CN103900985B - 一种发酵液中2‑酮基‑l‑古龙酸含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种发酵液中2‑酮基‑L‑古龙酸含量的检测方法，包括如下步骤：A、建立维生素C溶液标准曲线；B、检测样品：制备检测样品，碱处理前与处理后分别进行紫外吸收值测定，得出吸光差值与标准曲线对照作为维生素C定性或定量的依据，从而推算出发酵液中2‑酮基‑L‑古龙酸的含量。本检测方法简单，成本低；环保安全，不需要使用有毒的有机溶剂；经实际检测验证，该方法稳定性好，测定的准确性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵液中2-酮基-L-古龙酸含量的检测方法。
背景技术
维生素C是可溶于水的无色结晶，是一种六碳的多羟基内酯，为分子结构最简单的维生素。维生素C能参与人体内多种代谢过程，使组织产生胶原质，影响毛细血管的渗透性及血浆的凝固，刺激人体造血功能，增强机体的免疫力。另外，由于它具有较强的还原能力，可作为抗氧化剂，在医药、食品工业等方面获得广泛应用。
2-酮基-L-古龙酸是维生素C生产中重要的中间体，其经过简单的化学转化即可生成维生素C。我国的“两步发酵法”制备维生素C的生产工艺中，利用氧化葡糖酸杆菌与芽孢杆菌属或假单胞杆菌属的菌株混合培养，将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸，再经化学转化生产维生素C。因此发酵液中2-酮基-L-古龙酸含量的检测无论在生产工作还是在科研工作中都是非常重要的环节。
目前对发酵液中2-酮基-L-古龙酸的测定大多将其转化为维生素C，然后采用2010版药典中规定测定维生素C含量的方法进行测定。2-酮基-L-古龙酸在强酸介质中，加热经内酯化烯化反应转化成维生素C，当介质条件固定后，在一定的试验条件下，转化率仅与加热时间长短有关，如介质条件为7mol/L浓硫酸时，沸水浴25min，2-酮基-L-古龙酸生成维生素C的转化率为63.03％，所以测得转化生成的维生素C的含量，通过维生素C与2-酮基-L-古龙酸分子量之比及固定介质条件下的转化率计算，即可推得发酵液中2-酮基-L-古龙酸的含量。
所以此项检测多采用加热法将发酵液中的2-酮基-L-古龙酸按一定比例转化为维生素C，然后用碘滴定法进行检测，虽然该检测方法准确，但是在操作过程中要用到剧毒试剂三氧化二砷，而且该方法费时费力，不适宜对大规模样品进行检测，对菌种筛选等科研工作来说并不实用。
《水果、蔬菜中维生素C含量的测定——紫外分光光度快速测定方法探讨》(郑京平，《光谱实验室》，2006，第23卷，731-735)报道了利用紫外分光光度法对水果、蔬菜中的维生素C含量进行检测的方法，但是发明人在使用报道方法对发酵液中的2-酮基-L-古龙酸进行检测的过程中发现，检测结果不稳定且准确性较差。
发明内容
为了解决检测发酵液中的2-酮基-L-古龙酸检测方法费时费力、准确性与稳定性差的问题，本发明提供一种操作简便而准确性较高的发酵液中2-酮基-L-古龙酸定性或定量的快速检测方法。
实现上述目的的技术方案如下：
A、建立维生素C标准曲线
测定维生素C标准品溶液与NaOH溶解后的维生素C标准品溶液在244nm波长处的紫外吸光值之差，建立维生素C标准曲线；
B、检测样品
取待检测的发酵液制备检测样品，分别与标准品相同的条件处理，得出转化样品的吸光值之差，与标准曲线对照得出维生素C的含量，计算出2-酮基-L-古龙酸的含量。
所述步骤A包括如下步骤：
A-1、称取维生素C标准品0.05g溶于500mL醋酸-醋酸钠缓冲液中，配成100μg/mL的维生素C标准溶液；所述醋酸-醋酸钠缓冲液为：11.55mL冰醋酸溶于1000mL水配得溶液①，16.4g醋酸钠或27.2g三水醋酸钠溶于1000mL水配得溶液②，将46.3mL溶液①与3.7mL溶液②混合，加入1mol/L的EDTA200μL，蒸馏水定容至80mL，用醋酸调pH至3.6，蒸馏水定容至100mL；
A-2、取维生素C标准溶液，稀释至浓度为1、5、10、15、20、25、30，单位为μg/mL，分别在紫外可见分光光度计244nm波长处进行光谱扫描，以所述醋酸-醋酸钠缓冲液作为空白对照，测得吸光值A1；
