JPS59184132A - 百日ぜきワクチンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、百日ぜき菌の感染防御抗原ＨＡ画分（Ｆ　−
ＨＡ　：　Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ　Ｈｅｍａｇｇｌｕ
ｔｉｎｉｎおよびＬ　Ｐ　Ｅ　−ＨＡ　：　Ｌｅｕｃｏ
ｃｙｔｏｓｉｓ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇＦａｃｔｏｒ　Ｈ
ｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎを含んだ両分）を採取し、該
ＨＡ画分をアミノ酸の存在下に無毒化することによ・９
百日ぜきワクチンを製造する方法、さらに詳しくは、百
日ぜき菌をシクロデキストリン寸たはその誘導体を添加
した液状培地にて通気攪拌培養するに際し、培養温度お
よび溶存酸素量を特定範囲に制御しかつ消泡条件下で行
なうことにより百日ぜき菌の感染防御抗原ＨＡ画分を採
取し、これをアミノ酸の存在下に無毒化して百日ぜきワ
クチンを工業的規模にて製造する方法に関する。

産業上の利用分野 百日ぜきは我が国では届出伝染病に指定されてお９、乳
児〜幼児に多発する公衆衛生上重要な感染症である。と
くに乳児では重症経過をたどることが多く、時には死亡
例もみられる。この疾病は古くからワクチンによる予防
が効果的であることが知られており、原因菌である百日
ぜき菌■−相菌の全菌体の不活性ワクチンが広く用いら
れていた。

しかし、このような菌体不活化ワクチンは副作用が強く
、そのため一時期にはワクチンの接種が中止されていた
。その一方、百日ぜきによる乳幼児の疾病は大きな問題
となってお９、副作用のないワクチンの製造が熱望され
ていた。

従来技術 先に、佐藤らは感染防御抗原に関する基礎的研究をもと
にして画期的なコンポーネントワクチンである沈降百日
ぜき精製ワクチンの製造に成功した（特公昭５７−５２
０３号を参照）。このワクチンはＦ−ＨＡおよびＬＰＦ
−ＨＡを含んだＩ−Ｉ　Ａ画分を主な感染防御抗原とし
、副作用をほとんど示すことなく優れた予防効果を有す
るものであってすでに実用化されている。

この実用化されているワクチンの製造には、百日ぜき■
相菌を適当な培地に接種し、３５°Ｃ前後で５日間静置
培養し、培養液を遠心し、その上清に硫酸アンモニウム
を約５０チ飽和になるように加えるかアルコール添加し
、生じた沈殿を１０．ＯＱ　Ｑ　ｒｐｍ、３０分間遠心
して分離し、この沈殿を塩化ナトリウム添加緩衝液にて
抽出し、その抽出画分を常法によりショ糖密度勾配遠心
にかけて百日ぜきＩ（Ａ画分を回収し、ホルマリンで無
毒化処理してワクチンとしており、所望によりこれにジ
フテリアトキソイド、破傷風トキソイドを加え、さらに
必要によりアルミニウムアジュバント処理し、ゼラチン
、グルコースなどの安定剤を添加して沈降精製百日ぜき
・ジフテリア・破傷風混合ワクチンとしている。

しかしながら、この方法ではとくに培養に難点があり、
大規模な培養が不可能でワクチンの量産が困難である。

すなわち、この公知の沈降百日ぜき精製ワクチンの製造
法では、ル−瓶などの小容器に液状培地を１００〜３０
０ｍｌ！程度入れて横臥位置で３５℃前後にて５日間静
置培養するもので、きわめて小規模でかつ長期間を要す
る。一般に微生物の大量培養には液状培地による攪拌培
養方式が採用されることが多い。百日ぜき菌は液状培地
による振盪培養を行なうと菌自身の増殖はある程度まで
は達成されるが、たとえばＨＡ画分の産生けきわめて低
いといわれている（　Ａｒａｉ、　Ｈ，＆Ｍｕｎｏｚ、
　Ｊ、　Ｊ、、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　２５
．　７６４−７６Ｌ、’　１９７９を参照）。このこと
は精製ワクチンの構成成分の少なくとも一方は量産し難
いことを示唆するものである。しだがって、この佐藤ら
の百日ぜきワクチンは画期的なワクチンであるがその製
造には小規模で長時間を要する静置培養に頼らざるを得
す、その製法の改良が熱望されている。

最近、鈴木らは百日ぜき■相菌の増殖を促進しかつＬＰ
Ｆ−ＨＡの産生を促進しつる添加物の検索ヲ試み、シク
ロデキストリンおよびその誘導体、とくにメチル化β−
シクロデキストリン（２，６−ジ（０−メチル）−β−
シクロデキストリン、以下メチル化β−ＣＤと略称する
）の添加が百日ぜき■相菌のステイナーショルテ液体培
地（Ｓｔａｉｎｅｒ。

Ｄ、　Ｗｌ＆８ｃｈｏｌｔｅ、　Ｍ、　Ｊ、　；　Ｊ、
　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂ、ｔｏｌ、　６３　。

