KR900007658B1

KR900007658B1 - 백일해균 예방항원을 함유하는 ha 유분(留分)과 백일해 왁진의 제조방법

Info

Publication number: KR900007658B1
Application number: KR1019840001645A
Authority: KR
Inventors: 아끼히로 긴나가; 히로시 고바; 신 사꾸마; 히사시 기다가와; 아끼라 야마다; 요오지 스즈끼
Original assignee: 자이단 호오진 가가꾸 오요비겟세이 료오호오 겡뀨우쇼; 로꾸단다 도오끼찌; 데이진 가부시기가이샤; 나까오 마스로오
Priority date: 1983-03-30
Filing date: 1984-03-29
Publication date: 1990-10-18
Also published as: DE3484778D1; ES8505818A1; AU564634B2; EP0121249A2; AU2623084A; ES531112A0; EP0121249B1; US4687738A; CA1213234A; EP0121249A3; KR840008289A

Abstract

내용 없음.

Description

백일해균 예방항원을 함유하는 HA 유분(留分)과 백일해 왁진의 제조방법

제1도는 각종 배양온도에서의 배양시간 경과에 따른 세포농도를 도시한 그래프이다.

제2도는 실시예1에 따라 측정한 조절 DO 농도변화에 따른 세포농도, F-HA 및 LPF-HA 변화를 도시한 그래프이다.

제3(a) 및 3(b)도는 실시예6의 DO 조절배양하에서의 배양시간 경과에 따른 세포농도와 F-HA 및 LPF-HA 수준을 각각 도시한 것이다.

제4(a) 및 4(b)도는 실시예7의 DO 조절배양하에서의 배양시간 경과에 따른 세포농도와 F-HA 및 LPF-HA 수준을 각각 도시한 것이다.

본 발명은 사상체 혈구응집소(Fi1amentous Hemagglutinin,: 이하 F-HA로 칭함)과 백혈구 증가촉진인자 혈구응집소(Leucocytosis-promoting Factor Hemagglutinin, ; 이하 LPF-HA로 칭함)을 함유하는 유분 등의 백일해균(Bordete1la pertussis)의 예방항원을 함유하는 HA 유분의 제법과 이 HA 유분으로부터 백일해 왁진을 제조하는 방법에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 온도 및 용존산소량을 조절하면서 탈기시키는 조건하의 사이클로덱스트린 또는 그 유도체가 추가된 액상매질중에서 B.pertusis(이하 백일해균이라 함)를 회전배양(이는 진탕배양, 폭기배양 및 폭기회전배양과 유사한 배양방법임)시켜서 배양액으로부터 제조된 HA 유분을 수득하는 단계로 구성되는 백일해균을 함유하는 HA 유분의 제조방법에 관한 것이고, 또한 이같이 수득된 HA 유분을 아미노산 존재하에서 포르마린 처리하여 백일해 왁진을 공업적 규모로 제조하는 방법에 관한 것이다.

백일해는 전염병의 일종으로서 주로 유아와 어린이에게 있어 발병되며 따라서 공중보건의 관점에서 볼때 매우 중요한 질병이다. 특히, 이 병으로 고생하는 유아는 경우에 따라 매우 심한 증상을 나타내며 또 이따금씩 사망하는 경우도 발생된다. 이 질병은 사전 왁진 접종으로 예방될 수 있음은 공지된 바이며 또 이같은 목적으로 백일해균 제1상의 전세포로부터 제조된 비활성화 왁진이 널리 사용되고 있다. 그러나 전세포를 함유하는 비활성화 왁진은 심한 부반응을 일으키게 되며 따라서 일본에서는 과거 한때는 왁진 접종이 금지된적도 있었다. 백일해균에 의한 유아와 어린이의 질병은 아직도 가장 중요한 사회문제의 하나로 되어 있으며 따라서 부반응이 전혀없는 백일해 왁진의 개발이 요구되어 왔다.

사또 등은 최초의 세포형 왁진인 침전된 정제 백일해 왁진 제조에 성공하였으며 또 예방항원 기본연구상에 기준이 됨을 발견하였다(1982년도 일본국 특허공보 제5203호 참조). 이 왁진은 예방항원으로서 주로 F-HA와 LPF-HA를 함유하는 HA 유분으로 구성되며 또 적은 부반응을 갖는 우수한 예방효과가 있음이 밝혀졌으며 또 이는 벌써 실제로 사용되고 있다.

이 침전 백일해 왁진은 백일해균 제1상을 적합한 배지에 접종하며, 이를 약 35℃로 약 5일간 고정 배양시키고, 배양액을 원심분리시켜 상등액을 분리한 후 상등액에 황산암모늄을 약 50% 포화농도가 되도록 첨가하고 10000r.p.m.으로 30분간 원심분리하여 수득침전물을 분리하여, 이 침전물을 염화나트륨이 추가된 완충액으로 추출하고 이 추출액을 통상의 방법으로 슈크로즈 밀도경사 원심분리를 행하여 백일해 HA 유분을 수거하고 또 내독소(內毒素) 유분을 제거한 후, 이어 수득 HA 유분을 포르마린으로 처리해서 해독시켜서 제조되며 또 경우에 따라 이같이 제조한 왁진에 디프테리아 변성독소 및 파상풍 변성독소를 첨가하고 이어서 경우에 따라 여기에 알미늄 보조제를 첨가하고 또 추가로 여기에 제라틴, 글루코즈 등과 같은 안정제를 첨가하여 침전-정제 백일해 항원, 디프테리아 변성독소와 파상풍 변성독소의 혼합 왁진을 제조하였다.

