胞を含む細胞ユニットの群の第一の組を提供し、前記群を所望の培養条件に暴露するステップと、
(b)前記群の2以上をプールして、少なくとも1つのプールを形成するステップと、
(c)前記プールをサブ分割して、細胞ユニットの群のさらなる組を作るステップと、
(d)前記さらなる群を所望の培養条件に暴露するステップと、
(e)任意選択により、必要に応じ、ステップ(b)〜(d)を繰り返し反復するステップと、
(f)細胞が暴露された培養条件の所与の細胞ユニットに対する効果を評価するステップと
を含む、細胞に対する複数の培養条件の効果を決定する方法を提供する。
(a)各々が1以上の細胞を含む細胞ユニットの群の第一の組を提供し、前記群を所望の培養条件に暴露するステップと、
(b)前記群の1以上をサブ分割して、細胞ユニットの群のさらなる組を作るステップと、
(c)前記さらなる群をさらなる所望の培養条件に暴露するステップと、
(d)任意選択により、必要に応じ、ステップ(b)〜(c)を繰り返し反復するステップと
を含む、種々の細胞培養条件に細胞を暴露する方法を提供する。
(a)各々が1以上の細胞を含む細胞ユニットの群の第一の組を提供し、前記群を所望の培養条件に暴露するステップと、
(b)前記群の2以上をプールして、少なくとも1つの第二のプールを形成するステップと、
(c)第二のプールをサブ分割して、細胞ユニットの群のさらなる組を作るステップと、
(d)前記さらなる群を所望の培養条件に暴露するステップと、
(e)任意選択により、必要に応じ、ステップ(b)〜(d)を繰り返し反復するステップと、
(f)それが暴露された培養条件の所与の細胞ユニットに対する効果を評価するステップと
を含む、細胞に対する複数の培養条件の効果を決定する方法を提供する。
(a)本発明の前記態様に従い、細胞ユニットに対する1以上の培養条件の効果を測定するステップと、
(b)前記培養条件に暴露する場合の前記細胞ユニットにおける遺伝子発現を分析するステップと、
(c)所望の培養条件下で差異的に発現される遺伝子を同定するステップと
を含む、細胞プロセスに影響する遺伝子を同定する方法を提供する。
(a)本発明に従った細胞プロセスに関連して差異的に発現される1以上の遺伝子を同定するステップと、
(b)前記1以上の遺伝子の細胞における発現を調整するステップと
を含む、細胞において細胞プロセスを誘導する方法が提供される。
(a)前記した細胞プロセスに関連して差異的に発現される1以上の遺伝子を同定するステップと、
(b)細胞における前記1以上の遺伝子の発現の調整を検出し、それにより、前記細胞における細胞プロセスの状態を判断するステップと
を含む、細胞において細胞プロセスの状態を同定する方法を提供する。
(a)本発明の前記態様に従って、細胞ユニットに対する1以上の培養条件の効果を測定するステップと、
(b)細胞プロセスの変化を行う培養条件に細胞を暴露するステップと、
(c)所望の細胞を単離するステップと
を含む、細胞プロセスを調節する方法を提供する。
(a)本発明の前記態様に従って、細胞ユニットに対する1以上の薬剤の効果を測定するステップと、
(b)細胞ユニットにおいて所望の細胞プロセスを誘導する薬剤を同定するステップと
を含む、細胞プロセスを誘導することができる薬剤を同定する方法が提供される。
(a)異なる条件下で増殖された細胞の1以上の培養を合わせるステップと、
(b)前記細胞を通常の条件下で培養するステップと
を含む、インビトロにて細胞を培養する方法が提供される。
(a)細胞培養をインキュベートするステップと、
(b)前記培養を細胞の2以上の群に分割し、培養条件の2以上の異なる組下で細胞の前記群を培養するステップと
を含む、インビトロで細胞を培養する方法が提供される。
(a)異なる条件下で増殖された細胞の1以上の培養を合わせるステップと、
(b)通常の条件下で細胞を培養するステップと
を含む、インビトロにて、幹細胞、および幹細胞に由来する分化された細胞を培養する方法が提供される。
(a)幹細胞培養をインキュベートするステップと、
(b)前記培養を幹細胞の2以上の群に分割し、2以上の異なる組の培養条件下で前記幹細胞の群を培養するステップと
を含む、インビトロにて、幹細胞、および幹細胞に由来する分化された細胞を培養する方法が提供される。
<培養条件>
本明細書中で用いるように、用語「培養条件」とは、細胞の増殖または分化を促進するために細胞が置かれ、または暴露される環境をいう。従って、前記用語は、細胞の増殖および/または分化に影響し得る培地、温度、雰囲気条件、基材、攪拌条件などをいう。さらに詳しくは、前記用語は、培養培地に取り込むことができ、細胞の増殖および/または分化に影響し得る特定の薬剤をいう。
本明細書中でいう細胞は、全てが半透性細胞膜または細胞壁によって囲まれた、1以上の核、細胞質および種々のオルガネラよりなる、独立して機能することができる生物、または単細胞生物の最も小さな構造ユニットと定義される。前記細胞は原核生物、真核生物または古細菌であり得る。例えば、細胞は真核生物細胞であり得る。哺乳動物細胞、特にヒト細胞が好ましい。細胞は天然のものであるか、あるいは遺伝子操作または培養における継代によるなどして修飾して所望の特性を達成することができる。幹細胞は後により詳細に定義され、その1を超える分化した細胞型を生じることができる全能性、多能性または複能性細胞である。幹細胞はインビトロで分化した細胞を生じ、これはそれ自体が複能性であるか、または終末的に分化させることができる。インビトロで分化した細胞は、細胞分化を促進する1以上の薬剤に幹細胞を暴露することによって人工的に作られた細胞である。