２１１−２２０．１９７１を参照）を用いた攪拌培養に
おける菌増殖およびＬＰＦ−ＨＡ産生を促進すること、
さらに培養液中でのＬＰＦ−ＨＡの安定性にも寄与する
ことを報告している（鈴木ら、第２９回毒素シンポジウ
ム予稿集、１〜５．１９８２を参照）。

しかしながら、かかる方法を１０１あるいはそれ以上の
スケールの発酵槽を用いる工業的規棟の百日ぜきワクチ
ンの製造に適用した場合には、従来の攪拌培養にもとづ
く知見からは全く類推できない結果が得られた−０すな
わち、攪拌条件を一定とする振盪培養や攪拌培養系では
菌数の増加は見られる場合もあるが、ＬＰＦ　　ＨＡの
産生量は充分でないことを知ったのである。

まだ、ＷＨＯの１９７７年刊行の資料（Ｍａｎｕａｌｆ
ｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎａ　ｃｏｎ
ｔｒｏｌ　ｏｆ　ｖａｃｃｉｎｅｓＰθｒｔｕｓＳｉｅ
　ｖａｃｃｉｎｅ、　ＷＨＯを参照）によれば、百日ぜ
きワクチンの製法に関して発酵槽を用いた百日ぜき菌の
大量培養について記載されており、空気を上方からの表
面通気によりあるいはグリッドを通して培地中に入れ、
特殊な羽根で攪拌して培養液内に巻込む方式で、一定の
通気攪拌によって百日ぜき菌菌体を得ることができると
している。

しかしながら、本発明者らは、ステイナー・ショルテ培
地あるいは後述のその改良培地１０１の培養規模におい
てＷＨＯの記述に準じ、槽底からの通気量を０，２ＶＶ
Ｍ（空気流量（Ｉｌｌ’）／培養容量（１）／時間＠）
、羽根の回転数を５００あるいは６００ｒｐｍの一定と
し、いわゆる槽底からの一定通気攪拌培養系について検
討を加えたところ、菌数の増加は期待できるが、百日ぜ
き菌ＨＡ画分の産生は不充分であシ、到底、精製百日ぜ
きワクチンの工業的生産には適さないことを知った。

そこで、本発明者らは、大規模な培養装置、とくに通常
の発酵槽を用いた通気攪拌培養においても菌の増殖とと
もに所望のＨＡ画分の大量生産に適した培養条件を見い
出すべく種々研究を重ねた結果、ある範囲の培養温度に
おいて溶存酸素量（以下、Ｄｏと略記することがある）
を特定の範囲に制御しかつ消泡処理をしながら、さらに
望ましくは、ｐＨの制御条件下に培養することにより、
大規模な培養、とくに通常の発酵槽を用いた通気攪拌培
養においても、百日ぜき菌の著しい増殖とともに、百日
ぜき菌ＨＡ画分を著しく増大しうろことを見い出し、さ
らにこのＨＡ画分にアミノ酸の存在下で通常の不活化剤
、例えばホルマリンやグルタルアルデヒドを加えること
により無毒化が達成され、３７℃長期間加温経過しても
毒性復帰現象（リバース）がおこらないことを見出した
。この無毒化処理におけるアミノ酸の添加系ではアミノ
酸非添加系に比して凝集塊沈殿を生成することはなく、
音波処理等の工程が不要でそのまま無毒化Ｉ（Ａ画分を
メンブレンフィルターを用いて無菌濾過できることを見
出し、本発明を完成するに至った。

発明の構成および効果 本発明によれば、百日ぜき菌をシクロデキストリンまた
はその誘導体を添加した液状培地に接種し、消泡処理し
ながら、培養温度２０〜３７℃において溶存酸素量を０
．７〜６．０ｐｐｍの範囲に保ち、さらに望ましくはｐ
Ｈをたとえば６０〜９．０にて通気攪拌培養し、対数増
殖期ないし定常期の菌発育段階で感染防御抗原ＨＡ画分
を採取し、該ＨＡ画分をアミノ酸の存在下でホルマリン
やグルタルアルデヒドなどで無毒化し、これを用いて所
望の精製百日ぜきワクチン、沈降精製百日ぜきワクチン
、沈降精製百日ぜき・ジフテリア・破傷風混合ワクチン
等が大量かつ経済的に製造される。

本発明で用いられる百日ぜき菌株としては、通常ワクチ
ン株として知られているものであればいずれでもよく、
一般にその■相菌のボルデ・ジャング培地継代菌あるい
は振盪培養菌が用いられ、これを種菌として液状培地に
接種する。なお、百日ぜき菌■相菌も適用することがで
きる。接種量はとくに限定されないが、通常、最終濃度
が０．２〜ｌ　Ｑ　ＩＯＵ／ｆｎｌ（ＩＯＵ：Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｏｐａｃｉｔｙｕｎｉｔ、生物学
的製剤基準、２３８．１９７９．厚生省を参照）、好ま
しくは約１．　□　ＩＯＵ／ｍＡとなる程度である。

