CN112725269B - 一种无血清培养基的添加剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，具体的，本发明涉及一种无血清培养基的添加剂及其制备方法和应用。本发明的无血清培养基的添加剂，通过三种组分的协同配比，可以取代血清、血小板裂解液等动物源成分，添加剂的成分明确、不同批次之间重复性好、临床安全性高，满足脂肪、骨髓、脐带、脐血、胎盘等不同来源的间充质干细胞体外培养的需求。进一步地，本发明的无血清培养基的添加剂为冻干粉剂，能够长期保存、稳定性高，各组分的活性不易丧失，适于长期保藏、运输。

Description

一种无血清培养基的添加剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体的，本发明涉及一种无血清培养基的添加剂及其制备方法和应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)广泛存在于成体骨髓、脂肪、牙髓及围产期脐血、脐带、胎盘等多种人体组织器官中，是具有高度自我更新能力、多向分化潜能、良好的体外扩增能力以及免疫调节功能的成体干细胞。近年来在外科烧伤、软组织填充、终末期肝病、心肌梗死、糖尿病等疾病的治疗中展现出良好的安全性和有效性。
间充质干细胞来源于中胚层，最早发现于骨髓，还可从脂肪、脐血、胎盘、脐带、羊水、牙体等组织中分离出来。其中，来源于胎盘、脐带的间充质干细胞在采集过程不会对人体造成损伤，不存在伦理问题，并且获取到的干细胞数量大。来源于脂肪组织的脂肪间充质干细胞(adipos-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)组织来源丰富，含量丰富，ADSCs具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。间充质干细胞来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，并且表面抗原不明显，异体移植排异较轻，配型要求不严格。正是由于拥有这些特性，使得间充质干细胞能够提供一种理想的生物学平台。
在生物医学工程领域的研究中，大量种子细胞的获取往往需要通过干细胞的体外培养和收获来实现。传统用于培养间充质干细胞的培养基是一种含有动物源成分的液体培养基，常用的是以人血清和血小板裂解液(PL)为基础的支持干细胞体外扩增，传代培养。然而，血清的组分复杂、存在较多不确定成分，各批次之间的质量差别较大，难以保证间充质干细胞的标准化培养；人工PL同样存在成分不明确，各批次之间质量差异大的问题，影响体外培养间充质干细胞的表型和功能，不利于间充质干细胞的标准化培养。
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的问题，例如，以血清或血小板裂解液(PL)为基础的间充质干细胞培养基存在成分不明确，不同批次之间质量差异大，影响间充质干细胞标准化培养的缺陷。为此，本发明提供了一种无血清培养基的添加剂，添加剂中三种组分协同配比，可代替血清、血小板裂解液等成分，添加于基础培养基中可实现对间充质干细胞的高效培养，并具有来源明确、批次间差异小的优势。
用于解决问题的方案
本发明提供了一种无血清培养基的添加剂，其中，所述添加剂包括含有基础代谢类物质的第一组分、含有细胞因子类物质的第二组分，以及含有氧化还原类物质的第三组分；
以所述添加剂的总质量为100％计，所述第一组分为6％-22％，所述第二组分为35％-47％，所述第三组分为43％-47％。
在一些实施方式中，本发明所述的无血清培养基的添加剂，其中，所述添加剂为浓缩液或所述浓缩液的冻干粉剂。
在一些实施方式中，本发明所述的无血清培养基的添加剂，其中，所述第一组分包括维生素、
脂类、L-谷氨酰胺、L-抗坏血酸-2-磷酸、β-巯基乙醇、地塞米松和氢化可的松中的一种或两种以上的组合；
优选地，所述第一组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：所述维生素的浓度为8.3-95mg/L，所述脂类的浓度为18.4-95mg/L，所述L-谷氨酰胺的浓度为100-300mg/L，所述L-抗坏血酸-2-磷酸的浓度为10-100mg/L，所述β-巯基乙醇的浓度为1-10mg/L，所述地塞米松的浓度为1-5ng/ml，所述氢化可的松的浓度为1-5ng/ml。
在一些实施方式中，本发明所述的无血清培养基的添加剂，其中，所述第二组分包括bFGF、EGF、PDGF-BB、TTR、IGF、VEGF、LIF、HGF、CTGF、β细胞素、IL-8、重组人纤连蛋白和人血清白蛋白中的一种或两种以上的组合；
优选地，所述第二组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：所述bFGF的浓度为1-20ng/ml，所述EGF的浓度为1-20ng/ml，所述PDGF-BB的浓度为1-20ng/ml，所述TTR的浓度为1-20ng/ml，所述IGF的浓度为1-20ng/ml，所述VEGF的浓度为1-20ng/ml，所述LIF的浓度为1-20ng/ml，所述HGF的浓度为1-20ng/ml，所述CTGF的浓度为1-20ng/ml，所述β细胞素的浓度为1-10ng/ml，所述IL-8的浓度为1-5ng/ml，所述重组人纤连蛋白的浓度为1-20μg/ml，所述人血清白蛋白的浓度为1-4mg/ml。
在一些实施方式中，本发明所述的无血清培养基的添加剂，其中，所述第三组分包括左旋肉碱、乙醇胺、半乳糖、腐胺、亚硒酸钠、皮质酮、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、黄体酮、生育酚、生育酚乙酸酯、谷胱甘肽、胰岛素、超氧化物酶、转铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸和过氧化氢酶中的一种或两种以上的组合；
