JPS59187778A - 微生物を培養するための培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、微生物、特にボルデテラ（ＢＯｒ（ＩＱｔｅ
ｌｌａ＞属に属づ゛る微生物を培養するための培地に関
する。

ボルデテラ属に屈する微生物どしては、百［−１咳菌、
パラ百日咳菌、気管支敗血症菌等があり、特に百日咳菌
は、’１００Ｆ１つづくといわれる特有の咳を伴う、気
管、気管支、および小気管支がおかされる急ｔ（の感染
症である百１］咳の１１こる病原菌として知られている
。従って、臨床上は、かかる百日咳菌等の迅速・確実な
検出が望まれており、そのめには臨床分離菌の生育を促
進するＪ：うな培地が必用℃ある。

また、ボルデテラ属に属する微生物は種々の生物学的活
性物質を産生ずる。例えば、百日咳Ｔ粗金の培養物（培
養培地と菌体）からは、各種糖尿病治療乃至予防薬とし
ての展開が期待しつるところの、インシコリン分泌増強
活ｕｌ物質（ｌ　５ｌｅｔ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｐ
ｒｏｔｅｉｎ、以下Ｉ八Ｐと略記する）や、百日咳菌の
ワクチンコンボーネンｌ〜として注目されテイル白血球
増加因子（（ｃｕｃｏｃｙｔｏｓｉｓ　ｐ　ｒｏｍ。

ｔｉｎｇ　　Ｆ　ａｃｔｏｒ　　、以下ＬＰＦど略記づ
る）等、医療上有効な生物学的活性物質が得られる。

どころが、百Ｅ１咳Ｔ相菌は相変化をおこし易く安定し
た培養が勤しく、その結果、菌の抗原性。

病原性、ＩＰＦ産生能あるいは■ΔＰ産性能が培養条件
にｊ；って著しく異なるという問題点があった。かかる
問題点を解消する試みが従来性なわれてきた。

例えば、ロワッ１−ら（Ｒｏｗａｔｔ　Ｅ　、、ジャー
ナルオブ　ジェネラル　マイクロバイオロジー（Ｊ、ｑ
ｅｎ、　Ｍ　１ｃｒｂｉｏｑｙ）　１７巻、　　２７９
−２９６貞及び２９７−３２６頁、　１９５Ｈｆ）によ
ればボルデテラ属の微生物、とりわ【−１百日咳Ｔ相菌
の培養を抑制する因子とじ（は、以下のものが挙げられ
ている。　［１，）システィンの加熱（オートクレーブ
）処理によって１ηられるコロイド状サルファイド又は
リルファ−６（２）力げイン加水分解物のオー１へクレ
ープ処理によりｊｕられる過酸化水素又は有機過酸化物
。（３）菌が二次的に産生する不飽和脂肪酸、とりわれ
Ａレイン酸。

そしてこれらの抑制効果を打消寸培地への添加物として
、（１）に関してはアルブミン、赤血球又はその破砕物
、活性炭、イ副ン交換樹脂、（２）に関して（まカタラ
ーゼ、ヘミン、　Ｆｅ　ＳＯ４、（３）に関してはメタ
ーブ、アミロース、デＡ−スリトリン等が挙げられてい
るが、これ添加物の効果は菌の接種数が１×１０６個以
下では不安定である。また活性炭。

イオン交換樹脂、アミロースなどの吸着剤の添加も効果
があるどされるが、培地中に不均一な部分を形成しやづ
く必ず１ノも十分なものであるとは苦えない。赤血球、
アルブミンなどの添加物は、これらが１−１ツ１〜的に
組成変化しやすくまた、変性し易いので、保存に適し「
１つ安定した培地を調製づ−るには適切ではない。

近年スフ−ナー（３ｔａｉｎｅｒ）及びシ］ルデー（Ｓ
ｃｈｏｌｔｅ）によってこの百日咳■相菌の大量培養の
ための合成ｊ８地が開発された（ジャーナル　オブジＴ
ネラル　マイク［二１バイＡロジー　Ｊ、ｇｅｎ。

Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏｌ）　６３巻、　　２１１−２２０
頁、　１９７１年）このステプ−・ショルテー培地（以
下ＳＳ培地と略記り゛る）は天然物由来の血液及びポリ
ペプトン等、ロワ１〜差に変動の考えられる添加物を含
まないため、菌の培地組成を厳密にコン［〜ロールし１
ｑるので、菌性状に変化をもたらづ゛ことなく、培養を
行い１！′７ること、及び前述したＩＡＰもしくはＬＰ
Ｆの如ぎ生物学的活性物質の万頭・１ｌｌｒｉ製に際し
、不要な他種蛋白質の夾雑を防き得る等の特徴を有する
ので近年百［１咳ワクヂン及び百日咳菌Ｊ、りの生物学
的活性物質を工業的規模で製造覆るのに広く用いられて
いるが、撹拌下もしくは静置下の液体培養３− 条件で、特に接種リーイズが１０’］ｔに一／　ｍＱ以
下の場合、ＩＰＦの産生能力等の点で゛安定な生育特性
が得られないという欠点を有する。またＳＳ培地に寒天
を１．２％どなるように加えて固化して１〔Ｉた寒天培
地（以下ＳＳへ培地ど略記する）でｔよ、１０３コロニ
ー数以下の播種（シー１へ）でのコロニー形成は認めら
れないという大きな欠陥を右ηる。

本発明者らは、従来技術の欠点を改良し、微生物、特に
ボルデテラ属に属り−る微生物を安定にかつ効率良く培
養するだめの培地を得るべく鋭意研究の結果、本発明に
到達した。

即ち、本発明はシクロデキストリン又はその誘導体を含
有覆る、微生物を培養するための培地である。

本発明の培地は、種々の微生物の培養のために使用でき
るが、特にボルデテラ属に属する微生物を培養するため
に遺している。

ボルデテラ属に属する微生物どしては、百日咳菌、パラ
百日咳菌、気管支敗血症菌等がある。本発明において好
Ｊ：シク用いられるのは百日咳菌で４− あり、なかでも百日咳■相菌が好ま１ノい。

ボルデテラ属に属する微生物の菌学的１〈１質及び培養
条件等に関しては、Ｂｅｒｇｙｓ　Ｍａｎｕｓｌ　ｏｆ
　　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　　Ｂ　ａｃｔｅｒ：
ｏｌｏｇｙ、第８版、　１９７４年。

Ｔｈｅ　　Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆　　ＷｉｌｌｋｉｎＳＣ
ｏ、発行やＪ。

ＥＸＤ　　Ｍｅｄ、１２９巻、第５２３−５５０頁、　
１９６９年あるいは細菌学実習提要、第３版、第８０頁
以下、昭和１１７４Ｙ、丸首発行等がありすでに公知で
ある。

シクロデキストリンは、澱粉あるいは澱粉の加水分解物
にＢａｃ’＋ｌ１ｕｓ　ｍ　ａｃｅｒａｎｓ　ａｍｙｌ
ａｓｅ　　（ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）等を
作用させて得られる、Ｄ−グリコピラノース基が６〜１
０個α−１，４グリコシト結合によって環状に結合した
王冠状の分子である。そのうち主なものは６，７または
８個のＤ−グリコピラノース基からイ【す、それぞれα
−９β−９γ−シフロブキス１〜リンと呼ばれている。