그러나, 이 방법은 미생물을 대량으로 배양해야 하는 문제점이 있기 때문에 따라서 왁진을 공업적 규모로 생산할 수 없었다.

즉, 침전-정제 백일해 왁진의 공지된 제법에 따르면 배양은 100 내지 300ml 액체매질을 함유하는 로욱스 용기(Roux's bottle)과 같은 소형 용기내에서 정지조건하의 약 35℃로 약 5일간 진행되므로 이 방법은 그 규모가 매우 작고 또 매우 장기간의 배양시간을 필요로 하게 된다.

일반적으로 대규모 미생물의 배양은 배양기를 사용하여 액체매질중에서 회전배양시켜 진행시킨다. 백일해균은 액체매질중에서 진탕배양시켜 우수하게 증식시킬 수 있으나, F-HA 유분의 제조수율은 매우 낮다(Arai, H ＆ Munoz, J. J. : Infect Immun 25,764 내지 767,1979 참조) 이는 정제 왁진의 적어도 1성분이 대규모로는 거의 생산되지 않음을 의미한다.

따라서 사또 등에 의해 개발된 침전-정제 백일해 왁진이 우수한 왁진이기는 하지만 이 왁진은 정지배양법을 사용한 관계로 아주 오랜 배양시간을 소모하면서도 소량밖에는 제조되지 않으며 따라서 이같은 왁진의 개선된 제조방법의 개발이 요구되어 왔다.

최근에 스스끼 등은 백일해균 제1상의 성장을 증대시킬 수 있으며 또한 특히 합성매질중에서 LPF-HA의 제조를 증대시킬 수 있는 각종 첨가제에 대해 연구하였으며 또 그 결과로 사이클로덱스트린 또는 이들 유도체, 특히 메틸화 β-사이클로덱스트린(예. 헵타키스 2,6-O-디메틸-β-사이클로덱스트린, 이후 "메틸화 β-CD"로 칭한다)의 첨가는 왕복식 진탕배양에 의한 합성 스테이너-스콜데(stainer-scholte) 액체매질중에서의 백일해균 제1상의 생육과 LPF-HA 제조에 매우 효과적이라는 사실이 밝혀졌으며 또 이밖에 사이클로덱스트린 화합물의 첨가는 또한 배양액중의 LPF-HA의 안정화에 효과적이라는 사실이 밝혀졌다(스스끼 등, Symposium on Toxms, proceedings of the 29th Symposium on Toxins at Osaka, 1-5, 1982, Jpn. J. Med. Scl. Bio1. ,36,111,1983).

그러나 상기 방법을 백일해 왁진을 공업적 규모로 생산하기 위하여 배양기 탱크(101 또는 그 이상 용량의 탱크)를 사용하는 확대 배양기에 적응하는 경우에는, 일정한 진탕 조건하의 회전진탕배양이나 또는 왕복식 진탕배양에서 세포농도는 증대시킬 수는 있었으나 LPF-HA의 제조는 충분치 못하였음이 밝혀졌으며 선행 진탕배양의 상식을 벗어나는 결과였다.

1977간행 WHO의 왁진, 백일해 왁진의 제조와 대조 메뉴알에는 배양기 탱크를 사용하는 백일해균의 대규모 배양과 백일해 미생물 및 이로부터 전체세포 왁진을 제조하는 제법이 기재되어 있으며, 여기서 배양은 표면폭기 또는 그리드를 통해서 매질을 폭기시키고 또 특정 교반 블레이드로 교반시킴으로서 공기가 매질내에 함유된 상태에서 진행시키고 있다.

본 발명자 등은 500 내지 600r.p.m 의 일정한 교반 블레이드 회전속도에서 용기 하부로부터의 일정한 폭기 조건하, 예를 들어 0.2VVM[공기용적(

)/배양기용적(

)/배양시 간(분)]의 공기용적으로 폭기시키는조건하에서 전술한 VHO 메뉴알에 기재된 방법에 따라 스테이너-스콜테 매질 또는 이후 설명하고저 하는 개량된 매질(10리터)중에서 백일해균을 배양하기 위해 노력하였다.

결과로서 이 방법은 세포수를 증가시키는데는 매우 효과적이기는 하지만 백일해균의 HA 유분 제조에는 충분치 못하다는 사실이 밝혀졌으며, 따라서 이 방법은 정제 백일해 왁진의 공업적 제법으로 적합치 못하였다.

본 발명자 등은 백일해균의 예방항원을 함유하는 HA 유분과 백일해 왁진을 제조할 수 있는 개선된 제법과 세포수 증가뿐만 아니라 필요로 하는 LPF-HA와 F-HA 유분 제조를 또한 촉진시키는데 적합한 배양조건에 대해 집중적으로 연구를 행하였다. 그 결과로서, 배양을 일정배양온도에서 일정농도의 용존산소(이후, "DO"로 칭함) 존재와 소포 조건하에서 또 이외에 경우에 따라 일정 pH 범위하에서 진행시키는 경우예를 들어 선행 배양기 탱크를 사용하는 회전배양에서와 같은 대규모 배양에 있어서도 세포가 현저하게 증식될뿐만 아니라, 백혈구균의 HA 유분 또는 현저히 증대됨을 발견하였으며, 또 이밖에 이같이 수득된 HA유분을 아미노산 존재하에서 포르마린으로 처리하는 경우 독소가 제거된 백일해 왁진을 수득하게 되며 또이같이 제조된 왁진을 37℃로 장시간 보관하는 경우에도 독성이 재생되지 않는다는 사실을 발견하였다. 이같은 포르마린 처리에 있어서, 아미노산이 존재하는 경우에는 수득 제독 HA 유분은 응집침전이 생성되지않기 때문에(아미노산 존재하에서 관측된 바와 같이) 박막필터로 여과할 수 있으며 또 초음파 처리등을 행할 필요가 없게 된다.

