KR20100133688A - 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법, 및 이에 의해 제조된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트에 관한 것으로서, 상기 방법에 따른 경우, 유기 용매 존재 하에 컨쥬게이션 반응을 진행할 수 있어, 수불용성인 다양한 펩타이드 활성 성분의 약물 전달 시스템에 적용 가능하고, 생체적합성, 생분해성 유도체를 사용하여, 인체에 적용하기에 안전한 컨쥬게이트를 얻을 수 있다. 또한 본 발명의 제조 방법은 공정수행이 간편하여, 약효 시간이 증대된 펩타이드 의약품 서방성 제형의 제조에 관한 산업 분야에 유용하게 이용될 수 있다.
펩타이드, 히알루론산, 생접합, 생체적합성, 생분해성, 컨쥬게이트

Description

히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법, 및 이에 의해 제조된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트{PREPARATION METHOD OF HYALURONIC ACID-PEPTIDE CONJUGATE, AND HYALURONIC ACID-PEPTIDE CONJUGATE PREPARED THEREFROM}
본 발명은 펩타이드 의약품의 약물 전달체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 수불용성인 다양한 펩타이드 등의 활성 성분에 적용 가능하고, 생체적합성, 생분해성 전달체와 컨쥬게이션을 하여, 인체에 안전하게 적용할 수 있으며, 또한 제조 방법이 간편하고, 약효 시간을 증대할 수 있는 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
펩타이드 의약품의 장기 약효 지속 제형에 관한 연구는 최근까지 생체적합한 생분해성 고분자와의 컨쥬게이션 반응을 통한 제형 개발에 포커스가 맞추어 지고 있다. 상기와 같은 펩타이드 의약품의 약효 지속 시간은 제형의 형태 및 컨쥬게이션 되는 활성 성분에 따라 몇 주까지 연장되기도 한다. 이와 같은 제형을 개발하기 위해서는 제형의 약효 지속 시간의 증대 및 활성 성분에 컨쥬게이션 되는 고분자의 생체적합성 여부도 고려해야 한다.
따라서, 최근에는 생체적합한 생분해성 폴리에틸렌 글리콜(poly ethylene glycol, PEG) 또는 히알루론산(hyaluronic acid, HA)과 활성 성분을 컨쥬게이션하여 약물 전달 시스템에 응용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
하지만, 활성 성분에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 컨쥬게이션하는 반응, 즉 소위 말하는 페길화(PEGylation) 반응에 사용되는 PEG는 FDA에서 공인한 대표적인 생체용 고분자 재료 중의 하나이지만, 약물전달체로 활용되는 PEG-Liposome 접합체를 반복 주사하게 되면 체내에서 투여된 약물의 소실이 빨리 일어나는 'acelerated blood clearance' (ABC) 현상이 일어나는 것으로 보고되고 있다.
한편, 히알루론산을 활성 성분에 컨쥬게이션하여 사용하는 기술의 경우, 이들 컨쥬게이트 반응을 위한 제조 단계는 지나치게 복잡하고, 또한 수용성 용매 하에서만 컨쥬게이션 반응이 진행되어, 수불용성 펩타이드, 단백질 등의 수불용성 활성 성분에 적용되기에는 한계가 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 극복하여, 제조 방법이 간단하고 수불용성 펩타이드 등의 수불용성 활성 성분에 적용가능하며, 생분해성 유도체를 이용한 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 히알루론산(Hyaluronic acid, HA), 또는 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체와 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드(Tetra-n-butyl ammonium hydroxide, TBA-OH)를 반응시켜 HA-TBA 를 형성하는 단계; 말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드를 준비하는 단계; 및 상기 HA-TBA 및 상기 말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드를 유기 용매 존재 하에 반응하는 단계를 포함하는 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 제조 방법에 따라 제조된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트를 제공한다.
이하, 발명의 구현 예에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
발명의 일 구현예에 따라, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA), 또는 히알루론 산의 염, 또는 히알루론산의 유도체와 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드(Tetra-n-butyl ammonium hydroxide, TBA-OH)를 반응시켜 HA-TBA 를 형성하는 단계; 말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드를 준비하는 단계; 및 상기 HA-TBA 및 상기 말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드를 유기 용매 존재 하에 반응하는 단계를 포함하는 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법을 제공한다.
