CN114609296B - 一种酶解透明质酸寡糖混合物的检测方法 - Google Patents
一种酶解透明质酸寡糖混合物的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种酶解透明质酸寡糖混合物的检测方法，包括以下步骤：将酶解透明质酸寡糖液体样品灭活，离心去除大分子，取滤过液，稀释后作为待测液；将所述待测液采用高效液相色谱法进行分离检测；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C 18柱；流动相A为乙腈；流动相B为四丁基氢氧化铵‑磷酸混合水溶液；四丁基氢氧化铵‑磷酸的摩尔比为(5～25):(4～20)，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈为流动相A，四丁基氢氧化铵‑磷酸混合水溶液为流动相B进行梯度洗脱。该方法能够针对不同酶解机制的透明质酸寡糖混合物进行分离检测，分离度高，重复性好。
Description
技术领域
本发明属于液相色谱检测技术领域，尤其涉及一种酶解透明质酸寡糖混合物的检测方法。
背景技术
透明质酸(hyaluronan，HA)又称玻尿酸(Hyaluronic acid)，广泛存在于动物组织、细胞间质中，是由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和D-葡萄糖醛酸双糖(GlcUA)单位通过β-1,4糖苷键连接，并以β-1,3糖苷键连接形成的无支链双糖重复单元的黏性多糖。透明质酸广泛应用于食品、化妆品、医药、保健品等领域。透明质酸寡糖(o-HAs)是指由HA降解形成，相对分子质量小于10k的寡聚糖。o-HAs的制备方式有多种，其中酶切法因为专一高效、条件温和、易控制和产物相对单一的特点而被广泛使用，酶切法由于水解机制的不同可以分为三类：
专利CN113801904A及专利CN113876623A均报道了一种透明质酸寡糖分布的液相检测方法，该专利的检测方法为：色谱柱：SUPERDEX 200 10/300GL；柱温：40℃；检测器：紫外-可见分光检测器；流动相：1mol/L硫酸铵溶液；进样浓度：0.5％；进样量：20μL；流速：2ml/min；检测波长：200nm。从其结果可知，透明质酸寡糖没有完全分离，分离度不够，且专利中的色谱柱为非常规色谱柱，成本较高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种酶解透明质酸寡糖混合物的检测方法，该方法分离度较高、重复性好。
本发明提供了一种酶解透明质酸寡糖混合物的检测方法，包括以下步骤：
将酶解透明质酸寡糖液体样品灭活，离心去除大分子，取滤过液，稀释后作为待测液；
将所述待测液采用高效液相色谱法进行分离检测；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈；流动相B为四丁基氢氧化铵-磷酸混合水溶液；四丁基氢氧化铵-磷酸的摩尔比为(5～25):(4～20)，梯度洗脱。
在本发明中，所述流动相B四丁基氢氧化铵-磷酸混合水溶液中四丁基氢氧化铵的浓度为10mmol/L、磷酸的浓度为8mmol/L。
在本发明中，所述四丁基氢氧化铵-磷酸混合水溶液的pH值为6.0～7.5，优选为7.00±0.02。
在本发明中，采用agilent Poroshell120EC-C18色谱柱(3.0×150mm，2.7μm)，柱温为30℃；平衡时间为28～32h，优选为24h。
在本发明中，流动相A和流动相B的体积比为(25～50):(75～50)，优选为50:50；
流动相的流速为0.5mL/min；
检测波长为双波长，分别为210nm和232nm；
进样量为5μL。
在本发明中，所述酶解透明质酸寡糖液体样品选自牛睾丸型BTH酶酶解透明质酸寡糖液体、水蛭型LHase酶酶解透明质酸寡糖液体、细菌型MHase酶酶解透明质酸寡糖液体、高温加热的透明质酸寡糖水解液、或微生物滋生后透明质酸寡糖液体。
在本发明中，所述酶解透明质酸寡糖液体由透明质酸酶解制得；具体实施例中，采用的透明质酸为2000kDa的透明质酸。
所述酶解透明质酸寡糖液体中透明质酸寡糖的聚合度≤20。
在本发明中，所述待测液中透明质酸寡糖混合物的质量浓度为1.8～2.2％，优选为2％。
在本发明中，所述梯度洗脱具体为：
在本发明中，所述离心的转速为7000～9000rpm，离心的时间至少为8min，离心采用5K超滤离心管。
在本发明中，所述流动相A使用前过0.22μm有机相膜，超声至少12min；
所述流动相B使用前过0.22μm水相膜，超声至少12min，超声至少12min。