본 발명의 목적은 백일해균의 예방항원을 함유하는 HA 유분의 개선된 제조방법을 제공하는데 있다. 본발명의 또 다른 목적은 선행 배양기와 같은 대규모 배양으로 HA 유분을 제조하는 공업적 제법을 제공하는데 있다. 본 발명의 이밖의 목적은 백일해 왁진을 공업적 규모로 제조하는 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 이같은 목적과 이밖의 목적 및 장점은 다음 기재사항으로부터 본 기술분야에 숙련된 자들에게는 자명하게 된다.

본 발명에 따라 필요로 하는 HA 유분은 사이클로덱스트린 또는 이의 유도체를 함유하는 액체매질내에 백일해균을 접종하고 소포 조건하의 온도조정범위 20 내지 37℃ 및 DO량 조정범위 0.7 내지 6.0ppm하에서 또 경우에 따라 pH 조정범위 6.0 내지 9.0하에서 교반, 폭기시키면서 배양하고 또 로그적 발육상 또는 고정 발육상에서 제조된 예방항원의 HA 유분을 수득함으로서 제조될 수 있다.

이밖에, 백일해 왁진은 HA 유분을 아미노산 존재하에서 포르마린으로 처리하고 또 포르마린 처리 HA유분을 정제 백일해 왁진, 침전-정제 백일해 왁진 또는 침전-정제 백일해 왁진, 디프테리아 변성독소와 파상풍 변성독소의 혼합 왁진으로 제조함으로서 HA 유분으로부터 제조할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 출발물질 백일해균으로는 백일해 왁진을 제조하는데 사용되는 입수 가능한 백일해균의 모든 균주를 들 수 있다. 통상적으로, 제1상 균주는 볼데트-겐고우 매질내에서 2차 배양시키고 또 회전배양으로 배양시킨 후에 사용된다.

이같은 배양은 종배양으로 사용되며 또 액체매질내에 접종된다. 백일해균 제2상 균주가 또한 사용될 수있다. 접종되는 종배양의 양은 규정되어 있지는 않지만, 통상 최종농도로서 0.2 내지 10IOU/ml, 바람직하게는 약 10IOU/ml 범위이다[IOU 국제 불투명도 단위, 1IOU는 1×10⁹미생물이 된다 W.H.O.Technical Reports Series 1979, Vol 638, 66페이지, A. 3. 3. 2. 참조]

액체매질의 예로는 모든 공지 액체매질, 바람직하게는 스테이너-스콜테 매질, 더 바람직하게는 변형 스테이너-스콜테 매질, 예를 들어 0.1 내지 20g/l의 카사미노산으로 보충되고 아스코브산과 글루타티온의 함량이 각각 0.01 내지 1g/l와 0.1 내지 5g/l 범위로 조절된 스테이너-스콜테 매질(이후,"변형매질"로 칭한다)을 들 수 있다.

매질에 첨가되는 사이클로덱스트린(CD로 약함) 또는 이의 유도체의 예로는 α-CD,β-CD 및 γ-CD의 모든 이성체, 메틸화 α-CD, 메틸 β-CD 또는 γ-CD와 같은 에테르와 유도체; 와 이밖에 아민화 유도체와 에스테르화 유도체 또는 그 유사체를 들 수 있다. 이들 CD 화합물은 단독으로 사용되거나 또는 2개또는 그 이상을 혼합해서 사용된다. 이들 화합물중, 디메틸화 β-CD(헵타키스 2,6-O-디메틸-β-사이클로덱스트린), 디메킬화α-CD(헵타키스 2,6-O-디메틸-α-사이클로덱스트린), 트리메틸화β-CD(헵타키스 2,3,6-O-트리메틸-β-사이클로덱스트린)과 트리메틸화 α-CD(헵타키스 2,3,6-O-트리메틸-α-사이클로덱스트린)이 가장 효과적이다.

CD 화합물의 양은 규정되어 있지 않지만, 통상 0.001 내지 5g/l 범위, 바람직하게는 약 0.5 내지 2.5g/l이다.

대규모 배양에서 백일해균의 세포증식과 H-FA 및 LPF-HA의 제조증대는 배양온도와 DO 조절, 소포처리 및 이밖에 pH 범위조절의 영향을 받게 된다는 사실이 본 발명자 등에 의하여 밝혀졌다. 이들 인자는다음에 상세히 설명하였다.

배양온도의 최적범위는 종배양으로 볼데트-겐고우 매질로부터 수득한 백일해균 제1상 토하마 균주의 제2배양을 사용하고, 제2배양(0.2IOU/ml)을 1.0g/l의 메틸화 β-CD를 함유하는 변형매질(10ml)에 접종하고 또 이를 온도경사 배양장치 TN 112D(도요 가가꾸 산교 가부시기가이샤 제품)을 사용해서 60회/분의 왕복식 진탕속도로 48시간 동안 17℃ 내지 42℃ 온도로 배양하여 시험하였다. 세포농도는 광전자 색도계Coleman Jr. 6D형(콜만사 제품)으로 탁도를 측정해서 환산하였다.

