CN85103674A - 用细菌培养生产透明质酸 - Google Patents

Abstract

透明质酸是一种粘多糖体，可用链球菌以高产量制备，其方法为在无氧条件下在二氧化碳富集的生长培养基中使细菌发酵，使细菌与发酵的肉汤分离及从肉汤的剩余组成物中分离出透明质酸。通过在接种前经10^K微孔过滤器滤掉所有成分且其后维持无热条件则生长出的细菌可以不含内毒素。用三氯乙酸杀死细菌使微生物与多糖分离。在去除细菌细胞及浓缩较高分子量发酵产物后可用沉淀、再悬浮及再沉淀来分离、提纯透明质酸。

Description

透明质酸是从生物中提取的一种粘多糖体。已发现其在缓冲生理盐水中钠盐即透明质酸钠，在眼科手术及其他医学应用中可作为玻璃体的替代物有重要用途。在美国专利4141，973及4，328，803中已描述了一些在这方面的应用。为了这类医学上的目的，到目前为止曾经使用了分子量超过75万的无热原高纯度透明质酸钠。由新泽西州Piscataway的Pharmacia公司生产的名为“海龙（Healon）”的商品是为这类目的而出售的透明质酸钠的1%溶液。例如，据报道烯海龙液（含0.1-0.2%的透明质酸钠）眼药水。作为治疗干性角膜炎综合症很有用。透明质酸还用于试管培养麻疯杆菌作为配料及用作化妆品配方中的一种成份，这在美国专利4，303，676中说明的配方中既包括低分子量组份（约10～5万）又包括较高的分子量组份（超过1百万）。所有上述用途的透明质酸的来源为公鸡之冠，人的脐带或其他脊椎动物的组织。从这类组织中提取并提纯的透明质酸价格非常昂贵。用链球菌的A组和C组菌株能够生产透明质酸。曾经报道的作为细菌产品的一种用途是在人的血清中测定抗链球菌的透明质酸酶时作为试剂的，参见Kjems及Lebech在斯堪纳维亚病理学微生物学学报B部分84：162-164（1976）一文。在该论文中作者叙述了培养A组链球菌的限定配方的培养基，报道的产量为每公升培养肉汤中可分离出透明质酸0.3克。然而用细菌生产的透明质酸还未发现有实质上的用途，因为该酸属于低分子量范围。

本发明提供的用细菌源生产的透明质酸，其分子量范围比在先有技术中已报道过的用细菌源生产出的透明质酸的分子量范围更高。本发明提供的方法，其产量也比以前报道过的大大提高。该方法另外还生产医用的、纯度可与现有的相比拟或更好的透明质酸。虽然在典型情况下用本方法生产的透明质酸具有的平均分子量约为五万五千，但作为眼药水的成份及化妆品配方的成份，它有潜在的重要用途。用本发明的方法生产的透明质酸产量高、纯度高、成本低，因而可用于以前没有叙述过的地方，或是用哺乳类动物源或低产量的细菌源所生产的透明质酸未曾打算用的地方。例如透明质酸可以在食品加工中用作致湿剂，其他应用方面，有作为润滑剂，及在外科手术后用来减少由于纤维化反应及/或粘连形成所引起的并发症。该材料还可以用于回收第三纪原油时作为聚丙烯酰胺的代用品，类似的合成聚合物或从生物中生产出的聚合物。

本发明的方法的最佳形式包括在无氧条件下在二氧化碳富集的生长培养基（其中包括用细菌生产透明质酸所需的那些原料）中培养出可生产透明质酸的链球菌菌种。虽然不是必需杀死细菌但最好杀死细菌，将细菌与生长培养基分离，在离析出透明质酸。最好在肉汤培养基分离，再离析出透明质酸。最好在肉汤培养基中发酵使细菌生长。其他生长技术及培养基都可以使用。例如可以用琼脂培养基。所以“生长培养基”一词在此可以广义地指液体或固体培养基或两者的组合，且发酵之外的其其他生长方式，在技术上是众所周知的。

虽然本发明的最佳方式是设想在可产生透明质酸的培养基中直接生长细菌，但也可以在其他生长培养基中生长细菌，将细菌与培养基分离，在缓冲悬浮液或蒸馏水中再悬浮细菌，并在悬浮液中加适当的原料以便用已经生长细菌生产透明质酸。这种被看作为与最佳方法相同的工艺仅包括使用静止的细胞悬浮液。因而此处“使培养物生长”等词都应当作是包括在其范围中的两种手段。