本发明提供了一种酶解透明质酸寡糖混合物的检测方法，包括以下步骤：将酶解透明质酸寡糖液体样品灭活，离心去除大分子，取滤过液，稀释后作为待测液；将所述待测液采用高效液相色谱法进行分离检测；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈；流动相B为四丁基氢氧化铵-磷酸混合水溶液；四丁基氢氧化铵-磷酸的摩尔比为(5～25):(4～20)，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈为流动相A，四丁基氢氧化铵-磷酸混合水溶液为流动相B进行梯度洗脱。该方法能够针对不同酶解机制的透明质酸寡糖混合物进行分离检测，分离度高，重复性好。
附图说明
图1为空白样品的色谱图；
图2为本发明实施例1制备的透明质酸寡糖分布色谱图；
图3为本发明实施例2制备的透明质酸寡糖分布色谱图；
图4为本发明实施例3制备的透明质酸寡糖分布色谱图；
图5为本发明实施例4制备的透明质酸寡糖分布色谱图；
图6为本发明实施例5中微生物滋生后透明质酸寡糖分布色谱图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种酶解透明质酸寡糖混合物的检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
1.1仪器及试剂
仪器：液相色谱仪(Agilent1260)、电子天平、超声振荡器、高速离心机、pH计、agilent Poroshell120EC-C18色谱柱(3.0*150mm，2.7μm)。
试剂：乙腈(色谱纯)、超纯水(18.5MΩ)、四丁基氢氧化铵(HPLC级)、磷酸(HPLC级)。
1.2样品处理
酶解透明质酸寡糖液体样品，高温灭活后用5k超滤离心管8000r高速离心10min去除大分子物质，取滤过液进行适当稀释，为待测液。
1.3流动相配置
流动相A：乙腈，过0.22μm有机相膜，超声15min；
流动相B：四丁基氢氧化铵-磷酸混合水溶液，其中，四丁基氢氧化铵的浓度为10mmol/L、磷酸的浓度为8mmol/L，用磷酸调节pH至7.00±0.02，过0.22μm水相膜，超声15min。
1.4液相色谱条件
色谱柱：agilent Poroshell 120EC-C18色谱柱(3.0*150mm，2.7μm)
检测波长：双波长210nm及232nm；
柱温：30℃；
流速：0.5mL/min；
进样量：5μL；
洗脱程序：见下表1：
表1寡糖分布检测色谱洗脱程序
1.5色谱柱平衡
流动相A:流动相B(50：50)，流速0.5mL/min，柱温30℃条件下平衡24h。
1.6空白对照实验
以水作为空白对照，按照上述色谱条件进行检测，得到空白对照色谱图，见图1。由图1可知，在梯度洗脱程序下，基线波动范围小，无杂质峰干扰符合检测要求。
实施例1牛睾丸型BTH酶酶解透明质酸寡糖混合物检测
于含有超纯水99mL的38℃的酶反应器中加入100mg透明质酸(分子量2000kDa)，充分溶解后加入100万U/mL的牛睾丸透明质酸酶液1mL，水解24h后，得到酶解透明质酸寡糖液体样品，将其高温灭活后用5k超滤离心管8000r高速离心10min去除大分子物质，取滤过液进行适当稀释，为待测液；按照上述色谱条件进行检测，得到透明质酸寡糖分布色谱图，见图2。由图2可知，各透明质酸寡糖均得到较好分离，分离度结果见表2，且各透明质酸寡糖232nm处无特征吸收。
按照上述测试条件，重复测定6次牛睾丸型BTH酶酶解透明质酸寡糖混合物，计算各寡糖保留时间的RSD％，测试结果见表3：
表2牛睾丸型BTH酶酶解透明质酸寡糖保留时间的分离度结果
| 化合物名称 | 分离度 |
| HA-2 | - |
| HA-4 | 3.9 |
| HA-6 | 8.7 |
| HA-8 | 11.2 |
| HA-10 | 10.2 |
| HA-12 | 8.4 |
| HA-14 | 7.4 |
| HA-16 | 6.5 |
| HA-18 | 5.9 |
| HA-20 | 6.2 |
表3牛睾丸型BTH酶酶解透明质酸寡糖保留时间的重复测试结果
实施例2水蛭型LHase酶酶解透明质酸寡糖混合物检测
于含有超纯水99mL的38℃的酶反应器中加入100mg透明质酸(分子量2000kDa)，充分溶解后加入100万U/mL的水蛭透明质酸酶液1mL，水解24h后，按照1.2进行样品处理，按照上述色谱条件进行检测，得到透明质酸寡糖分布色谱图，见图3。由图3可知，各透明质酸寡糖均得到较好分离，分离度结果见表4，且各透明质酸寡糖232nm处无特征吸收。
按照上述测试条件，重复测定6次水蛭型透明质酸酶酶解透明质酸寡糖混合物，计算各寡糖保留时间的RSD％，测试结果见表5：
表4水蛭型LHase酶酶解透明质酸寡糖保留时间的分离度结果
| 化合物名称 | 分离度 |
| HA-2 | - |
| HA-4 | 4.8 |
| HA-6 | 10.7 |
| HA-8 | 15.7 |
| HA-10 | 15.3 |
| HA-12 | 12.5 |
表5水蛭型LHase酶酶解透明质酸寡糖保留时间的重复测试结果
实施例3细菌型MHase酶酶解透明质酸寡糖混合物检测