本発明にお【づるシフロブキスミルリンとは、前記α。

β、γ等のシクロデキストリン又はそれらの混合物をい
う。

シクロデキストリン分子は多数の１級及び２級水酸基を
右ＣするのＣ゛、甲糖類（Ｊ広く用いられている反応を
）内用して種々の誘導体が１１られる。本発明にお【Ｊ
るシフ［−１ア゛キストリン誘導体とはかがるブラ法で
１ｒ−１られる誘導体を意味し、例えばアミノシフ１１
デＡス１〜リンヤ）　／／ミノデ′Ａ１シシク］−１デ
＝Ｆス１−リンの如きアミン化誘導体、アセＪ−ルシク
［〕デキストリンヤ）イ１へ［−１シクロデキス１ヘリ
ンの如き」ステル化誘導体、メヂルシクロデギス１〜リ
ン、　ｉｎチルシク［−］デデキストリンプロビルシク
ロデ゛二１ストリン、ハルボキシルメヂルシク［１デギ
ス１〜リンの如き−「−チル化誘８９体（ニーーｊル化
シクＩ」デキストリン）がある。本発明において好まし
いのはＴ−チル化シク［１デキス１ヘリンであり、中で
ちヘキサＡ−ス（２，６−Ｏ−ジメチル）α−シクロデ
キス１〜リン（ｎｅα−ＣＤ）やヘプタ−１ニス（２，
６−０−ジメーｆル）β−シクロデキス１〜リン（ｎｅ
β−ＣＤ）等のメブルシク［１デー１−スＩ〜リンが特
に好ましい。

本発明において培地とは、ブイヨンやペプトン水などの
従来公知の液状培地、あるい（ま液状培地　７− に寒天、１２ラテン、卵白、白酒４ｆとを加えて固形に
した従来公知の固形培地を意味するが好ましいのはＳＳ
培地、及びこれに寒天を１〜２％（Ｗ　／＼／）程度添
加し固化したＳＳ培地である。ＳＳ培地、１１あたり、
グルタミン酸ナトリウム、文−プ［−１リン、塩化す１
〜リウム、リン酸２水素カリウム、塩化カリウム、塩化
マグネシウム、塩化力ルシウｌ＼、１〜リスヒト［］キ
シメヂルアミノメタンを、それぞれ１０，７．　０．２
４．２．５．　０゜５．　０．２．　０．０２　。

１．５２５９を含む水溶液を濃塩酸で　ｐＨ７，６に調
整した後１２１°Ｃで１５分間オートクレーブで滅菌し
て得られる基礎培地に、μｍシスヂン、硫酸第１鉄。

）７ス］ルピン酸、ニアシン、還元型ゲルタデオンを１
すあたり、それぞれ４．１．２．　０．４．１０ｇ含む
溶液をミリポアフィルタ−（０，４５μ）で除菌して得
られる補液を、基礎培地に対して１．０％（Ｖ／Ｖ）の
割合で加えて得られる。

本発明において、前記培地に添加混合されるシクロデギ
ス１〜リン又はモの誘導体の量は、接種される菌の量に
依存するが、例えば、接種される菌が１０６〜１０８］
ロニー／ｍρの場合には、前記培地に１０〜５０００μ
ｇ／ｍｉ！、好ましくは１００〜１０００μｑ／ｄの割
合でシフロブキス１へリン又はその誘導体を添加混合し
、本発明においＣ用いられる培地を得る。かかるシク］
］デキストリン又はその誘導体の添加培地、とりわけ添
加ＳＳ培地は菌が安定に且つ効率良く生育するので糖尿
病治療薬としての医薬効果が期待されるＩＡＰ、百日咳
ワクチンコンポーネントとして期待される１−Ｐ「及び
菌体ワクチン等の活性物質の製造上極めて有利な培地で
ある。

かかる培地を用いたボルデアラ属に属する微生物の培養
方法及び条件は特に限定されるものではなく、従来公知
の方法及び条件を採用できるが、静置培養よりは振どう
培養の方が好ましく、培養温度は３５°Ｃ前後、培養時
間は１０〜１００時間が適当である。