液状培地としては公知のいずれの培地も用いられるが、
好ましくはステイナー・ショルテ培地、とくに好ましく
は、該ステイナー・ショルテ培地を基本とし、これにカ
ザミノ酸を０１〜２０１１／１添加シ、アスコルビン酸
を０．０１〜Ｉｆ／ｌ、グルタチオンを０．１〜５９／
１３の範囲に調整したステイナー・ショルテ改良培地（
以下、単に改良培地という）が用いられる。

培地に添加されるシクロデキストリン（以、下、ＣＤと
略称する）またはその誘導体としては、α−ＣＤ、β−
ＣＤ、γ−ＣＤなどの異性体、メチル化α−ＣＤ、メチ
ル化β−ＣＤ（前掲）、メチル化γ−ＣＤなどのエーテ
ル化誘導体のほか、アミン化誘導体かエステル化誘導体
などが挙げら江それらは単独で捷だけ２種以上を併用し
て用いられる・これらのうち、メチル化β−ＣＤがもつ
とも良好な添加効果を示す。その添加量はとくに限定さ
れないが、通常、０００１〜５１１／１１．好ましくは
約０．５〜２．５ｆ／１１である。

本発明者らは百日ぜき菌の大規模培養における菌増殖、
Ｆ−ＨＡおよびＬ　Ｐ　Ｆ−ＨＡ産生量の増大には培養
温度ならびにＤｏの制御が大きな要因となることを初め
て認め、かつ消泡操作の有無さらには培地のｐＨの制御
も大きく影響することを明らかにした。これらの成績に
ついて以下説明する。

培養温度については、百日ぜき菌Ｉ相菌東浜株をボルデ
・ジャング培地で継代したものを種菌とし、メチル化β
−ＯＤ　］、、　Ｏｆ／ｌを添加した改良培地１０ｍｇ
にＱ、　２　ＩＯＵ／ｍ６になるように接種し、温度勾
配培養装置ＴＮ１１２Ｄ（東洋科学産業製）を用い、培
養温度を１７℃から４２°Ｃの範囲で振盪速度６０回／
分にて４８時間振盪培養して至適−範囲を調べた。増殖
した菌数は光電比色計コゝ−ルマンジュニア６Ｄ型（コ
ールマン社製）ヲ用イ、０Ｄ６５０における測定値から
換算して求めた。

なお、この実験は実験室的小規模にて振盪培養で行なっ
たが、培養温度に関しては大規模な通気攪拌培養でも同
傾向を示す。

その結果を第１図に示しだが、菌の増殖は２０〜３７℃
の範囲が望ましく、より好捷しくけ２３〜３７℃であっ
た。

培地の溶存酸素量（ＤＯ）は０．７〜６．０　ｐｐｍ、
好ましくは１０〜５．５　ｐｐｍの範囲に保持される。

この範囲内に制御することによシ、百日ぜき菌の増殖が
増大するとともに、所望のＬＰＦ−ＨＡおよびＦ−ＨＡ
の産生も著しく増大する。

なお、ＤＯ制御には通気量と攪拌速度の制御を組合せて
行なうのがもつともよく、通気量と攪拌速度はとくに限
定されないが、通常の通気攪拌槽を用いた場合には、空
気の通気量は３ＶＶＭ以下、通常０１〜２ＶＶＭ、好ま
しくは０．１〜１．５ＶＶＭの範囲であり、攪拌速度は
６００　ｒｐｍ以下、通常５０〜３５０　ｒｐｍ、好ま
しくは１００〜２５０ｒｐｍの範囲である。ただし、純
酸素を併用する場合は通気量あるいは攪拌速度は減する
ことができる。

また、消泡操作の有無によっても培養液中の菌数増加お
よびＦ−ＨＡ、ＬＩ’Ｆ−ＨＡ量の収率が大きく影響さ
れ、後述の実施例１と同様の実験条件で培養した場合、
消泡を行わないときには泡に付着した菌体がそのまま槽
壁に累積されたり、排気ノズルから流出されたりして培
養液中の菌数、ＦＨＡおよびＬＰＦ−ＨＡ量ともに数〜
８０％程度の派別が認められた。なお、消泡は機械的消
泡と化学的消泡剤のいずれも適用され、例えば回転ティ
スフ式、スプレーノズル方式などの公知の消泡用装置を
用いるか、あるいは通常の脂肪酸エステル系、シリコン
系、アルコール系などの化学的消泡剤を用いることがで
きる。なお、培養液からのＨＡ画分の採取、精製等の点
からは機械的消泡手段を用いるのがよシ好ましい。

培地ｐＨの至適範囲を知るため、ｐＨを種々に変えて菌
の増殖を調べた。ＤＯを２．５　ｐｐｍと一定にした以
外は後述の実施例１と同様の実験条件で培養した。ｐＨ
６，０〜９．０の範囲ではいずれも菌増殖は達せられ、
ｐＨ５，５〜８．５、とくにｐＨ６，８〜７５の範囲で
は菌増殖速度が若干増大することが認められた。