优选地，所述第三组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：所述左旋肉碱的浓度为0.4-10μg/ml，所述乙醇胺的浓度为0.2-5μg/ml，所述半乳糖的浓度为3-45μg/ml，所述腐胺的浓度为3-50μg/ml，所述亚硒酸钠的浓度为0.003-0.07μg/ml，所述皮质酮的浓度为0.004-0.1μg/ml，所述亚油酸的浓度为0.2-5μg/ml，所述亚麻酸的浓度为0.2-5μg/ml，所述硫辛酸的浓度为0.009-0.24μg/ml，所述黄体酮的浓度为0.001-0.03μg/ml，所述生育酚的浓度为0.02-0.5μg/ml，所述生育酚乙酸酯的浓度为0.02-0.5μg/ml，所述谷胱甘肽的浓度为0.2-5μg/ml，所述胰岛素的浓度为0.8-20μg/ml，所述超氧化物酶的浓度为0.5-12.5μg/ml，所述转铁蛋白的浓度为1-25μg/ml，所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为0.0004-0.01μg/ml，所述过氧化氢酶的浓度为0.5-12.5μg/ml。
本发明还提供了一种根据本发明所述的无血清培养基的添加剂的制备方法，其包括将所述添加剂的各组分溶解后混合的步骤。
在一些实施方式中，本发明所述的制备方法，其中，还包括将混合的溶解液冻干的步骤。
在一些实施方式中，本发明所述的制备方法，其中，包括如下步骤：
将所述第一组分、第二组分和第三组分的溶解液混合后过滤，得到混合的溶解液；
所述混合的溶解液经预冻、升华和干燥处理，得到冻干粉剂的添加剂；
优选地，所述预冻处理的温度为-35～-45℃，处理时间为3～5小时；
所述升华处理的真空度为10pa以下，处理温度为19～25℃，处理时间为24小时；
所述干燥处理的温度为7～9℃，处理时间为3～5小时。
本发明还提供了一种根据本发明所述的无血清培养基的添加剂在间充质干细胞的无血清培养基中的应用。
在一些实施方式中，本发明所述的应用，其中，所述间充质干细胞的无血清培养包括基础培养基和所述无血清培养基的添加剂；可选地，所述基础培养基为DMEM，DMEM/F-12，IMDM和α-MEM中的至少一种。
发明的效果
在一些实施方式中，本发明的无血清培养基的添加剂，通过三种组分的协同配比，可以取代血清、血小板裂解液等动物源成分，添加剂的成分明确、不同批次之间重复性好、临床安全性高，满足脂肪、骨髓、脐带、脐血、胎盘等不同来源的间充质干细胞体外培养的需求。
在一些实施方式中，本发明的无血清培养基的添加剂为冻干粉剂，能够长期保存、稳定性高，各组分的活性不易丧失，适于长期保藏、运输。
在一些实施方式中，本发明的无血清培养基的添加剂的制备方法，可有效减少各组分在制备过程中聚集成团的现象，保持组分活性，进而改善间充质干细胞在应用添加剂的无血清培养基中的生长情况。
附图说明
图1显示12孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养48小时后的细胞形态观察结果；
图2显示12孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养72小时后的细胞形态观察结果；
图3显示12孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养24小时后的细胞形态观察结果；
图4显示6孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养24小时后的细胞形态观察结果；
图5显示6孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养48小时后的细胞形态观察结果；
图6显示6孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养72小时后的细胞形态观察结果；
图7显示实施例2(7A)和实施例3(7B)中无血清培养基对脂肪干细胞的阳性指标CD73的检测结果；
图8显示实施例2(8A)和实施例3(8B)中无血清培养基对脂肪干细胞的阳性指标CD90的检测结果；
图9显示实施例2(9A)和实施例3(9B)中无血清培养基对脂肪干细胞的阳性指标CD105的检测结果；
图10显示实施例2(10A)和实施例3(10B)中无血清培养基对脂肪干细胞的阴性指标CD14的检测结果；
图11显示实施例2(11A)和实施例3(11B)中无血清培养基对脂肪干细胞的阴性指标CD19的检测结果；
图12显示实施例2(12A)和实施例3(12B)中无血清培养基对脂肪干细胞的阴性指标CD34的检测结果；
图13显示实施例2(13A)和实施例3(13B)中无血清培养基对脂肪干细胞的阴性指标CD45的检测结果；
图14显示12孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养24小时后在4倍镜(4X)和10倍镜(10X)下的细胞形态观察结果；
图15显示12孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养48小时后在4倍镜(4X)和10倍镜(10X)下的细胞形态观察结果；
图16显示72孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养72小时后在4倍镜(4X)和10倍镜(10X)下的细胞形态观察结果；
图17显示6孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养24小时后在4倍镜(4X)和10倍镜(10X)下的细胞形态观察结果；
图18显示6孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养48小时后在4倍镜(4X)和10倍镜(10X)下的细胞形态观察结果；
图19显示6孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养72小时后在4倍镜(4X)和10倍镜(10X)下的细胞形态观察结果；
