JPS60500597A - 細菌培養によるヒアルロン酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細菌培養によるヒアルロン酸 を説明 発明の背景 ヒアルロン酸は生物由来のムコ多糖である。そのナトリウム塩、ヒアルロン酸ナ トリウムを緩衝化生理食塩液に溶解し九溶液は、眼科手術時における硝子体置換 物として、ま危地の医学的応用で有用であることが判りている。これの利用のい くつかはアメリカ特許第４１４１９７３号および第４３２８８０３号明細書に記 載されている。このような医学的な目的には、これ聾で分子量７５０，０００以 上の発熱性物質を含まない高度に精製されたヒアルロン酸が使用されてきた。フ ァルマシア　インコーホレイテッド。

ビスカタウェイ、二為−ジャージー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｉｎｃ、。

Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ、　Ｊ　）製造のＨＦ５ＡＩ、ＯＮ”として知られ る市販製品はこの目的で販売されているヒアルロン酸す）　ＩＪウムの１パーセ ント溶液である。例えば、希ＨＥＡＬＯＮ”溶液（（Ｌｌ−１２チヒアルロン酸 ナトリウム）が乾性角膜炎症候群患者治療の点眼薬として有用であると報告され ている。

ヒアルロン酸はらい病細菌の試験管内培養の培地成分として、また化粧品調剤の 成分としても使用されている。

アメリカ特許第４５０５６７６号明細書に記載された化粧品調剤は、低分子量画 分（約１０−５０，０００）と高分子量画分（ＩＸ１０６以上）を共に含んでい る。

上記の使用はいずれも、ヒアルロン酸の起源が雄鶏のとさか、人間の曙帯または 他のを椎動物の組織である。

このような組織からのヒアルロン酸の抽出・精製は比較的複雑な工程で、その結 果、製品が非常に高価になる。

ヒアルロン酸はストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細菌のグル ープ人およびＣの株により産生される。この細菌産生物についてのひとつの利用 は１人間の血漿試料中の抗−ストンブトコツカス　ヒアルロニダーゼ測定の試薬 として利用することがケームス　アンド　レーベック、アクタ　バソロジカ　エ 　ミクロビオロジヵ　スヵンジナビカ、セクシヲン８　８４巻　１６２−１６４ 頁（１９７６年）　（Ｋｊｅｍｓ　ａｎｄ　Ｌｅｂｅｃｋ、　Ａｃｔａ　Ｐａｔ ｈ、　ｍ１ｃｒｏ−ｂｉｏｌ　５ｃａｎｄ、、　５ｅｃｔｉｏｎ　Ｂ、　８４　 ：　１６２−１６４．　（１９７６）　）に報告されている。この報告において 、著者等はグループ人のストレプトコッカス細菌培養のための合成培地及びヒア ルロン酸の分離を記述し、培養液１リットル当りａｓｙの収率を報告している。

しかし、細菌が産生ずるヒアルロン酸は低分子量範囲にあるため十分な使用が見 い出されていない。

発明の詳細な説明 本発明は、従来までの技術に２いて細菌起源で得られると報告されているものよ り望ましい、高分子量範囲の細菌起源ヒアルロン酸を提供する。本発明は細菌起 源で従来報告されているものより高い収率でヒアルロン酸を生産する方法をも提 供する。更に、その方法によれば、医学的用途の為に現在側・謝されているいか なるものにも匹敵するか、それよシ高い純度を有するヒアルロン酸が製造される 。本発明の方法によって製造されるヒアルロン酸は典型的には約ｓｓ、ｏｏｏの 平均分子量を持っているが、点眼薬成分や化粧品調剤の成分として潜在的に重要 な利用性を持っている。本発明の方法により製造されたヒアルロン酸が高収率、 高純度および低コストであるため、哺乳動物または細菌起源の低収率で得られる ヒアルロン酸について前に示した用途または考えられる用途以外の用途に使用す ることもできる。例えば、ヒアルロン酸は湿潤剤として食品製造時に、潤滑剤と して他の応用面で、および帛維化反応および／または癒着形成による合併症を低 減するために手術後の利用に使用できるであろう。本物質はポリアクリルアミド 、類似の合成重合体または生物学的に製造された重合体の代りに三級オイル回収 にも使用できるであろう。