本発明による培養温度、溶存酸素量さらには消泡、ｐｎ
などの制御は自動制御および手動制御のいずれも採用さ
れる。

また、目的とするＨＡ画分を高収率で得るには菌の培養
状態のチェックが重要であり、対数増殖期から転換期を
経て定常期に至るまでの菌発育段階において採取するの
がもつとも望ましく、それは接種菌によって変るが、通
常、７〜４０時間に相当し、例えば、１．０　ＩＯＵ／
ｍｄの接種菌量の場合には通常２４〜３５時間である。

上記のようにして産生されるＨＡ含有培養液から沈降精
製百日ぜきワクチンが調製される。

すなわち、得られた培養液には直接または連続遠心処理
したのち、硫酸アンモニウムを約１／３飽和になるよう
に加え、生じた沈殿を遠心分離まだは濾過して収集し、
これを１モル塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液、ｐＨ７
，２に溶解する。この溶液に硫酸アンモニウムを約１／
２飽和になるまで加え、生じた沈殿を遠心分離または濾
過などにより収集し、これを透析チューブに入れて１モ
ル塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液、　ｐＨ７，２に対
して透析し溶解する。これを超遠心分離にかけ、得られ
る上清をさらにショ糖密度勾配遠心にかけて、その上清
（百日ぜき菌ＨＡ画分）を得る。これらの一連の精製工
程は４°Ｃ以下で行なうのが望ましい。得られた上清に
は、大量のＬＰＦ−ＨＡとＦ−ＨＡが含まれている。こ
れを電気泳動法により調べたところ、従来の静置培養法
由来のＦ−ＨＡやＬＰＦ−ＨＡと同程度の分子量および
電荷をもち、さらに同等の形態（電子顕微鏡所見）、抗
原性（ゲル内沈降反応所見）およびマウスＬＰＦ毒素活
性を有している。

このＨＡ画分を適宜希釈し、これにホルマリンをＯ，’
１〜１．２Ｖ／ｖ％、好ましくは０４〜０．８ｖ／ｖチ
の濃度に添加し、２０〜４３”Ｃ１好ましくは３７〜４
０℃で５〜６０日間処理する。このホルマリン無毒化処
理によ５ＨＡ画分中のＬＰＦ活性、Ｈ８Ｆ活性（Ｈｉｓ
ｔａｍｉｎｅ　−ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ　ｆａｃｔｏ
ｒ　）等が減車される。本発明者らは、この無毒化処理
においてアミノ酸を添加すれば、無毒化に要する時間が
著しく短縮され、凝集塊沈殿を生成することなく、毒性
復帰現象（リバース）が起こらないことを見出した。な
お、この際アミノ酸とともに安定剤としてツイーン８０
、ゼラチンを適宜添加することができる。グルタルアル
デヒドの場合は、０．０５〜０３ｖ／ｖ％の濃度に添加
し、室温で１〜７日間処理するのが望ましい。

アミノ酸としては、グリシン、メチオニン、シスナイン
、グルタミン酸ナトリウム、アスパラギン酸、セリン、
アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、スレオニ
ン、γ−アミノ酪酸１．リシンなどから１種または２種
以上が選ばれて用いられる。

シクロデキストリンあるいはその誘導体を添加した液状
培地で発酵槽を用いて得られる培養液から精製したＨＡ
画分を、上記のアミノ酸を添加してホルマリンで無毒化
する場合には、凝集塊沈殿を生成しないのでメンブラン
フィルタ−による無菌濾過を行なうことが可能である。

一方、アミノ酸を実質的に存在しない状態でホルマリン
無毒化処理を適用すると、シクロデキストリンを添加し
ない液状培地で静置培養して得られる培養液から精製し
たＨＡ画分を無毒化する場合と同様に、凝集塊沈殿を生
じ、以後の工程において音波処理によってこの沈殿を破
砕する必要がある。この場合無毒化後の工程における無
菌濾過は困難である。

上記無毒化処理後、適当な蛋白濃度に調製（通常、最終
蛋白窒素濃度８〜２０μｐ’Ｉ’ｃＡＰＮ揖）し、所望
によりさらにジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド
を加え、そのまままたは必要にょシアシュバントとして
水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムを最終濃
度０１５〜０．３μｇ４４程度に加えて処理する。最後
に安定剤としてゼラチン、グルコース、保存剤としてチ
メロサールなどを適当量加えてワクチンとする。

実施例 つぎに実験例および実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが本発明はこれらに限定されない。

実施例 ５０／？の発酵槽（丸菱理化株製）に、下記第１表に示
す組成を有する改良培地にメチル化β−ＣＤを最終濃度
１．０９／ｌになるように添加した培地３５１を加え、
百日ぜき菌Ｉ相菌を１．　□　ＩＯＵ／ｍ７の量で接種
し、スパージャ−にょる槽底がらの通気攪拌培養系でＤ
Ｏの制御範囲を種々変え、温度３５℃、ｐＨ７，２に制
御し、消泡手段として機械的消泡を用い、それぞれ２４
時間培養を行なった。