与以前透明质酸的生产方式不同，在接种前可以通过1万（10K）额定分子量限制截止过滤器如微孔聚胺膜盒式切向流过滤系统来滤掉所有成份，从一开始就将内毒素从系统中排出，其后维持无热无氧的生长条件。

在本发明的最佳实施例中，使用了诸如含有以下成份的半限定生长培养基：

1.酪蛋白水解液，酶催性    20.0克

2.氯化钾    3.0克

3.磷酸钠，二代性    2.8克

4.硫酸镁（7H₂O） 0.5克

5.氯化钙（2H₂O） 10.0毫克

6.葡萄糖    20.0毫克

7.维生素溶液

A）D-生物素    2.0毫克

B）D-泛酸钙    1.0毫克

C）氯化胆碱    1.0毫克

D）叶酸    1.0毫克

E）I-肌醇    2.0毫克

F）烟酰胺    1.0毫克

G）盐酸吡哆醛    1.0毫克

H）核黄素    0.1毫克

I）盐酸硫胺素    1.0毫克

该培养基可配制成带有反透析、无热原的水1公升。当然适用于此目的的其他生长培养基也可以使用。

一百毫升的18型化脓性链球菌的培养物在无氧条件下在37±1℃生长6小时。上述的其他可产生透明质酸的细菌也可以使用，但以18型为最佳。用此六小时培养物为五升同样的培养基接种并生长到高可见密度，最好生长到至少每毫升含2亿个细胞且典型的为生长到每毫升含5亿个细胞。然后此五升接种物用来在200升发酵桶中为160升的培养基接种开始进行生产，一面连续搅拌，一面灌输二氧化碳气使培养物生长，灌输的流速应足以维持二氧化碳的溶解水平并用二氧化碳监测探头加以探测。而以二氧化碳溶解水平为5-10%时最佳。灌输的气体以氮/二氧化碳的混合物为最佳且以85/15的比例为最佳，但并不严格，当将气体引入到C级箱室中时对气体进行过滤杀菌。温度控制在约37±1℃的最佳值上。PH值最好控制在基本上为恒定值±0.1，恒定值的范围则约为6.5～7.5，由PH值探头/控制器监控，并由控制器控制添加氢氧化钾。当培养物的PH值停止下降（不再需要加氢氧化钾来维持PH值在规定限度之内）时或者当细胞密度达到高可见密度为典型的每毫升细胞有10-50亿个时可视为已完全发酵。此时通过加入100%饱和的三氯乙酸的水溶液使发酵混合物达到最终三氯乙酸浓度约为5%时将发酵过程终止。此情况可以变化。

往发酵肉汤内添加三氯乙酸不仅由于杀死细菌而终止生长而且还由于出现细胞絮凝，使得从肉汤中分离细胞相当容易。不加三氯乙酸的混合物是很难分离的，且会对肉汤成份、微生物及多醣体（即透明质酸）的完整性造成严重破坏。不加三氯乙酸用离心沉淀或过滤的方法就无法分离。虽然有可能用其他方式例如热处理来结束培养物的生长但用三氯乙酸处理的优点是其后分离透明质酸方便。通过使用上述微孔的切向流过滤系统的0.22微米孔径的耐用孔过滤盒来将发酵混合物从发酵桶中泵出。此步骤使160升的细胞浓缩为约5升。保留滤液并对于导电率大于10兆欧姆的反透析水使用额定分子量30000截止的多微孔聚酰胺膜盒式系统进行渗析过滤，直到连续排出的滤液的导电率达到大约0.5兆欧为止。渗析过滤是一种与常规的被动渗析技术不同的强制渗析技术，诸如在麻省01730，贝得福特的微孔公司的1981年样本号OM029中名为多孔聚酰胺膜盒式系统中所公开的技术。然后用不进一步加水的连续过滤方法对透明质酸进行浓缩。

然后用试剂级乙醇对浓缩物进行处理，最佳比值为3∶1。其他醇、丙酮、氯仿或其他有机溶剂及某些有机盐诸如“CETAB”（一种混合的溴化三甲基铵）也可以用来使透明质酸或透明质酵钠从水溶液中沉积。这样做时不应有任何混合动作，但将透明质酸泵进溶剂的操作可以除外。已经发现在处理用醇时搅拌会减少透明质酸的产量。此步骤中产生的沉积物可在温度为4℃时在黑暗中长时期存放。