图20显示实验组和对照组中无血清培养基对脂肪干细胞的阳性指标CD73的检测结果；
图21显示实验组和对照组中无血清培养基对脂肪干细胞的阳性指标CD90的检测结果；
图22显示实验组和对照组中无血清培养基对脂肪干细胞的阳性指标CD105的检测结果；
图23显示实验组和对照组中无血清培养基对脂肪干细胞的阴性指标CD14的检测结果；
图24显示实验组和对照组中无血清培养基对脂肪干细胞的阴性指标CD19的检测结果；
图25显示实验组和对照组中无血清培养基对脂肪干细胞的阴性指标CD34的检测结果；
图26显示实验组和对照组中无血清培养基对脂肪干细胞的阴性指标CD45的检测结果。
具体实施方式
以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
如无特殊声明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。
本说明书中，如没有特别说明，则“％”均表示质量百分含量。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，所述“常温”、“室温”，其温度可以是10-40℃。
另外，本说明书中，所述“水”包含去离子水、蒸馏水、离子交换水、双蒸水、高纯水、纯净水等本领域能够使用的任何可行的水。
第一方面
本发明的第一方面提供了一种无血清培养基的添加剂，包括：
含有基础代谢类物质的第一组分、含有细胞因子类物质的第二组分，以及含有氧化还原类物质的第三组分；
以所述添加剂的总质量为100％计，所述第一组分为6％-22％，所述第二组分为35％-47％，所述第三组分为43％-47％。
本发明的无血清培养基的添加剂，其中的第一组分可以提供间充质干细胞代谢所需物质，提高细胞代谢活性；第二组分提供细胞增殖、生长所需要的各类因子，促进细胞增殖；第三组分能够为间充质干细胞提供维持其细胞形态、生物学特性所需的氧化还原体系，防止细胞变形以及干细胞特性的丧失。无血清培养基的添加剂通过三种成分的协同作用，可代替血清、血小板裂解液等动物源成分。添加剂的成分明确、不同批次之间重复性好、临床安全性高，满足脂肪、骨髓、脐带、脐血、胎盘等不同来源的间充质干细胞体外培养的需求。
进一步的，本发明的无血清培养基的添加剂为包含上述组分的浓缩液，或者是所述浓缩液的冻干粉剂，浓缩液或冻干粉剂的添加剂具适合加入基础培养基中，代替间充质干细胞的培养基中的人血清、人血小板裂解液等成分。
在一些优选的实施方案中，无血清培养基的添加剂为冻干粉剂。本发明在实验中发现，现有的无血清培养基中在储存和运输中存在稳定性不高的问题，其中的谷氨酰胺、脂肪酸酯等活性成分易失活，各类蛋白成分在2-8℃的温度下也无法长期存储。针对上述问题，本发明将浓缩液型的添加剂冻干为冻干粉剂，其稳定性大大提高，各组分活性不易丧失，适合长期的贮存、运输；且冻干粉剂具有良好的可复溶性，在添加于基础培养基后，各组分仍具有高的物质活性。
在一些具体的实施方式中，所述无血清培养基中，无血清培养基添加剂的浓度为2588.5mg/L。
第一组分
第一组分包含基础代谢类物质，提供间充质干细胞生长、代谢所需的能量来源。具体的，以所述添加剂的总质量为100％计，所述第一组分的含量为6％-22％，优选为6.4％-20.9％。示例性的，第一组分的含量为6％、6.4％、9％、12％、15％、18％、20.9％、21％、22％。所述无血清培养基中，第一组分的含量为6％-22％时，有利于提高间充质干细胞的代谢活性，促进其增殖能力和活性的维持。
在一些具体的实施方案中，第一组分包括维生素、脂类、L-谷氨酰胺、L-抗坏血酸-2-磷酸、β-巯基乙醇、地塞米松和氢化可的松中的一种或两种以上的组合。作为优选，第一组分包括上述所有组分，各组分协同配合，提供细胞生长、代谢的必要养分。
在本发明中，维生素作细胞培养基的生长补充剂，以增加间充质干细胞的生长和活力。第一组分中的维生素可以是由维生素B12、维生素E、维生素C等不同种类的维生素配制得到，也可以是市售的混合维生素成分。脂类为细胞的生长和繁殖提供所需营养物质，有利于提高细胞生长密度，显著改善细胞性能。第一组分中的脂类可以是由胆固醇、棕榈酸、花生四稀酸等不同种类的脂类成分配制得到，也可以是市售的混合脂类成分。L-谷氨酰胺可提高细胞内环境的稳定性，改善间充质干细胞的活性和生长。L-抗坏血酸-2-磷酸是一种高稳定性的维生素C衍生物，具有强抗氧化性，具有抗凋亡的作用并参与干细胞的生长增殖等。β-巯基乙醇兼具乙二醇(HOCH2CH2OH)和乙二硫醇(HSCH2CH2SH)的官能团，可用于二硫键的还原，从而使蛋白质不被氧化掉而失活。地塞米松、氢化可的松属于糖皮质激素，参与间充质干细胞的糖类、脂类等成分的代谢，并参与干细胞免疫抑制。
具体的，所述第一组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：所述维生素的浓度为8.3-95mg/L，优选为93.1mg/L；所述脂类的浓度为18.4-95mg/L，优选为92.6mg/L；所述L-谷氨酰胺的浓度为100-300mg/L，优选为292mg/L；所述L-抗坏血酸-2-磷酸的浓度为10-100mg/L，优选为50mg/L；所述β-巯基乙醇的浓度为1-10mg/L，优选为4.3mg/L；所述地塞米松的浓度为1-5ng/ml，优选为4ng/ml，所述氢化可的松的浓度为1-5ng/ml，优选为3.62ng/ml。当第一组分包含物质的所需含量在上述范围内时，能满足细胞的基本生长，当其缺乏时，细胞的生长发育受阻。
在一些具体的实施方式中，第一组分包含的维生素、脂类、L-谷氨酰胺、L-抗坏血酸-2-磷酸、β-巯基乙醇、地塞米松和氢化可的松的物质的浓度分别为93.1mg/L、92.6mg/L、292mg/L、50mg/L、4.3mg/L、4ng/ml、3.62ng/ml。
第二组分