細胞プロセスは、細胞に起こるか、あるいは細胞に観察されるか、あるいは細胞に帰すことができる、いずれかの細胞内または細胞外の特徴的な機能、プロセス、事象、原因または効果である。細胞プロセスの例は、限定されるものではないが、生存率、老化、死滅、多能性、形態学、シグナリング、結合、認識、分子生産または破壊(分解)、突然変異、タンパク質フォールディング、転写、翻訳、触媒、シナプス伝達、小胞輸送、オルガネラ機能、細胞周期、代謝、増殖、細胞分裂、分化、表現型、遺伝子型、遺伝子発現、またはこれらのプロセスの制御を含む。
細胞の群であり、1つの群であってもよい。細胞ユニットのプールは、細胞ユニットが細胞のコロニーとして挙動し、細胞ユニットにおける各細胞が同一の培養条件に暴露されるように、細胞ユニットそれ自体を実質的に解離させることなく分類し、サブ分割し、取り扱うことができる。例えば、細胞ユニットは、細胞の群に接着するビーズを含むことができる。
全能性細胞は、生物において見出された体細胞または生殖細胞のいずれかのタイプに分化する能力を持つ細胞である。従って、いずれの所望の細胞も、何らかの手段で、全能性細胞に由来することができる。
多能性細胞は、1を超えるが、全てではない細胞型に分化することができる細胞である。
本明細書中で用いる標識またはタグは、細胞ユニットを同定し、および/または細胞ユニットが暴露された培養条件、または培養条件の配列を決定するための手段である。従って、標識は標識の群であってもよく、各々は特異的な培養ステップに添加され;または細胞ユニットが暴露された培養ステップに従って修飾された、あるいは初期に、あるいは前記ステップの間に追跡された実験の間に添加された標識であり;または用いられる培養工程が推定できるようにする単純に位置的な参照である。また、標識またはタグは、いずれか1つの時点で細胞ユニットの位置または同一性を報告し、または記録し、あるいは細胞ユニットに独特なアイデンティファイアーに割り当てるデバイスであってもよい。標識またはタグの例は独特な配列、構造または質量の分子;あるいはビーズのような蛍光分子または物体;あるいは放射線周波数および他のトランスポンダ;またはユニークなマーキングまたは形状を持つ物体である。
細胞が培地と接触するように置かれるか、または細胞の増殖、分化または代謝状態のような1以上の細胞プロセスに影響する条件下で増殖された場合、細胞は培養条件に暴露される。従って、もし培養条件が細胞を培地中で培養することを含めば、細胞はそれが効果を有するのに十分な長さの時間培地に入れられる。同様に、もし条件が温度条件であれば、細胞は所望の温度で培養される。
細胞ユニットの1以上の群のプーリングは、1を超えるバックグラウンドの細胞ユニットを含み、すなわち、培養条件の1を超える異なる組に暴露された単一の群またはプールを作り出すための群の混合物を含む。プールはさらにランダムにまたはランダムではなく群にサブ分割され;そのような群は本発明の目的ではそれ自体は「プール」ではないが、それ自体は、例えば、培養条件の異なる組への暴露の後に組合せによってプールされる。
細胞成長および細胞増殖は、ここでは、異なる細胞型または細胞系譜への分化なしで細胞の数の大きさを示すのに相互交換的に用いられる。換言すれば、前記用語は生きた細胞数の増加を示す。好ましくは、増殖は表現型または遺伝子型の認識可能な変化は伴われない。
細胞分化は、異なる細胞型の、細胞型からの発生である。例えば、二能性、多能性、または全能性細胞は中性細胞に分化することができる。分化には増殖が伴うことができ、あるいはそれとは独立していてもよい。用語「分化」は、一般には、発生的にはあまり定義されていない細胞型からの成熟細胞型、例えば、ニューロン、またはリンパ球の表現型の獲得をいうが、トランス分化を排除せず、それにより、1つの成熟細胞型はもう1つの成熟細胞型に変換することができ、例えば、ニューロンはリンパ球に変換することができる。
細胞の分化の状態は、細胞が特定の経路または系譜に沿って分化されたレベルである。
細胞プロセスの状態は、細胞プロセスが起こりつつあるか、またはそうでないかをいい、複雑な細胞プロセスでは、その細胞プロセスにおける特定のステップまたは段階を示すことができる。例えば、細胞における細胞分化経路は不活性であるか、あるいは誘導されており、酵素または中間体の特徴的な組の存在によって特徴付けられるシグナリング事象のような区別されるステップまたは成分の数を含むことができる。
遺伝子は、それがポリペプチドまたはRNA遺伝子産物であるかを問わず遺伝子産物をコードする核酸である。本明細書中で用いるように、遺伝子は遺伝子産物をコードするコード配列を少なくとも含み;それは、所望により、コード配列の転写および/または翻訳に必要な1以上の調節領域を含むことができる。
遺伝子産物は、典型的には、慣用的方法で遺伝子によってコードされるタンパク質である。しかしながら、前記用語は遺伝子によってコードされるリボ核酸のような非ポリペプチド遺伝子産物も含む。
核酸は、いずれかの入手可能な技術に従って合成することができる。好ましくは、核酸合成は自動化される。さらに、核酸は、当分野で公知の手法に従って、細菌または真核生物細胞におけるクローニングおよび複製によるような、生物学的複製によって生産することができる。