상기와 같이, 활성 성분인 펩타이드에 생체적합성, 생분해성 고분자인 히알루론산을 컨쥬게이션하여, 인체에 안전하게 적용할 수 있을 뿐만 아니라, 유기 용매 하에서 컨쥬게이션 반응을 진행할 수 있어, 수불용성인 펩타이드 등을 포함한 수불용성 활성 성분의 약물 전달 시스템에 관한 산업분야에 널리 적용할 수 있다.
한편, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA), 또는 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체와 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드(Tetra-n-butyl ammonium hydroxide, TBA-OH)를 반응시켜 HA-TBA를 형성하는 단계는 양이온 교환수지를 이용하여 진행할 수 있다.
구체적으로, 상기 HA-TBA의 형성은 양이온 교환수지에 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드(Tetra-n-butyl ammonium hydroxide)를 반응시키는 단계, 및 히알루론산, 또는 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체를 추가로 첨가하여 반응하는 단계를 포함한다.
이 때, 상기 양이온 교환수지는 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드와 반응하여, TBA-OH의 양이온을 교환할 수 있는 것이면, 그 구성의 한정이 없이 사용될 수 있다.
바람직하게는 상기 양이온 교환수지는 Dowex® 50WX2-200, Dowex® 50WX4-400, Dowex® 50WX2-100, Dowex® 50WX2-400, Dowex® 50WX8-100, Dowex® 50WX8-200, 및 Dowex® 50WX8-400로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다. 상기와 같은 양이온 교환수지를 HA-TBA 형성에 사용하는 경우, HA의 카르복실기에 있던 Na+ 이온을 TBA 이온으로 교환하여 HA-Na를 HA-TBA로 변환시킬 수 있는 점에서 유리하다.
한편, 말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드의 준비는 활성 성분인 펩타이드 자체에 아미노기를 말단에 포함한 것이라면, 별도의 준비 과정을 거치지 않아도 된다. 그러나, 활성 성분인 펩타이드의 말단에 아미노기를 포함하지 않는 펩타이드거나, 또는 말단에 아미노기를 갖고 있으나, 포함된 아미노기의 반응성이 낮은 펩타이드의 경우, 펩타이드의 말단에 별도로 아미노기를 도입하는 공정을 거칠 수 있다.
말단 아미노기를 갖는 펩타이드의 준비는 특별한 제한 없이 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 펩타이드의 N-말단에 라이신 또는 글리신을 도입하여 진행할 수 있다. 펩타이드의 N-말단에 라이신 또는 글리신을 사용하여 아미노기를 도입하면, 도입된 아미노기에 의해 컨쥬게이션 반응성을 증가시킬 수 있다.
또한, 히알루론산에 생접합되는 말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드는 유기 용매 하에 용해될 수 있는 것이면, 그 구성의 한정이 없이 선택될 수 있다. 특히, anti-Flt1 펩타이드, FPRL1 수용체(receptor)에 대한 길항제 펩타이 드(antagonist peptide), 또는 FPRL1 수용체(receptor)에 대한 작용제 펩타이드(agonistic peptide)를 사용할 수 있다.
구체적으로는, GNQWFI (SEQ ID NO: 1), KGNQWFI (SEQ ID NO: 2), 및 GGNQWFI(SEQ ID NO: 3)로 이루어진 anti-Flt1 펩타이드군에서 선택되는 하나 이상, GwWRWWM (SEQ ID NO: 4), GWRWWWW (SEQ ID NO: 5), KwWRWWM (SEQ ID NO: 6), 및 KWRWWWW(SEQ ID NO: 7)로 이루어진FPRL1 수용체(receptor)에 대한 길항제 펩타이드(antagonist peptide)군에서 선택되는 하나 이상, 또는 GWRYMVm (SEQ ID NO: 8), GWKYYMVm (SEQ ID NO: 9), KWRYMVm (SEQ ID NO: 10), 및 KWKYMVm (SEQ ID NO: 11)로 이루어진 FPRL1 수용체(receptor)에 대한 작용제 펩타이드(agonist peptide)군에서 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 한정되는 것은 아니다.