第二组分包括经筛选得到的各类细胞因子、生长素、白细胞介素、重组人纤连蛋白、人血清白蛋白等蛋白成分，能够促进间充质干细胞增殖。具体的，以所述添加剂的总质量为100％计，所述第二组分的含量为35％-47％，优选为35.4％-46.7％。示例性的，第二组分的含量为35％、35.4％、38％、41％、44％、46.7％、47％。当第二组分含量为35％-47％时，能够使间充质干细胞保持高的生长速度，提高细胞培养效率，并保持间充质干细胞的分化潜能。
在一些具体的实施方案中，第二组分包括bFGF、EGF、PDGF-BB、TTR、IGF、VEGF、LIF、HGF、CTGF、β细胞素、IL-8、重组人纤连蛋白和人血清白蛋白中的一种或两种以上的组合。作为优选，第二组分为bFGF、TTR、IGF、VEGF、LIF、HGF、CTGF、β细胞素、IL-8、重组人纤连蛋白和人血清白蛋白的组合，上述组分协同配合，提供细胞增殖所需营养。
在本发明中，bFGF(basic fibroblast growth factor，bFGF)为碱性成纤维细胞生长因子，是传递发育信号，能促进中胚层和神经外胚层细胞分裂的多肽，能够促进细胞的增殖、迁移。EGF为表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor)，可促进细胞分裂。PDGF-BB(Platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)为血小板衍生生长因子-BB，是低分子量促细胞分裂素，能够促进多种细胞进入分裂增殖周期。TTR为转甲状腺素蛋白，对于影响干细胞增殖和分化功能的维生素A活性的发挥有重要作用。IGF(insulin like growthfactor，IGF)是一组具有促生长作用的多肽类物质。VEGF(vascular endothelial growthfactor，VEGF)是血管内皮生长因子，具有诱导细胞存活、增殖、迁移等功能。LIF(LeukemiaInhibitory Factor)为白血病抑制因子，可维持间充质干细胞的未分化状态。HGF为肝细胞生长因子，可调节多种细胞生长、运动和形态发生。CTGF为结缔组织生长因子，是一种由349个氨基酸组成，分子量为34～38KD的富含半胱氨酸的分泌肽，具有促细胞增殖、迁移及分化等作用。β细胞素也即Betacellulin，是表皮生长因子家族的一员，可调节细胞的生长、增殖，抑制干细胞分化以维持干细胞的分化潜能。IL-8(Interleukin-8，IL-8)为白细胞介素-8，是趋化因子家族的一种细胞因子，能够诱导细胞增殖。
进一步的，所述第二组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：所述bFGF的浓度为1-20ng/ml，所述EGF的浓度为1-20ng/ml，所述PDGF-BB的浓度为1-20ng/ml，所述TTR的浓度为1-20ng/ml，所述IGF的浓度为1-20ng/ml，所述VEGF的浓度为1-20ng/ml，所述LIF的浓度为1-20ng/ml，所述HGF的浓度为1-20ng/ml，所述CTGF的浓度为1-20ng/ml，所述β细胞素的浓度为1-10ng/ml，所述IL-8的浓度为1-5ng/ml，所述重组人纤连蛋白的浓度为1-20μg/ml，所述人血清白蛋白的浓度为1-4mg/ml。当第二组分包含物质的含量在上述范围内时，干细胞能够保持高的生长活性，当其缺乏时，干细胞形态不正常并增殖缓慢甚至不增殖。
在本发明中，重组人纤连蛋白(Fn)是一类高活性蛋白，是细胞黏连的机体结构得以维持、细胞生长完成的必要条件，重组人纤连蛋白可以促进细胞的黏连生长，使多种细胞的贴壁率显著提高，细胞形态结构良好，细胞的代谢率增强，遗传物质(DNA、RNA)等合成速度变快，细胞的集落率升高，原代培养的成活率明显提高，细胞生长时间缩短。具体的，重组人纤连蛋白在无血清培养基中的浓度为1-20μg/ml，例如，重组人纤连蛋白的浓度为1μg/ml、5μg/ml、7μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、15μg/ml、18μg/ml、20μg/ml等等。当重组人纤连蛋白的含量在上述范围内时，干细胞易于快速贴壁生长。
在本发明中，人血清白蛋白(HSA)是细胞生长代谢的重要营养物质，人血清白蛋白分解产生的氨基酸可用于细胞合成组织蛋白，氧化分解以供应能量或转变成其他含氮物质。此外，人血清白蛋白可以提供合适的培养基渗透压，满足细胞生长的渗透压平衡，避免细胞遭受机械损伤，还与培养基中许多难溶性的小分子有机物和无机离子可逆地结合形成易溶性复合物，成为这些物质在培养基中的存在方式。具体的，人血清白蛋白在无血清培养基中的浓度为1～4mg/ml，例如，人血清白蛋白的浓度为1mg/ml、1.5mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml、2.2mg/ml、2.5mg/ml、2.8mg/ml、3mg/ml、3.2mg/ml、3.4mg/ml、3.6mg/ml、3.8mg/ml等等。当人血清白蛋白的含量在上述范围内时，维持干细胞生长环境体系的稳定。
在一些具体的实施方式中，第二组份包含的bFGF、EGF、PDGF-BB、TTR、IGF、VEGF、LIF、HGF、CTGF、β细胞素、IL-8、重组人纤连蛋白和人血清白蛋白的物质的浓度分别为10ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、5μg/ml、2mg/ml。
第三组分
第三组分包含氧化还原类物质以及其他类物质，形成干细胞培养体系的微环境，此微环境能够提供间充质干细胞所需的氧化还原体系，维持间充质干细胞的三维立体形态，防止细胞发生形变，保持其自我更新和多项分化的干细胞特性，维持细胞生理代谢。具体的，以所述添加剂的总质量为100％计，所述第三组分的含量为43％-47％，优选为43.7％-46.9％。示例性的，第三组分的含量为43％、43.7％、44％、45％、46.9％、47％等等。当第三组分的含量为43％-47％时，能够维持使间充质干细胞的细胞形态，保持其干细胞特性。
