KR0126427B1

KR0126427B1 - 히아론산의 정제방법

Info

Publication number: KR0126427B1
Application number: KR1019940019510A
Authority: KR
Inventors: 장이섭; 홍승기; 염명훈; 권순상; 김승정
Original assignee: 한동근; 주식회사태평양
Priority date: 1994-08-08
Filing date: 1994-08-08
Publication date: 1997-12-19

Abstract

본 발명은 바이오세라믹을 이용한 히아론산(hyaluronic acid)의 정제방법에 관한 것으로, 좀더 상세하게는, 다공성유리, 실리카, 탄화규소아파타이트, 제올라이트로 이루어진 군에서 선택된 바이오세라믹을 히아론산 발효액에 첨가하여 미생물뿐만 아니라 단백질, 핵산 등의 불순물을 동시에 제거함으로써 히아론산을 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

히아론산의 정제방법

본 발명은 바이오세라믹을 이용한 히아론산(hyaluronic acid)의 정제방법에 관한 것이다. 좀더 상세하게는, 본 발명은 미생물 발효에 의해 얻은 히아론산-함유 발효액으로부터 히아론산을 정제함에 있어, 발효액에 바이오세라믹을 첨가하여 미생물뿐만 아니라 단백질, 핵산 등의 불순물을 동시에 제거함으로써 히아론산을 정제하는 방법에 관한 것이다.

히아론산은 분자량이 수만 내지 수백만의 고분자 다당체로서, 소의 안구 수정액, 닭벼슬, 동물의 태반이나 알세포, 분화가 일어나는 세포, 관절등의 결체조직에서 얻을 수 있으며, 단백질인 콜라겐과 결합하여 젤리상태로 되어 외부로부터의 물리적 마찰에 대한 윤활효과 및 세균등의 침입에 대한 보호효과가 있고, 보습성이 있어 화장품에서는 피부보호제로 이용된다.

종래에는 히아론산을 상기 동물의 생체조직으로부터 추출하여 얻었으나, 근래에는 연쇄상 구균인 스트렙토코커스속의 파이오제네스, 이퀴, 쥬에피데미쿠스 등의 미생물을 배양하여 히아론산을 제조하는 방법이 연구되고 있다[일본특허공보 58-56692호, 독일 공개 제DE 3,517,629호(1985)]. 이들의 배양방법에는 회분식, 반회분식, 연속식, 등이 이용되고 있다. 미생물의 배양이 완료된 후 미생물 배양액으로부터 히아론산을 정제하기 위해서는 먼저 미생물을 제거해야 하는데, 히아론산의 발효액은 히아론산의 분자량이 수만에서 수백만에 이르러 발효액의 점성이 매우 높아져 있어서, 발효액으로부터 미생물을 분리하기가 매우 어렵다. 스미스(Smith)등[J. Chem. Tech. Biotechnol., 32, 119(1982)]은 고분자 다당류인 풀루란, 잔탄 등의 배양액에서 미생물을 제거하기 위하여 원심분리법이나, 여과보조제를 이용한 여과법을 사용하였다. 원심분리법에서 발효액의 점성으로 인하여 그대로 원심분리를 행할 수 없기 때문에, 원심분리에 앞서 먼저 많은 물을 이용하여 희석하여야 한다. 그러나, 이러한 경우 원심분리를 해야 할 시료의 부피가 커져 많은 시간이 소요될 뿐 아니라, 원심 분리후에 히아론산을 정제할 때 많은 처리부피로 인하여 정제설비의 대형화, 인건비의 증가 등 원가상승의 요인이 된다. 또한, 여과보조제를 이용한 여과법도 점성으로 인하여 물로 희석한 다음 여과를 해야하므로 원심분리법에서와 동일한 문제점을 안고 있다. 또한, 미생물이 제거된 히아론산 여과액에는 단백질, 핵산 등의 불순물이 과량 존재하며, 이들을 제거하기 위해서는 이온교환수지, 흡착수지 등의 다단계 컬럼을 사용해야 하는 번거로움이 있다.