本発明の方法の望ましい態様には、ＣＯ１増強生育培地にヒアルロン酸生産スト レプトコッカス株を嫌気条件下に培養し、その培地は上記細菌によるヒアルロン 酸産生に必要な原料を含んでおり、望ましくは細菌を殺す必要はないもののその 生育した培地から細菌を分別し、ヒアルロン酸を分離することを含む。望ましく は生育は液体培養における発酵によって行う。その他の生育技術や培地を使用し てもよい。例えば寒天培養を行ってよい。したがって、ここに云う「生育培地」 とは、液体または固体培地またはその組合せ、および当該技術において公知のす べてのもののような発酵以外の他の生育形態を意味するものとして広く受けとる べきである。

本発明の望ましい態様では、ヒアルロン酸が産生されるべき培地中で直接細演を 生育させることを考えているが、他の生育培地で細菌を生育させ、その培地から 細菌を分離して緩衝化した懸濁培地または蒸溜水に再懸濁し、この既に生育した 細菌によりヒアルロン酸を産生させるために適当な原料をこの懸濁液に加えると いうことも可能である。これは望ましい方法と同等の技術と考えられ、単に休止 細胞懸濁液の使用が含まれるだけである。したがって、ここに云う「培養生育」 その他類似の語法は、その範囲内の近いものを共に含むと受けとるべきである。

ヒアルロン酸製造の従来の方法と異り、細菌接種の前にすべての成分を最初にＭ ｉｌｌｉｐｏｒｅ’　Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ■　カセット　タンジェンシャル　フｏ 　−（ｃａｓｓｅｔｔｅ　ｔａｎｇｅｎｔｉａｌｆｌｏｗ）濾過システムのよう なＩＱ、０００　（１０Ｋ）　名目分子量限界（ＮＭＷＬ）カット　オフ　フィ ルターで濾過することにより、エンドトキシンを系から除外することができ、こ のため発熱性物質を含まない嫌気生育条件を保つことができる。

発明の詳細な説明 本発明の望ましい実施態様においては、下記のような半合成生育培地を用いる： ｔ　カゼイン氷解物、酵素による　２０−０９２　塩化カリウＪ−五〇ｇ 五　二塩基性リン酸ナトリウム　２．８Ｉ瓜　硫酸マグネシウム（７ＨｔＯ）　 ａ、５Ｉ瓜　塩化カルクラム（２鴇０）　１（ＬＯη＆　グルコース　２（１０ ｇ ｌ　ビタミン溶液： ａ）　ｄ−ビオチン　ｔＯ〜 ｂ）Ｄ−ハントテン酸カルシウム　ｔＯ１１９Ｃ）塩化プリン　ｔＯダ ｄ）　葉　酸　ｔｏＷｇ ｅ）　ｉ−イノシトール　２０ダ ｆ）ニコチンアミド　１．ＯｒＩｖ ｇ）塩酸ビリドキサル　ｔＯ■ ｈ）リボフラビン　ｒｌ、１ダ ｉ）塩酸チアミン　ｔＯダ 培地を逆浸透の発熱性物質不含水で１リツトルにする。

勿論、この目的に好適な他の生育培地も使用してよい。

ストレプトコッカス　ビオジェネス　タイプ１８（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ 　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　ｔｙｐｅ　１８　）を上記培地中、３７°±１℃で６時間 、嫌気的に１００ｙＬｌ培養する。前述の他のヒアルロン酸産生細菌も使用でき るが、タイプ１８が望ましい。同じ培地５リツトルにこの６時間培養物を接種し 、明らかに目で見える菌濃度、望ましくは少くとも１ゴ当り２Ｘ１０’細胞、典 型的には１ゴ当ｆｉ５Ｘ１０”細胞まで生育させる。この５リツトルの種母を使 って２００１Ｊットル発酵槽中の１６０リツトルの培地に接種し。