본 실험은 소규모로 행하였으나 배양온도에 관한 한예는 적어도 유사한 경향이 배양기를 사용하는 대규모 회전배양에서도 관측될 것이다.

시험결과는 첨부 제1도에 도시하였다. 제1도에 도시된 바와 같이 미생물은 20 내지 37℃, 바람직하게는 23 내지 37℃의 배양온도에서 잘 성장될 수 있다.

매질중의 DO양은 0.7 내지 6.0ppm, 바람직하게는 1.0 내지 5.5ppm 범위이다. DO를 상기 범위로 조절함으로서 백일해균의 증식이 증가되며 또 LPF-HA 및 F-HA의 제조가 또한 획기적으로 증가된다.

DO는 폭기속도와 교반속도를 조절함으로서 바람직하게 조정된다. 폭기속도와 교반속도는 규정되어 있지않지만, 폭기속도는 3VVM 미만으로. 통상 0.1 내지 2VVM 범위, 바람직하게는 0.1 내지 1.5VVM 범위이고 또 교반속도는 600r.p m. 미만으로, 통상 50 내지 350r.p.m. 범위, 바람직하게는 100 내지 250r.p.m. 범위이다. 순수산소가 공기와 함께 사용되는 경우에는 폭기속도와 교반속도를 감소시킬 수도 있다.

배양액중의 미생물 생육과 F-HA 및 LPF-HA의 수율은 또한 소포체 처리에 의하여 크게 영향을 받게된다. 예를 들어, 다음에 기술되는 바와 같이 실시예1에서와 동일 조건하에서 소포처리 않고 배양을 행하는 경우에는 세포가 기포에 접착되고 또 용기 기벽에 부착되거나 또는 공기배기노즐을 통해 배출됨으로서 결과적으로 세포농도와 F-HA 및 LPF-HA양이 수% 내지 80% 감소되는 결과를 얻게 된다. 소포처리는 예를 들어 회전판 또는 분무노즐과 같은 선행 소포장치를 사용하거나 또는 지방족 에스테르(예: 아사히 일렉트로 케미칼 캄파니 제품의 B-3009A), 실리콘 화합물(예: 시네쮸 케미칼 캄파니 제품의 KM70, KM72), 알콜 화합물(예: 아사히 일렉트로 케미칼 캄파니 제품의 LG109, LG126)과 같은 화학 소포체를 사용하는 선행 기계적 소포처리 또는 화학적 소포처리로 행할 수 있다. 배양액으로부티 HA 유분회수 및 정제가 더 용이하다는 관점에서 기계적 소포처리 방법이 더 바람직하다.

매질의 최적 pH 범위는 D0를 2.5ppm으로 고정시킨 이외에는 실시예1에서와 동일한 조건하에서 각종pH를 갖는 매질중에서 백일해균을 배양함으로서 결정하였다. 결과로서, pH 범위 6.0 내지 9.0에서 미생물이 잘 성장되고 또 pH 6.5 내지 8.5, 특히 pH 6.8 내지 7.5 범위에서 미생물의 생육속도 또한 다소 증대되었다.

배양온도, DO량, 소포처리 및 pH 범위의 조절은 자동조절 또는 수동조절로 행할 수 있다.

필요로 하는 HA 유분을 고수율로 수득하기 위해서는, 미생물의 생육상을 점검하는 것이 중요하며 또 유분을 로그식 발육상 내지 전환상을 통한 고정발육상 단계에서 수확하는 것이 가장 바람직하다.

이 단계는 접종되는 미생물 양으로 변경될 수도 있으나, 통상 접종 후 7 내지 40시간이다. 예를 들어,10IOU/ml의 미생물이 접종되는 경우에 적합한 배양시간은 통상 24 내지 35시간이다.

HA 유분-함유 배양액을 사용하면 침전-정체 백일해 왁진이 예를 들어 다음 방법으로 제조된다.

앞에서 수득된 배양액은 그 상태 그대로 사용하거나 또는 상등액을 분리하기 위하여 원심분리한 후에 사용된다. 이 배양액 또는 상등액에 황산암모늄을 약 1/3 포화량이 되도록 첨가하고, 또 수득 침전물을 원심분리법 또는 여과법으로 수거한다. 침전을 1몰의 염화나트륨을 함유하는 인산염 완충액(pH 7.2)에 용해시킨다, 이 용액에 황산암모늄을 약 1/2 포화량이 되도륵 첨가하고 또 수득 침전물을 원심분리법 또는 여과법으로 분리시킨다. 침전물은 투석관내에서 상술한 바와 동일한 완충액에 대해 투석을 행한다. 수득용액을 초원심분리시키고 또 상등액을 슈크로즈밀도 경사 원심분리에 걸어주고 또 상등액(백일해균의 HA 유분)을 수거한다.

전술한 공정은 4℃ 또는 그 이하 온도에서 바람직하게 진행된다. 이같이 수득된 HA 유분은 다량의 필요로 하는 LPF-HA와 F-HA를 포함하고 있다. 전기이동에 따라 이같이 수득된 LPF-HA와 F-HA는 백일해균의 공지된 고정배양에 의해 수득된 LPF-HA 및 F-HA의 유사한 분자량과 저하를 갖게 되며 또 이밖에 유사한 형태(전자현미경으로 관찰함), 동일한 항원성(겔중에서 침전반응으로 시험함)과 동일한 LPF 쥐독성을 갖는다.