在一些具体的实施方案中，第三组分包括左旋肉碱、乙醇胺、半乳糖、腐胺、亚硒酸钠、皮质酮、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、黄体酮、生育酚、生育酚乙酸酯、谷胱甘肽、胰岛素、超氧化物酶、转铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸和过氧化氢酶中的一种或两种以上的组合。作为优选，第三组分包括上述全部组分，通过各组分的协同作用，提供维持间充质干细胞形态所需的干细胞微环境体系。
在本发明中，左旋肉碱可促进脂肪和脂肪酸类代谢。乙醇胺和腐胺可延长细胞的周期，提高细胞的增殖密度以及抗凋亡作用。半乳糖是合成细胞内及表面糖蛋白的重要原料。亚硒酸钠作微量元素为细胞生长代谢不可缺少的一部分。皮质酮一种肾上腺皮质激素，对于间充质干细胞的免疫抑制具有重要作用。亚油酸在细胞内直接合成脂肪酸。亚麻酸是体内必须脂肪酸，细胞体内难以合成。硫辛酸属于B族维生素中的一类化合物，是一种存在于线粒体的辅酶，能消除导致加速老化与致病的自由基。黄体酮能有效的促进细胞增殖。生育酚和生育酚乙酸酯是是细胞内不可缺少的维生素E，并具有抗氧化剂和抗细胞凋亡的作用。谷胱甘肽并具有抗氧化作用。胰岛素同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成，在细胞生长、代谢中不可缺少。超氧化物酶具有清楚氧自由基的作用，可减少氧自由基的积累对细胞产生毒害。转铁蛋白是人血清中主要的结合铁蛋白质，在铁转运中有重要作用，为细胞代谢提供所需的铁。此外，转铁蛋白还具有抗菌、作为细胞增殖、分化中的生长因子等功能。三碘甲状腺原氨酸是一种含碘的酪氨酸，它是以碘和酪氨酸为原料在甲状腺腺细胞内合成，用于调控细胞内外调控钙离子浓度，维持细胞膜电位稳定，氧化氢酶能清除细胞的代谢废物过氧化氢的作用，起到为细胞解毒的作用。
进一步的，所述第三组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：所述左旋肉碱的浓度为0.4-10μg/ml，所述乙醇胺的浓度为0.2-5μg/ml，所述半乳糖的浓度为3-45μg/ml，所述腐胺的浓度为3-50μg/ml，所述亚硒酸钠的浓度为0.003-0.07μg/ml，所述皮质酮的浓度为0.004-0.1μg/ml，所述亚油酸的浓度为0.2-5μg/ml，所述亚麻酸的浓度为0.2-5μg/ml，所述硫辛酸的浓度为0.009-0.24μg/ml，所述黄体酮的浓度为0.001-0.03μg/ml，所述生育酚的浓度为0.02-0.5μg/ml，所述生育酚乙酸酯的浓度为0.02-0.5μg/ml，所述谷胱甘肽的浓度为0.2-5μg/ml，所述胰岛素的浓度为0.8-20μg/ml，所述超氧化物酶的浓度为0.5-12.5μg/ml，所述转铁蛋白的浓度为1-25μg/ml，所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为0.0004-0.01μg/ml，所述过氧化氢酶的浓度为0.5-12.5μg/ml。
在一些具体的实施方式中，第三组分中左旋肉碱、乙醇胺、半乳糖、腐胺、亚硒酸钠、皮质酮、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、黄体酮、生育酚、生育酚乙酸酯、谷胱甘肽、胰岛素、超氧化物酶、转铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸和过氧化氢酶的物质的浓度分别为2μg/ml、1μg/ml、15μg/ml、16.1μg/ml、0.01435μg/ml、0.02μg/ml、1μg/ml、1μg/ml、0.047μg/ml、0.0063μg/ml、0.1μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、4μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、0.002μg/ml、2.5μg/ml。
本发明的无血清培养基的添加剂，其中第一组分、第二组分、第三组分的组分和浓度经特定筛选得到，通过各组分之间的协同作用，为间充质干细胞提供生长、代谢、增殖刺激、维持细胞形态及干细胞特性所需的营养成分，可代替人血清、血小板裂解液等成分不明确的添加剂，有利于实现间充质干细胞的标注化培养。无血清培养基的添加剂具有来源明确、成本低的优势，可以添加于基础培养基中，作为脂肪、脐血、脐带、胎盘、骨髓等多种组织来源的间充质干细胞的无血清培养基。特别地，无血清培养基用于脂肪间充质干细胞的培养，能够获得优异的培养效果。
第二方面
本发明的第二方面中，提供了一种第一方面的无血清培养基的添加剂的制备方法，包括将所述添加剂的各组分溶解后混合的步骤。进一步的，还包括将混合的溶剂液冻干的步骤。
在一些具体的实施方案中，无血清培养基的添加剂的制备方法包括如下步骤：
将所述第一组分、第二组分和第三组分的溶解液混合后过滤，得到混合的溶解液；
所述混合的溶解液经预冻、升华和干燥处理，得到冻干粉剂的添加剂。
制备混合的溶解液
在本发明中，为了有效减少添加剂的各组分混合时发生聚集成团的现象，将第一组分、第二组分和第三组分分别溶解后，混合三种组分的溶解液，过滤后得到混合的溶解液。
对于第一组分的溶解液，可以是将包含维生素的溶液(MEM Vitamin Solution)、液态的脂类(Cholesterol Lipid Concentrate)、包含L-谷氨酰胺的补充剂溶液(GlutaMAXTMSupplement)、L-抗坏血酸-2-磷酸、β酸巯基乙醇、地塞米松和氢化可的松混合后得到。
对于第二组分的溶解液，可以是将bFGF、EGF、PDGF-BB、TTR、IGF、VEGF、LIF、HGF、CTGF、β细胞素、IL-8、人血清白蛋白、重组人纤连蛋白中的一种或多种溶解于溶剂中得到。本发明对溶解第二组分的溶剂不作特别限定，可以是适用于细胞培养的各类溶剂成分。