第１表 →基礎培地は１２１℃、３０分間高圧滅菌し、補液は濾
過淋菌し、使用前に両者を混合して用いる。

得られた培養液について、先と同様にして菌数を測定し
、またＦ−ＨＡを血球凝集試験（５ａｔｏ。

Ｙ、　ｅｔ、　ａｌ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、
　７．９２９〜９９９．１９７３を参照）により測定、
ＬＰＦ−ＨＡをｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｆは■ｐ−ＥＬＩＳ
Ａ法（佐原ら、第２８回毒素シンポジウム予稿集、１４
１〜１４４．１９８１を参照）による単位（Ｌ　Ｐ　Ｅ
　ｕ／ｍｌと略記する）を測定し、ｉｎ　ｖｉｖｏでは
ｄｄ／Ｙマウス（４週令、雌）を用いＬＰＦ−ＨＡ静静
注３後後白血球数をカウントする方法（銘木ら、第２９
回毒素シンポジウム予稿集、１〜５．１９８２を参照）
によって測定した。その結果を第２図に示す。

第２図から明らかなように、菌増殖ならびにＨＡ画分の
高単位の産生が見られるのはＤｏが０７〜６０ｐｐｍで
あり、ＤＯ１，０〜５．５　ｐｐｍではとくに良好な結
果が得られた。

比較実験例１〜１０および実験例２〜５培養条件を種々
かえて百日ぜき菌ＨＡ画分の産生量を比較検討した。す
なわち、従来の通気攪拌を一定とする方法と本発明に基
づく通気攪拌を連続的に変化させる方法について比較し
た。

１、４１の通気攪拌培養装置（Ｎ’ＢＳ社製）に、実験
例１で用いたものと同じメチル化β−ＣＤを最終濃度１
．０ｆｉ／ＩＪ添加した改良培地１０１を加え、百日ぜ
き菌Ｉ相菌を１．ＱＩＯ則頷ｌの量で接種し、スパージ
ャ−による槽底からの通気攪拌培養系で、第２表に示す
条件下に、すべて３５℃で３６時間培養した。

通気攪拌を一定とし消泡処理を行なわない培養は第２表
中の比較実験例（以下単に比較例という）１〜５，７お
よび８である。その中では比較例５の１０　Ｏｒｐｍで
Ｑ、５ｒｒｍという条件がＨＡ画分の産生量は良好であ
った。しかしながら、その場合においても培養１０時間
まではある程度の対数増殖（約１０　ＩＯＵ／ｍ７　）
を示したが、その後急激に増殖速度が減じ３６時間後に
おいても約１５ＩＯＵΔ扉にとどまり、ＨＡＡ分産生量
はＦ　　ＨＡが１６Ｈ’　Ａ　／ｍｅ　、　Ｌ　Ｐ　Ｆ
　−ＨＡ　カ１００　ＩＯＵ／ｍｄ　テキわめて低く、
４８時間後１で培養を続けた場合においてもほとんど増
加しなかった。

また、０．２　ｖｖｍで通気し、攪拌を５００　ｒｐｍ
あるいは６００　ｒｐｍの一定とし、消泡処理をしない
培養系は、比較例７，８であるが、いずれの場合も培養
後５〜１０時間で、激しい発泡のために菌体が槽壁土部
に付着するが培養液が槽外へ流失し、それを３６時間後
にすべて回収混合した場合においてもＨＡ画分量はきわ
めて低かった。

ＤＯを制御するが消泡処理を行なわない培養系の比較例
１０においても、同様の培養液の流失や菌体の槽壁への
付着がおこシ、ＨＡ画分量は低かった。

通気攪拌を一定とし、がっ消泡処理を行なう培養系は比
較例６および９である。いずれの場合も、培養初期のＤ
ＯがＨＡＡ分産生にとって不適当な６．０ｐｐｍ以上に
あり、培養の進行に伴ないＤＯは連続的に下降しつづけ
３６時間以前に菌増殖およびＨＡ産生に不適当な０．７
　ｐｐｍ以下の状態に達していた。本発明の方法を一部
加味して化学的消泡処理を行なった比較例９では、３６
時間培養後にオイテ８０　ＩＯＵ／ｍＡに達したが、Ｆ
−ＨＡは１２８ＨＡ／ｆｎｌ、ＬＰＦ−、ＨＡｉｊ５Ｑ
ＱＬＰＥＵ／−程度であった。

一方、培養液中のＤＯをＤｏコントローラー（ＮＢＳ社
製）を用いて自動的に連続的に通気量あるいは攪拌速度
を変化させて、１６〜３．５　ｐｐｍとなるように制御
しかつ消泡処理をしながら培養を行なったものが実験例
２〜５であるが、それらは培養１０時間後においても対
数増殖を維持し、最終的には３６時間できわめて高い菌
数、Ｆ−ＨＡ量およびＬ　Ｐ　Ｆ　−ＨＡ量を得ること
ができた。