이같이 수득된 HA 유분은 식염수를 사용해서 적당히 희석하는데, 통상 2 내지 3배 희석을 행하며 또 여기에 포르마린을 0.1 내지 1.2 v/v%, 바람직하게는 0.4 내지 0.8v/v% 농도로 첨가하고 또 이 혼합물을 20 내지 43℃ 온도, 바람직하게는 37 내지 40℃ 온도에서 3일 내지 60일간 처리한다. 이 포르마린 처리에 의해서 LPF 활성과 HSF(히스타민-감지인자) 활성이 감소되며 비독성 유분이 제조된다. 본 발명자 등은이 포르마린 처리를 아미노산 존재하에서 행하는 경우에 포르마린 처리시간이 현저하게 짧게 되며 또 이외에도 응집침전 현상이나 또는 독성의 재생현상 등이 유발되지 않는다는 사실을 알게 되었다.

트윈 80이나 또는 제라틴과 같은 안정제가 경우에 따라 아미노산과 함께 첨가할 수도 있다. 이 안정제는 통상 0.02 내지 0.05% 량으로 사용된다.

아미노산의 예로는 글리신, 메티오닌, 시스테인, 나트륨글루타메이트, 아스파르트산, 세린, 알라닌. 루이신, 발린, 트레오닌, γ-아미노부티르산, 리신, 히스티딘 등을 들 수 있으며, 이들 물질은 단독으로 사용하거나 또는 2개 또는 그 이상을 혼합 사용할 수도 있다. 아미노산의 양은 규정된 것은 아니지만, 통상 0.01 내지 0.5M, 바람직하게는 0.05 내지 0.3M 범위이다.

본 발명에서 예를들어 배양기를 사용하여 사이클로덱스트린 또는 이의 유도체를 함유하는 매질중에서 배양시킨 후에 배양액으로부터 수득한 정제 HA 유분을 아미노산 존재하에서 포르마린과 처리하는 경우에는 응집침전물이 전혀 생성되지 않게 되며 따라서 이는 선행 살균용 박막필터로서 여과할 수 있다. 반대로, 포르마린 처리를 아미노산이 거의 부존하는 상태에서 진행시키는 경우에는 사이클로덱스트린을 함유하지 않는 매질중에서 선행 고정배양에 따라 수득한 HA 유분의 포르마린 처리에서와 같이 응집침전물이 생성하게 되며, 따라서 이를 초음파 처리해서 분쇄시킬 필요성이 발생된다. 이 경우에 이 유분을 살균용 박막필터로 여과해 준다는 것은 매우 어렵게 된다.

전술한 바와 같은 포르마린 처리와 여과조작 후에, 여과액은 적합한 단백질 농도, 통상 만백질 질소의 최종농도가 8 내지 20μg TCAPN/ml(TCAPN :뜨거운 트리클로로아세트산에 침전되는 단백질 질소)가 되도록 조절한다.

이같이 해서 수득된 용액은 경우에 따라 디프테리아 변성독소와 파상풍 변송독소로 혼합하고 또 경우에 따라 여기에 최종농도 0.15 내지 0.3μg/ml로 수산화알미늄 또는 인산알미늄과 같은 첨가제를 첨가해서 침전시키고 또 이어 수득 침전물을 제거한다.

최종적으로 제라틴 또는 글루코즈와 같은 안정제와 또한 티머로살과 같은 보존제를 여기에 첨가해서 필요로 하는 왁진을 수득한다.

본 발명은 다음 실시예로서 설명될 수 있으나 본 발명을 여기에 한정하려는 의도는 결고 아니다.

실시예 1

50리터 배양기(마루비시 리카 가부시기가이샤 제품)에 살균 메틸화 β-CD를 최종농도 10g/l로 첨가한 표1에 제시한 성분을 갖는 변형매질 35/를 장입한다.

백일해균 제1 상을 1.0IOU/ml 양으로 접종한 후에 DO양을 변화시켜 가면서 35℃, PH 7.2에서 24시간동안 기계 소포처리와 함께 스퍼져를 사용하면서 용기 하부를 관통하는 폭기조건하에서 이를 배양한다.

이같이 수득된 배양액에 대하여 각종 인자를 측정하였다.

세포농도 : 앞에 기술한 것과 동일 방법으로 측정함.

F-HA :혈구응집소 시험으로 측정함(사또, Y. 등, Infect Immun 7,992 내지 999, 1973 참조).

시험관내 LPF-HA : 단위(LPEU/ml)는 Hp-ELISA 방법으로 측정함[사또 등, Jpn. J. Med. Sci. Biol., 35, 135, 1982 참조).

생체내 LPF-HA : LPF-HA를 ddY 숫놈쥐(4주령)에 정맥내 투여하고 또 이 정맥투여 3일 후에 백혈구수를 헤아려서 측정함.

결과는 첨부 제2도에 기재하였다.

제2도로부터 분명한 바와 같이 0.7 내지 6.0PPm 범위, 특히 1.0 내지 5.5ppm DO 범위에서 미생물 발육의 증대와 HA 유분 제조의 촉진현상이 관측되었다.

[표 1]

* 기본배지는 고압하의 121℃에서 30분간 살균하고 또 보충액을 박막여과법에 따라 살균처리하고 또 2개용액을 사용전에 혼합하였다.