細胞培養条件に応答した異なるレベルで発現される遺伝子は、当分野で知られた方法によって、遺伝子アレイ上のような遺伝子発現分析によって同定することができる。差異的に(differential)発現された遺伝子は、総じて遺伝子発現レベルに対して、別の条件下よりもテスト条件下で細胞におけるmRNAまたは遺伝子産物のより大きなまたはより小さな量を呈する。
遺伝子は、いずれかの適当な手段によって細胞にトランスフェクトすることができる。前記用語は、ここでは、例えば、リン酸カルシウムを用いる従来のトランスフェクションを意味するように用いられるが、形質転換、ウイルス導入、電気穿孔などを含む、核酸を細胞に導入するための他の技術も含む。
前記用語調整は、調整されるべきパラメーターの増加および/または減少を意味するように用いられる。従って、遺伝子発現の調整は、遺伝子発現の増加および遺伝子発現の減少を共に含む。
細胞ベースのアッセイは現代の生物医薬科学の重要な一部であり、細胞が用いられる工程を含むいずれかのアッセイを含む。細胞ベースのアッセイを、薬物発見および開発プロセスのほとんど全ての段階にわたって用いることができ、どのようにして化合物が単離された潜在的薬物標的と相互作用するかについてではなく、どのようにして化合物が生物学的系で相互作用するかについての情報を提供するのに貴重である。
幹細胞はStem Cells:Scientific Progress and Future Research Directions.Department of Health and Human Services.June 2001.http//www.nih.gov/news/stemcell/scireport.htmに詳細に記載されている。参照することにより前記報告の内容を本明細書に組み込む。
何が幹細胞を構成するかについては依然としてかなりの論争があるが、この議論の目的では、鍵となる特徴は異なる細胞型に分化する能力である。幹細胞の例を以下に掲げる。
幹細胞の重要な特性は培養において対称的に分裂するその能力であり、由来する幹細胞の正確なコピーである2つの娘細胞を生じる。これは、幹細胞がその未分化状態で培養において拡大培養できることを可能とし、生物学的研究または細胞療法のための十分な材料を生じる。幹細胞がこれをなすことができる手段は、理解されることには、精力的な研究の主題であるが、幹細胞更新を促進する因子は少数しか知られていない。典型的には、多能性幹細胞系が線維芽細胞の細胞分裂的には不活性なフィーダー層、またはそのような細胞によるコンディション培地で維持される。フィーダー細胞は培養基からいくつかの未知の因子を除去し/中和し、および/またはそれは、分化を抑制し、幹細胞の自己複製を促進する因子を提供すると考えられている。1つのそのような因子は白血病阻害因子(LIF)、すなわち、フィーダー細胞の非存在下でマウスE3細胞自己複製を促進できる、IL−6に関連するサイトカインファミリーのメンバーである。フィーダー細胞(および/またはLIF)の非存在下で増殖された幹細胞は、しばしば、自然発生的に、および偶然に分化し、分化した細胞型の混合物を生じる。
特別な細胞型の成功した培養のための、あるいは細胞プロセスを達成するまたは調整するための条件の開発において、しばしば、種々の因子を考慮するのが重要である。
本発明の重要な態様は、細胞(細胞コロニー)の群が種々の条件下で細胞培養を増殖させることができ、コロニーは、乱された場合、および他のコロニーと混合された場合、種々の条件下でその一体性を大いに維持することができることである。そのような群またはコロニーは、本明細書では細胞ユニットという。細胞ユニットの形成は、例示として、キャリアーのような固体基材上での接着性培養としての細胞を増殖させることによって達成することができる。もしキャリアー上でのシーディング後に細胞増殖が起これば、娘細胞は同一キャリアー上に付着し、同一コロニーの一部を形成する。一般には、生きた接着性細胞はその増殖基材から容易には解離せず、従って、細胞コロニーの一体性は、キャリアーのいずれかの機械的な操作、培養基の揺動、またはもう1つの組織培養系への導入にもかかわらず終始一貫して存在する。同様に、もしいずれかの時点において、複数キャリアーが同一容器に入れられると(例えば、ビーズがプールされると)、1つのビーズからもう1つのビーズへの細胞の実質的移動はない。
<スプリットプール細胞培養>
細胞ユニット(特に、顕微鏡的細胞ユニット)の形成は、多数の組織培養条件をサンプリングするのにさらに有用である。というのは、各細胞ユニットは、種々の細胞培養条件に暴露することができる容易に取り扱われるユニットを構成するからである。単純のために、この議論においては、我々は、マイクロキャリアー培養において細胞を増殖することによって細胞のグループ分けが作成されると仮定しており、用語細胞ユニット、細胞群、コロニーおよびビーズは相互交換的に用いられる。しかしながら、記載した方法はいずれの細胞ユニットにも、例えば、前記したものに同等に適用することができる。非常に多数の細胞培養条件をサンプリングするための特に効果的な方法は、コンビナトリアル細胞培養またはスプリットプール細胞培養といい(図1および2)、1つの実施形態においては、細胞培養条件の複数の組合せをサンプリングするための細胞ユニットの群の系列的サブ分割および組合せを含む。本発明の一つの態様において、前記方法は、細胞ユニットの初期スターター培養(または異なるスターター培養)を(各々が異なる培養条件下で別々に増殖された複数ビーズ(群/コロニー/キャリアー)を含有する)アリコットのX1数で割ることによって行われる。所与の時間の間の細胞培養に続き、細胞ユニットは、異なるアリコットからのビーズを組合せ、混合することによってプールすることができる。