なお、上方からの表面通気による方法では、ＨＡ画分の
産生は全く認められなかった。

これらの成績から明らかなように、発酵槽を用いた通気
攪拌培養では、ＤＯ非制御下においては消泡処理をした
場合に菌増殖は認められるが、それらの例ではＦ−ＨＡ
およびＬＰＦ−４Ａはいずれも産生量が低いことがわか
った。一方、ＤＯ制御下で行った場合には菌増殖のみな
らずＦ−ＨＡ量およびＬＦＦ−ＨＡ量ともに著しく増大
した。

このように発酵槽を用いた通気攪拌培養では、ＤＯ制御
によって菌増殖は勿論、目的とする百日ぜき菌ＨＡ産生
量の著しい増大が図れることが判明した。

比較実験例１１ならびに実験例６および７上述のように
、本発明による特定の条件制御下に培養することによシ
目的とする百日ぜき菌ＨＡ両分の大量産生が達成される
が、これを従来公知の静置培養における場合と比較する
と第３表に示すとおシである。なお、表に示す各培養の
条件は下記のとおりである。ただし、°菌接種量と培養
温度はそれぞれ１．　Ｑ　ＩＯＵ／ｍｄ　、および３５
°ｃで共通とした。

（Ａ）静置培養（比較例１１） 培養容器ニル−瓶、１．５１容 培地：実施例１で用いたものと同じ改良培地ｏ２培養時
間＝１２０時間 （至）制御培養（本発明の方法）（実験例６および７） 培養容器：３００ｎ容発酵槽（丸菱理化製）培地：実験
例１で用いたものと同じ改良培地、２００１　；メチル
化β〜ＣＤ（実験例６）またはメチル化α−ＣＤ（実験
例７）１、Ｏｇ／４を添加 ＤＯ副制御　２．２−２．４　ｐｐｍ 消泡：機械的消泡手段（回転ディスク方式による） ｐＨ制御：　ｐＨ７，３ 培養時間：３５時間 上記結果を第３表に示す。

第３表 第３表の結果からも明らかなように、本発明方法によれ
ば従来静置法に比べて菌増殖およびＬＰＦ−ＨＡ量とも
に著しく増大しておシ、Ｆ−ＨＡ量は同等かそれ以上で
、例えば菌数は２〜３倍、ＬＰＦ−ＨＡ量は１０倍以上
増大し、培養時間は１２０時間から３５時間へと大幅に
短縮されている。

なお、実験例６および７におけるＤＯ制御下での培養の
場合の菌数、Ｆ−ＨＡ量およびＬＰＦ−ＨＡ量の経時的
な推移を第３図（Ｉ）および（Ｉｌ）、第４図（Ｉ）お
よび■にそれぞれ示した。これらの図からも明らかなよ
うに、本発明によるＤＯ制御下に培養した場合には菌数
の増大とともにＦ−ＨＡ量およびＬＰＦ−４Ａ量も著し
く増大される。

実施例１ 前記実験例１で得られたＨＡ画分を蛋白濃度が３０μｆ
　Ｔ　ＣＡ　Ｐ　Ｎ／ｍｌとなるように希釈し、これに
ホルマリン０．６または１．　Ｏｖ／Ｖ％の濃度に添加
し、３７℃または３９℃で５〜２１日間処理する。この
ホルマリンによる無毒化処理の際、第４表に示す各種ア
ミノ酸を表示の濃度にて添加する。

この無毒化処理の際の凝集塊沈殿の有無、また無毒化処
理後、透析チューブを用いて透析してホルマリンを除去
したのち、マウス毒性を検査しもさらに、３７℃で３週
間加温して毒性復帰現象の有無を検査した。また得られ
たワクチンの力価も測定した。それらの結果を第４表に
示す。

２１ 実施例２ 百日ぜき菌Ｉ相菌東浜株をポルデーシャ２グ培地で継代
したものを種菌とし、これをメチル化β−Ｃ’Ｄ　１０
　ｒｒＬ９／ｍｌを添加した実験例１で用いたものと同
じ改良培地０．４１を入れた２１容三角コルベンに、菌
数の最終濃度１．　□　ＩＯＵ、４Ａで接種し、これを
３５℃で１８時間培養して元培養菌を得だ。

上記と同じ培地２００１を入れた３００１容槽型発酵槽
（丸菱理化製）に上記元培養菌を１，０■（１）べ接種
し、通気攪拌培養する。

この培養はＤＯＩ、８〜２．７ｐｐｍになるように通気
量と攪拌速度の双方を自動制御した。まだ培養温度３５
℃、　ｐｉｆ　７．２に自動制御し、さらに機械的消泡
（回転ディスク方式）を行なった。