于含有超纯水99mL的38℃的酶反应器中加入100mg透明质酸(分子量2000kDa)，充分溶解后加入100万U/mL的芽孢杆菌透明质酸酶液1mL，水解24h后，按照1.2进行样品处理，按照上述色谱条件进行检测，得到透明质酸寡糖分布色谱图，见图4。由图4可知，各透明质酸寡糖分离度均得到较好分离，分离度结果见表6，且各透明质酸寡糖在232nm处有特征吸收，证明水解产生的是不饱和透明质酸寡糖。
按照上述测试条件，重复测定6次细菌型MHase酶酶解透明质酸寡糖混合物，计算各寡糖保留时间的RSD％，测试结果见表7：
表6细菌型MHase酶酶解透明质酸寡糖保留时间的分离度结果
| 化合物名称 | 分离度 |
| HA-2 | - |
| HA-4 | 4.3 |
| HA-6 | 12.2 |
| HA-8 | 18.7 |
| HA-10 | 15.4 |
| HA-12 | 11.0 |
| HA-14 | 7.9 |
| HA-16 | 5.6 |
| HA-18 | 4.5 |
| HA-20 | 4.1 |
表7细菌型MHase酶酶解透明质酸寡糖保留时间的重复测试结果
实施例4高温加热透明质酸寡糖变化情况检测
取实施例2的透明质酸寡糖水解液，100℃水浴加热4h，按照上述色谱条件进行检测，得到透明质酸寡糖分布色谱图，见图5。由图5可知，透明质酸寡糖在高温加热的情况下峰有明显分叉，表明透明质酸寡糖在高温下发生了结构改变；各透明质酸寡糖分离度均得到较好分离，分离度结果见表8，证明本发明可以用于检测透明质酸寡糖高温喷雾干燥工艺中的过程样，进行产品质量监测。
按照上述测试条件，重复测定6次高温加热透明质酸寡糖混合物，计算各寡糖保留时间的RSD％，测试结果见表9：
表8高温加热透明质酸寡糖保留时间的分离度结果
| 化合物名称 | 分离度 |
| HA-2 | - |
| HA-4 | 3.8 |
| HA-6 | 10.4 |
| HA-8 | 15.1 |
| HA-10 | 12.9 |
| HA-12 | 9.8 |
| HA-14 | 7.6 |
| HA-16 | 6.1 |
| HA-18 | 5.2 |
| HA-20 | 5.9 |
表9高温加热透明质酸寡糖保留时间的重复测试结果
/>
/>
实施例5微生物滋生后透明质酸寡糖变化情况检测
取实施例2的透明质酸寡糖水解液，常温保存一周，按照上述色谱条件进行检测，得到透明质酸寡糖分布色谱图，见图6。由图6可知，谱图中有明显的杂质峰产生；各透明质酸寡糖分离度均得到较好分离，分离度结果见表10。
按照上述测试条件，重复测定6次微生物滋生后透明质酸寡糖混合物，计算各寡糖保留时间的RSD％，测试结果见表11：
表10微生物滋生后透明质酸寡糖保留时间的分离度结果
| 化合物名称 | 分离度 |
| HA-2 | - |
| HA-4 | 3.6 |
| HA-6 | 7.8 |
| HA-8 | 12.5 |
| HA-10 | 14.1 |
| HA-12 | 13.7 |
| HA-14 | 11.0 |
表11微生物滋生后透明质酸寡糖保留时间的重复测试结果
/>
由以上实施例可知，本发明提供了一种酶解透明质酸寡糖混合物的检测方法，包括以下步骤：将酶解透明质酸寡糖液体样品灭活，离心去除大分子，取滤过液，稀释后作为待测液；将所述待测液采用高效液相色谱法进行分离检测；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈；流动相B为四丁基氢氧化铵-磷酸混合水溶液；四丁基氢氧化铵-磷酸的摩尔比为(5～25):(4～20)，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈为流动相A，四丁基氢氧化铵-磷酸混合水溶液为流动相B进行梯度洗脱。该方法能够针对不同酶解机制的透明质酸寡糖混合物进行分离检测，分离度高，重复性好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种酶解透明质酸寡糖混合物的检测方法，包括以下步骤：
将酶解透明质酸寡糖液体样品灭活，离心去除大分子，取滤过液，稀释后作为待测液；
将所述待测液采用高效液相色谱法进行分离检测；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈；流动相B为四丁基氢氧化铵-磷酸混合水溶液；四丁基氢氧化铵-磷酸的摩尔比为(5～25):(4～20)，梯度洗脱；
所述四丁基氢氧化铵-磷酸混合水溶液的pH值为6.0～7.5；
流动相A和流动相B的体积比为(25～50):(75～50)；
流动相的流速为0.5mL/min；
所述梯度洗脱具体为：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用agilent Poroshell 120EC-C18色谱柱，3.0×150mm，2.7μm，柱温为30℃，平衡时间为28～32h。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