このプールはアリコットのX2数に再度分割することができ、その各々はある時間異なる条件下で培養され、引き続いてプールもされる。細胞ユニットを分割し、培養し、およびプールする(またはプーリング、分割および培養;どこで前記周期に入るかに依存)この反復手法は、細胞培養条件の多くの異なる組合せの系列的サンプリングを可能とする。実験に複雑性、換言すれば、テストした細胞培養条件の異なる組合せの数は各ラウンドでサンプリングした異なる条件の数の積(X1×X2×...Xn)に等しい。引き続いての分割に先立って全ての細胞ユニットをプールする工程は任意とすることができ−限定された数の細胞ユニットがプールされる工程は、図3および4に示したように同一の効果を有することができることに留意のこと。本発明は、従って、細胞ユニットの群がひとまとめで取り扱われる場合に、細胞培養条件の多数の組合せを系列的にサンプリングする多数の関連方法を具体化する。
細胞ユニット上でスプリットプールプロセスを行う目的は、条件の予め規定された組合せにこれらを系統的に暴露することである。当業者であれば、この結果を達成する多くの異なる手段を考え付くであろう。分割プールプロセスおよびその変形に加えて、分割−分割(split−split)プロセスを軽く議論するのは価値あることである。分割−分割プロセスは、細胞ユニットのプーリングに介入することなく、細胞ユニットの群を少なくとも2回サブ分割することを含む(図5)。もし分割−分割プロセスが大きな数のラウンドにわたって用いられれば、生じた別々の試料の数は指数関数的に増大する。この場合、あるレベルの自動化、例えば、ロボットプラットフォームおよび巧妙な試料トラッキングシステムの使用を用いるのが重要である。分割−分割工程の利点は、(細胞ユニットが組み合わせられていないので)、それらの細胞培養履歴に基づいて種々の細胞ユニットの系統を分離することが可能である。その結果、分割−分割工程を用いて、特定の細胞培養条件がいずれかの所与の細胞プロセスを担うかを推定することができ、従って、(図6で説明された、および「Determination of culture history of a cell unit」下で詳細に説明された)細胞ユニットの培養履歴を推定することができる。
細胞ユニットの分割および/またはプーリングは全くランダムに達成することができるか、あるいは所定のプロトコルに従うことができる。細胞にユニットがランダムに分割および/またはプールされる場合、与えられた細胞ユニットのいずれかの群への分離は断じて所定のものであったり、妥当性を損なうものではない。少なくとも1つの細胞ユニットが細胞培養条件の可能な組合せの1つに暴露される高い確率がもたらされるためには、テストされるべき細胞培養条件の組合せの合計数よりも大きな数の細胞ユニットを使用するのが有利である。従って、ある種の条件下では、所定のプロトコルに従って細胞ユニットを分割しおよび/またはプールするのが有利であり、総じての効果は、偶発的な複製または省略が妨げられるということである。細胞ユニットの所定の取扱は、所望により、予め計画し、スプレッドシートまたはコンピュータプログラム、および自動化プロトコル、例えば、ロボットを用いて実行される分割および/またはプーリング操作にログすることができる。細胞ユニットの標識(後記参照)は多数の手段、例えば、RFIDによる標識、光学タグ付けまたは空間的暗号化のいずれかによることができる。試料の同時性を決定し、従って、所定のプロトコルに従って試料を分割することができるロボットデバイスが記載されている(「Combinatorial Chemistry A practical Aprorch」)、Oxford University Press(2000)Ed H.Fenniri参照)。あるいは、標準研究所液体取扱および/または組織培養ロボット(例えば、Beckman Coulter Inc.Fullerton,CA;The Automation Partnership,Royston,UKによって製造されたような)は、多数の試料の同一性を空間的に暗号化し、予めプログラムされたプロトコルに従ってこれらを付加し、除去し、または移動させることができる。
細胞培養の各ラウンドに続き、または規定された数のラウンドの後、細胞ユニットを調べて、組織培養条件によって影響され得るいずれかの所定の細胞プロセスを観察することができる。以下の例は説明的であって、本発明の範囲を限定する意図のものではない。
非常に多数の細胞ユニットを取り扱う場合、その同一性および/または細胞培養履歴(例えば、いずれかの1つの群またはユニットが暴露されたであろう一連の培養条件の年代学および正確な性質)は混乱しかねない。例えば、細胞培養の分裂プールプロトコルは各ラウンドにおける細胞ユニットの混合を含み、それを個々のユニットに従うのを困難とする。複数培養条件に供された細胞ユニットの混合物における細胞ユニットの細胞培養履歴の決定は、時々、細胞培養履歴の「脱回旋」と言う。これを成す1つの方法は細胞ユニットを標識することであり、従って、細胞ユニットを標識するのは有利である。標識は実験の開始時、実験の各ラウンドの間に行うことができ、ユニークな標識(実験の間に修飾することができるか、またはできない)、またはユニークな集合を含む一連の標識を含むことができる。同様に標識の読みは、各ラウンドの間にまたは単純に実験の最後に行うことができる。好ましくは、RFID標識のようなユニークな標識は各ラウンドの間に読まれ、他方、各ラウンドにおいて系列的に付加された標識は実験の最後に読まれる。