培養物（培養培地と菌体）から、生成された生物学的活
性物質を採取する方法１手段も特に限定されるものでは
なく、公知の方法９手段を利用で　８− ぎる。例えば、Ｌ　Ｐ　Ｆを得るには、百日咳Ｔ相開を
（ボルデテラ・パタシス東浜株）を３００μｑ／ｄのメ
ヂルβ−シクロデギストリンを含むＳＳ培地にて３５°
Ｃで１８時間培養し、得られる培養液の遠心上Ｗｔ　（
ｐｌ−１８，６）を、１）Ｈ８，（ｌの０．０１　Ｍリ
ン酸緩ｔｌｉ液で平衡化したハイドロキシアパタイトカ
ラムに通過せしめる。そして、得られる通過液をρｌ−
１６，０に調整した後、今度は、ｐｌ−１６，０の０．
０１　Ｍリン酸緩衝液で平衡化したハイドキシアバタイ
１〜カラムに吸着させ、これを０．５Ｍ塩化ナトリウム
を含む０，１Ｍリン酸緩衝液（１）８７．０）で溶出し
て蛋白文面を得る。この蛋白文面をハプトグロビン−レ
フアロ−スを支持体とするアフィニティークロマトグラ
フィーに吸着させ、０．５Ｍ　Ｎ　ａＣΩ及び３Ｍのチ
オシアン化カリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液で脱着
してＬＰＭを得ることができる。

以下、実施例により本発明を詳述する。

実施例１ ボルデテラパタシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔ
ｕｓｓｉｓ　）（百日咳菌）東浜株■相開の凍結乾燥菌
体を１％カザミノ酸溶液に懸濁させ、脱繊維馬面液を２
０％含むボルデ・ジャングー（Ｂ　ｏｒｃｌｅｔ　−Ｑ
　ｅｎｇｏｕ　）培地（以下Ｂ　（３培地という）で３
５℃、３日間培養した。この菌を１白金耳かき取り、更
にＢＧ培地で２４時間リフ１ノツシコしたＳＳ培地に懸
濁し、５Ｘ１０３１０ニー／ｒｄ！の接種菌懸濁液を得
た。

予め所定の終濃度（μ９／威）となるように、シフ［コ
ブキス１〜リン又はイの誘導体を含む１．２％寒天ｍ度
の固定ＳＳ培地を調整しておぎ、１プレー１〜当りの菌
数が１０３コロニーどなるようにスーゾレッドした。

３５℃で４日間培養後の菌生育状態（コロニー数）を第
１表に示した。

第１表 〈以五余白） １２− −１１− 一・・・・・・１０個以下 ±・・・・・・１０へ・　１００個 十・・・・・・１００−５００個 １ト　・・・　・・・　５００　　＝　　１０００個な
お、用いたエーテル化シクロデキス１〜リンは、ｌ−１
，５ｃｈｌｅｎｋらの方法（Ａｂｓｔ、ｒ、　Ｐａｐ、
、Ａｍｅｒ　０Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１４９．１１Ｃ，
１９６５参照）ニ準拠して合成された。

以下、α−シクロテキス１へリンをα−Ｃ１）、そのメ
チル化物（ヘキサキス（２，６−０−ジメチル）α−シ
クロデキストリン）をＭｅα−Ｃ［〕。

エエチル化をＥ［α−Ｃ１つ、β−シクロデキストリン
をβ−ＣＩ）、　（のメチル化物をＭｅβ−シクロデキ
ストリン）、エチル化物をトしβ−〇　Ｉ）と略記する
。

第１表から明らかな如く、シクロデキストリン又はその
誘導体を培地に添加することにより、百日咳菌の１：１
−育が促進されている。また、その効果はα−ＣＤ又は
β−Ｃｌ）よりもそれらのメチル化物又はエチル化物の
方が優れでおり、α体よりもβ体の方がよりすぐ優れ−
Ｃいることがわかる。

実施例２ 実施例１ど同様の方法で得られた接種菌懸濁液を、所定
ａ度のＭＯβ−ＣＤを含むＳＳ液体培地１０　ｍ（！に
接種サイズが１０６コロニーとなるＪ：うに接種し、１
字型試験管で往復壁とうしながら３５℃で培養した。得
られた培地の濁度（ＯＤ６５０ｍμ）の経時変化は第２
表の通りであった。

第２表 （以下余白） 一１区− 第２表より、Ｍｅβ−ＣＤを培地に１〜５００μｒｉ　
／　ｍＱの範囲で添加すると、添加量の増大と共に培地
の濁度が増大、即ち菌の生育が促進されていることがわ
かる。