상술한 바와 같이, 본원의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법은 컨쥬게이션 반응이 유기 용매 하에서 진행되어, 유기 용매에 용해 가능한 수불용성 펩타이드 활성 성분의 생접합을 통한 약물 전달 시스템 제조에 응용 가능하다. 특히, 상기 유기 용매는 HA-TBA 및 말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드를 용해시킬 수 있는 것이면, 구성의 한정이 없이 사용될 수 있다.
구체적으로, 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF), 디메틸아세트아미드(dimethylacetamide), N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP), 및 헥사메틸포스포아미드(hexamethylphosphoramide, HMPA)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.
또한, HA-TBA 및 말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드를 유기 용매 존재 하에 반응하는 단계를 수행하기 전에, HA-TBA를 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포니움 헥사플로로포스페이트 (Benzotriazole-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, BOP), 1, 3-디시클로헥실카르보디이미드(1,3-Dicyclohexylcarbodiimide, DCC) 및 1, 3-다이아이소프로필카보다이이미드(1,3-Diisopropylcarbodiimide, DIC)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 활성제에 첨가해 활성화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기와 같은 활성제에 HA-TAB를 첨가해 활성화 시키는 단계를 거친 후에, HA-TBA 및 말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드를 유기 용매 존재 하에 반응하는 컨쥬게이션 반응을 진행하면, 히알루론산(HA)의 카르복실기가 활성화 되어 펩타이드의 아미노기와 반응성이 높아져, 컨쥬게이션 반응 효율을 높일 수 있다.
이 때, 활성제에 첨가해 활성화 시키는 시간은 사용되는 활성제의 종류 및 농도에 따라 달리 적용할 수 있는데, 바람직하게는 충분한 반응성 향상을 위해 30분 내지 1시간 활성화시킬 수 있다.
한편, 상술한 바와 같이 HA-TAB와 말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드의 컨쥬게이션 반응은 유기 용매 존재 하에서 일어날 수 있는데, 이 때, HA-TAB 및 말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드 혼합 시, N, N-디이소프로필 에틸아민(N,N-diisopropyl ethylamine , DIPEA), 2,2,6,6,-테트라메틸피페리딘(2,2,6,6-tetramethylpiperidine) 또는 이들의 혼합물을 첨가할 수 있다. 상기와 같은 N, N-디이소프로필 에틸아민(DIPEA) 등의 첨가물은 컨쥬게이션 반응에서 촉매의 역할을 하여, 반응 속도를 증가시킬 수 있다.
참고로, 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법을 간단히 나타낸 것이다. 도 1에 나타난 바와 같이, 히알루론산은 TBA-OH와 반응하여 HA-TBA를 형성하고, 형성된 HA-TBA는 BOP를 통해 활성화 될 수 있다. 그 후, 활성화된 HA-TBA와 말단 아미노기를 갖는 펩타이드는 유기 용매의 존재 하에 반응하여 히알루론산-펩타이드 켄쥬게이트를 생성한다. 이 때, 도 1에 나타난 바와 같이, 유기 용매 존재 하에 활성화된 HA-TBA와 말단 아미노기를 갖는 펩타이드의 반응 단계에서, 추가로 촉매인 DIPEA를 첨가하여 진행시킬 수 있다.
상술한 바와 같이, HA-TAB와 말단 아미노기를 갖는 펩타이드의 컨쥬게이션 반응은 히알루론산에 포함된 카르복실기와 펩타이드의 아미노기의 반응을 통해 진행된다.
한편, 상기 구현예에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법에 있어서, 사용되는 히알루론산, 또는 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체는 그 구성의 한정은 없으나, 바람직하게는 분자량이 10,000 내지 3,000,000 달톤(Da)인 것을 사용할 수 있다. 상기와 같은 범위의 분자량을 갖는 히알루론산, 또는 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체는 약물 전달을 위한 컨쥬게이트에 사용되기에 적합하다.