３５時間培養後、培養液を採取する。このようにして得
られた培養液について菌数およびＨＡ画分量を測定した
ところ、菌数２１０　ＩＯＵ／ｍ７　、　Ｆ−ＨＡＡ量
１　Ｑ　２４　ＨＡ　／ｍｌ　、　Ｌ　Ｐ　Ｆ　−ＨＡ
量２，４００ＬＰＥＵ／ｍｌであった。

上記で得られた培養液を遠心して上清を集め、その上清
に硫酸アンモニウムを謁飽和になるように加え、生じた
沈殿を１０．ＯＯＯｒｐｍ　３０分間遠心して集め、こ
れを１モル塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（、ｐｉｆ
　７．２　）に溶解し、不溶の沈殿部分を１０．００　
Ｏｒｐｍ、３０分間遠心して除去した。この上清に硫酸
アンモニウムを約１カ飽和に加え、生じた沈殿を同様に
遠心分離して集め、再び上記と同じ緩衝液に溶解、透析
チューブに入れて４℃で透析し不溶の沈殿部分を同様に
遠心分離して除去した。これを超遠心にかけ、得られだ
上清をさらに１０〜３０％シヨ糖密度勾配遠心（３９，
０００ｒｐｍｓ２０時間）にかけて、その上清（ＨＡ画
分）を回収した。これをメンブランフィルタ−にて除菌
した。このＨＡ画分の蛋白濃度を３０μｇＴＣＡ　Ｐ　
Ｎ／ｍｌに上記と同じ緩衝液を用いて調製した。

なお、上記採取した培養液の処理工程およびＨＡ画分の
精製工程はおもに２〜４°Ｃにて行なった。

得られ九Ｈ，Ａ画分にホルマリンを０．６　ｖ／ｖ％、
ツイーン８０を０．０５　ｖ／ｖ％、ゼラチンを０．０
２Ｗ／Ｖ％およびグリシンを０．２５　Ｍ加え、３９°
Ｃで７日間加温した。

０、７　ｗ／ｖ％塩化ナトリウム添加リン酸す衝ｆｉ（
ｐＨ’７．２　）に対して透析チューブに入れて透析し
てホルマリンを除去し、これを上記緩衝液にて蛋白濃度
８μｆＴＣＡＰＮ／ｍｇと彦るように希釈し、無毒化Ｈ
Ａ画分希釈液を得だ。

この希釈液に水酸化アルミニウムゲルを０．２０ｍｆ／
ｍｌ（アルミニウム換算）になるように加えてＨＡ画分
を吸着させた。これにさらに保存剤としてチメロサール
０．０１　ｗ／ｖ％添加して沈降精製百日ぜきワクチン
を調製した。

このワクチンは国家検定規準（生物学的製剤基準、薬発
第２８７号、１９８１を参照）に従って検定を行なった
ところ、第５表に示すとおりすべて適合していることが
判明した。

第５表 実施例３ 前記実施例１で得られた無毒化ＨＡ画分希釈液に、ジフ
テリアトキソイド３３Ｌｆ／ｍおよび破傷風トキソイド
５Ｌｆ７ｍを添加し、これに水酸化アルミニウムゲルを
０．２０　ｔｎｙ／ｍｌ　（アルミニウム換算）加えて
ゲル吸着させた。これに安定剤としてゼラチン０．０２
　ｗ／ｖ　％　、ブドウ糖０．１　ｗ／ｖ　％、保存剤
としてチメロサール０．０１　ｗ／ｖ％を加え、沈降精
製百日ぜき・ジフテリア・破傷風混合ワクチンを調製し
た。