如在上述程序中所见的那样，发现了一种独特的方法，即用从肉汤中离析透明质酸要用两步法，其中第一步为分子量分离是用渗析过滤法从肉汤的基本上全部低分子量成份中分离该酸，第二步是用沉淀法从任何剩下的肉汤组合物中分离该酸。

沉淀出的透明质酸能用许多常规的技术进行去水（去掉大量的水/醇溶液），且然后在反渗透水中或0.15克分子的氯化钠溶液中再悬浮。然后将悬浮物质冻干，溅干，真空干燥或渗析过滤以去掉最后的醇迹。进一步进行提纯是通过制成PH值为8.0的硼酸盐缓冲溶液其中透明质酸的浓度约为10毫克/毫升来进行的。然后将0.32%的CETAB（一种混合物的溴化三甲基铵）加入溶液及混合物中并在4℃终夜搅拌以提供透明质酸钠沉淀。也可以使用其他沉淀剂，诸如氯化十六烷苯基偶氮二氨基吡啶或有关的盐。用粗滤及在由反渗透水制造的1克分子的氯化钠溶液中再悬浮来回收沉淀物。然后对再悬浮透明质酸进行掺析过滤及浓缩如上。然后可将得到的透明质酸进行过滤杀菌后使用或转换为透明质酸钠，然后过滤杀菌后使用。

常规的去水技术包括加压，离心，添加化学剂等等。选用的特殊技术取决于沉淀物以后的使用情况。

如需要医药级的无热原产品，应使用无热原过滤过的生长培养基，且包括对透明质酸/透明质酸钠的离析及处理等的全部工艺操作都应在100级的净室内使用无热原容器进行。如果该物质仅用于化学级的应用，则操作室的清洁度，及收集容器相对于热原要求不严格。

本发明的方法强调在不通风条件下生长细胞，因而可以防止链球菌产生正常的最终产品的补体，主要是热原性外毒素。该细菌的外毒素是众所周知的。上述生长条件还可使透明质酸的产量比以前报导过的更高。使用上述最佳细胞生长及离析条件，每升培养肉汤中最少可得到5克透明质酸。在不通风的情况下能得到高产量是意想不到的，因为人们都认为透明质酸的功能之一是为细胞提供氧障，只有在暴露在氧气之下才能期望得到最高的产量。

用上述制备的透明质酸/透明质酸钠的平均分子量约为55000±20%，其分子量的总范围约为1万～2百万，可用凝胶过滤法或用准弹性光散射法测得。这些技术都为人们所熟知，测量误差及用上法得到的结果都是由于生物上的变化引起的。产品中蛋白质含量在0.03%～0.3%之间，并与分析的方法有关。百分之一溶液的紫外线吸收在260毫微米时为0.314，在280毫微米时为0.169。百分之一溶液的粘度约为300厘拖。

用本发明方法生产的0.5-1.5%的无热原透明质酸钠溶液可用作眼药水的成份，以代替从高分子量的公鸡鸡冠中得到透明质酸的很稀的溶液，现可用来治疗干性角膜炎。

其他在A组及C组菌株中能生产的透明质酸的链球菌也可以用于本发明中。此外，不离开在下述权利要求中提出的发明，也可以对生长培养基及生长条件与离析工艺作些改变。

Claims (49)