또한, 상기 컨쥬게이션 반응에 있어서, 상기 HA-TBA 한 분자에 결합되는 펩타이드 분자수는 그 구성의 한정은 없으나, 바람직하게는 3 내지 60개 분자수의 펩타이드가 결합될 수 있다. 상기와 같은 범위 내의 분자수의 펩타이드가 결합된 히 알루론산-펩타이드 컨쥬게이트는 원하는 약효 지속 시간을 나타낼 수 있다.
본 발명은 다른 구현예에 따라, 상술한 방법으로 제조되는 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트를 제공한다. 상술한 바와 같이, 상기 컨쥬게이트에 생접합 가능한 펩타이드는 유기 용매의 존재 하에 생접합 가능한 것이면 그 구성의 한정은 없다. 구체적으로는 GNQWFI(SEQ ID NO: 1), KGNQWFI (SEQ ID NO: 2), GGNQWFI (SEQ ID NO: 3)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 anti-Flt1 펩타이드, GwWRWWM (SEQ ID NO: 4), GWRWWWW (SEQ ID NO: 5), KwWRWWM (SEQ ID NO: 6) 또는KWRWWWW (SEQ ID NO: 7)의 FPRL1 수용체(receptor)에 대한 길항제 펩타이드(antagonist peptide), GWRYMVm (SEQ ID NO: 8), GWKYYMVm (SEQ ID NO: 9), KWRYMVm (SEQ ID NO: 10), 및KWKYMVm (SEQ ID NO: 11)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 FPRL1 수용체(receptor)에 대한 작용제 펩타이드(agonist peptide)를 사용할 수 있으나, 이에 특별히 한정되는 것은 아니다.
또한, 상술한 바와 같이 상기 HA-TBA 한 분자에 결합되는 펩타이드 분자수는 3 내지 60인 것이 바람직하다.
본 발명의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 제조 방법에 따르면, 유기 용매 존재 하에 컨쥬게이션 반응을 진행할 수 있어, 수불용성인 다양한 펩타이드 활성 성분에 적용 가능하고, 생체적합성, 생분해성 유도체와 결합하여, 인체에 적용하기에 안전한 컨쥬게이트를 얻을 수 있다. 또한, 제조 방법이 간편하여, 약효 시간이 증대된 펩타이드 의약품 서방성 제형의 제조에 관한 산업 분야에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 발명의 다양한 실시예에 대해 설명하기로 한다. 다만, 이는 발명의 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 발명의 권리 범위가 제한되는 것은 아니다.
< 제조예 : 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트의 제조>
제조예1 ( HA - GNQWFI 컨쥬게이트의 제조)
Dowex® 50WX-8-400 ion-exchange resin (12.5 g)을 250 mL의 증류수로 3회 세척한 후, 상기 Dowex resin에 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드(tetra-n-butyl ammonium hydroxide, TBA-OH) (24.5 mL)를 넣어 30분간 반응 후, 필터를 통해 여과하였다.
히알루론산(HA)(MW=1.323 × 105, 1 g)을 100 mL의 물에 녹인 후, DOWEX-TBA resin (10g)을 첨가해 3시간 동안 반응시켰다. 상층액을 0.45 μm 필터로 걸러 3일간 동결건조 시켜, HA-TBA를 얻었다.
말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드로, Anti-Flt1 펩타이드인 GNQWFI (SEQ ID NO: 1) 서열을 갖는 펩타이드를 준비하였다. GNQWFI (SEQ ID NO: 1) 서열을 갖는 펩타이드와 상기 HA-TBA를 각각 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 용해시켰다. HA-TBA 용액에 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포니움 헥사플로로포스페이트 (Benzotriazole-1-yl-oxy- tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, BOP)를 HA의 카르복실기에 대해 2.5배의 몰비로 첨가해 30분 간 활성화 시켰다.
이 후, HA-TBA 용액과 상기 펩타이드 용액을 혼합하고 N,N-디이소프로필 에틸아민(N,N-diisopropyl ethylamine, DIPEA)를 HA의 카르복실기에 대해 1/1의 몰비로 첨가하였다. Feed 내에서 HA 한 분자 당 반응시킨 펩타이드의 분자수는 4, 8, 16, 33, 55 였다. 37℃에서 하루 동안 반응시킨 후 1/1의 부피비로 1 M NaCl 수용액을 첨가하였다.
