CN111551513B - 一种快速测定发酵液中透明质酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速测定发酵液中透明质酸含量的方法，该方法将发酵液进行吸附纯化，将吸附纯化后的上清液稀释后进行酶解，使发酵液中的透明质酸彻底酶解为4,5‑不饱和双糖，然后检测酶解前后发酵液的紫外吸收值，将酶解前后发酵液紫外吸收值的差值带入4,5‑不饱和双糖浓度与紫外吸收值的标准曲线中，计算得到发酵液中透明质酸的含量。该方法操作简便，专一性高，无需对发酵液中的透明质酸进行纯化，批次检测样品数量多，可以广泛应用于透明质酸发酵领域中对透明质酸含量的检测，为透明质酸发酵工艺的优化与过程监控提供了便捷高效的工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速测定发酵液中透明质酸含量的方法，特别是涉及一种利用透明质酸酶或硫酸软骨素酶对透明质酸发酵液进行彻底酶解，并利用酶解前后发酵液在232nm处的吸收值差值来标定发酵液中透明质酸含量的检测方法，属于酶学及药物化学技术领域。
背景技术
透明质酸是一种广泛存在于动物及人体内的天然粘多糖，是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β-(1→4)糖苷键和β-(1→3)糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖。几乎所有的动物组织中均含有 HA，含量较高能够用于工业生产原料的主要为鸡冠和人脐带。随着HA用途越来越广泛，而动物来源的原料有限，提取法已经越来越无法满足工业化生产的需要。细菌发酵法是利用某些以 HA 为主要成分的荚膜的链球菌，通过对菌株筛选、诱变，优化发酵条件制备HA，极大程度上提高了HA的产量，降低了生产成本。
经典的透明质酸含量检测方法为硫酸咔唑法，咔唑显色法检测透明质酸被认为是最为广泛的方法，目前药典中检测透明质酸均是采用该方法，但咔唑显色法的特异性差，透明质酸发酵液中的成分比较复杂，直接用发酵液进行咔唑显色检测干扰因素太多，特别是发酵工艺开发初期，采用不同培养基发酵出来的透明质酸发酵液性质差别比较大，势必会影响判断。因此需要预先对透明质酸发酵液进行醇沉、重溶后，才能进一步利用咔唑法测定透明质酸含量，操作复杂。
发明内容
针对现有透明质酸检测方法存在的不足，本发明提供了一种快速测定发酵液中透明质酸含量的方法，该方法利用透明质酸裂解酶（hyaluronate lyase）或硫酸软骨素酶酶解透明质酸得到的4,5-不饱和双糖在紫外区有特异性吸收峰的特性，通过透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶酶解-紫外检测酶解液的思路检测发酵液中透明质酸的含量，该方法操作简便、专一性高、检测快速，无需对发酵液中的透明质酸进行纯化，批次检测样品数量多，适合各种培养基得到的透明质酸发酵液，可以广泛应用于透明质酸发酵领域中对透明质酸含量的检测，为透明质酸发酵工艺的优化与过程监控提供了便捷高效的工具。
透明质酸裂解酶（hyaluronate lyase）或硫酸软骨素酶是作用于β-1,4糖苷键、能够通过β-消去机制将透明质酸酶解为4,5-不饱和双糖的酶。4,5-不饱和双糖的双键在紫外区205～235 nm（优选232nm）有特异性吸收峰。因此，可以利用酶解前后在205～235 nm（优选232nm）处的紫外吸收峰差值来确定透明质酸的含量。
但是，如果透明质酸发酵培养基中的营养物质成分复杂，发酵得到的发酵液自身的紫外吸收峰会有很高的吸收值，影响检测准确性，无法进行检测。此外，在发酵罐发酵前期或者摇瓶培养时，发酵液中透明质酸产率较低，酶解液稀释后在232nm处的吸收值与培养基稀释液自身在232nm的吸收值没有明显差异。在这种情况下，采用此方法会具有很高的实验误差，干扰实验的准确性。基于这些技术难点，发明人进行了大量的研究，先对发酵液进行吸附纯化，吸附纯化发酵液中的杂质，降低发酵液自身在232 nm处的吸收值，然后对发酵液进行稀释，使232nm处的紫外吸收值在可检测的范围，从而能使酶解前后232nm的吸收值有较大的差异，保证了检测结果的准确性。
本发明具体技术方案如下：