分裂プール培養実験を行って、未分化マウスES細胞のスターター培養を用い、ドーパミン作動性表現型のニューロンを生起させることができる組織培養条件をアッセイした。
分割プール培養実験を行って、特定の細胞プロセス、すなわち、チトクロームP450(CyP450)代謝酵素の発現および/または活性に影響し得る組織培養条件をアッセイした。1A1および1A2のようなこのクラスの酵素のメンバーは基質、すなわち、酵素的に加水分解されて生成物である、CyP450酵素活性を測定するのに用いることができる区別される蛍光特徴を有するレソルフィンを生じるエトキシレソルフィンの使用でアッセイすることができる。CyP450酵素の発現はβ−ナフトフラボンのようなインデューサー分子、およびα−ナフトフラボン、キノジンまたはアミノトリアゾールのような阻害薬剤によって調節することができる。また、いくつかの分子について、CyP450遺伝子の発現を誘導することができるが、遺伝子の酵素産物の活性を阻害することが可能である。従って、発現および活性の複雑なパターンが、調節化合物への細胞の一連の暴露パターンに従って生起することができる。
Tau−GFP融合タンパク質を発現する多能性マウスES細胞を、15%FCS、0.55mM 2−メルカプトエタノール、L−グルタミン、抗生物質(全てGIBCO/BRLからのもの)、および1,400U ml-1の白血病阻害因子(Chemicon)を補足したイスコベの培地よりなるES細胞培地中のマイトマイシンC−処理SNL細胞(STO細胞誘導体)でのフィーダー層で維持し、1日おきに1:5分割した。細胞ユニットの形成で用いたES細胞およびフィーダー細胞をゼラチン被覆フラスコに移し、ES培地中で1日間培養して培養におけるフィーダー細胞の数を低下させた。ES細胞をゼラチンプレートからトリプシン処理し、FCS含有培地で洗浄し、次いで、PBS中で水和させたCytopore2またはCytodex3マイクロキャリアー(Amersham Biosciences)いずれかと共にインキュベートし、オートクレーブ処理または70%エタノール処理によって滅菌し、次いで、ES培地で洗浄した。ES細胞を非接着性ブラスチック皿中で約10細胞/マイクロキャリアーの密度で蒔いた。ES細胞培養を、1日置きに培地の半分を新鮮なES培地で交換しつつ、標準条件(5%CO2、37℃)下で維持した(図7参照)。多能性細胞の増殖をこれらの条件下で5日間観察し、その後、細胞をES細胞培地から移して分化を開始させた。
多能性マウスES細胞ユニットをES細胞培地中で5日間培養し(実施例3参照)。ES培地を捨て、細胞ユニットをPBSで2回洗浄して痕跡量のES培地を除去した。ビーズ集団を3つの群に分割し、PBSを捨て、(i)ES細胞培地;(ii)10%胎児ウシ血清を含むダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM);または(iii)化学的に定義された培地(CDM;Wiles MV,Johansson BM,1999,Exp.Cell Res.,vol 247,p.241−8)の一つで置き換えた。標準条件下での1時間の培養の後、3つの群の各々を3つのさらなる群に分割し、その各々を(i)細胞群を培養した培地;(ii)細胞群を1μm LiClを含む培養した培地;または(iii)細胞群を、1μMレチノイン酸(RA)を含む培養した培地の1つにおいてインキュベートした。一日おきに培地の半分を各新鮮な培地で置き換えた。
Cultispher G(Percell Biolytica)マイクロキャリアーに、Tau−GFP融合タンパク質を発現するマウスES細胞を蒔き、無血清培地(ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1400U/ml LiFを補足したGlutamax(Gibco)を含むイスコブの修飾DMEMである15%Gibco KO血清代替物)中で4週間増殖させた。培地中の色インジケーターによって示したように、pHが酸性になると培地を変化させた。ビーズのアリコットを取り出し、PBSで洗浄した後、4℃PBS中の4%パラホルムアルデヒドで20分間固定した。ビーズをPBSで数回洗浄し、PBS/2.5%FCS、0.1%トリトンX−100に再懸濁させ、2つの試料に分割した。1つの試料をネズミ−抗グリア繊維酸性タンパク質(GFAP)モノクローナル抗体で1:200とし、他は対照として残した。4℃における一晩のインキュベーションの後、試料をPBSで3回洗浄し、次いで、双方を室温にてCy3−標識ロバ抗マウス抗体(Jackson Immuno Research)と共に2時間インキュベートした。試料をPBSで3回洗浄し、次いで、DAPI(Vector)を含有する設置培地で顕微鏡スライドにスポットした。マイクロキャリアー上の細胞の大部分はGFAPについての特異的染色を呈した(図8A〜H参照)。
