CN118086255A - 一种重组透明质酸酶的制备方法及其应用 - Google Patents
一种重组透明质酸酶的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种重组透明质酸酶的制备方法及其应用，属于酶工程技术领域，所述方法包括：菌体破碎，预处理，纯化；所述纯化，采用AKTA蛋白纯化系统，利用镍柱亲和层析法进行纯化，收集洗脱峰，然后经过浓缩换液，得到透明质酸酶酶液；所述层析程序为：平衡，NiA buffer 5CV；上样；漂洗，10%NiB buffer 10CV；洗脱，50%NiB buffer 5CV；本发明利用纯化后的高酶活透明质酸酶，酶解大分子透明质酸钠，制备低分子量及寡聚透明质酸钠，制备的透明质酸酶液发酵周期短，适用于工业化大量制备透明质酸酶，纯化后的透明质酸酶酶活高，适用于工业化生产制备低分子量及寡聚透明质酸钠。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种重组透明质酸酶的制备方法及其应用。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid，HA)又名玻璃酸，是人体中重要的成分，由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和D-葡萄糖醛酸(GlcA)二糖重复单位通过β-1,4-糖苷键和β-1,3-糖苷键构成的无分支结构的高分子酸性黏多糖，具有很强的亲水性和非常好的保湿性能，广泛存在于皮肤、软骨、关节、玻璃体等生物组织中，具有重要的生理学功能。根据其分子量不同可以分为高分子量HA(HMWHA)和低分子量HA(LMWHA)，HMWHA能够抑制内皮细胞的迁移，具有抗血管生成活性，促进人体伤口愈合；LMWHA能够促进内皮细胞的分化，抗细胞凋亡，促进软骨、内皮等细胞的迁移，还具有抗炎的作用。HA以其独特的理化性质，在医学和药学研究方面发挥了重要的作用。
目前低分子量HA在制备时，主要是通过物理、化学和酶等降解方法将大分子透明质酸降解为低分子量HA。但是物理降解法通常得不到超低分子量的HA，化学降解法可能会导致制备的低分子量HA产品中有化学试剂的残留，并且可能会对透明质酸单体中醛酸或羟基基团产生修饰作用，因此化学法可能会破坏低分子量HA结构。
酶降解法由于其专一性强，反应条件温和，且多糖的结构未发生变化，可通过控制不同降解时间，得到不同分子量HA，是制备低分子量HA理想的方法。透明质酸酶(Hyaluronidase，HAase)是一种将高分子量HA降解为低分子量或寡聚HA的糖苷酶，部分HAase还具有降解软骨素和肝素的能力。HAase除用于制备低分子量或寡聚HA外，还可以作为药物扩散剂，降解组织的HA，增加组织的通透性，促进注射液的扩散，且污染较少。根据水解机制不同，HAase可分为3类：睾丸型HAase(BTH)、水蛭型HAase(LHase)、微生物型HAase。
目前HAase的产业化一直未得到突破，市场上尚没有针对特定低分子量HA降解的商业用酶，由于HAase的来源非常有限，现有技术主要是从牛睾丸提取获得的，价格昂贵，在很大程度上限制了它们的应用；微生物来源酶的酶学性质丰富多样，且易于重组表达和提高产量，是未来应用酶制剂的主要来源。另一方面微生物生长繁殖快，生长周期短，培养方法简单，原料来源丰富，价格低廉，经济效益高，有很大的应用价值。因此，挖掘更多微生物来源的HAase，摸索纯化出高酶活的HAase，提供一种制备HAase的方法，并应用于制备低分子量及寡聚透明质酸钠，具有重要的研究意义。
目前微生物来源的HAase表达方式主要分为两种，一种是胞外分泌表达，如酵母、芽胞杆菌发酵产透明质酸酶；一种是胞内表达，如柠檬酸杆菌、大肠杆菌发酵产透明质酸酶。