检测波长为双波长，分别为210nm和232nm；
进样量为5μL。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酶解透明质酸寡糖液体样品选自牛睾丸型BTH酶酶解透明质酸寡糖液体、水蛭型LHase酶酶解透明质酸寡糖液体、细菌型MHase酶酶解透明质酸寡糖液体、高温加热的透明质酸寡糖水解液、或微生物滋生后透明质酸寡糖液体。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酶解透明质酸寡糖液体由透明质酸酶解制得；
透明质酸寡糖的聚合度≤20。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述离心的转速为7000～9000rpm，离心的时间至少为8min，离心采用5K超滤离心管。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A使用前过0.22μm有机相膜，超声至少12min；
所述流动相B使用前过0.22μm水相膜，超声至少12min。
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Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20100133688A (ko) * | 2009-06-12 | 2010-12-22 | 포항공과대학교 산학협력단 | 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법, 및 이에 의해 제조된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 |
| CN104330507A (zh) * | 2014-10-14 | 2015-02-04 | 天津医药集团津康制药有限公司 | 一种头孢地尼反应终点的液相检测方法 |
| CN105699578A (zh) * | 2016-04-22 | 2016-06-22 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种玻璃酸钠组成糖型指纹图谱分析方法 |
| GB201611639D0 (en) * | 2016-07-04 | 2016-08-17 | Ockham Biotech Ltd | Delivery device and formulation |
| CN106153778A (zh) * | 2016-09-05 | 2016-11-23 | 东北农业大学 | 一种采用高效液相色谱法检测乳中他唑巴坦的方法 |
| CN108956803A (zh) * | 2018-05-24 | 2018-12-07 | 广东华南药业集团有限公司 | 一种头孢克肟的质量控制方法 |
| CN109517012A (zh) * | 2018-11-13 | 2019-03-26 | 华熙福瑞达生物医药有限公司 | 一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法 |
| CN112472624A (zh) * | 2020-11-23 | 2021-03-12 | 湖南御家化妆品制造有限公司 | 一种非晶的透明质酸纳米磷酸钙负载叶酸载体、制备方法及化妆品 |
| CN113325101A (zh) * | 2021-05-27 | 2021-08-31 | 南京海纳医药科技股份有限公司 | 一种盐酸氨基葡萄糖制剂在不同介质中溶出度的检测方法 |
| CN113801904A (zh) * | 2021-09-17 | 2021-12-17 | 山东华熙海御生物医药有限公司 | 一种透明质酸寡糖组合物及其制备方法和用途 |
| CN113876623A (zh) * | 2021-09-24 | 2022-01-04 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种透明质酸寡糖组合物在抗皮肤衰老、促进胶原蛋白生成中的用途 |
| CN114181275A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-03-15 | 水羊化妆品制造有限公司 | 一种人参皂苷Rg3、其制备方法及其用途 |
| CN115151815A (zh) * | 2020-02-25 | 2022-10-04 | 美迪恩斯生命科技株式会社 | 核酸药物等的分析方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW200643033A (en) * | 2005-03-08 | 2006-12-16 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Conjugate of water-soluble modified hyaluronic acid and glp-1 analogue |