分割−分割培養によって分割するように誘導されたマウスES細胞の細胞ユニット(実施例4参照)をPBSで洗浄し、製造業者の指示(Qiagen)に従ってRneasy試薬を用いて細胞ユニットからRNAを調製した。次いで、製造業者の指示(Invitrogen)に従って、逆転写酵素を用いて、オリゴ−dTプライミングにて第一ストランドcDNAを調製した。試料の濃度を正規化するために、各cDNA試料について10倍希釈系列を作成し、「ハウスキーピング」遺伝子用のオリゴヌクレオチドプライマー、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼを用いる25、30および35ラウンドのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に供した。1.5%アガロースゲルで分離した得られた産物の臭化エチジウム染色を用いて、各試料中のcDNAの相対量を見積もった。次いで、各試料からの当量のcDNAを、(未分化ES細胞で起こることが予測される)Oct4;(分化したニューロン子孫で起こることが予測される)ネスチン;または(分化した内胚葉子孫で起こることが予測される)HNF3βのためのDNAプライマーでのPCR反応で用いた。プライマーの配列は以下の通りであった。
ガラスに入れたID100−Aトランスポンダ(Trovan)を1N塩酸で2時間処理し、脱イオン水で十分に洗浄し、次いで、ガラス容器中でアミノプロピルポリエトキシシラン(Sigma)と共に2時間インキュベートした。シラン試薬をデカントし、タグを順次水、70%エタノール、滅菌脱イオン水、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。タグを、個々に、非接着性細菌プラスチックマルチウェルプレートのウェルに入れた(Sterilin)。ゼラチン被覆プレート上でLIF(Chemicon)を含むES細胞培地で維持されたTau−GFP融合トランスジーンを発現するES細胞の多能性系をトリプシン処理によって単細胞懸濁液に解離した。細胞をES細胞培地で一回洗浄し、106細胞/mlにてES培地に再懸濁し、250μLの懸濁液を各タグにスポットした。標準培養条件(37℃、5%CO2)下での1時間のインキュベーションの後に1.5mlのさらなるES培地を添加し、プレートをインキュベーターに戻した。
Cytodex3マイクロキャリアー(Amersham Biosciences)は変性コラーゲン(ゼラチン)の表面層と共にデキストランから構成される。Cytodex3ビーズ(PBS中での水和の後50μl沈降用量)を、合計用量200μl中の2.5%胎児ウシ血清を含むPBS中の1:50の希釈にて、ビオチンにコンジュゲートした抗コラーゲン抗体(Abcam,Cambridge,UK)と共に室温にて90分間インキュベートした。次いで、ビーズを、再懸濁、次いで、重力沈降によって、大過剰のPBS中で3回洗浄した。対照試料を同一法であるが、抗コラーゲン抗体を添加することなく処理した。対照および処理した試料を各々二つに分割し、各々の1つの試料を250μl用量のPBS/FCS中の2.5μg/mlの濃度にて、ストレプトアビジン−FITCコンジュゲートと共に室温にて30分間インキュベートした。2つの試料を同一条件下ではあるがストレプトアビジン−FITCなしでインキュベートした。ビオチン化抗コラーゲン抗体、続いて、ストレプトアビジン−FITCコンジュゲートで予備処理したビーズは、より高いレベルの蛍光を示した(図12参照)。ビオチン化抗体でのマイクロキャリアービーズのコーティングは、今度は、容易に脱着可能なストレプトアビジンコンジュゲートに結合することができるビオチン部位を提供する手段である。ストレプトアビジンは非常に多数の分子および高分子体にコンジュゲートすることができるので、従って、それが大きな範囲のタグに高い親和性で結合できるようにマイクロキャリアービーズを誘導体化することができる。
Cytodex3マイクロキャリアー(Amersham)を、Tau−GFPトランスジーンを発現するES細胞でシードした。1日後、マイクロキャリアーをPBSで洗浄し、次いで、ストレプトアビジン(Sigma)に共有結合した赤色1μm直径ラテックスビーズの懸濁液と共に室温にて30分間インキュベートし;標準条件下で直ちに、または培養から24時間後に分析した。分析は再懸濁による大過剰のPBS中での3回の洗浄、次いで、重力による沈降を含み、試料は、FITCおよびテキサスレッド/ローダミンの検出用の標準フィルファー組を用いてエピ蛍光下で観察した。ES細胞(緑色)を含み、ラテックスビーズタグ(赤色)とのコロイド相互作用によって標識された細胞ユニットは各場合に明らかであった(図13参照)。
Tau−GFP融合タンパク質を発現するマウスES細胞およびCytodex3マイクロキャリアーを含む細胞ユニットを裸のcytoex3マイクロキャリアーと1:100の比率で混合した。相および蛍光設定を用い、混合物を顕微鏡下で観察した。GFPを発現する細胞ユニットが、大過剰の非蛍光キャリアーにおいてさえ、蛍光顕微鏡を用いる場合に容易に明らかであった(図16参照)。個々の細胞ユニットは、小容量の細胞ユニットを含有する培養を吸引するための所定の位置に設けられたピペットを用いて、手動で分類することができた。
自動または高スループット様式にて、種々のタグで標識される細胞ユニットを分析し、分類し、または特定の細胞プロセスを表示することができるのが望ましい。多細胞生物おおびビーズを0.5mmまでの直径にて分類することができるCOPAS Select機器(Union Biometrica Inc.,Somerville,MA)を用いて、細胞ユニット、マイクロキャリアーおよび標識されたマイクロキャリアーを分析した。Cytodex3(Amersham Biosciences)をそのサイズおよび光学特徴に従った機器(Time of Flight,TOF;Extinction,Ext)によって分析し、サイズのわずかな変化を呈したが、利用した設定下で有意な自動蛍光は呈しなかった(図17A/B参照)。赤色ストレプトアビジン−コンジュゲーテッドラテックスビーズ(Sigma)でのCytodex3マイクロキャリアーの標識(実施例9参照)は、赤色蛍光において検出可能なシフトに導いた(図17C/D)。