따라서, 본 발명자들은 상기한 원심분리법이나 여과법에서의 문제점들을 해소하고, 물에 의한 희석단계를 거치지 않고 히아론산 발효액으로부터 미생물을 제거할 수 있는 정제방법을 연구하던 중, 미생물과 응집 반응를 할 수 있는 바이오세라믹을 발효가 완료된 발효액에 첨가하는 경우 바이오세라믹과의 응집에 의해 발효액의 점성을 저하시킬 수 있으며, 따라서 원심분리를 용이하게 행할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다. 또한, 바이오세라믹을 이용하는 경우, 발효액 내에 함유되어 있는 단백질, 핵산 등의 불순물들이 바이오세라믹에 흡착하여 엉김으로써 별도의 정제공정 없이 단백질, 핵산 등의 불순물도 제거할 수 있음을 알았다.

즉, 본 발명의 목적은 배양이 완료된 히아론산 발효액에 바이오세라믹을 첨가하여 미생물 뿐만 아니라 단백질, 핵산 등의 불순물을 동시에 제거할 수 있는 히아론산의 정제방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 정제방법에서 히아론산 발효액에 첨가되는 바이오세라믹은 주로 실리카재질로 되어 있으며, 실릭카 표면에 있는 실라놀기는 단백질,아미노산 등의 생체 고분자와 강한 친화력을 갖고 있어 효소, 항체, 수용체 등과 공유결합할 수 있고, 이에 의해 항암효과, 항균효과, 세포분화 촉진효과를 나타내며, 이러한 이유로 바이오세라믹이라 불리우고 있다. 이러한 특성을 갖고 있는 바이오세라믹으로는 유리, 실리카, 지르코늄, 뮬라이트, 코디어라이트, 인산티타늄, 탄화규소아파타이트, 제올라이트, 탄산칼슘, 황산칼슘 등이 있으며, 불활성, 다공성, 표면활성, 분해성 등의 형태를 갖는다. 이러한 바이오세라믹은 효소의 고정화, 바이오센서, 생체고분자 결정화 기제로 널리 이용되고 있다. 본 발명에서는 이러한 다양한 효과를 가지며, 다양한 용도로 사용되고 있는 바이오세라믹을 히아론산 발효액에 첨가함으로써 발효액증의 미생물과 응집하게 하여 미생물을 제거하는데 이용된다. 이때 바이오세라믹은 발효액의 0.1~25%(w/ v)로 첨가하는 것이 바람직하다. 0.1% 미만으로 첨가하는 경우, 미생물과의 응집 반응의 정도가 미약하여 원하는 효과를 얻을 수 없으며, 25% 이상에서는 거의 같은 정도의 효과가 얻어지므로, 0.1~25%(w/ v)를 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 히아론산 제조에 사용되는 균주는 히아론산 제조를 위해 통상 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 이하의 설명은 스트렙토코커스 이퀴 PCI 106(KFCC 10700)를 예로 들어 설명한다.

스트렙토코커스 이퀴 PCI 106(KFCC 10700)을 트립톤 1.5%, 펩톤 0.5%, 식염, 트리스완충액이 함유된 배지에서 일정시간 배양하여 얻은 것으로, 점성이 8,000~12,000cps인 히아론산 발효액에 바이오세라믹의 농도가 0.1~25%가 되도록 첨가하여 60~70℃로 유지하여 일정시간 교반한 다음, 약 24시간 방치한다. 얻은 미생물 배양액을 원심분리기를 이용하여 15,000rpm에서 30분간 원심분리하여 미생물이 제거된 상등액을 얻는다.

이때, 상등액중의 미생물의 잔존여부는 분광광도계로 측정하였고, 600nm에서 흡광도가 0.0일때 미생물이 완전히 제거된 것으로 계산한다.

원심분리후 상등액을 막여과기를 통과시켜 미생물을 완전히 제거한 다음, 알코올을 이용하여 히아론산을 침전시켜, 이를 진공건조기에서 건조시킨다. 건조물을 0.5%의 수용액으로 제조하여 단백질과 핵산의 함량을 측정하여 불순물의 제거 정도를 확인한다.

이때, 단백질의 함량은 공지의 방법인 로우리(Lowry)법을 이용하고, 핵산의 함량은 분광광도계를 이용하여 278nm에서의 흡광도로 측정한다.