-
2022
- 2022-03-29 CN CN202210318062.1A patent/CN114609296B/zh active Active
Patent Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20100133688A (ko) * | 2009-06-12 | 2010-12-22 | 포항공과대학교 산학협력단 | 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법, 및 이에 의해 제조된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 |
| CN104330507A (zh) * | 2014-10-14 | 2015-02-04 | 天津医药集团津康制药有限公司 | 一种头孢地尼反应终点的液相检测方法 |
| CN105699578A (zh) * | 2016-04-22 | 2016-06-22 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种玻璃酸钠组成糖型指纹图谱分析方法 |
| GB201611639D0 (en) * | 2016-07-04 | 2016-08-17 | Ockham Biotech Ltd | Delivery device and formulation |
| CN106153778A (zh) * | 2016-09-05 | 2016-11-23 | 东北农业大学 | 一种采用高效液相色谱法检测乳中他唑巴坦的方法 |
| CN108956803A (zh) * | 2018-05-24 | 2018-12-07 | 广东华南药业集团有限公司 | 一种头孢克肟的质量控制方法 |
| CN109517012A (zh) * | 2018-11-13 | 2019-03-26 | 华熙福瑞达生物医药有限公司 | 一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法 |
| CN115151815A (zh) * | 2020-02-25 | 2022-10-04 | 美迪恩斯生命科技株式会社 | 核酸药物等的分析方法 |
| CN112472624A (zh) * | 2020-11-23 | 2021-03-12 | 湖南御家化妆品制造有限公司 | 一种非晶的透明质酸纳米磷酸钙负载叶酸载体、制备方法及化妆品 |
| CN113325101A (zh) * | 2021-05-27 | 2021-08-31 | 南京海纳医药科技股份有限公司 | 一种盐酸氨基葡萄糖制剂在不同介质中溶出度的检测方法 |
| CN113801904A (zh) * | 2021-09-17 | 2021-12-17 | 山东华熙海御生物医药有限公司 | 一种透明质酸寡糖组合物及其制备方法和用途 |
| CN113876623A (zh) * | 2021-09-24 | 2022-01-04 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种透明质酸寡糖组合物在抗皮肤衰老、促进胶原蛋白生成中的用途 |
| CN114181275A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-03-15 | 水羊化妆品制造有限公司 | 一种人参皂苷Rg3、其制备方法及其用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| A reversed一phase ion-pair high-performance liquid chromatography method for bovine testicular hyaluronidase digests using postcolumn derivatization with 2一cyanoacetamide and ultraviolet detection;Jeffrey A. Cramer etal.;《Analytical Biochemistry》;第183-191页 * |
| 反相高效液相色谱法测定注射用奥美拉唑钠中乙二胺四乙酸二钠含量;韩继永等;《医药导报》;第1493-1495页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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