製造運転を開始する。

この製造運転中、培養物は常に攪拌して生育させ、この間ＣＯ１監視プローブに より測定しながら、ＣＯ２の溶存濃度が十分に保たれるような流速でＣＯ２ガス を吹き込み続ける。５−１０チの溶存ＣＯ２が望ましい。ガスはＮ２／ＣＯ２混 合物として吹き込むことが望ましく、８５／１５の比が望ましいが、これは臨界 値ではない。培養槽に導入する際に、ガスはフィルターで殺菌する。温度は約３ ７±１　”Ｃに調節するのが望ましい。ｐＨプローブ／調節装置で監視し、調節 装置を通じてＫＯＨを添加することにより、ｐＨを約４５乃至７．５の範囲内で ±［１１の実質的に一定の値に調節することが望ましい。培養物のｐＨが低下し なくなった時（設定した限界内にｐＨを保つためのＫＯＨがもはや要求されなく なった時）、または細胞濃度が十分に目で見える濃度、典型的には１ｉ当り１− ５Ｘ１０”細胞に達した時に、発酵は完結したと考えられる。この時点で、トリ クロル酢酸飽和水溶液をトリクロル酢酸最終濃度が約５％になるまで発酵混合液 に加えて発酵を停止する。これは変えてよい。

発酵ブロスにトリクロル酢酸を加えることは、細菌を殺して生育を止めるだけで なく、細胞の凝集を助けてブロスからの細胞の分離をいっそう容易にする。トリ クロル酢酸を加えないと、ブロス成分の完全さの極度の破壊を引き起さずには、 分離が非常に困難である。微生物と多糖、すなわちヒアルロン酸はトリクロル酢 酸添加なしには遠心分離または濾過で簡単に分離しない。このため培養を他の手 段、例えば熱処理で停止することは可能であるが、トリクロル酢酸処理は次のヒ アルロン酸分離を容易にするという利点を持つ。

発酵混合物をポンプにより発酵槽から、前述のＭｉ　’＞　１　ｉ　−ｐｏｒｅ ■タンジェンシャル　７０−濾過システムを使い、Ｑ、２２マイクロメーターポ アサイズＤｕｒａｐｏｒｅ■濾過カセツトを通過さぐる。この工程により細胞は １６０　Ｑットルから約５リツトルに濃縮される。ｐ液を貯め、１０メガオーム 以上の電気伝導度の逆浸透水に対し、３Ｑ、０００名目分子量ｊｙｙトオフＭｉ １１ｉｐｏｒｅ＠Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ■　カセットシステムによりｐ液が約（１５ メガオームの電気伝導度に達するまで透析Ｆ遇し、その際にｐ液は連続的に捨て る。

ミリボア　コーボレイ゛シ百ン、ベッドフォード、マサチェー　セｙ　：／　０ １７５　Ｇ　（Ｍｉｌｌ　１ｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｂｅｄｆｏ ｒｄ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　０１７５０　）のカタログ　ナンバー　０ＭＯ２ ９、１９８１年３月（Ｃａｔａｌｏｇ　Ｎｕｍｂｅｒ　ＯＭＯ２９，Ｍａｒｃｈ １９８ｊ）にＰｅｌ　ｌ　１ｃｏｎｏ　カセット　システム（Ｐｅ　１１　ｉ　 ｃｏｎ■Ｃａ５ｓｅｔｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍ）の表題で記載されているように、透 析濾過は従来の受動的透析法に反して、力を加えた透析法である。ヒアルロン酸 は、水を導入することなくこの濾過工程を続けることにより濃縮される。

この濃縮物を次に試薬級のエタノールにより、好ましくは５：１の比で処理する 。他のアルコール、アセトン、クロロホルムまたは他の有機溶媒、および０ＢＴ ＡＢ、臭化、トリメチルアンモニウム混合物のようないくつかの有機塩をヒアル ロン酸またはヒアルロン酸ナトリウムを水溶液から沈殿させるために使用するこ とができる。これは、溶媒中にヒアルロン酸をポンプで入れる際に起るもの以外 のいかなる混合もせずに行うべきである。アルコール処理中の攪拌はヒアルロン 酸の工程収率を低下させることが見い出された。この段階における沈殿は４°Ｃ １遮光下にいつまでも貯蔵できる。