1、一种生产透明质酸的方法，包括：

在二氧化碳富集，无氧的情况下在生长培养基中使可产生透明质酸的链球菌的肉汤培养物发酵；

使细菌细胞与发酵后肉汤分离；及从肉汤剩下的组成物中离析透明质酸。

2、为权利要求1所述的方法，其中在接种前通过一万分子量截止过滤器对生长培养基进行过滤，使生长培养基做到无热原。

3、为权利要求1所述的方法，其中细菌细胞分离步骤包括首先将三氯乙酸加进肉汤。

4、如权利要求3所述的方法，其中三氯乙酸应加到使发酵混合物的最终浓度为5-6%为止。

5、为权利要求3所述的方法，其中添加上述三氯乙酸后细菌的生长就终止。

6、为权利要求1所述的方法，其中离析的完成是通过分离酸及那些具有类似的或较高分子量的肉汤组成物然后用沉淀法使酸与那些相似的肉汤组成物分离。

7、如权利要求6所述的方法，其中沉淀是通过将透明质酸及剩余肉汤组成物加到醇中去而不作实质性混合来完成的。

8、如权利要求1所述的方法其中离析是通过使肉汤和细胞分离渗析过滤肉汤，及将溶液加到有机溶剂中去而不作实质性混合，使酸在溶液中沉淀来完成的。

9、如权利要求1所述的方法，其中发酵步骤包括在发酵全过程中将PH值控制在6.5-7.5的范围中基本上为恒定值±0.1、且将温度控制在37±1℃。

10、如权利要求9所述的方法，其中PH值的控制是通过用PH探头/控制器来自动加碱。

11、如权利要求1所述的方法，其中溶解的二氧化碳浓度维持在约为5-10%。

12、如权利要求1所述的方法，其中在细菌停止生长前生长到密度为每毫升2亿细胞。

13、如权利要求1所述的方法，其中细菌为18型化脓性链球菌。

14、如权利要求6所述的方法，其中过滤生长培养基是在用细菌培养物接种前通过一万分子量截止过滤器进行的，且实行剩余步骤是在100级的净室中并使用无热原容器的条件下进行的。

15、如权利要求14中所述的方法，进一步包括：精制离析出的透明质酸是在将其溶解在温和的碱性缓冲溶液中，用混合的溴化烷基三甲基铵使透明质酸沉淀，在稀氯化钠溶液中使沉淀物再悬浮及通过将悬浮物加到乙醇，且不作搅拌，对其再沉淀得酸。

16、透明质酸其分子量组份范围约从一万到二百万道尔顿，其平均分子量约5.5万道尔顿±约20%其生产是通过：

在二氧化碳富集的生长培养基中在无氧条件下使可生产透明质酸的链球菌细菌的肉汤培养基发酵;

使细菌细胞与发酵的肉汤分离;及从肉汤的剩余组成物中离析透明质酸。

17、为权利要求16所述的酸，其中细菌为18型化脓性链球菌。

18、为权利要求16所述的酸，其中离析是通过分离酸与那些有相似的或较高分子量的肉汤组成物及然后用沉淀法将酸与那些相似的肉汤组成物分离来完成的。

19、如权利要求17所述的酸，其中沉淀是通过将透明质酸及剩余的肉汤组成物加到乙醇中去且不作任何实质上的混合来完成的。

20、如权利要求16所述的酸，其中离析是通过使肉汤和细胞分离，渗析过滤肉汤及将溶液加到有机溶剂而不作任何实质性的混合使酸在溶液中沉淀

21、如权利要求16所述的酸其中蛋白质的含量范围在约0.3%与约0.03%之间，1%的溶液的紫外线吸收在260毫微米时为0.314，在280毫微米时为0.169，且粘度约为300厘拖。

22、为权利要求21所述的酸，其中离析是通过分离酸与那些有相似的或较高分子量的肉汤组成物及然后用沉淀法将酸与那些相似肉汤组成物分离来完成的。

23、为权利要求22所述的酸，其中沉淀是通过将酸及剩余的肉汤组成物加进乙醇中去而不作实质性的混合来完成的。

24、如权利要求21所述的酸，其中离析是通过使肉汤与细胞分离渗析过滤肉汤及将溶液加到有机溶剂中去而不作实质性的混合，使酸在溶液中沉淀来完成的。

25、在生产透明质酸的方法中包括用细菌生产透明质酸，其改进包括通过将酸与那些含有相似的或更高的分子量的肉汤组成物与液体分离且然后用沉淀法使醇与那些相似的肉汤组成物分离来将酸从细菌在其中生长的肉汤中离析出来。