一种快速测定发酵液中透明质酸含量的方法，该方法包括以下步骤：将发酵液进行吸附纯化，将吸附纯化后的上清液稀释后进行酶解，使发酵液中的透明质酸彻底酶解为4,5-不饱和双糖，然后检测酶解前后发酵液的紫外吸收值，将酶解前后发酵液紫外吸收值的差值带入4,5-不饱和双糖浓度与紫外吸收值的标准曲线中，计算得到发酵液中透明质酸的含量。
进一步的，用活性炭或吸附树脂等对发酵液进行吸附纯化，以去除发酵液中影响检测结果的杂质。
进一步的，用透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶等对透明质酸进行酶解，以使透明质酸酶解成在紫外区有特异性吸收峰的4,5-不饱和双糖。
进一步的，上述方法包括以下具体步骤：
（1）向透明质酸发酵液中加入活性炭或者吸附树脂，吸附纯化后离心，取上清液；
（2）将上述上清液稀释，然后加入透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶，使发酵稀释液中的透明质酸彻底酶解为4,5-不饱和双糖，酶解后灭酶、过滤，得酶解后待测液；
（3）将步骤（2）中的透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶替换为等体积的水，然后按照步骤（2）的步骤进行同样的处理，得酶解前待测液；
（4）检测酶解前和酶解后待测液的紫外吸收值；
（5）将酶解前后待测液的紫外吸收值的差值带入4,5-不饱和双糖浓度与紫外吸收值的标准曲线中，计算得到发酵液中透明质酸的含量。
进一步的，本发明通过透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶将透明质酸酶解为4,5-不饱和双糖。所选的透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶可以是任意具有这一作用的酶，例如细菌产透明质酸酶、细菌产硫酸软骨素酶。基于成本考虑，优选为细菌产透明质酸酶。所述细菌产透明质酸酶优选为芽孢杆菌产透明质酸酶。基于酶的反应活性以及成本等的考虑，本发明细菌产透明质酸酶优选为芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744发酵生产得到的透明质酸酶。
进一步的，酶解的温度和pH为各透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶优选的适宜温度和pH，当透明质酸裂解酶为上述芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744发酵生产得到的透明质酸酶或硫酸软骨素酶时，其酶解温度一般为20~50℃，pH为5~7。通过控制透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶的用量可以调整酶解的时间，加快检测速度。优选的，透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶的用量为：根据预估的透明质酸含量，每1 mg 透明质酸加入500 IU~5000 IU透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶，优选的，每1 mg 透明质酸加入1000 IU~2000 IU透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶。在此用量下，透明质酸彻底酶解所需的时间一般为20~30min。可通过每隔5 min测定透明质酸酶解液在232nm的吸收值，其吸收值不再继续增高，确定发酵液中透明质酸已经彻底酶解。酶解后对透明质酸裂解酶进行灭活处理，灭活方式可以采用现有技术中公开的任意不影响透明质酸检测的方式，例如高温灭活，温度可以选择在90℃及以上。
进一步的，本发明采用活性炭或吸附树脂对发酵液进行纯化处理，以去除发酵液中的蛋白、核酸、色素等杂质，避免这些成分的存在对检测结果的干扰，提高检测结果的准确性。所用的活性炭或者吸附树脂为市面上在售的任一可以高效吸收蛋白、核酸、色素等杂质的活性炭或树脂。一般的，每100ml发酵液中加入1~30g的活性炭或吸附树脂，考虑到成本和处理效果，优选的，每100ml发酵液中加入5~10g的活性炭或吸附树脂。加入活性炭或吸附树脂后，在搅拌或振荡下纯化处理0.5~1h，然后离心取上清液。