1 M HCl를 첨가하여 용액의 pH를 3.0으로 내려 반응을 종료시키고, 1 M NaOH를 첨가해 pH을 7.0으로 올렸다. 과량의 0.3 M NaCl 수용액, 25% 에탄올, 증류수에 대해 투석시킨 후 3일간 동결건조 시켜, 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트를 얻었다.
상기에서 얻어진 anti-Flt1 펩타이드-HA conjugate는 1H-NMR (DPX500, Bruker, Germany)과 형광분석으로 분석하였다.
제조예2 ( HA - KGNQWFI 컨쥬게이트의 제조)
Anti-Flt1 펩타이드로 GNQWFI (SEQ ID NO: 1)서열을 갖는 펩타이드 말단에, 라이신(lysine, K)을 도입해, HA의 카르복시 그룹과의 반응성이 좋은 말단 아미노기를 갖는 펩타이드(KGNQWFI) (SEQ ID NO: 2)를 사용한 점을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 컨쥬게이트를 얻었다.
제조예3 ( HA - GGNQWFI 컨쥬게이트의 제조)
Anti-Flt1 펩타이드로 GNQWFI (SEQ ID NO: 1)서열을 갖는 펩타이드 말단에, 글리신(glycine, G)을 도입해, HA의 카르복시 그룹과의 반응성이 좋은 말단 아미노기를 갖는 펩타이드(GGNQWFI) (SEQ ID NO: 3)를 사용한 점을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 컨쥬게이트를 얻었다.
상기에서 얻어진 anti-Flt1 펩타이드-HA conjugate는 1H-NMR (DPX500, Bruker, Germany)과 형광분석을 수행하였다. 도 2b는 제조예3에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
제조예4 ( HA - GWRYMVm 컨쥬게이트의 제조)
Formyl 펩타이드 수용체(receptor) like 1 (FPRL1) 수용체(receptor)에 대한 작용제 펩타이드(agonist 펩타이드)인, WRYMVm (SEQ ID NO: 12) 의 말단에 글리신(G)를 도입한 GWRYMVm (SEQ ID NO: 8)를 말단 아미노기를 갖는 펩타이드로 사용한 점을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 컨쥬게이트를 얻었다.
제조예5 ( HA - GWKYYMVm 컨쥬게이트의 제조)
Formyl 펩타이드 수용체(receptor) like 1 (FPRL1) 수용체(receptor)에 대한 작용제 펩타이드(agonist 펩타이드)인, WKYYMVm (SEQ ID NO: 13)의 말단에 글리 신(G)를 도입한 GWKYYMVm (SEQ ID NO: 9)를 말단 아미노기를 갖는 펩타이드로 사용한 점을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 컨쥬게이트를 얻었다.
제조예6 ( HA - KwWRWWM 컨쥬게이트의 제조)
Formyl 펩타이드 수용체(receptor) like 1 (FPRL1) 수용체(receptor)에 대한 길항제 펩타이드(antagonist peptide)인 DTrp-Trp-Arg-Trp-Trp-Met (wWRWWM) (SEQ ID NO: 14)의 말단에 라이신(lysine, K) 을 도입한 KwWRWWM (SEQ ID NO: 6)을 말단 아미노기를 갖는 펩타이드로 사용한 점을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 컨쥬게이트를 얻었다.
제조예7 ( HA - KWRWWWW 컨쥬게이트의 제조)
Formyl 펩타이드 수용체(receptor) like 1(FPRL1) 수용체(receptor)에 대한 길항제 펩타이드(antagonist peptide)인 Trp-Arg-Trp-Trp-Trp-Trp (WRWWWW) (SEQ ID NO: 15)의 말단에 lysine (K) 을 도입한 KWRWWWW (SEQ ID NO: 7) 을 말단 아미노기를 갖는 펩타이드로 사용한 점을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 컨쥬게이트를 얻었다.
< 실험예 >
1. 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트의 NMR 분석
1-1) 분석 방법
상술한 제조예들에 따라 얻어진 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트를 1H-NMR (DPX500, Bruker, Germany)로 분석하였다. 분석 결과 중, 제조예 3에 따른 HA-GGNQWFI 컨쥬게이트 및 히알루론산 자체의 1H-NMR 스펙트럼을 도 2에 도시하였다.