对于第三组分的溶解液，可以是将左旋肉碱、乙醇胺、半乳糖、腐胺、亚硒酸钠、皮质酮、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、黄体酮、生育酚、生育酚乙酸酯、谷胱甘肽、胰岛素、超氧化物酶、转铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸和过氧化氢酶中的一种或多种溶解于溶剂中得到。本发明对溶解第三组分的溶剂不作特别限定，可以是适用于细胞培养的各类溶剂成分。
制备冻干粉剂
在本发明中，为保留各物质组分的活性，将混有三种组分的混合的溶解液依次经预冻、升华和干燥处理，得到冻干粉剂的添加剂。
对于预冻处理，是在-35～-45℃的温度下，保持3～5小时。
对于升华处理，首先将温度降低到-45～-55℃以下，然后对整个工作系统抽真空；当真空度控制到10pa以下后，在19～25℃的温度下，升华干燥24小时。
对于干燥处理，是在7～9℃的温度下，干燥3～5小时。
干燥处理结束后，向工作系统中输入空气，使工作系统的压力达到0.9～1.1个标准大气压，得到冻干粉剂的添加剂。
以上述方法制备的添加剂的冻干粉剂，制备过程中对组分的活性损耗少，冻干粉剂质量稳定性高、具有良好的复溶性，用无菌水复溶后，可用于间充质干细胞培养、扩增和传代。
第三方面
本发明的第三方面中，提供了一种第一方面的无血清培养基的添加剂在间充质干细胞的无血清培养基中的应用。无血清培养基的添加剂来源明确、批次间重复性好，以添加剂代替血清等成分得到的无血清培养基能够作为脂肪等来源的间充质干细胞的培养基，可长期维持其细胞形态，且具有快速贴壁、增殖等特性，经多次传代保持干细胞的分化能力和自我更新能力。
在一些具体的实施方式中，本发明提供了一种无血清培养基，包括基础培养基和无血清培养基的添加剂，无血清培养基的添加剂可以是冻干粉剂或是将添加剂的冻干粉剂溶解后得到的浓缩液。
进一步的，基础培养基可以是本领域常用的各类基础培养基。例如，基础培养基可以为DMEM、DMEM/F-12、IMDM、α-MEM培养基。基础培养基是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，能够提供细胞生长、增殖所需营养。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
下表1中示出了若干实施例中涉及试剂的来源及工作浓度：添加剂
Figure BDA0002954813800000161
Figure BDA0002954813800000171
实施例1
按照表2中提供的组分制备无血清培养基的添加剂，添加剂具体为冻干粉剂。添加剂的制备方法包括如下步骤：
(1)分别溶解表2中第一组分、第二组分和第三组分，混合三类组分的溶解液，充分混匀后过滤；
(2)预冻：箱内温度降至-45℃，保持3小时；
(3)升华：将冷凝器的温度降到-55℃以下，对整个系统抽真空；
控制真空度在10pa以下，隔板温度控制在25℃，升华干燥24小时。
(4)干燥：提高板层温度至7℃，干燥5小时；
(5)冷冻干燥完成后，往冻干箱中输入混合气体，使箱内压力达到期1.1个标准大气压，然后出塞，出箱。
无血清培养基的添加剂中第一组分的含量为20％，第二组分的含量为39％，第三组分的含量为41％。
表2
Figure BDA0002954813800000181
Figure BDA0002954813800000191
Figure BDA0002954813800000201
实施例2
本实施例制备一种无血清培养基，具体步骤如下：
(1)将15.6g基础培养基DMEM/F-12的粉末溶于920ml注射用水中，分装两瓶，各460ml。
(2)按照表3中提供的步骤依次加入各组分，至混合液的总体积为500ml，最终混匀后过滤，即得液体的无血清培养基。
表3
Figure BDA0002954813800000202
Figure BDA0002954813800000211
实施例3
本实施例制备一种无血清培养基，具体步骤如下：
(1)取2份以实施例1中方法制备的添加剂的冻干粉剂复溶于无菌水中，至总体积为20ml，得到添加剂的浓缩液。
(2)将基础培养基15.6g DMEM/F-12的粉末溶于920ml注射用水中，分装两瓶，各460ml。
(3)按照表4所示的组分和步骤向460ml的DMEM/F-12培养基中依次加入各组分，至混合液的总体积为500ml，混匀，过滤，得到无血清培养基。
表4
Figure BDA0002954813800000221
效果评价实验
1、实施例2与实施例3中配制的无血清培养基的工艺参数如下：
表5
Figure BDA0002954813800000222
Figure BDA0002954813800000231
2、细胞培养效果评价
将实施例2-3中的无血清培养基按照下列步骤进行细胞培养效果测试：
(1)在无菌操作工作台上，用这两种实验方案配制的培养基，培养ADSCs，ADSCs分别接种96孔板：细胞数量5000个/100μl；每组三个复孔，12孔板：细胞数量4.0x104/1ml。
(2)将96孔板，12孔板中培养的ADSCs细胞混匀，置37摄氏度培养箱中培养，分别24小时，48小时，72小时观察细胞形态，拍照。
(3)72小时后,CCK8检测96孔板中用这两种实验方案配制的培养基，培养ADSCs的情况，检测OD值，12孔板中ADSCs收集计数，接种6孔板，置37摄氏度培养箱中培养，分别24小时，48小时，72小时观察细胞形态，拍照。
(4)6孔板72小时以后，细胞收集计数，流式检测表明标志物。
实验结果：
1、细胞形态效果评价