进一步的，本发明将活性炭或吸附树脂纯化后的透明质酸发酵液进行稀释，从而使发酵液酶解后4,5-不饱和双糖的浓度在合适的检测范围之内。稀释可以一次性稀释至合适的倍数，也可以分多次稀释至合适的倍数。根据纯化后发酵液（即步骤（1）中纯化离心后的上清液）的浓度情况，稀释倍数为10~100倍。稀释时，采用透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶的酶解缓冲液进行稀释，酶解缓冲液可以是现有技术中报道的适宜各透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶的缓冲液，酶解缓冲液的pH在5.0-7.0。优选的，所述酶解缓冲液为pH为5.5~6.5、浓度为50~200 mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，更优选的，所述酶解缓冲液为pH为6.0、浓度为50~100 mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
进一步的，本发明同步检测酶解前和酶解后的发酵液稀释液的紫外吸收值。酶解前后的紫外吸收值的差值为透明质酸变化带来的紫外吸收值的变动，以此来计算透明质酸的含量。该方法专一性高、受外界影响小、不用将透明质酸从发酵液中提取出来，操作简单。以等量的水代替透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶进行相同处理后的发酵液稀释液作为酶解前的发酵液稀释液，以得到透明质酸变化带来的紫外吸收值的变化。酶解灭活后，用紫外检测器进行检测。因为4,5-不饱和双糖的双键在紫外区205～235 nm（优选232nm）有特异性吸收峰，因此，对酶解前后的发酵液在205～235 nm（优选232nm）处的紫外吸收值进行检测，取酶解前后在此波长处的紫外吸收值的差值来确定透明质酸的含量。
进一步的，将本发明酶解前后发酵液稀释液紫外吸收值的差值带入4,5-不饱和双糖与紫外吸收值的标准曲线中，计算得到发酵液中透明质酸的含量。标准曲线的绘制方法为：配制不同浓度的4,5-不饱和双糖溶液，检测其紫外吸收值，以4,5-不饱和双糖浓度为X轴、以紫外吸收值为Y轴，绘制4,5-不饱和双糖与紫外吸收值的标准曲线。绘制标准曲线时，所用的4,5-不饱和双糖为经过无氧化二磷减压真空干燥24 h以上、含量≥99.5%的4,5-不饱和双糖。
进一步的，本发明某一具体实施方式中，还提供了一种快速测定发酵液中透明质酸含量的方法，步骤如下：
一、标准曲线的制备
1、精密称取透明质酸不饱和二糖（4,5-不饱和双糖）标准品0.1 g（WS）（以五氧化二磷为干燥剂真空干燥至恒重，含量＞99.5%），置100 ml容量瓶中，加纯化水溶解稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。临用前精密量取贮备液5.0 ml，置100 ml量瓶中，加水制成每1 ml中含透明质酸不饱和二糖50 μg的溶液，摇匀，得透明质酸不饱和二糖标准溶液。
2、分别取0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5 ml标准溶液于试管中，对应的加入5ml、4ml、3ml、2ml、1ml、0 ml纯化水，充分混匀，以纯化水调零，测定232 nm处的紫外吸收值A232。
3、以透明质酸不饱和二糖标准品浓度（μg/ml）为X轴，以A232 为Y轴，绘制标准曲线。
二、发酵液透明质酸含量的测定
1、酶解缓冲液配制：称取磷酸二氢钠(NaH2 PO4 ·2H2O) 27.37 g、磷酸氢二钠(Na2 HPO4·12H2O) 8.81 g置1000 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得酶解缓冲液(200mM/L Na2HPO4 -NaH2PO4 缓冲液，pH6.0)。（使用不同浓度缓冲液时，可取用此缓冲液进行稀释。）
2、吸附纯化：向发酵液中加入1%~30%的活性炭或吸附树脂，吸附0.5~1 h，离心，得到发酵液上清。