記載した方法かられかるように、二段工程によるブロスからのヒアルロン酸の分 離には独特の手法が見出され、ここでは、ブロスの実質的にすべての低分子量成 分からヒアルロン酸を分離するために分子量分別工程を透析濾過によって汚い、 次いで残存するすべてのブロス成分からこの酸を沈殿によって分離している。

沈殿したヒアルロン酸は多くの従来法により脱水（水／アルコール溶液の大部分 の除去）を行うことができ、次いで逆浸透尿またはα１５Ｍ　Ｎａ　Ｃ１溶液に 再懸濁する。

次にこの再懸濁したものを凍結乾燥、スプレィ乾燥、真空乾燥または透析濾過し て最後の微量のアルコールを除く。更に約１０■／ゴヒアルロン酸ナトリウム濃 度を持つｏ、ｏｓＭホウ酸緩衝液、ｐＨ８，８をつくることにより精製を行う。

Ｑ、３２係０ＢＴＡＢをこの溶液に加え、その混合物を４℃で一夜攪拌して沈殿 、ヒアルロン酸す）　ＩＪウムを得る。塩化セチルピリジウムまたは関連した塩 のような他の沈殿剤を使用してもよい。沈殿を粗い濾過で回収し、逆浸透水を使 ってつくったＩ　Ｍ　Ｎａ　（Ｊ溶液に再懸濁する。この再懸濁ヒアルロン酸を 次に前述のように透析濾過して濃縮する。得られたヒアルロン酸を次に濾過殺菌 して使用するか％またはヒアルロン酸ナトＩＪウムに変えてから濾過殺菌して使 用することができる。

従来からの脱水法には圧縮、遠心分離、化学品添加その他が含まれる。どの方法 を選択するかは、沈殿を次にどのように使用するかによって決まる。

もし医療品数の発熱性物質を含まない製品を望む時には、発熱性物質を含まない 濾過した生育培地を使い、ヒアルロン酸／ヒアルロン酸ナトリウムの分離および 処理を含むすべての工程の操作は、発熱性物質の無い容器を使ってクラス１００ の清浄室の条件下で行う。もし、単に化学品数の使用のためであれば、発熱性物 質に関しては、部屋や回収容器の清浄度は厳密でなくてよい。

嫌気条件下における細胞の生育を強調する本発明の方法は、ストレプトコッカス 細菌が最終産物の正常の補充吻、−次的にはこの微生物でよく知られている発熱 性エクソトキシンをつくることを防いでいる。前述の生育条件は、以前に報告さ れたものよりはるかに高いヒアルロン酸の収率をも与える。望ましい細胞生育と 上記の分離条件を使うことにより培養ブロス１リットル当り最低５グラムのヒア ルロン酸が得られた。ヒアルロン酸の提唱された機能の１つが細胞のための酸素 バリヤーを与えることだと考えられていたため、嫌気条件下での高収率は予期さ れなかった。このため、その産生は承素に暴露した条件下で最大になると期待さ れていた。

記載したようにして調製したヒアルロン酸／ヒアルロン酸ナトリウム、：は、ゲ ル濾過または疑似弾性光拡散法による測定で約１０，０００−２，０００．Ｄ　 ＯＯの範囲内の分子量で約５５、（１００士約２０チの平均分子量を持っている 。これらの方法が１１１定にンいて変ｌすること、および生物学的変動のために 、これら：Ｃよって１尋られた結果に変動があることはよく知られている。本、 製品は分析法によりａ、ＳチとＱ、０３％の間の蛋白質含量を持っている。１チ 溶液の紫外部吸収は２６０　ｎｍで０．３１４と２８０ｎｍで（Ｌ１６９である 。１チ溶液の粘度は約３００センチストロークである。

本発明の方法てよって製造された発熱性′：ＩＩｊ質を含まないヒアルロン酸ナ トリウムの０．５−１．５パーセント溶液は、現在乾性角膜炎に使用されている 高分子量の雄鶏とさかのヒアルロン酸の極希薄溶液の代りに点眼薬成分として使 用できる。