26、如权利要求25所述的方法，其中细菌为18型化脓性链球菌。

27、如权利要求25所述的方法，其中沉淀是通过将酸与剩余的肉汤成份加到乙醇中去而不作实质性的混合来完成的。

28、如权利要求25所述的方法，其中离析是通过将肉汤与细菌分离，渗析过滤肉汤，及通过在将溶液加到有机溶剂中去而不作任何实质性混合，使酸在溶液中沉淀来完成的。

29、在生产透明质酸的方法中包括用细菌生产透明质酸，其改进包括在细菌生长培养基的环境中维持二氧化碳富集无氧的条件。

30、一种生产透明质酸的方法其中：

在二氧化碳富集无氧的条件下在生长培养基中使可产生透明质酸的链球菌的培养物生长。

形成细菌及其副产物的液态悬浮液，形成这种悬浮液不是所用的生长方法的固有性质。

将细菌细胞与悬浮液分离及从剩余液体的组成物中离析透明质酸。

31、如权利要求30中所述的方法，其中离析是通过将酸与那些有相似或较高分子量的液体组成物与液体分离及然后将酸与那些相似组成物分离来完成。

32、如权利要求30所述的方法，其中生长步骤包括在发酵全过程中控制PH值在6.5-7.5的范围内大体上为恒定值±0.1且控制温度为37±1℃。

33、如权利要求30所述的方法，其中PH值用PH探头/控制器自动加碱进行控制。

34、透明质酸其分子量组份的范围从约十万到约二百万，平均分子量约为55，000±约20%，其生产是通过：

在二氧化碳富集无氧的条件下使可产生透明质酸的链球菌的培养物生长。

形成细菌及其副产物的液态悬浮液，形成这种悬浮液不是所用生长方法的固有性质。

将细菌细胞与悬浮液分离及从剩余液体的组成物中离析透明的质酸。

从剩余液体的组成物中离析透明质酸。

35、如权利要求34所述的酸其中离析是通过将酸，及那些有相似或较高分子量的组成物与液体分离且然后将酸与那些相似组成物分离来完成。

36、如权利要求35所述的酸，其中用沉淀法进行最后分离，沉淀的完成是通过将酸及剩余组成物加到乙醇中去而不作实质性的混合来完成的。

37、如权利要求34所述的酸，其中蛋白质含量范围在约0.3%及0.03%之间，1%溶液的紫外线吸收在260毫微米时为0.314，在280毫微米时为0.169，且粘度约为300厘拖。

38、如权利要求37所述的酸，其中离析是通过将酸及那些有相似或较高分子量的组成物与液体分开且然后将酸与那些相似的组成物分离来完成。

39、为权利要求38所述的酸，其中最后分离是用沉淀法，沉淀是通过将酸及剩余组成物加进乙醇中去且不作实质性的混合来完成的。

40、一种生产透明质酸的方法、包括：

在二氧化碳富集无氧的条件下在固定生长基上使可产生酸的链球菌的培养物生长，形成细菌及其副产物的液态悬浮液再将其物与固体培养基分离，将细菌细胞与悬浮液分离，及从剩余液体的组成物中离析透明质酸。

41、为权利要求40所述的方法其中离析是通过将酸及那些有相似或较高分子量的液体组成物与液体分开且然后将酸与那些相似组成物分离来完成的。

42、为权利要求41所述的方法，其中最后分离是用沉淀法，沉淀是通过将透明质酸及剩余组成物加到乙醇中去而不作实质性混合来完成的。

43、为权利要求40所述的方法其中发酵步骤包括在发酵的全过程中控制PH值在6.5～7.5范围内并大体上为恒定值±0.1且控制温度为37±1℃。

44、如权利要求40所述的方法，其中溶解的二氧化碳维持在浓度约为5-10%。

45、如权利要求40所述的方法，其中在细菌生长终止前使细菌生长到密度为每毫升大于二亿个细胞。

46、如权利要求40所述的方法进一步包括：通过将其溶解在温和的缓冲溶液中来精制离析出的透明质酸。

用混合的溴化烷基三甲基铵使透明质酸沉淀。

在烯氯化钠溶液中使沉淀物再悬浮。

通过将其加到乙醇中去而不进行搅拌使其再沉淀成为酸。

47、一种生产透明质酸的方法包括：

提供可产生透明质酸的细菌;

将细菌与生长培养基合在一起因而细菌产生包括透明质酸的副产品;

在生长培养基的环境中维持二氧化碳富集无氧的条件;

形成细菌及其副产物的液态悬浮液，这种悬浮液的形成不是生产方法所用培养基的固有性质;

将细菌与悬浮液分离;

从剩余液体的组成物中离析出透明质酸。

48、为权利要求47所述的方法，其中起初在静止悬浮液中提供细菌。

49、如权利要求47所述的方法，其中细菌为18型化脓性链球菌。