3、稀释：取发酵液上清5 ml，采用酶解缓冲液稀释10~100倍，制成待测溶液。
4、酶解：取待测溶液1 ml，根据预估的透明质酸含量估值，每1 mg 透明质酸加入500 IU~5000 IU透明质酸裂解酶，用酶解缓冲液定容至10 ml，在合适温度下彻底酶解10~30 min，100℃煮沸2 min，测定232nm处的紫外吸收值。
5、空白的处理：除了将透明质酸裂解酶替换为等体积的纯化水外，将发酵液按照2-4的步骤同步处理。
6、含量计算：根据发酵液酶解前后A232的差值，通过透明质酸不饱和二糖标准曲线及稀释倍数，计算发酵液中透明质酸的含量。
本发明对透明质酸发酵液进行彻底酶解，并利用酶解前后发酵液在232 nm处的吸收值差值来标定发酵液中透明质酸含量的检测方法。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明无需将透明质酸发酵液经过乙醇沉淀、重溶等复杂耗时的步骤，采用活性炭或吸附树脂等经过短时间吸附除杂、离心得到发酵液上清可以直接用于紫外测定，依据透明质酸不饱和二糖标准曲线可以计算得到发酵液中透明质酸含量，操作简便快捷，批次检测样品数量大，可以用于透明质酸发酵工艺优化及过程检测，为透明质酸发酵行业提供了便捷的检测工具。
2、与传统的硫酸-咔唑法相比，该方法所采用试剂无毒无害，反应条件温和，操作安全高效。
3、本发明无需采用高效液相色谱等精密仪器，对仪器设备的要求简单，方便在工业化中尤其是发酵过程监控中广泛的应用。
4、该方法操作简便、专一性高、灵敏度高，可用于任一透明质酸发酵液以及类似的复杂体系中的透明质酸含量的测定，一次性测定样品量大，方便快捷，尤其适用于早期发酵培养基筛选及透明质酸发酵过程中对透明质酸含量的过程监测。
附图说明
图1为透明质酸不饱和二糖浓度-A232标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，下述说明仅是示例性的，并不对本发明保护范围进行限制，本发明的实施方式也不局限于此。
如无特别说明，下述实施例中的透明质酸酶指的均为芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744发酵生产得到的透明质酸酶，来自华熙生物科技股份有限公司。
实施例1
一、标准曲线的制备
1、精密称取透明质酸不饱和二糖（4,5-不饱和双糖）标准品0.1 g（WS）（以五氧化二磷为干燥剂真空干燥至恒重，含量＞99.5%），置100 ml容量瓶中，加纯化水溶解稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。临用前精密量取贮备液5.0 ml，置100 ml量瓶中，加水制成每1 ml中含透明质酸不饱和二糖50 μg的溶液，摇匀，得透明质酸不饱和二糖标准溶液。
2、分别取0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5 ml标准溶液于试管中，对应的加入5ml、4ml、3ml、2ml、1ml、0 ml纯化水，充分混匀，以纯化水调零，测定232 nm处的紫外吸收值A232。
3、以透明质酸不饱和二糖标准品浓度（μg/ml）为X轴，以A232 为Y轴，绘制标准曲线。
二、发酵液透明质酸含量的测定
1、酶解缓冲液配制：称取磷酸二氢钠(NaH2 PO4 ·2H2O) 6.84 g、磷酸氢二钠 (Na2HPO4·12H2O) 2.2 g，置1000 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得酶解缓冲液(50 mM/LNa2HPO4 -NaH2PO4 缓冲液，pH6.0)。
2、取平行3批次各100 ml发酵结束的透明质酸发酵液，分别加入5 g 活性炭，振荡吸附30 min。离心，得到发酵液上清。
3、采用酶解缓冲液(50 mM/L Na2HPO4 -NaH2PO4 缓冲液，pH6.0) 将各发酵液上清稀释20倍得到发酵液上清稀释液。
4、取待测溶液1 ml，加入250 IU的透明质酸酶，酶解缓冲液定容至10 ml，在温度35℃下彻底酶解30 min，100℃煮沸2 min。
5、测定酶解液在232 nm处的紫外吸收值，得到发酵液稀释液酶解后的A232。
6、除了将透明质酸酶替换为等体积的纯化水外，按照2-5的步骤进行同步处理，得到发酵液稀释液酶解前的A232。