이하, 본 발명의 비제한적 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

[실시예 1]

트립톤 1.5%, 펩톤 0.5%, 식염 및 트리스 완충액이 함유된 배지 9ℓ를 용량 14ℓ인 발효조에 충입하고 증기 멸균한 다음, 따로 멸균한 포도당 용액 1ℓ를 최종농도가 1.0% 되도록 첨가한 배양액에 스트렙토코커스 이퀴 PCI 106(KFCC 10700)의 종배양액 100ml를 접종하여 통기량을 0.1VVM으로 공기를 주입하고 pH 조절장치로 pH를 7.0으로 유지하면서 25시간 배양하여 발효액 10ℓ를 얻었다. 이때, 발효액의 점도는 10,000cps이었다.

발효액에 증류수 10ℓ와 10ｇ[발효액의 0.1%(w/ v)]의 실리카(구경 0.007∼

0.14㎛, 시그마사)를 첨가하여 온도를 65℃로 유지하면서 1시간 동안 100rpm으로 교반하였다. 교반이 끝난 후 12시간동안 방치한 후 15,000rpm에서 30분간 원심분리하였다. 이때, 상등액의 흡광도는 2.3이었다. 또한, 발효액의 일부를 취하여 증류수를 원래 발효액(배양이 완료된 직후의 발효액)의 20배가 되도록 첨가한 다음 동일한 조건으로 원심분리하였을때, 상등액의 흡광도는 0.35이었다.

상등액을 0.22㎛의 막여과기를 통과시켜 미생물을 완전히 제거한 다음, 알코올을 이용하여 히아론산을 침전시켰다. 이 침전을 0.5%의 수용액으로 제조하였을때 수용액의 단백질 농도는 0.17%이었고, 핵산의 흡광도는 0.21이었다.

[실시예 2]

실시예 1과 동일한 방법으로 얻은 발효액 10ℓ를 증류슈 10ℓ로 희석한 다음, 100ｇ[발효액의 1.0%(w/ v)]의 실리카(구경 0.007~0.14㎛, 시그마사)를 첨가하여 원심분리하였다. 상등액의 흡광도는 0.72이었다. 또한, 진공건조 후 단백질의 함량은 0.09%이었고, 핵산의 흡광도는 0.14이었다.

[실시예 3]

실시예 1과 동일한 방법으로 얻은 발효액 10ℓ를 증류수 10ℓ로 희석한 다음, 500ｇ[발효액의 5.0%(w/ v)]의 실리카(구경 0.007~0.14㎛, 시그마사)를 첨가하여 원심분리하였다. 상등액의 흡광도는 0.35이었다. 또한, 진공건조 후 단백질의 함량은 0.07%이었고, 핵산의 흡광도는 0.11이었다.

[실시예 4]

실시예 1과 동일한 방법으로 얻은 발효액 10ℓ를 증류슈 10ℓ로 희석한 다음, 1000ｇ[발효액의 10.0%(w/ v)]의 실리카(구경 0.007~0.14㎛, 시그마사)를 첨가하여 원심분리하였다. 상등액의 흡광도는 0.30이었다. 또한, 진공건조 후 단백질의 함량은 0.06%이었고, 핵산의 흡광도는 0.10이었다.

[실시예 5]

실시예 1과 동일한 방법으로 얻은 발효액 10ℓ를 증류수 10ℓ로 희석한 다음, 2500ｇ[발효액의 25.0%(w/ v)]의 실리카(구경 0.007~0.14㎛, 시그마사)를 첨가하여 원심분리하였다. 상등액의 흡광도는 0.30이었다. 또한, 진공건조 후 단백질의 함량은 0.05%이었고, 핵산의 흡광도는 0.07이었다.

[비교예 1]

실시예 1과 동일한 방법으로 얻은 발효액 10ℓ를 증류수를 이용하여 20배로 희석한 다음 원심분리하였다. 상등액의 흡광도는 0.55이었다. 다음 0.5%의 수용액으로 제조하였다. 또한, 진공건조 후 단백질의 함량은 0.34%이었고, 핵산의 흡광도는 0.42이었다.

Claims

미생물 발효에 의해 얻은 히아론산-함유 발효액으로부터 히아론산을 정제함에 있어서, 발효액에 다공성유리, 실리카, 탄화규소아파타이트, 제올라이트로 이루어진 군에서 선택된 바이오세라믹을 첨가함을 특징으로 하는 히아론산의 정제방법.
제 1 항에 있어서, 바이오세라믹은 발효액의 0.1%~25.0%(w/ v)양으로 첨가함을 특징으로 하는 방법.