Cultispher G(Percell Biolytica)マイクロキャリアーをビオチン部位に架橋させ(実施例8参照)、ビオチン化は、蛍光顕微鏡を用いてストレプトアビジン−FITCでの染色レベルを比較することによって確認した(図18A〜D)。
正確なサイズおよび蛍光特徴の広く種々のラテックスビーズの入手可能性は、マイクロキャリアーの多重標識を可能とする。ビオチン化Cultispher Gマイクロキャリアー(実施例12参照)は、サイズ、蛍光発光スペクトルおよび蛍光強度が異なる3つの異なるタイプのストレプトアビジン−被覆ビーズタグを含有する培地中での系列的なインキュベーションによって標識した。タグとして用いたビーズタイプは、1)Sigmaによって製造された1μmの緑色ラテックスビーズ;2)Bangs Laboratoriesによって製造された1連の5.5μm赤色−蛍光ラテックスビーズ(QuantumPlex)におけるビーズ組no.1;および3)Bangs Laboratoriesによって製造された一連の4.4μm赤色−蛍光ラテックスビーズにおけるビーズ組5ビーズであった。
Claims (45)
- (a)各々が1以上の細胞を含む細胞ユニットの群の第一の組を提供し、前記群を所望の培養条件に暴露するステップと、
(b)前記群の1以上をサブ分割して、細胞ユニットの群のさらなる組を作るステップと、
(c)前記さらなる群をさらなる所望の培養条件に暴露するステップと、
(d)任意選択により、必要に応じて、ステップ(b)〜(c)を繰り返し反復するステップと、
(e)細胞ユニットが暴露された培養条件に関する所与の細胞ユニットに対する効果を評価するステップと
を含む、細胞に対する複数の培養条件の効果を決定する方法。 - (a)各々が1以上の細胞を含む細胞ユニットの群の第一の組を提供し、前記群を所望の培養条件に暴露するステップと、
(b)2以上の前記群をプールして、少なくとも1つの第二のプールを形成するステップと、
(c)第二のプールをサブ分割して、細胞ユニットの群のさらなる組を作るステップと、
(d)前記さらなる群を所望の培養条件に暴露するステップと、
(e)任意選択により、必要に応じて、ステップ(b)〜(d)を繰り返し反復するステップと、
(f)細胞ユニットが暴露された培養条件に関する所与の細胞ユニットに対する効果を評価するステップと
を含む、細胞に対する複数の培養条件の効果の決定方法。 - (a)各々が1以上の細胞を含む細胞ユニットの群の最初の組を提供し、前記群を所望の培養条件に暴露するステップと、
(b)前記群の2以上をプールして、少なくとも1つの第二のプールを形成するステップと、
(c)第二のプールをサブ分割して、細胞ユニットの群のさらなる組を作るステップと、
(d)前記さらなる群を所望の培養条件に暴露するステップと、
(e)任意選択により、必要に応じて、ステップ(b)〜(d)を繰り返し反復するステップと
を含む、細胞を種々の細胞培養条件に暴露する方法。 - (a)各々が1以上の細胞を含む細胞ユニットの群の第一の組を提供し、前記群を所望の培養条件に暴露するステップと、
(b)前記群の2以上をプールして、少なくとも1つの第二のプールを形成するステップと、
(c)第二のプールをサブ分割して、細胞ユニットの群のさらなる組を作るステップと、
(d)前記さらなる群を所望の培養条件に暴露するステップと、
(e)任意選択により、必要に応じて、ステップ(b)〜(d)を繰り返し反復するステップと、
(f)それに対して暴露された培養条件の所与の細胞ユニットに対する効果を評価するステップと
を含む、細胞に対する複数の培養条件の効果を決定する方法。 - 細胞ユニットを標識し、前記1又は複数の標識が、細胞ユニットが暴露された培養条件を反映する請求項1〜4に記載の方法。
- 前記標識が空間的にエンコードされている請求項5に記載の方法。
- 前記標識が、オリゴヌクレオチド、ペプチド、蛍光化合物、第二級アミン、ハロカーボン、安定な同位体の混合物、バーコード、光学タグ、ビーズ、および放射線周波数暗号化タグからなる群より選択される請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が細胞ユニットにて培養され、各々の細胞ユニットが1以上の細胞を含む前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 細胞ユニットが単一の細胞である請求項8に記載の方法。
- 各細胞ユニットが固体基材に接着しているか、または固体基材に結合している1以上の細胞を含む請求項8に記載の方法。
- 前記固体基材がマイクロキャリアーまたはビーズである請求項10に記載の方法。
- 前記固体基材がウェルまたは培地浸透性バリアーである請求項10に記載の方法。
- 培養条件が、細胞が暴露される培地である請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 前記培地が、細胞プロセスに影響する1以上の特異的な薬剤を含有する請求項13に記載の方法。
- 細胞培養条件が、1以上の特異的な温度で培養することを含む請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