A-3、以0.3mol/L的NaOH为溶液，配制浓度分别为1、5、10、15、20、25、30，单位为μg/mL的维生素C标准品溶液，室温反应15分钟后，以0.3mol/L的NaOH溶液作为空白对照，测得吸光值A2；
A-4、分别计算相同维生素C标准品浓度时的吸光值差值ΔA＝A1-A2，以维生素C标准品溶液中维生素C的浓度为横坐标，单位为μg/mL，以相应的吸光值差值ΔA为纵坐标，作标准曲线；
所述步骤B包括如下步骤：
B-1、取待测的含有2-酮基-L-古龙酸的发酵液，加入等体积7mol/L浓硫酸溶液，混匀后煮沸25min，使2-酮基-L-古龙酸部分转化为维生素C，以12,000g的离心力离心10min，取上清液备用；
B-2、50μL上清液加入950μL所述醋酸-醋酸钠缓冲液，得溶液③，取20μL溶液③加入980μL所述醋酸-醋酸钠缓冲液，得检测液I；将检测液I置紫外可见分光光度计，以所述醋酸-醋酸钠缓冲液作为空白对照，于244nm波长处测定紫外吸光值A3；
B-4、取20μL溶液③加入980μL 0.3mol/L的NaOH溶液，混匀，室温反应15min，得检测液II，以0.3mol/L的NaOH溶液作为空白对照，于244nm波长处测定紫外吸收值A4；
B-5、样品中维生素C的光吸收值AVc＝A3-A4，根据光吸收值及标准曲线即可得到维生素C含量CVc＝(AVc-0.006)/0.046；
B-6、发酵液中2-酮基-L-古龙酸的含量C古＝2000*CVc*1.1023/0.6303，C古单位为μg/mL，2000为稀释倍数，1.1023为2-酮基-L-古龙酸分子量/Vc分子量；0.6303为2-酮基-L-古龙酸生成维生素C的转化率。
该方法在检测过程中只需要15-20分钟，检测过程不需要使用有毒试剂，实际检验过程中检测结果稳定性好、准确性高。
附图说明
维生素C的标准曲线图
具体实施方式
实施例1
主要设备：5300紫外分光光度计(美国GE公司)；PICO17离心机(Thermo公司)；FE20实验室pH计(梅特勒-托利多公司)。所检测发酵液由华北制药集团新药研究开发有限责任公司提供。
1、建立维生素C溶液标准曲线
1)配制醋酸-醋酸钠缓冲液(EDTA 2mmol/L)(pH3.6)
溶液①：0.2mol/L醋酸(11.55mL冰醋酸溶于1000mL水)；
溶液②：0.2mol/L醋酸钠(16.4g醋酸钠或27.2g醋酸钠·3H2O溶于1000mL水)；
将46.3mL溶液①与3.7mL溶液②按相应体积混合，定容至100mL，加入相应量1MEDTA至终浓度2mmol/L，用醋酸调pH至3.6。
2)配制维生素C标准溶液
准确称取0.05g维生素C标准品，以10mL醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，此处及以下所述醋酸-醋酸钠缓冲液均为步骤1)所配，并以醋酸-醋酸钠缓冲液定容到500mL，至终浓度为100μg/mL。
3)绘制维生素C标准曲线
按下表所列，以醋酸-醋酸钠缓冲液(EDTA 2mmol/L)(pH3.6)将维生素C标准溶液稀释至不同浓度，以醋酸-醋酸钠缓冲液(EDTA 2mmol/L)(pH3.6)作空白试剂，在244nm下测定吸光值A1；0.3mol/L氢氧化钠溶液为溶剂，配制相应浓度的维生素C溶液，以0.3mol/L氢氧化钠为溶液配制相应浓度的维生素C溶液，以0.3mol/L氢氧化钠溶液为空白对照，在244nm下测定吸光值A2，然后以维生素C浓度(μg/mL)为横坐标，以相应的吸光值差值ΔA＝A1-A2为纵坐标，绘制标准曲线。
表1
2、检测样品
1)取待检测的含2-酮基-L-古龙酸的16个不同批次的发酵液，加入等体积7mol/L浓硫酸溶液，煮沸25min(严格控制煮沸时间)，以12000g的离心力离心10min，取上清备用。
2)取上清50μL加入950μL醋酸-醋酸钠缓冲液，得③液，取③液20μL加入980μL醋酸-醋酸钠缓冲液，得检测液I；
3)将检测液I置紫外可见分光光度计，以醋酸-醋酸钠缓冲液作为空白对照，于244nm下测定紫外吸光值A1；
4)取③液20μL加入980μL0.3mol/L的NaOH溶液，混匀，室温反应15min，得检测液II，以0.3mol/L的NaOH溶液作为空白对照，于244nm下测定紫外吸收值A2；