참고실시예 1 내지 10과 실시예 2 내지 5

백일해균의 HA 유분 제조를 각종 배양조전에 따라 특히 폭기와 교반이 모두 일정하게 행해지는 선행 배양기와 폭기와 교반이 계속해서 변화되는 본 발명 배양기 간에 대해 비교하였다.

141 배양기(NBS 캄파니 제품)에 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 변형매질(10리터: 메틸화 β-CD가 최종농도 10g/l로 첨가됨)을 장입하고 또 여기에 백일해균 제1상을 10IOU/ml 양으로 접종하고 또 이어 이는 표 2에서 설정한 것과 같은 조건하의 35℃에서 36시간 동안 스퍼져를 사용해서 용기바닥으로부터 폭기시키면서 배양하였다.

표 2의 참고실시예 1 내지 5, 7과 8에서는 소포처리를 행하지 않은 일정한 폭기 및 교반하에서 배양을 행하엿으며, 이중 참고실시예 5의 배양조건(교반속도 100r.p. m , 폭기 0.5VVM)에서 HA 유분 제조가 우수하였다. 그러나, 이와 같은 우수한 조건 하에서도 특정 로그식 발육(세포농도 약 10IOU/ml)에는 약 10시간까지는 도말될 수 있었으나 발육속도가 그 이후부터는 급격히 감소하게 되고 또 36시간 후에 이르러도 세포농도는 약 15IOU/ml에 불과하고 또 HA 유분 제조 또한 소량에 불과하였다(F-HA : 16HA/ml LPF-HA : 100LPEU/ml) 배양을 48시간 계속하더라도 세포농도나 HA 유분 제조량은 거의 증가되지 않았다.

참고실시예 7과 8에서는 소포처리를 행하지 않고 0.2VVM의 폭기속도와 500r. p.m 또는 600r.p.m.의 고정교반하에서 배양을 행하였다. 전술한 2개 실시예에서 5 내지 10시간 경과후에 세포는 용기 상부벽에 점착되거나 또는 배양액이 격렬한 발포현상으로 인하여 용기 외부로 넘쳐 흐르게 되고 또 36시간 경과 후 용기내 잔유 모든 세포가 기벽에 점착되었고 또한 넘쳐흐른 세포를 수거한 경우에도 HA 유분의 제조량은 크게 저하하였다.

참고실시예 10에서는 DO를 조절한 상태, 그러나 소포처리를 하지 않은 상태에서 배양을 행하였다. 이 배양에서도, 배양액 유출과 세포의 기벽 점착현상이 관측되었고 또 HA 유분 제조량이 크게 감소되었다.

참고실시예 6 내지 9에서는 소포처리를 행하고 일정한 폭기 및 교반상태에서 배양을 행하였다. 이 모든경우에, 배양 초기단계에서의 DO량은 6.0ppm 이상으로서 HA 유분 제조에 적합치 못하다. 배양이 진행되면서, DO는 계속해서 감소되고 또 36시간 이전에 0.7ppm 이하로 떨어져서 세포증식 및 HA 유분 제조에 적합치 못하게 된다.

화학 소포체 처리를 행한 참고실시예 9에서는 36시간 후에 세포농도가 80IOU/ml가 되었으나 F-HA 및 LPF-HA는 각각 128HA/ml 및 500LPEU/ml가 되었다.

실시예 2 내지 5에서는 소포처리를 행하고 DO 조절기(NBS 캄파니 제품)로 폭기와 교반속도를 자동적으로 또 연속적으로 조절함으로서 DO를 1.6 내지 3.5ppm으로 유지하면서 배양을 행하였다.

이 모든 실시예에서는 10시간 경과 후에도 미생물은 로그적 상에서 성장하고 또 36시간 후에는 세포농도, F-HA 및 LPF-HA가 높은 수준으로 수득되었다.

그러나, 폭기가 표면에서 행해진 경우에는 HA 유분의 제조를 관측할 수 없었다.

[표 2]

1) ＋ : 조절함 , - : 조절않음.

2) *＋ : 화학 소포제 처리, 기타 ＋ : 기계 소포처리.

3) 자동은 표시된 DO 양으로 조절하는데 자동조절방법을 사용하였음을 의미한다.

상기 결과에서 명백한 바와 같이, DO 조절이 없는 배양기에서의 세포발육은 소포가 행해진 경우에만 관찰할 수 있었으나 이같은 경우에도 F-HA 및 LPF-HA의 생산성은 아직도 매우 낮았다.

한편, 배양을 DO 조절하에서 행할 경우에는 세포 발육뿐만 아니라 F-HA 및 LPF-HA 제조 또한 현저히 증가한다. 따라서 배양기 내에서 DO 조절에 의하여 세포발육이 증대되고 또 백일해균의 필요로 하는 HA 유분 제조량이 현저하게 증가된다.

참고실시예 11과 실시예 6 및 7

백일해균의 필요로 하는 HA 유분을 제조하기 위해서 특정조건 하에서 진행되는 본 발명의 배양과 선행고정배양을 다음 표 3에 비교 수록하였다. 각 배양은 공통사항으로 미생물 접종량 및 배양온도를 각각 1.0IOU/ml 및 35℃로 한 것 이외에는 다음에 기술한 데로 진행하였다.