中国专利CN117448305A公开了一种酵母发酵产水蛭透明质酸酶的方法及其应用，该发明将发酵液离心取上清，经洗脱纯化蛋白，收集洗脱峰得到粗酶液，其发酵上清液经纯化后酶活由2.414×106U/mL提升为4.698×106U/mL，发酵上清液中酶活高，但是纯化后酶活虽然有所提升但仍然不高，并且发酵周期耗时较长，需7-10天。
中国专利CN112501088A公开了一种芽胞杆菌、其产生的透明质酸酶及生产方法，该发明将培养后的透明质酸酶发酵液于10000-15000rpm条件下离心10-20min去除沉淀，得到上清液，用硫酸铵沉淀上清液，之后离心或过滤收集粗蛋白；用磷酸盐缓冲液复溶收集的粗蛋白，经超滤或透析除去小分子杂质后得到纯化后的透明质酸酶，其过程繁琐，纯化中使用硫酸铵沉淀，对硫酸铵需求大，并不适用于工业化大量制备透明质酸酶。
中国专利CN117568222A提供了一种葡萄牙柠檬酸杆菌、透明质酸酶及其制备方法、应用，该发明对葡萄牙柠檬酸杆菌培养后的菌液，离心处理后进行破碎，得透明质酸酶，其酶活为1000-10000U/mL，由于没有对后续粗酶液进行纯化富集，并不适用于工业化生产制备低分子量及寡聚透明质酸钠。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种重组透明质酸酶的制备方法及其应用，利用纯化后的高酶活透明质酸酶，酶解大分子透明质酸钠，制备低分子量及寡聚透明质酸钠，制备的透明质酸酶液发酵周期短，适用于工业化大量制备透明质酸酶，纯化后的透明质酸酶酶活高，适用于工业化生产制备低分子量及寡聚透明质酸钠。
为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：
一种重组透明质酸酶的制备方法，包括：菌体破碎，预处理，纯化；
所述菌体破碎，将重组大肠杆菌进行高密度发酵培养，得到发酵液，发酵液经破碎后，得到破碎液；
所述预处理，将破碎液进行第一次离心收集沉淀，得到菌泥，按照菌泥：NiAbuffer为1:10-20重悬；高压破碎；对破碎液进行第二次离心收集上清；上清液抽滤除杂，得到重组菌上样液；
所述预处理中，第一次离心的转速为7000-9000rpm，时间为13-17min；
所述高压破碎的破碎压力为500-700bar，破碎次数为2-3次；
所述第二次离心的转速为12000-14000rpm，时间为25-35min；
所述抽滤中的滤膜精度为0.4-0.5μm；
所述纯化，采用AKTA蛋白纯化系统，利用镍柱亲和层析法进行纯化，收集洗脱峰，然后经过浓缩换液，得到透明质酸酶酶液；
所述纯化中的层析程序为：平衡，NiA buffer 5CV；上样；漂洗，10% NiB buffer10CV；洗脱，50% NiB buffer 5CV；
所述NiA buffer的组成为：25 mM磷酸盐缓冲液，50 mM咪唑，500 mM NaCl，pH为7.4；
NiB buffer的组成为：25 mM磷酸盐缓冲液，500 mM咪唑，500 mM NaCl，pH为7.4；
前述重组透明质酸酶的应用，在37℃下，向纯水中加入重组透明质酸酶、大分子透明质酸钠，密封，酶解1-5h，过滤，向滤液中加入硅藻土，搅拌均匀，过滤至料液澄清，使用超滤膜进行分离，喷雾干燥，得到小分子透明质酸钠；
所述分离中超滤膜的精度为1wDa，物料温度为30-35℃，压力为0.4-0.5Mpa；
所述喷雾干燥中进风温度为170-180℃，出风温度为70-80℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）本发明提供了一种重组透明质酸酶的制备方法，该重组透明质酸酶可以酶解大分子透明质酸或透明质酸钠，制备低分子量及寡聚透明质酸钠；
（2）本发明提供了一种重组透明质酸酶的制备方法，制备的重组透明质酸酶，纯度高、酶活高，因此在制备小分子透明质酸时，使用的酶量较少，酶解温度为37℃，酶解时间为1-5h，酶解得到的小分子透明质酸钠为二糖、四糖、六糖、八糖中的任一种或多种组合混合物，无需高温加热及其添加活性炭等除杂工艺，极大简化工业化程序的复杂性，降低生产成本，极具工业化应用价值；