7、根据发酵液稀释液酶解前后A232的差值，通过透明质酸不饱和二糖标准曲线，获得该差值对应的透明质酸不饱和二糖的浓度。乘以稀释倍数，计算得到发酵液中原始透明质酸的含量。结果如下表1所示。
实施例2
取平行3批次各100 ml发酵结束的透明质酸发酵液，分别加入10 g活性炭，搅拌50min，离心取上清，采用酶解缓冲液(80 mM/L Na2HPO4 -NaH2PO4 缓冲液，pH6.0) 将各发酵液稀释40倍，制成待测溶液；取待测溶液1 ml，加入150 IU的透明质酸酶，酶解缓冲液定容至10 ml，在温度25℃下彻底酶解25 min，100℃煮沸2 min。测定酶解液在232nm处的紫外吸收值，得到发酵液稀释液酶解后的A232。
除了将透明质酸酶替换为等体积的纯化水外，将发酵液按照以上同样的步骤进行同步处理，得到发酵液稀释液酶解前的A232。
根据发酵液稀释液酶解前后A232的差值，通过实施例1的透明质酸不饱和二糖标准曲线，获得该差值对应的透明质酸不饱和二糖的浓度。乘以稀释倍数，计算得到发酵液中原始透明质酸的含量。结果如下表2所示。
实施例3
取发酵16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、 36 h、40 h、44 h的透明质酸发酵液各100ml，分别加入西安蓝晓科技股份有限公司的LX-60吸附树脂 20 g，振荡吸附1 h，离心取上清。采用酶解缓冲液(50 mM/L Na2HPO4 -NaH2PO4 缓冲液，pH6.0)将各发酵液稀释20倍，制成待测溶液；取待测溶液1 ml，加入900 IU的透明质酸酶，酶解缓冲液定容至10 ml，在温度30℃下彻底酶解20 min，100℃煮沸2 min。测定酶解液在232 nm处的紫外吸收值，得到发酵液稀释液酶解后的A232。
除了将透明质酸酶替换为等体积的纯化水外，将发酵液按照以上同样的步骤进行同步处理，得到发酵液稀释液酶解前的A232。
根据发酵液稀释液酶解前后A232的差值，通过实施例1的透明质酸不饱和二糖标准曲线，获得该差值对应的透明质酸不饱和二糖的浓度。乘以稀释倍数，计算得到发酵液中原始透明质酸的含量。结果如下表3所示。
实施例4
取平行3批次采用不同培养基培养的透明质酸发酵液各50 ml，（培养基配方为：A、玉米浆干粉10 g/L，酵母粉10 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，葡萄糖50 g/L；B、玉米浆干粉10 g/L，酵母粉10 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，蔗糖50 g/L；C、玉米浆干粉10 g/L，酵母粉10 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，麦芽糖50 g/L）；分别加入活性炭15g，振荡吸附1 h，离心取上清。
采用酶解缓冲液 (100 mM/L Na2HPO4 -NaH2PO4 缓冲液，pH6.0) 将各发酵液稀释20倍，制成待测溶液；取待测溶液1 ml，加入500 IU的透明质酸酶，酶解缓冲液定容至10ml，在温度45℃下彻底酶解30 min，100℃煮沸2 min。测定酶解液在232 nm处的紫外吸收值，得到发酵液稀释液酶解后的A232。
除了将透明质酸酶替换为等体积的纯化水外，将发酵液按照以上同样的步骤进行同步处理，得到发酵液稀释液酶解前的A232。
根据发酵液稀释液酶解前后A232的差值，通过实施例1的透明质酸不饱和二糖标准曲线，获得该差值对应的透明质酸不饱和二糖的浓度。乘以稀释倍数，计算得到发酵液中原始透明质酸的含量。结果如下表4所示。
实施例5
取采用不同培养基、摇瓶培养24 h得到的透明质酸发酵液各50 ml。培养基如下：
A、玉米浆干粉10 g/L，酵母粉10 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，葡萄糖50 g/L；
B、玉米浆干粉5 g/L，酵母粉15 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，葡萄糖50g/L；