グループＡおよびグルー１０株の他のヒアルロン酸産生ストレプトコッカス細菌 を本発明に使用してよい。更に、生育培地誓生育条件および分離法を、下記の請 求範囲に示した本発明から逸脱せずに変化させてよい。

国際調査報告 １＋ｌ＊ｌ＋ｌ１ｌＱ６１１　Ａｌｎ１ｌｆ１．１ｌ１６゜ｎｏ、ＰＣτ／ＵＳ ８３１０１４２Ｂ１ １

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｔ　Ｃへ増強嫌気条件下において生育培地でヒアルロン酸産生ストレプトコッカ ス細菌の液体培養発酵を行うこと； 得られた発酵ブロスから細菌細胞を分離すること：および ブロスの残存成分からヒアルロン酸を分離することを特徴とするヒアルロン酸の 製造法。 ２　生育培地をＩＱ、ＯＱＯ分子量カットオフフィルターを通して接種前に濾過 することによ）発熱性物質を含まないようＫしてつくる請求の範囲第１項記載の 方法。 五　細菌細胞分離工程が最初にブロスにトリクロル酢酸を加えることを含む請求 の範囲第１項記載の方法。 ４、トリクロル酢酸を最終濃度５−６％になるまで発酵混合物に加える請求の範 囲第３項記載の方法。 五　トリクロル酢酸添加により細菌の生育を停止させる請求の範囲第３項記載の 方法。 ＆　酸およびそれに類似またはより高分子量のブロス成分を分離し１次いでこの 類似のブロス成分から酸を沈殿により分離することによって分離を行う請求の範 囲第１項記載の方法。 ｌ　ヒアルロン酸および残存ブロス成分を実質的に混合せずにエタノールに加え ることにより沈殿させる請求の範囲第６項記載の方法。 ＆　ブロスを細胞から分離し、そのブロスを透析濾過し、その溶液を実質的に混 合することなしに有機溶媒に加えることにより溶液から酸を沈殿させることによ って分離を行う請求の範囲第１項記載の方法。 θ　発酵工程が、全発酵中、６５−４５の範囲内で実質的に一定値±１ｌＬ１に ｐＨを調節し、温度を３７±１℃に調節することを含む請求の範囲第１項記載の 方法。 ＩＱ、ｐＨプローブ／調節装置を使った塩基の自動添加により　ｐＨを調節する 請求の範囲第９項記載の方法。 １ｔ　溶存００２を約５−１０−の濃度に保つ請求の範囲第１項記載の方法。 １２−　生育停止前に１ｄ当り２Ｘ１０’細胞以上の濃度まで細菌を生育させる 請求の範囲第１項記載の方法。 １＆　細菌がストレプトコッカス　ビオジェネス　タイプ１８　（Ｓｔｒｅｐｔ ｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　ｔｙｐｅ　１８　）である請求の範囲第１ 項記載の方法。 １瓜　細菌培養物による接種前に、生育培地をＩＱ、０００分子量カット　オフ 　フィルターを通して濾過し、以後の工程を発熱性物質を含まない容器を使って クラス１００の清浄度の室の条件下で行う請求の範囲第６項記載の方法。 １５　分離したヒアルロン酸を弱塩基性緩衝液に溶解し、混合アルキル　トリメ チルアンモニウムプロミドによりヒアルロン酸ナトリウムを沈殿させ、この沈殿 を希塩化す）　ＩＪウム溶液に再懸濁し、それを攪拌せずにエタノールに加える ことによって酸として再沈殿させることにより分離したヒアルロン酸を精製する ことを更に含む請求の範囲第１４項記載の方法。 １ｈ　Ｃｏ、増強生育培地で嫌気条件下にヒアルロン酸産生ストレプトコッカス 細菌の液体培養発酵を行うこと：得られたブロスから細菌細胞を分μすること； およ、　びブロスの残存成分からヒアルロン酸を分離することにより製造された 、約５５，０００ダルトン±約２ｏ％の平均分子量を持つ約ＩＱ、ＯＤＤ乃至約 ２．ｏｏｌ１１．ｏｏｏダルトンの範囲の分子量画分のヒアルロン酸。 １ｚ　細菌がストレプトコッカス　ビオジェネスタイプ１　Ｂ　（８ｔｒｅｐｏ ｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　ｔｙｐｅ　１　Ｂ　）　である請求の範囲第 １６項記載の酸。 １＆　酸およびそれに類似の、またはより高分子量のブロス成分を分離し、次い でこの類似のブロス成分から酸を沈殿によって分離することにより分離を行う請 求の範囲第１６項記載の酸。 １″ｌ　ヒアルロン酸および残存ブロス成分を実質的に混合せずにエタノールに 加えることによシ沈殿させる請求の範囲第１７項記載の酸。　１ ２０、ブロスを細胞から分離し、そのブロスを透析←し、その溶液を実質的にい かなる混合もすることなしに有機溶媒に加えることによシ溶液から竣を沈殿させ ることによって分離を行う請求の範囲第１６項記載の方法。 ２ｔ　蛋白質含量が約ＣＬ３％ないし１０３％の間の範囲にあり、１％溶液の紫 外部吸収が２６０ｎｆｆＩでＣＬ３１４と４　竹表昭Ｇｏ−５００５！ｊ’、’ 　（２）２８０　ｎｍでＩ：Ｊ１６９であり、その粘度が約３００センチストロ ークである請求の範囲第１６項記載の酸。 ２２、酸およびそれに類似の、またはより高分子量のブロス成分を分離し、次い でこの類似のブロス成分から酸を沈殿によって分離することにより分離を行う請 求の範囲第２１項記載の酸。 ２！Ｌ　酸および残存ブロス成分を実質的に混合せずにエタノールに加えること によシ沈殿させる請求の範囲第２２項記載の酸。 ２４　グロスを細胞から分離し、そのブロスを透析濾過し、その溶液を実質的に 混合することなしに有機溶媒に加えることにより溶液から酸を沈殿させることに よって分離を行う請求の範囲第２１項記載の酸。 ２５　細菌によりヒアルロン酸の産生を含むヒアルロン酸製造法において、酸お よびそれに類似の、またはより高分子量のブロス成分を液体から分離し１次いで この類似のブロス成分から酸を沈殿によって分離することにより、細菌が生育し たブロスから酸を分離することからなる改良方法。 ２＆細菌がストレプトコッカス　ビオジェネスタイプ１８　（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ ｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　ｔｙｐｅ　１８　）である請求の範囲第２５項 記載の方法。 ２７、酸および残存ブロス成分を実質的に混合しないでエタノールに加えること により沈殿させる請求の範囲第２５項記載の方法。 ２Ｂ−ブロスから細胞を分離し、そのブロスを透析濾過し、その溶液を実質的に いかなる混合もすることなしに有機溶媒に加えることにより溶液から醸を沈殿さ せることによって分離を行う請求の範囲第２５項記載の方法。 ２９　細菌によるヒアルロン酸産生を含むヒアルロン酸の製造法において、細菌 生育培地の環境でＣＯ２増強嫌気性条件を保持することを含む改良方法。 ！＋［Ｌ　Ｃｏ、増強嫌気性条件下で生育培地にヒアルロン酸産生ストレプトコ ッカス細菌を培養生育させるとと；懸濁液の形成が使用した生育方法に固有のも のでない場合には細菌とその副生物の液体懸濁液を形成させること： 懸濁液から細菌細胞を分離するとと：および残存液体の成分からヒアルロン酸を 分離することを特徴とするヒアルロン酸の製造法。 ６ｔ　酸とそれに類似の、またはよシ高分子量の液体の成分をその液体から分離 し、次いでその類似の成分から酸を分離することによって分離を行う請求の範囲 第３０項記載の方法。 ３２−　全発酵工程中、ｐＨを＜ｉ、　５−７．５の範囲内の実質的に一定値± ０．１．温度を６７土１℃に調節することを生育工程が含む請求の範囲第３０項 記載の方法。 ５１　ｐＨプローブ／調節装置を使って塩基の自動添加によりｐＨを調節する請 求の範囲第５０項記載の方法。 ３４、Ｃｏ、増強嫌気条件下にヒアルロン酸産生ストレプトコッカス細菌の培養 生育を行うこと； 懸濁液の形成が使用した生育方法に固有のものでない場合には細菌とその副生物 の液体懸濁液を形成させること； その懸濁液から細菌細胞を分離するとと；および残存液体の成分からヒアルロン 酸を分離することによる約ｓｓ、ｏｏｏ士約２０チの平均分子量を持ち約１ｔＬ ＯＯＯ乃至約２．００１１，０００の範囲の分子量画分のヒアルロン酸。 ３５　酸とそれに類似の、またはより高分子量の成分を液体から分離し、次いで この類似の成分から酸を分離することにより分離を行う請求の範囲第３４項記載 の酸。 ３＆　酸と残存成分を実質的な混合を行わずにエタノールに加えることによる沈 殿によって最後の分離を行う請求の範囲第３５項記載の酸。 ３ｚ　蛋白質含量が約しＩと（１０３％の間の範囲にあり、１チ溶液の紫外部吸 収が２６０　ｍｍでＱ１１４と２８０　ａｍでＣ１，１６９であり、その粘度が 約３００センチストロークである請求の範囲第３４項記載の酸。 ３＆　酸と、それに類似の、またはより高分子量の成分を液体から分離し、次い でその類似の成分から酸を分離することにより分離を行う請求の範囲第３７項記 載の酸。 ３９　酸と残存成分を実質的な混合を行わずにエタノールに加えることによる沈 殿によって最後の分屋を行う請求の範囲第５８項記載の酸。 ４Ｇ、００□増強嫌気条件下に酸産生ストレプトコッカス細菌を固体生育培地に 培養生育させるとと：固体培地から細菌とその副生物を分離して細菌とその副生 物の懸濁液を形成させるとと； 懸濁液から細菌細胞を分離するとと；および残存液体の成分からヒアルロン酸を 分離することを特徴とするヒアルロン酸の製造法。 ４１、酸およびそれに類似の、またはよシ高分子量の液体の成分を液体から分隔 し１次いでこの類似の成分から酸を分離することにより分離を行う請求の範囲第 ４０項記載の方法。 ４２、ヒアルロン酸と残存成分を実質的な混合を行わずにエタノールに加えるこ とによる沈殿によって最後の分離を行う請求の範囲第４１項記載の方法。 ４＆　全発酵工程中、ｐＨを４５−１５の範囲内の実質的に一定値±Ｑ、１、温 度を６７±１℃に調節することを発酵工程が含む請求の範囲第４０項記載の方法 。 ４４、溶存ＣＯ８を約５−１０チの濃度に保つ請求の範囲第４０項記載の方法・ ４＆　生育の停止前に細菌が１−当り２　Ｘ　１０’　ｉ胞以上の濃度に生育し ている請求の範囲第４０項記載の方法。 ４４　分離したヒアルロン酸を低緩衝化溶液に溶解し、混合アルキルトリメチル アンモニウムプロミドでヒアルロン酸ナトリウムを沈殿させ、その沈殿を希塩化 ナトリウム溶液に再懸濁し、それを攪拌せずにエタノール（加えることによって 酸として再沈殿させることによる分離したヒアルロン酸の精製を更に含む請求の 範囲第４０項記載の方法。 ４７、ヒアルロン酸産生、細菌を準備すること；その細菌がヒアルロン酸を含む 副生物を産生ずる生育培地とその細菌を組合せること； その生育培地の環境で００．増強嫌気条件を保持すること； 懸濁液の形成が使用した生育方法および培地に固有のものでない場合には細菌と その副生物の液体懸濁液を形成させること； 懸濁液から細菌を分離すること、 残存液体の成分からヒアルロン酸な分離することを特徴とするヒアルロン酸の製 造法。 ４＆　細菌が最初に休止懸濁液で与えられる請求の範囲第４７項記載の方法。 ４９、細菌がストレプトコッカス　ビオジヱネス　タイプ１８　（Ｓｔｒｅｐｔ ｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　ｔｙｐｅ　１８　）である請求の範囲第４ ７項記載の方法。