图1显示12孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养48小时后在4倍镜(4X)和10倍镜(10X)下的细胞形态观察结果，图2显示12孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养72小时后在4倍镜(4X)和10倍镜(10X)下的细胞形态观察结果，图3显示12孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养24小时后在4倍镜(4X)和10倍镜(10X)下的细胞形态观察结果，图4显示6孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养24小时后在4倍镜(4X)和10倍镜(10X)下的细胞形态观察结果，图5显示6孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养48小时后在4倍镜(4X)和10倍镜(10X)下的细胞形态观察结果，图6显示6孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养72小时后在4倍镜(4X)和10倍镜(10X)下的细胞形态观察结果。由图1-图6结果可知，以本发明实施例2-3中的无血清培养基对ADSCs进行培养，ADSCs具有较好的增殖速度，且ADSCs可随时间的增加保持其细胞形态。
2、细胞毒性效果评价
96孔板培养ADSCs 72小时CCK8检测的OD值如表6所示，12孔板和96孔板培养ADSCs的细胞计数结果如表7所示：
表6
Figure BDA0002954813800000241
表7
Figure BDA0002954813800000242
由表6和表7结果可知，以本发明的添加剂配置的无血清培养基，其细胞毒性低，脂肪间充质干细胞在其中生长可以保持高的存活率。
3、脂肪间充质干细胞表面标志物评价
以流式细胞仪检测脂肪干细胞的三个阳性指标：CD73，CD90，CD105；以流式细胞仪检测脂肪干细胞的四个阴性指标：CD14，CD19，CD34，CD45。图7-图9分别显示对脂肪干细胞的阳性指标CD73，CD90，CD105的检测结果，其中，图7的A部分显示实施例2中无血清培养基培养脂肪干细胞的CD73的检测结果，图7的B部分显示实施例3中无血清培养基培养脂肪干细胞的CD73的检测结果；图8的A部分显示实施例2中无血清培养基培养脂肪干细胞的CD90的检测结果，图8的B部分显示实施例3中无血清培养基培养脂肪干细胞的CD90的检测结果；图9的A部分显示实施例2中无血清培养基培养脂肪干细胞的CD105的检测结果，图9的B部分显示实施例3中无血清培养基培养脂肪干细胞的CD105的检测结果。
图10-13分别显示对脂肪干细胞的阴性指标CD14，CD19，CD34，CD45的检测结果。其中，图10的A部分显示实施例2中无血清培养基培养脂肪干细胞的CD14的检测结果，图10的B部分显示实施例3中无血清培养基培养脂肪干细胞的CD14的检测结果；图11的A部分显示实施例2中无血清培养基培养脂肪干细胞的CD19的检测结果，图11的B部分显示实施例3中无血清培养基培养脂肪干细胞的CD19的检测结果；图12的A部分显示实施例2中无血清培养基培养脂肪干细胞的CD34的检测结果，图12的B部分显示实施例3中无血清培养基培养脂肪干细胞的CD34的检测结果；图13的A部分显示实施例2中无血清培养基培养脂肪干细胞的CD45的检测结果，图13的B部分显示实施例3中无血清培养基培养脂肪干细胞的CD45的检测结果。图7-图13结果可知，包含本发明添加剂的无血清培养剂可以保持ADSCs的特性不发生改变。
比较实施例
比较实施例中以市售的无血清培养基(STEMCELL，货号：05401)作为对照品，以实施例3中制备的无血清培养基作为实验组，比较两种组无血清培养基培养干细胞的区别。
具体的，将上述两组无血清培养基按照下列步骤进行细胞培养效果测试：
(1)在无菌操作工作台上，用这两种实验方案配制的培养基，培养ADSCs，ADSCs分别接种96孔板：细胞数量5000个/100μl；每组三个复孔，12孔板：细胞数量4.0x104/1ml。
(2)将96孔板，12孔板中培养的ADSCs细胞混匀，置37摄氏度培养箱中培养，分别24小时，48小时，72小时观察细胞形态，拍照。
(3)72小时后，CCK8检测96孔板中用这两种实验方案配制的培养基，培养ADSCs的情况，检测OD值，12孔板中ADSCs收集计数，接种6孔板，置37摄氏度培养箱中培养，分别24小时，48小时，72小时观察细胞形态，拍照。
(4)6孔板72小时以后，细胞收集计数，流式检测表明标志物。
实验结果：
1、细胞形态效果评价图14显示12孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养24小时后在4倍镜(4X)和10倍镜(10X)下的细胞形态观察结果，图15显示12孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养48小时后在4倍镜(4X)和10倍镜(10X)下的细胞形态观察结果，图16显示72孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养72小时后在4倍镜(4X)和10倍镜(10X)下的细胞形态观察结果，图17显示6孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养24小时后在4倍镜(4X)和10倍镜(10X)下的细胞形态观察结果，图18显示6孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养48小时后在4倍镜(4X)和10倍镜(10X)下的细胞形态观察结果，图19显示6孔板培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs)培养72小时后在4倍镜(4X)和10倍镜(10X)下的细胞形态观察结果。由图14-图19结果可知，与对照组相比，以本申请实施例2-3中的无血清培养基对ADSCs进行培养，ADSCs具有更好的增殖速度，并且可保持ADSCs良好的细胞形态。
2、细胞毒性效果评价