C、玉米浆干粉15 g/L，酵母粉5 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，葡萄糖50g/L；
D、蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，葡萄糖50 g/L；
E、蛋白胨5 g/L，酵母粉15 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，葡萄糖50 g/L；
F、蛋白胨15 g/L，酵母粉5 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，葡萄糖50 g/L。
分别加入西安蓝晓科技股份有限公司的LX-68吸附树脂10 g，振荡吸附1 h，离心取上清。
采用酶解缓冲液(150 mM/L Na2HPO4 -NaH2PO4 缓冲液，pH6.0)将各发酵液稀释10倍，制成待测溶液；取待测溶液1 ml，加入750 IU的透明质酸酶，酶解缓冲液定容至10 ml，在温度40℃下彻底酶解20 min，100℃煮沸2 min。测定酶解液在232 nm处的紫外吸收值，得到发酵液稀释液酶解后的A232。
除了将透明质酸酶替换为等体积的纯化水外，将发酵液按照以上同样的步骤进行同步处理，得到发酵液稀释液酶解前的A232。
根据发酵液稀释液酶解前后A232的差值，通过实施例1的透明质酸不饱和二糖标准曲线，获得该差值对应的透明质酸不饱和二糖的浓度。乘以稀释倍数，计算得到发酵液中原始透明质酸的含量。结果如下表5所示。
从上表结果可见，最适培养基为C培养基，且含玉米浆粉的发酵液在232 nm处的吸收值高于不含玉米浆粉的发酵液在232 nm处的吸收值，如果不采用活性炭或者树脂对发酵液进行初步纯化，会导致酶解液在酶解前在232 nm处的吸收值远高于因为透明质酸酶解所导致的酶解液在232nm处的吸收值增高数值，严重影响测定结果的准确性。
实施例6
以玉米浆粉、酵母粉为氮源，考察不同硫酸镁含量对透明质酸发酵产率影响。
取采用不同培养基、摇瓶培养24 h得到的透明质酸发酵液各50 ml。培养基如下：
A、玉米浆干粉15 g/L，酵母粉5 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，硫酸镁0.3 g/L，葡萄糖50g/L；
B、玉米浆干粉15 g/L，酵母粉5 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，葡萄糖50g/L；
C、玉米浆干粉15 g/L，酵母粉5 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，硫酸镁0.8 g/L，葡萄糖50g/L。
分别加入西安蓝晓科技股份有限公司的LX-60吸附树脂15 g，振荡吸附1 h，离心取上清。
采用酶解缓冲液(50 mM/L Na2HPO4 -NaH2PO4 缓冲液，pH6.0)将各发酵液稀释20倍，制成待测溶液；取待测溶液1 ml，加入80 IU的透明质酸酶，酶解缓冲液定容至10 ml，在温度40℃下彻底酶解30 min，100℃煮沸2 min。测定过滤液在232 nm处的紫外吸收值，得到发酵液稀释液酶解后的A232。
除了将透明质酸酶替换为等体积的纯化水外，将发酵液按照以上同样的步骤进行同步处理，得到发酵液稀释液酶解前的A232。
根据发酵液稀释液酶解前后A232的差值，通过实施例1的透明质酸不饱和二糖标准曲线，获得该差值对应的透明质酸不饱和二糖的浓度。乘以稀释倍数，计算得到发酵液中原始透明质酸的含量。结果如下表6所示。
从上表结果可见，当硫酸镁的含量为0.5 g/L时，HA发酵产率最高。
实施例7
将实施例1中的透明质酸酶替换为等量的硫酸软骨素酶，其余条件不变，检测结果见表7。
通过表1与表7的数据对比可以看出，透明质酸酶与硫酸软骨素酶的检测结果没有明显差异。
比较例1