(A) 고정배양(참고실시예 l1)

배양용기 : l. 5리터 부피 로욱스 용기

매질 : 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 변형 매질(0. 2

)

배양기간 : 120시간

(B) 특정조절배양(본 발명 실시예 6 및 11)

배양용기 : 300리터 배양기(마루비시 리카 가부시기가이샤 제품)

매질 : 1.0g/

의 메틸화 β-CD로 보충되고(실시예 6) 또 10g/

의 메틸화 α-CD로 보충된(실시예 7) 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 변형매질(200

)

DO조절 : 2. 2 내지 2. 4ppm.

소포처리 회전판을 사용한 기계적 소포처리.

pH 조절 : pH 7. 3

배양시간 : 35시간

상기 결과를 다음 표 3에 도시하였다.

[표 3]

표 3으로부터 명백한 것처럼, 본 발명 제법은 선행 고정 배양법에 비하여 세포증식과 LPF-HA제조에 있어 월등하게 우세하고. 또 F-HA 제조에 있어 동일 내지는 우세하였다. 예를 들어 본 발명 제법은 고정배양법과 비교할때 세포농도가 2 내지 3배 높고 또 LPF-HA 수준이 10배 또는 그 이상이었다. 이밖에 본발명은 배양시간이 120시간 내지 35시간 등으로 현저하게 단축되었다.

실시예 6과 7에서의 DO 조절하의 배양에서 시간경과에 따른 세포농도, F-HA 및 LPF-HA 수준의 변화를 첨부도면 제3(I)도 및 3(II)도와 제4(I)도 및 4(II)도에 각각 도시하였다. 이들 도표로부터 명백한바와 같이, 본 발명에서의 DO 조절하의 배양은 세포농도를 증가시키고 또한 F-HA 및 LPF-HA 제조의 탁월한 증가를 가져온다.

실시예 8

실시예 1에서 수득한 HA 유분은 단백질 농도가 30μg TCAPN/ml로 되도록 생리적 식염수로 희석시킨다. 이 용액에 포르마린을 0.6 또는 1.0부피/부피%로 첨가하고 또 이 혼합물을 37℃ 또는 39℃에서 5 내지 21일간 처리한다. 이 포르마린 처리단계에서 표 4에 기재한 각종 아미노산을 기재농도가 되도록 첨가한다.

포르마린 처리기간 중에 응집침전물이 현저하게 나타나게 되며 또 이어 용액은 투석관 내에서 투석시켜 포르마린을 제거하고 또 이어 제품의 잔유독성을 쥐를 사용 시험하였다. 이 밖에 37℃로 3주일간 보관한 후에 독성 재생시험을 다시 행하였다. 왁진의 성능시험 또한 행하였다. 이들 결과는 다음 표 4에 도시하였다.

[표 4]

1) 각 왁진(8g TCAPN/ml)은 수산화알미늄에 의하여 최종농도 0.2mg/ml로 침전되었다.

*) ○ : 국가조절시험 통과. ● : 시험통과 못함.

**) ND : 측정않음. ***) IPU : 국제제조단위.

실시예 9

볼데트-겐고우 매질에서 배양하여 수득되는 백일해균 제1상 토하마 균주를 종배양으로 사용한다. 종배양을 21 플라스크에서 10mg/ml의 메틸화 β-CD를 보충한 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 변형매질(0.4

)중으로 최종농도 1.0IOU/ml로 접종한다. 35℃ 200r.p.m.에서 회전진탕을 18시간동안 시켜 배양을 진행시킨다.

앞에서 제조된 배양액을 전부 합치고 또 300

배양기(마루비시 리카 가부시기가이샤 제품)내에 전술한바와 동일한 매질 200ml중에 1.0IOU/ml 양으로 접종하고 또 이것을 폭기 교반시키면서 배양한다.

이 배양은 DO 범위가 1.8 내지 2.7ppm이 되도록 폭기와 교반속도를 자동 제어시키면서 행한다. 이밖에 다른 조건들을 자동 제어하여 배양온도 35℃ 및 PH 7.2가 되도록 하고 또 이밖에 소포처리를 회전판을 사용 기계적으로 행한다.

35시간 동안 배양한 후에 배양액을 수거한다. 배양액에 대하여 세포농도와 HA 유분량을 측정한다. 결과로서 세포농도 210IOU/ml, F-HA ; 1,024HA/ml 및 LPF-HA ; 2,400LPEU/ml를 수득하였다.

배양액을 원심분리하고 또 상등액을 수거한다. 이 상등액에 황산암모늄을 1/3 포화량이 되도록 첨가하고 또 수득침전물은 10000r.p.m.으로 30분간 원심분리해서 수거한다.

이 침전물을 1몰의 염화나트륨이 보충돤 인산염 완충액(pH 7.2)중에 용해하고 또 비용해질 물질은 10000r.p.m.으로 30분간 원심분리시켜 제조한다. 수득상등액에 황산암모늄을 약 1/2 포화 농도가 되도록 첨가한다. 수득침전물을 유사한 원심분리법으로 수거하고 또 다시 전술한 바와 동일한 완충액에 용해시키고 또 투석관에서 4℃로 투석하고 또 비용해물질은 원심분리법에 의하여 유사하게 분리 제거한다. 용액을 초원심분리시키고 또 상등액을 10 내지 30% 슈크로즈 밀도경사 원심분리에 걸어주고(39000r.p.m.에서 20시간 동안) 또 이어 HA 유분을 수거한다. HA 유분을 합치고 또 이를 박막필터를 통해주어 여과 살균시킨다. HA 유분의 단백질 농도는 전술한 것과 동일한 완충액으로 30μg TCAPN/ml로 희석한다. 수거 배양액 처리와 HA 유분 정제의 전술한 처리단계는 2 내지 4℃에서 진행시킨다.