5)待检测的样品中维生素C的光吸收值AVc＝A1-A2，根据光吸收值及标准曲线即可得到维生素C含量CVc＝(AVc-0.006)/0.046；
6)发酵液中2-酮基-L-古龙酸的含量C古＝2000*CVc*1.1023/0.6303，C古单位为μg/mL。检测结果如表2所示。结果显示，与碘量法相比，本检测方法测定发酵液Vc含量的回收率达到99.1％，准确性较高。
表2
实施例2
使用《水果、蔬菜中维生素C含量的测定——紫外分光光度快速测定方法探讨》(郑京平，《光谱实验室》，2006，第23卷，731-735)中报道的检测方法对实施例1中的16个不同批次的发酵液进行检测，检测结果见表3。结果显示，与碘量法相比，上述方法测定发酵液Vc含量的平均回收率为89.9％，远低于本发明检测结果99.1％的回收率。
表3
本发明列举的实施例旨在更进一步地阐明检测方法具体操作和应用方向，而不对本发明的范围构成任何限制。
Claims (2)
1.一种发酵液中2-酮基-L-古龙酸含量的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
A、建立维生素C标准曲线
测定维生素C标准品溶液与NaOH溶解后的维生素C标准品溶液在244nm波长处的紫外吸光值之差，建立维生素C标准曲线；
B、检测样品
取待检测的发酵液制备检测样品，分别与标准品相同的条件处理，得出转化样品的吸光值之差，与标准曲线对照得出维生素C的含量，计算得出2-酮基-L-古龙酸的含量；
所述步骤B包括如下步骤：
B-1、取待测的含有2-酮基-L-古龙酸的发酵液，加入等体积7mol/L浓硫酸溶液，混匀后煮沸25min，使2-酮基-L-古龙酸部分转化为维生素C，以12,000g的离心力离心10min，取上清液备用；
B-2、50μL上清液加入950μL醋酸-醋酸钠缓冲液，得溶液③，取20μL溶液③加入980μL醋酸-醋酸钠缓冲液，得检测液I；将检测液I置紫外可见分光光度计，以醋酸-醋酸钠缓冲液作为空白对照，于244nm波长处测定紫外吸光值A3；所述醋酸-醋酸钠缓冲液为：11.55mL冰醋酸溶于1000mL水配得溶液①，16.4g醋酸钠或27.2g三水醋酸钠溶于1000mL水配得溶液②，将46.3mL溶液①与3.7mL溶液②混合，加入1mol/L的EDTA200μL，蒸馏水定容至80mL，用醋酸调pH至3.6，蒸馏水定容至100mL；
B-4、取20μL溶液③加入980μL 0.3mol/L的NaOH溶液，混匀，室温反应15min，得检测液II，以0.3mol/L的NaOH溶液作为空白对照，于244nm波长处测定紫外吸收值A4；
B-5、样品中维生素C的光吸收值AVc＝A3-A4，根据光吸收值及标准曲线即可得到维生素C含量CVc＝(AVc-0.006)/0.046；
B-6、发酵液中2-酮基-L-古龙酸的含量C古＝2000*CVc*1.1023/0.6303，C古单位为μg/mL，2000为稀释倍数，1.1023为2-酮基-L-古龙酸分子量/Vc分子量；0.6303为2-酮基-L-古龙酸生成维生素C的转化率。
2.根据权利要求1所述的发酵液中2-酮基-L-古龙酸含量的检测方法，其特征在于所述步骤A包括如下步骤：
A-1、称取维生素C标准品0.05g溶于500mL所述醋酸-醋酸钠缓冲液中，配成100μg/mL的维生素C标准溶液；
A-2、取维生素C标准溶液，稀释至浓度为1、5、10、15、20、25、30，单位为μg/mL，分别在紫外可见分光光度计244nm波长处进行光谱扫描，以所述醋酸-醋酸钠缓冲液作为空白对照，测得吸光值A1；
A-3、以0.3mol/L的NaOH为溶液，配制浓度分别为1、5、10、15、20、25、30，单位为μg/mL的维生素C标准品溶液，室温反应15分钟后，以0.3mol/L的NaOH溶液作为空白对照，测得吸光值A2；
A-4、分别计算相同维生素C标准品浓度时的吸光值差值ΔA＝A1-A2，以维生素C标准品溶液中维生素C的浓度为横坐标，单位为μg/mL，以相应的吸光值差值ΔA为纵坐标，作标准曲线。
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