采用硫酸咔唑法测定发酵液中透明质酸含量：取实施例1中的透明质酸发酵液50ml，用2倍体积乙醇沉淀，离心，采用纯化水将沉淀溶解至1000 ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取经 60℃减压干燥至恒重的葡萄糖醛酸对照品 60 mg，精密称定，置100 ml 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取 10 ml葡萄糖醛酸溶液，置 100ml 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，分别置 25 ml 具塞试管中，依次分别加水至 1.0 ml，混匀，冰浴中冷却，并在不断振摇下缓缓滴加 0.025 mol/L 硼砂硫酸溶液 5.0 ml，密塞，沸水浴加热 10分钟（中间振摇一次），迅速冷却，加 0.125％咔唑无水乙醇溶液 0.2 ml，摇匀，沸水浴中加热15分钟（中间振摇一次），冷却。按照紫外-可见分光光度法，以 0 管为空白，在 530 nm 的波长处测定吸光度，以葡萄糖醛酸的μg数对相应的吸光度计算回归方程。精密称取供试品溶液1 g，置 25 ml 具塞试管中，自“冰浴中冷却”起照标准曲线制备项下的方法测定，由回归方程计算葡萄糖 醛酸的含量，乘以 2.0675，即得透明质酸含量。采用此法处理实施例1中3个批次的发酵液，测得透明质酸含量分别为4.69 g/L、4.58 g/L、4.54 g/L，与实施例1结果由于方法差异，数值略有差异，高低趋势一致，可进行方法替代。
比较例2
将比较例1中的供试品溶液替换为：透明质酸发酵液50 ml，采用纯化水稀释20倍，离心，取上清作为供试品溶液。
其余步骤同比较例1。
采用此法处理比较例1中3个批次的发酵液，测得透明质酸含量分别为3.35 g/L、5.28 g/L、5.11 g/L，与比较例1相比，由于没有对发酵液进行醇沉、重溶的处理，采用硫酸咔唑法测定发酵液中透明质酸含量，数据严重失真。而实施例1由于发酵液经过活性炭的短暂快速处理，减少了酶解前酶解液中杂质，清除了紫外吸收的物质对酶解-紫外法测定含量的干扰。与比较例1与2的方法相比，本发明的方法更加方便快捷，准确率更高。
比较例3
采用酶解—HPLC的方法测定发酵液中透明质酸含量：
1）对照品溶液制备：精密称取透明质酸钠对照品约50 mg于50 ml容量瓶中，酶解缓冲液溶解并定容至刻度，混匀。取上述溶液0.2 ml置于10 ml容量瓶中，加入400 IU透明质酸酶，混匀，密封，42℃酶解2 h，煮沸2 min使酶失活，流动相定容至刻度，0.22μm滤膜过滤，即得对照品溶液。2）供试品(也可以称为待测样品)溶液制备：取透明质酸发酵液50 ml，2倍体积乙醇沉淀，离心，采用纯化水将沉淀溶解至500 ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀。取上述溶液0.2 ml置于10 ml容量瓶中，加入400 IU透明质酸酶，混匀，密封，42℃酶解2 h，煮沸2 min使酶失活，流动相定容至刻度，0.22μm滤膜过滤，即得供试品溶液。3）HPLC 测定含量：色谱柱MCI GEL CK08EH色谱柱(三菱化学，8×300mm，5μm)；流动相为1％磷酸溶液；流速0.6 ml/min；进样量20μl；柱温40℃；检测波长232 nm。分别取对照品，供试品溶液20μl进样，按照上述色谱条件进行检测，以外标法峰面积计算供试品溶液中透明质酸钠含量。按以下公式计算供试品溶液中的HA含量：
式中，X—供试品溶液中HA含量，mg/mL
As—供试品溶液峰面积
Ar—对照品溶液峰面积
Wr—对照品称样量，mg
Z—对照品含量
h—对照品干燥失重
另外，理论塔板数(N)是反映色谱柱的柱效参数，计算公式为：
N＝5.54×(保留时间/半峰宽)2
理论塔板数一般由色谱工作站数据处理软件自动计算给出。
采用此法处理实施例1中3个批次的发酵液，测得透明质酸含量分别为4.55 g/L、4.51 g/L、4.45 g/L，与实施例1结果基本一致，可进行方法替代。
比较例4
按照实施例6的方法检测透明质酸含量，不同的是：各发酵液中不加入LX-60吸附树脂。检测结果如下表8所示。
通过表6与表8的数据对比可以看出，发酵液稀释液酶解前的A232过高，而酶解前后A232 差值/发酵液稀释液酶解前A232的值过低，约为15%，严重影响数据准确性。
Claims (18)