（3）本发明提供了一种重组透明质酸酶的制备方法，制备的透明质酸酶的酶活为2×107U/mL。
附图说明
图1为实施例2得到的蛋白纯化洗脱结果图；
图2为实施例2得到的SDS-PAGE电泳结果图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现说明本发明的具体实施方式。
实施例中酶活性的测试方法为：
1.2g/L透明质酸底物的配制：将2g透明质酸溶于1L 50mM柠檬酸缓冲液中，配制成2g/L的透明质酸底物溶液；
所述柠檬酸缓冲液的pH为5.5。
2.测定：根据3,5-二硝基水酸（DNS）比色法测定透明质酸裂解酶酶降解透明质酸产生的还原末端含量。分别以实施例1中得到的透明质酸酶和透明质酸溶液为实验组，灭活酶液和透明质酸溶液作为对照组，37℃反应15min，加入DNS试剂，沸水浴10min终止反应，冷却后使用酶标仪在540nm处测量吸光值。制备不同浓度的葡萄糖溶液，建立葡萄糖标准曲线。
3.酶活计算方法：酶活单位(1U)定义为上述实验条件下，每分钟产生1μg葡萄糖还原当量所需的酶量，测定均重复3次。以此作为透明质酸酶酶活标准测定方法。
实施例1一种重组透明质酸酶的制备方法
一种重组透明质酸酶的制备方法，具体为：
1.将重组大肠杆菌进行高密度发酵培养，得到发酵液，发酵液经破碎后，得到破碎液，测定破碎液中的酶活为1.5×105U/mL；
所述重组大肠杆菌是按照专利CN116286764A 一种透明质酸裂解酶及其重组菌与应用的方法得到的重组菌。
2.重组透明质酸酶发酵液预处理：对破碎液离心收集沉淀，离心条件为转速8000rpm，时间15min；称取菌泥沉淀，按照菌泥：NiA buffer为1:15重悬；高压破碎，破碎压力为600bar，重复2次；破碎液离心收集上清，离心条件为转速13000rpm，时间30min；上清液抽滤除杂，得到重组菌上样液，抽滤中的滤膜精度为0.45μm；
3.重组透明质酸酶的一步层析纯化；采用AKTA蛋白纯化系统，利用镍柱亲和层析法进行纯化。层析程序为：平衡，NiA buffer 5CV；上样；漂洗，NiA buffer 10CV；洗脱，50%NiB buffer，5CV，收集洗脱峰，然后经过浓缩换液，得到透明质酸酶酶液；并对各步骤取样，进行酶活测试，如下表所示：
所述NiA buffer的组成为：25 mM磷酸盐缓冲液，50 mM咪唑，500 mM NaCl，pH为7.4；
NiB buffer的组成为：25 mM磷酸盐缓冲液，500 mM咪唑，500 mM NaCl，pH为7.4；
本实施例得到的重组透明质酸酶酶活性可由重组菌发酵破碎液1.5×105U/mL提升为纯化后的1.8×107U/mL。酶活提升高，并且适合工业放大进行重组透明质酸酶的工业化生产。
实施例2重组透明质酸酶的洗脱方式的优化
相比较实施例1，本实施例采用10%NiB、20%NiB、30%NiB、40%NiB、50%NiB、100%NiB梯度洗脱方式，并对各段取样，进行SDS-PAGE电泳，其中蛋白纯化洗脱结果图见图1所示，SDS-PAGE电泳结果图见图2所示。图1中，蓝色为UV280，表示蛋白吸收峰，红色为UV260，表示核酸吸收峰，浅蓝色为B%，橙色为cond电导曲线，其中各阶段取样编号与NiB梯度洗脱体积分数对应关系如下：10%NiB（A1、A2、A3）、20%NiB（B10、B11、B12、C1）、30%NiB（D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8）、40%NiB（E11、E12、F1）、50%NiB（F10、F11）、100%NiB（G10）。