- 細胞培養条件が、1以上の特異的な基材上で培養することを含む請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- a)請求項1〜16のいずれか一項により細胞ユニットに対する1以上の培養条件の効果を決定するステップと、
b)前記培養条件に暴露された場合に前記細胞ユニットにおける遺伝子発現を分析するステップと、
c)所望の培養条件下で差異的に発現される遺伝子を同定するステップと
を含む、細胞プロセスに影響する遺伝子を同定する方法。 - 所望の培養条件が細胞プロセスに影響する請求項17に記載の方法。
- 請求項17または請求項18に従って遺伝子を同定するステップと、核酸合成または生物学的複製によって前記遺伝子の少なくともコード領域を生じさせるステップとを含む、細胞プロセスに影響する遺伝子産物をコードする核酸の製造方法。
- a)請求項17または請求項18に従って細胞プロセスに関連して差異的に発現される1以上の遺伝子を同定するステップと、
b)細胞における前記1以上の遺伝子の発現を調整するステップと
を含む、細胞プロセスを誘導する方法。 - 細胞における遺伝子発現の調整が、前記1以上の遺伝子の細胞へのトランスフェクションを含む請求項20に記載の方法。
- 遺伝子発現の調整が、遺伝子産物の外因性投与を含む請求項20に記載の方法。
- a)請求項17または請求項18に従って細胞プロセスに関連して差異的に発現される1以上の遺伝子を同定するステップと、
b)細胞における前記1以上の遺伝子の発現の調整を検出し、それにより、前記細胞の細胞プロセスの状態を決定するステップと
を含む、細胞の細胞プロセスの状態を同定する方法。 - 前記1以上の遺伝子がマーカーをコードする請求項23に記載の方法。
- 前記マーカーがイムノアッセイによって検出することができる請求項24に記載の方法。
- a)請求項1〜16のいずれか一項に従って、細胞ユニットに対する1以上の培養条件の効果を決定するステップと、
b)細胞プロセスを誘導する培養条件に細胞を暴露するステップと、
c)所望の細胞を単離するステップと
を含む、細胞プロセスを誘導する方法。 - a)請求項1〜16のいずれか一項により、細胞ユニットに対する1以上の薬剤の効果を決定するステップと、
b)細胞ユニットにおいて細胞プロセスを誘導する薬剤を同定するステップと
を含む、細胞プロセスを誘導することができる薬剤を同定する方法。 - a)請求項1〜16のいずれか一項に従って、細胞ユニットに対する1以上の薬剤の効果を決定するステップと、
b)細胞ユニットにおいて所望の細胞プロセスを誘導する薬剤を同定するステップと、
c)前記薬剤を合成するか、あるいは単離するステップと
を含む、細胞プロセスを誘導することができる薬剤を調製する方法。 - 細胞プロセスが細胞増殖または分化である請求項17、18、19、20、23、26、27または28のいずれかに記載の方法。
- a)異なる条件下で増殖した細胞の1以上の培養を組合せるステップと、
b)前記細胞を培養するステップと
を含む、インビトロにて幹細胞、または幹細胞から誘導された細胞を培養する方法。 - a)幹細胞培養をインキュベートするステップと、
b)前記培養を幹細胞の2以上の群に分割し、培養条件の2以上の異なる組下で幹細胞の前記群を培養するステップと
を含む、インビトロにて幹細胞または幹細胞に由来する細胞を培養する方法。 - 前記細胞を細胞ユニットで培養し、各細胞ユニットが1以上の細胞を含む請求項30または請求項31に記載の方法。
- 前記細胞ユニットが単一の細胞である請求項30または請求項31に記載の方法。
- 各細胞ユニットが、固体基材に接着した、または固定基材に結合した1以上の細胞を含む請求項30または請求項31に記載の方法。
- 前記固体基材がマイクロキャリアーまたはビーズである請求項34に記載の方法。
- 前記固体基材がウェルまたは培地浸透性バリアーである請求項34に記載の方法。
- マイクロキャリアーまたはビーズに接着した前記幹細胞を増殖させることを含む幹細胞を培養する方法。
- 前記幹細胞が、培養条件の少なくとも1つの変化に供される請求項37に記載の方法。
- 培養条件の前記変化が培地の変化を含む請求項38に記載の方法。
- 前記プロセスが、少なくとも50g(乾燥重量)のマイクロキャリアーが使用されるようにスケールアップされる請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
- (a)培養基においてマイクロキャリアーに接着された幹細胞を増殖させるステップと、
(b)マイクロキャリアーを1つの培養基からもう1つの培養基に移動させるステップと、
(c)所望により、必要であれば、ステップ(b)を反復するステップと、
(d)マイクロキャリアーに付着した分化した細胞を得るステップと
を含む、インビトロにおいて幹細胞から分化した細胞を得る方法。 - 前記プロセスが、少なくとも50g(乾燥重量)のマイクロキャリアーが使用されるようにスケールアップされる前記請求項に記載の方法。
- 分化した細胞がマイクロキャリアーからの酵素脱着によって単離される請求項38または39に記載の方法。
- 分化した細胞がマイクロキャリアーの消化によって単離される請求項38または39に記載の方法。
- (a)マイクロキャリアーに前記細胞を播種するステップと、
(b)キャリアーに接着させつつ細胞を繁殖するステップと
を含む、インビトロにて多能性幹細胞を増殖させる方法。
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