전기 수득 HA 유분에 0.6v/v% 포르마린, 0.05v/v% 트윈 80, 0.02w/v% 제라틴과 0.25M 글리신을 첨가하고 또 이 혼합물을 39℃에서 7일간 보관한다. 이 혼합물을 투석관 내에서 0.7w/v% 영화나트륨으로 보충된 인산염 완충액(pH 7.2)에 대하여 투석을 행하고 또 수득용액을 전술한 것과 동일한 완충액으로 단백질 농도가 8μg TCAPN/ml로 되게 희석하여 비독성 HA 유분의 희석용액을 수득한다.

이 희석용액에 수산화알미늄 겔을(알미늄으로 환산해서)0.20mg/ml 양이 되게 첨가함으로서 HA 유분을 알미늄 겔 상에 흡착시키고 또 여기에 보존제로서 0.01w/v% 티머로살을 첨가해서 필요로 하는 침전-정제 백일해 왁진을 수득한다.

이같이 수득된 왁진의 특성은 국가대조시험법에 따라 시험하였다(일본국 보건후생성 Minimum Requirement of Bio1ogical Products, #287, 1981참조) 결과적으로, 이들의 모든 특성은 표5에 기재된 바와 같이 흡족한 것이었다.

[표 5]

실시예 10

실시예 9에서 수득한 비독성 HA 유분의 회석용액에 디프테리아 변성독소(33Lf/ml)와 파상풍 변성독소(5Lf/ml)를 첨가하고 또 여기에 알미늄 하이드록사이드겔(알미늄으로 환산 0.20mg/ml)을 첨가하여 HA 유분 및 변성독소를 알미늄겔 상에 흡착시킨다.

이 혼합물에 안정제로서 0.02w/v% 제라틴과 0.1w/v% 글루코즈를 첨가하고 또 추가로 보존제로서 0.01w/v% 티머로살을 첨가해서 침전-정제 백일해 왁진, 디프테리아 변성독소 및 파상풍 변성독소의 필요로하는 혼합 왁진을 수득한다.

이 혼합물에 안정제로서 0:02w/v% 제라틴과 0.1w/v% 글루코즈를 첨가하고 또 추가로 보존제로서 0.01w/v% 티머로살을 첨가해서 침전-정제 백일해 왁진, 디프테리아 변성독소 및 파상풍 변성독소의 필요로 하는 혼합 왁진을 수득한다.

이같이 수득된 혼합 와진의 특성은 국가대조시험법 (일본국, 보건후생성, Minimum Requirement of Viological Products, #287, 1981참조)에 따라 시험하였다. 결과로서, 이들의 모든 특성은 표 6에 기재된 바와 같이 흡족한 것이었다.

[표 6]

Claims

사이클로덱스트린 또는 이의 유도체를 함유하는 액체 매질중에 백일해균(B. pertussis)의 균주를 접종하고 :이를 소포 조건하의 용존산소량 0.7 내지 6.0ppm 및 배양온도 20 내지 37℃에서 회전배양(Spinnerculture)법으로 배양시키고 : 또 로그식 발육상 내지는 고정식 발육상 단계에서 배양액으로부터 제조 HA 유분을 수득하는 단계로 구성되는 백일해균의 예방항원을 HA 유분의 제조방법.
제1항에 있어서, 액체매질이 0.1 내지 20g/
의 카사미노산, 0.01 내지 1g/
의 아스코브산, 0.1내지 50g/
의 글루타티온 및 0.001 내지 5g/
의 사이클로덱스트린 또는 그 유도체를 함유하는 HA 유분제조방법.
제1항에 있어서, 사이클로덱스트린 또는 그 유도체가 메틸화 α-사이클로덱스트린, 메틸화 β-사이클로덱스트린, 메틸화 γ-사이클로덱스트린,α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린 및 γ-사이클로덱스트린으로 구성되는 군에서 선정한 1개 물질이거나 또는 이의 2개 또는 그 이상의 혼합물질인 HA 유분제조방법.
제1항에 있어서, 배양을 7 내지 40시간 진행시키는 HA 유분 제조방법.
제1항에 있어서, 소포처리가 기계적 소포처리 방법으로 행해지는 HA 유분 제조방법.
제1항에 있어서, 소포처리가 화학 소포제로 행해지는 HA 유분 제조방법.
제1항에 있어서, 배양을 pH 6.0 내지 9.0에서 행하는 HA 유분 제조방법.
제1항에 기재한 방법에 따라 제조된 HA 유분을 아미노산 존재하에서 포르마린 처리하는 단계로 구성되는 백일해 왁진의 제조방법.
제8항에 있어서, 아미노산이 글리신, 메티오닌, 시스테인, 나트륨글루다메이트, 아스파르트산, 세린, 알라닌, 로이신, 발린, 트레오닌, 히스티딘과 γ-아미노부티르산으로 구성되는 군으로부터 선징된 물질이거나 또는 이들중 2개 또는 그 이상의 혼합물질인 백일해 왁진의 제조방법.
제8항에 있어서, 왁진을 디프테리아 변성독소(toxoid)와 파상풍변성독소와 혼합하여 혼합왁진을 수득하는 백일해 왁진의 제조방법.