1.一种快速测定发酵液中透明质酸含量的方法，其特征是：将发酵液用活性炭或吸附树脂进行吸附纯化，将吸附纯化后的上清液稀释后进行酶解，使发酵液中的透明质酸彻底酶解为4,5-不饱和双糖，然后检测酶解前后发酵液的紫外吸收值，将酶解前后发酵液紫外吸收值的差值带入4,5-不饱和双糖浓度与紫外吸收值的标准曲线中，获得该差值对应的4,5-不饱和双糖的浓度，乘以稀释倍数，计算得到发酵液中透明质酸的含量；所述吸附树脂为能够吸收蛋白、核酸、色素的树脂。
2. 根据权利要求1 所述的方法，其特征是：用透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶进行酶解。
3. 根据权利要求1 所述的方法，其特征是包括以下步骤：
（1）向透明质酸发酵液中加入活性炭或者吸附树脂，吸附纯化后离心，取上清液；
（2）将上述上清液稀释，然后加入透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶，使发酵稀释液中的透明质酸彻底酶解为4,5-不饱和双糖，酶解后灭酶、过滤，得酶解后待测液；
（3）将步骤（2）中的透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶替换为等体积的水，然后按照步骤（2）的步骤进行同样的处理，得酶解前待测液；
（4）检测酶解前和酶解后待测液的紫外吸收值；
（5）将酶解前后待测液的紫外吸收值的差值带入4,5-不饱和双糖浓度与紫外吸收值的标准曲线中，计算得到发酵液中透明质酸的含量。
4. 根据权利要求2-3 任一项所述的方法，其特征是：所述透明质酸裂解酶为细菌产透明质酸酶，所述硫酸软骨素酶为细菌产硫酸软骨素酶。
5. 根据权利要求4 所述的方法，其特征是：所述细菌产透明质酸酶为芽孢杆菌产透明质酸酶。
6. 根据权利要求 5 所述的方法，其特征是：所述芽孢杆菌产透明质酸酶为芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744 发酵生产得到的透明质酸酶。
7. 根据权利要求1-3 任一项所述的方法，其特征是：所述透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶的用量为：每1 mg 透明质酸加入500 IU~5000 IU 透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶。
8. 根据权利要求7 所述的方法，其特征是：每1 mg 透明质酸加入1000 IU~2000 IU透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶。
9. 根据权利要求3 所述的方法，其特征是：步骤（1）中，每100ml 发酵液中加入1~30g的活性炭或吸附树脂。
10. 根据权利要求9 所述的方法，其特征是：步骤（1）中，每100ml 发酵液中加入5~10g的活性炭或吸附树脂。
11. 根据权利要求3 所述的方法，其特征是：步骤（1）中，加入活性炭或吸附树脂后，搅拌或振荡0.5~1 h。
12. 根据权利要求3 所述的方法，其特征是：步骤（2）中，上清液的稀释倍数为10~100倍。
13. 根据权利要求1 所述的方法，其特征是：用透明质酸裂解酶或硫酸软骨素酶的酶解缓冲液对上清液进行稀释，所述酶解缓冲液的pH 为5.0~7.0。
14. 根据权利要求13 所述的方法，其特征是：所述酶解缓冲液为pH 为5.5~6.5、浓度为50~200 mmol/L 的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
15. 根据权利要求14 所述的方法，其特征是：所述酶解缓冲液为pH 为6.0、浓度为50~100 mmol/L 的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
16. 根据权利要求1-3 任一项所述的方法，其特征是：配制不同浓度的4,5-不饱和双糖溶液，检测其紫外吸收值，以4,5-不饱和双糖浓度为X 轴、以紫外吸收值为Y 轴，绘制4,5-不饱和双糖与紫外吸收值的标准曲线。
17. 根据权利要求1 所述的方法，其特征是：紫外吸收的检测波长为205～235 nm。
18. 根据权利要求17 所述的方法，其特征是：紫外吸收的检测波长为232 nm。
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