実施例３ 実施例１と同様の方法で得られた接種懸濁液を、所定の
濃度のＭｅβ−ＣＤを含むＳＳ培地に１０７−］［に−
／　ｍｅどなる様に懸濁させ、静置又は撮とう条イ′１
下、３５°Ｃで１８時間培養を行った。

培養後、培養液の濁度（ＯＤ　６ｇ。）を測定し、次に
以下の如き方法で産生きれたＩＰＦを採取しその活性を
測定した。ｊ８養液の遠心上清（ｌ１ｌ−１８，６）を
、ｐ１〜４８．０のＯ，Ｏ４Ｍリン酸緩衝液で平衡化し
たハイドロキシアパタイトカラムに通過せしめ、得られ
る通過液をｐＨ６，０に調整した後、今度（ま１）ｌ−
１６，０の０．０１　Ｍリン酸緩衝液で平衡化したハイ
ドロキシアパタイトカラムに吸着させ、これを０．５Ｍ
塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（１）８　
７．０）で溶出して蛋白文面を得た。この蛋白文面をハ
プトグロビン−セファロースを支持体どするアフィニテ
ィークロマ１〜グラノイーに吸着さぜ、０，５Ｍ　　Ｎ
ａＣｕ及び３Ｍのヂオシアン化カリウムを含む０．１Ｍ
トリス緩衝液で脱＠１ノで１−ＰＦ　　を１り１．：。

１−Ｐ「活性は、４ノ１Ｂらの酵素抗体法（ＥＩ　　Ｉ
ｓＡ法、第２８回毒素シンポジウム（１９８１年７月２
３１］〜２４日、岩手県へ幡平）講演要旨束、第１４１
〜・１４４頁参照）によって測定し、ＬＰＦの活性単位
（Ｕ）は、ＯＤ４００ｍμが、単位容量　＜＊）当り０
．１を与える各サンプルの希釈倍数であられした。

結果を第１図に示した。第１図から、Ｍｅβ−Ｃｆ）は
、特に振どう条件下で、菌体当りのＬ　Ｐ　’Ｆ産十能
を著しく増大さゼていることがわかる。

なお、Ｍｅα−ＣＤを用いた場合も、はぼ同様な結果が
得られた。

実施例４ 実施例１と同様の方法で得られた接挿菌懸濁液を、Ｍｅ
β−ＣＤを５００μ！１７　／　ｍｆ！含むＳＳ培地１
５０　ｍＱ、に３．３ｘ　１０８コロニー／ｍｅとなる
様に懸濁させ、振どう条件下、３５°Ｃで所定時間培養
を行つ１６− た。培養時間と培養液の濁度及び産生きれたＩＰＦの量
（Ｌ　Ｐ　Ｆ活性）との関係を第２図に示した。

なお、ＬＰＦ活性の測定は実施例３の場合と同様にして
行った。

第２図から、少なくとも培養時間が２０時間を越えると
Ｍｅβ−ＣＤの有無によって、培養液の濁度、即ち生育
した菌の絶対蚤は大差がないが、産生されるＩＰＦの量
は著しく異なり、Ｍｅβ−ＣＤの存在によって百日咳菌
のＬ　Ｐ　Ｆ産性能が著しく増大していることがわかる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、培地へのＭｅβ−ＣＤの添加量と培養液の濁
度及び産生されたＩＰＦのｆｆｌ　（Ｌ　Ｐ　Ｆ活性）
との関係を示す図である。第２図は、培地へのＭｅβ−
ＣＤの添加の有無の場合における、培養時間と培養液の
濁度及びＬ　Ｐ　Ｆの量との関係を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　シクロデキストリン又はその誘導体を含有する、
   微生物を培養するための培地。 ２、　シフロブキス１〜リン又はその誘導イ木を１０〜
   ５０００μ”；ｌ　／　ｍｅの割合で含有する、特許請
   求の範囲第１項記載の培地。