この混合ワクチンは国家検定規準（生物学的製剤基準、
薬発第２８７号、１９８１を参照）に従って検定を行な
ったところ、第６表に示すとお９すべて適合しているこ
とが判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は百日ぜき菌の増殖と培養温度の関係を示すグラ
フ、第２図は培養液中のＤＯ制御範囲と２４時間培養後
の菌数、Ｆ−ＨＡ量およびＬＰＦ−ＨＡ量を示すグラフ
、第３図（Ｉ）および（ＩＩ）ならびに第４図（Ｉ）お
よび（ＩＩ）はＤＯ２，２〜２．４１）ｐｍの制御下に
培養した場合の菌数、Ｆ−ＨＡ量およびＬＰＦ−ＨＡ量
の経時的な推移を示すグラフである。 −２８： 手続補正書（睦） 昭和５８年６、ａ１３日 特許庁長官　殿 １事件の表示 昭和５８年特許願第　０５８５４８　　５２、発明の名
称 百日ぜきワクチンの製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　熊本県熊本市清水町大窪６６８番地名称　財団法
人化学及血清療法研究所 （ほか１名） ４代理人 ５補正命令の日付　自発 （Ｉ）明則書第１〜２頁の特許請求の範囲を別紙のとお
り補正する。 ■同書の「発明の詳細な説明」のＳ″ｆｆ：下記のとお
り補正する。 （１）２頁末行：　「ＬＰＥ−Ｉ−ＩＡｊを「ＬＰＩｉ
’−ＨＡ」と補正。 （２〕５頁下から３行：　「ＨＡ画分」をｊＦ−ＨＡ画
分」と補正。 （３）８頁末行：「通常の不活化剤、例えば」を削除。 （４〕８頁末行〜９頁１行：「やグルタルアルデヒド」
を削除。 （５）９頁下から３〜２行二「やグルタルアルデヒドな
ど」を削除。 （６）１６頁７行：「５〜６０日間」全「３〜６０日間
ｊと補正。 ｔ７Ｈ６頁下から５〜３行二Ｆグルタルアルデヒドの・
・・（中略）・・・が望ましい。」を削除。 （８０９頁第１表中ｌＯ行ニドリスヒドロキンメチルア
ミノメタンの含量のｒｌ、５２５」”ｋ　ｒ６１００Ｊ
と補正。 （９］２２頁７行：　「培養後５〜１０時間」を「培養
５〜１０時間」と補正。 ＱＱ３０頁第４頁中４表中段：「アルギニン」の項を全
行削除。 ｑυ３１頁第４表（続き）中：「グリンン＋アルギニン
」の項を全行削除。 以上 補正した特許請求の範囲 （１）百日ぜき菌をシクロデキストリンまたはその誘導
体を添加した液状培地に接種し、培養温度２０〜３７℃
で培地の溶存酸素量を０７〜６．０　ｐｐｍの範囲に保
ちかつ消泡処理をしながら通気攪拌培養し、対数増殖期
ないし定常期の菌発育段階で感染防御抗原）ＩＡ画分を
採取し、ついで該ＨＡ画分をアミノ酸の存在下に無毒化
することを特徴とする百日ぜきワクチンの製造方法。 （２＞　−ｙ　ミノ酸がグリシン、メチオニン、システ
ィン、グルタミン酸ナトリウム、アスパラギン酸、セリ
ン、７ラニン、ロイシン、インロイシン、バリン、スレ
オニン、γ−アミノ酪酸、リジンから選ばれる１＠また
は２種以上でおる前記第（１〕項の方法。 （３）液状培地がカザミノ酸を０．１〜２０Ｐ／ｌ、ア
スコルビンｅ’ｋｏ、０１〜１９／ｌ、グルタチオンを
Ｏ１〜５（１／／およびシフロブキス１−リンまたはそ
の誘導体を０．００１〜５グ／ｌ含有している前記第（
１１項の方法。 （４）シクロデキストリンまたはその誘導体がメチル化
α−シクロデキストリン、メチル化β−ンクロテキスト
リン、メチル化γ−シクロデキストリン、α−ンクロデ
キストリン、β−ンクロデキストリンおよびγ−シクロ
デキストリンから選ばれる１種または２種以上である前
記第（１）項の方法。 （５）培養時間を７〜４０時間とする前記第（１）項の
方法。 （６］消泡処理が、機械的消泡手段、化学的消泡剤の添
加またはそれらの組合わせによる前記第（１）項の方法
。 （７）ｐＨが６０〜９０の範囲である前記第（１）項の
方法。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）百日ぜき菌をシクロデキストリンまたはその誘導
   体を添加しだ液状培地に接種し、培養温度２０〜３７℃
   で培地の溶存酸素量を０．７〜６．０　ｐｐｍの範囲に
   保ちかつ消泡処理をしながら通気攪拌培養し、対数増殖
   期々いし定常期の菌発育段階で感染防御抗原ＨＡ画分を
   採取し、ついで該ＨＡ画分をアミノ酸の存在下に無毒化
   することを特徴とする百日ぜきワクチンの製造方法。
2. （２）アミノ酸がグリシン、メチオニン、システィン、
   グルタミン酸ナトリウム、アスパラギン酸、セリン、ア
   ラニン、ロイシン、インロイシン、バリン、スレオニン
   、γ−アミノ酪酸、リジンから選ばれる１種または２種
   以上である前記第（１）項の方法。
3. （３）液状培地がカザミノ酸を０，１〜２０ｆ／１１，
   １スコルビン酸を００１〜１１／ｌ、グルタチオンを０
   ．１〜５　Ｑ　ｆ／１２およびシクロデキストリンまた
   はその誘導体をｏ、ｏｏｉ〜５　ｆ／／ｌ含有している
   前記第（１）項の方法。
4. （４）シクロデキストリンまたはその誘導体がメチル化
   α−シクロデキストリン、メチル化α−シクロデキスト
   リン、メチル化γ−シクロデキストリン、α−シクロデ
   キストリン、β−シクロデキストリンおよびｒ−シクロ
   デキストリンから選ばれる１種または２種以上である前
   記第（１）項の方法。
5. （５）培養時間を７〜４０時間とする前記第（１）項の
   方法。
6. （６）消泡処理が、機械的消泡手段、化学的消泡剤の添
   加またはそれらの組合わせによる前記第（１）項の方法
   。
7. （７）　ｐｌ＋が６．０〜９．０の範囲である前記第（
   １）項の方法・