96孔板培养ADSCs 72小时CCK8检测的OD值如表8所示，12孔板和96孔板培养ADSCs的细胞计数结果如表9所示：
表8
Figure BDA0002954813800000271
表9
Figure BDA0002954813800000272
3、脂肪间充质干细胞表面标志物评价
以流式细胞仪检测脂肪干细胞的三个阳性指标：CD73，CD90，CD105；以流式细胞仪检测脂肪干细胞的四个阴性指标：CD14，CD19，CD34，CD45。图20-图22分别显示实验组和对照组中无血清培养基对脂肪干细胞的阳性指标CD73，CD90，CD105的检测结果，图23-图26分别显示实验组和对照组中无血清培养基对脂肪干细胞的阴性指标CD14，CD19，CD34，CD45的检测结果。图20-图26结果可知，包含本申请中添加剂的无血清培养剂可以保持ADSCs的特性不发生改变。
产业上的可利用性
本发明的提供的无血清培养基的冻干粉及其制备方法和应用，可以在工业上应用。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种无血清培养基的添加剂，其中，所述添加剂包括含有基础代谢类物质的第一组分、含有细胞因子类物质的第二组分，以及含有氧化还原类物质的第三组分；
以所述添加剂的总质量为100%计，所述第一组分为6%-22%，所述第二组分为35%-47%，所述第三组分为43%-47%；
所述第一组分为维生素、脂类、L-谷氨酰胺、L-抗坏血酸-2-磷酸、β-巯基乙醇、地塞米松和氢化可的松的组合；
所述第二组分为bFGF、TTR、IGF、VEGF、LIF、HGF、CTGF、β细胞素、IL-8、重组人纤连蛋白和人血清白蛋白的组合；
所述第三组分为人血清白蛋白、左旋肉碱、乙醇胺、半乳糖、腐胺、亚硒酸钠、皮质酮、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、黄体酮、生育酚、生育酚乙酸酯、谷胱甘肽、胰岛素、超氧化物酶、转铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸和过氧化氢酶的组合；
所述第一组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：所述维生素的浓度为93.1mg/L，所述脂类的浓度为92.6mg/L，所述L-谷氨酰胺的浓度为292mg/L，所述L-抗坏血酸-2-磷酸的浓度为50mg/L，所述β-巯基乙醇的浓度为4.3mg/L，所述地塞米松的浓度为4ng/ml，所述氢化可的松的浓度为3.62ng/ml；
所述第二组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：所述bFGF的浓度为10ng/ml，所述TTR的浓度为10ng/ml，所述IGF的浓度为10ng/ml，所述VEGF的浓度为10ng/ml，所述LIF的浓度为10ng/ml，所述HGF的浓度为10ng/ml，所述CTGF的浓度为10ng/ml，所述β细胞素的浓度为5ng/ml，所述IL-8的浓度为2ng/ml，所述重组人纤连蛋白的浓度为5µg/ml，所述人血清白蛋白的浓度为1mg/ml；
所述第三组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：所述人血清白蛋白的浓度为1mg/ml，所述左旋肉碱的浓度为2µg/ml，所述乙醇胺的浓度为1µg/ml，所述半乳糖的浓度为15µg/ml，所述腐胺的浓度为16.1µg/ml，所述亚硒酸钠的浓度为0.01435µg/ml，所述皮质酮的浓度为0.02µg/ml，所述亚油酸的浓度为1µg/ml，所述亚麻酸的浓度为1µg/ml，所述硫辛酸的浓度为0.047µg/ml，所述黄体酮的浓度为0.0063µg/ml，所述生育酚的浓度为0.1µg/ml，所述生育酚乙酸酯的浓度为0.1µg/ml，所述谷胱甘肽的浓度为1µg/ml，所述胰岛素的浓度为4µg/ml，所述超氧化物酶的浓度为2.5µg/ml，所述转铁蛋白的浓度为5µg/ml，所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为0.002µg/ml，所述过氧化氢酶的浓度为2.5µg/ml。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基的添加剂，其中，所述添加剂为浓缩液或所述浓缩液的冻干粉剂。
3.一种根据权利要求1或2所述的无血清培养基的添加剂的制备方法，其包括将所述添加剂的各组分溶解后混合的步骤。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，还包括将混合的溶解液冻干的步骤。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其中，包括如下步骤：
将所述第一组分、第二组分和第三组分的溶解液混合后过滤，得到混合的溶解液；
所述混合的溶解液经预冻、升华和干燥处理，得到冻干粉剂的添加剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，所述预冻处理的温度为-35~-45℃，处理时间为3~5小时；
所述升华处理的真空度为10pa以下，处理温度为19~25℃，处理时间为24小时；
所述干燥处理的温度为7~9℃，处理时间为3~5小时。
7.权利要求1或2所述的无血清培养基的添加剂在制备间充质干细胞的无血清培养基中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述间充质干细胞的无血清培养基包括基础培养基和所述无血清培养基的添加剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述基础培养基为DMEM，DMEM/F-12，IMDM和α-MEM中的一种。
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