由图2可以看出，10%NiB可以有效的去处大部分杂蛋白，因此，可以在漂洗阶段调整为10%NiB，胶图显示20%NiB洗脱时仍有一部分杂蛋白，但是目标蛋白有损失，后续根据需求考虑是否进一步去除，也可结合其它层析技术进一步纯化。
实施例3重组透明质酸酶的层析工艺的优化
相比较实施例1，本实施例层析程序为：平衡，NiA buffer 5CV；上样；漂洗，10%NiB buffer 10CV；洗脱，50% NiB buffer，5CV，收集洗脱峰，然后经过浓缩换液，得到透明质酸酶酶液；并对各步骤取样，进行酶活测试，如下表所示：
将实施例1和实施例3的结果进行比较，漂洗中采用10%NiB得到的酶活更高。
实施例4制备小分子透明质酸钠
1.酶解反应：向不锈钢桶中加入14L纯水，水浴锅加热37℃后，按照1‰体积先加入实施例3得到的重组透明质酸酶14mL，再加入1400g大分子透明质酸钠(分子量为100wDa)；保鲜膜密封，37℃下酶解1-5h，通过控制不同降解时间，得到不同分子量的小分子透明质酸钠；
2.酶解液预处理：板框过滤，往滤液加入1kg硅藻土，搅拌均匀，过滤至料液澄清。
3.有机超滤膜分离：对上述预处理酶解液用1wDa有机超滤膜分离，收集透过液。物料温度控制在30-35℃，压力控制在0.4-0.5Mpa，收集透过液。
4.喷雾干燥：进风温度为175℃，出风温度为75℃，得到小分子透明质酸钠。
所述的小分子透明质酸钠可为二糖、四糖、六糖、八糖中的任一种或多种组合混合物。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为体积百分数。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种重组透明质酸酶的制备方法，其特征在于，包括：菌体破碎，预处理，纯化；
所述纯化，采用AKTA蛋白纯化系统，利用镍柱亲和层析法进行纯化，收集洗脱峰，然后经过浓缩换液，得到透明质酸酶酶液；
所述纯化中的层析程序为：平衡，NiA buffer 5CV；上样；漂洗，10% NiB buffer 10CV；洗脱，50% NiB buffer 5CV。
2.根据权利要求1所述的重组透明质酸酶的制备方法，其特征在于，所述菌体破碎，将重组大肠杆菌进行高密度发酵培养，得到发酵液，发酵液经破碎后，得到破碎液。
3.根据权利要求1所述的重组透明质酸酶的制备方法，其特征在于，所述预处理，将破碎液进行第一次离心收集沉淀，得到菌泥，按照菌泥：NiA buffer为1:10-20重悬；高压破碎；对破碎液进行第二次离心收集上清；上清液抽滤除杂，得到重组菌上样液。
4.根据权利要求3所述的重组透明质酸酶的制备方法，其特征在于，所述预处理中，第一次离心的转速为7000-9000rpm，时间为13-17min；
所述高压破碎的破碎压力为500-700bar，破碎次数为2-3次；
所述第二次离心的转速为12000-14000rpm，时间为25-35min；
所述抽滤中的滤膜精度为0.4-0.5μm。
5.根据权利要求1所述的重组透明质酸酶的制备方法，其特征在于，所述NiA buffer的组成为：25 mM磷酸盐缓冲液，50 mM咪唑，500 mM NaCl，pH为7.4；
NiB buffer的组成为：25 mM磷酸盐缓冲液，500 mM咪唑，500 mM NaCl，pH为7.4。
6.一种权利要求1-5任一项所述的重组透明质酸酶的应用，其特征在于，在37℃下，向纯水中加入重组透明质酸酶、大分子透明质酸钠，密封，酶解1-5h，过滤，向滤液中加入硅藻土，搅拌均匀，过滤至料液澄清，使用超滤膜进行分离，喷雾干燥，得到小分子透明质酸钠。
7.根据权利要求6所述的重组透明质酸酶的应用，其特征在于，所述分离中超滤膜的精度为1wDa，物料温度为30-35℃，压力为0.4-0.5Mpa；
所述喷雾干燥中进风温度为170-180℃，出风温度为70-80℃。
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