1-2) 분석 결과
도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 제조예 3에 따른 HA-GGNQWFI 컨쥬게이트의 1H-NMR 스펙트럼에서는 히알루론산의 피크 외에도, anti-Flt1 펩타이드의 피크가 나타났다. 특히 δ = 7.10 ~ 7.65 ppm의 피크는 페닐알라닌(phenylalanine)과 트립토판(tryptophan)의 aromatic ring에 의한 것이고, δ = 0.866 ppm의 피크는 아이소루신(isoleucine)의 두 메틸기(methyl groups)에 의한 것이다. 정량분석을 위해 δ = 1.85 ~ 1.95 ppm의 히알루론산의 아세토아미도 관능기의 메틸 공명(methyl resonance of acetamido moiety of HA)을 내부표준(internal standard)으로 정했다 (도 2a). 제조예 1 내지 3에 따른 Anti-Flt1 펩타이드-히알루론산 컨쥬게이트 내의 펩타이드 함량은 δ = 1.85 ~ 1.95 ppm의 피크 면적과 δ = 0.866 ppm의 피크 면적을 비교해서 구했다 (도 2b의 β). 1H-NMR 분석을 통해 anti-Flt1 펩타이드-히알루론산 컨쥬게이트가 합성된 것을 확인할 수 있었다.
2. 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트의 ( Gel Permeation Chromatography , GPC) 분석
2-1) 분석 방법
제조예 1 내지 3, 및 제조예 6, 제조예 7에 따라 준비된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 GPC 분석을 통해 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 형성을 확인하였다.
High performance liquid chromatography (HPLC)를 사용하여 히알루론산-펩타이드 conjugate의 GPC 분석하였다. 분석 조건은 하기와 같다.
2-2) GPC 분석 조건
펌프: Waters 1525 binary HPLC pump
흡광도 측정기: Waters 2487 dual λ absorbance detector
샘플러: Waters 717 plus auto-sampler
컬럼: Superdex Peptide 10/300 GL column
이동상: 30 vol% acetonitrile (ACN) / 0.1 vol% trifluoroacetic acid (TFA), flow rate는 1 mL/min.
측정 파장: 210 nm와 280 nm로 이중 측정(dual detection).
2-3) 분석 결과
도 3은 본 발명의 제조예 1 내지 제조예 3, 제조예 6, 및 제조예 7에 따른 방법으로 제조된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트(a 내지 e는 순차적으로 제조예 1 내지 제조예 3, 제조예 6, 및 제조예 7에 따른 방법으로 제조된 히알루론산-펩타이트 컨쥬게이트)의 GPC 결과를 나타낸 것이다
도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 280nm의 파장에서 측정하였을 때, 고분자량의 히알루론산의 체류 시간(retention time) 인 8분 대에서 피크가 나타나 히알루론산(HA)에 펩타이드가 컨쥬게이션 되었음을 확인하였다.
3. 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트의 형광 분석
3-1) 분석 방법
페닐알라닌(Phenylalanine), 트립토판(tryptophan), anti-Flt1 펩타이드 (GGNQWFI), anti-Flt1 펩타이드-히알루론산 컨쥬게이트를 각각 0.5 M HCl에 녹였다. 280 nm에서 여기(excitation)시킨 후, 샘플의 광루미네선스(photoluminescence)를 형광분석기인 스펙트로플로오로미터(spectrofluorometer) (제조사: Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer, Varian, Australia)로 측정하였다. 결과는 도 4에 나타내었다. 구체적으로 도 4는, 페닐알라닌(a), 트립토판(b), GGNQWFI (SEQ ID NO: 3)(c), 제조예3에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트(HA-GGNQWFI)(d)의 형광 분석 결과이다.
상기 제조예3에 따른Anti-Flt1 펩타이드-히알루론산 컨쥬게이트 내의 펩타이드 함량은 여기 파장(excitation wavelength)은 280 nm,　방출 파장(emission wavelength) 350 nm에서 형광 세기(fluorescence intensity)를 측정해 구하였다.
0.5 M HCl에 6.4 mg/mL의 농도로 트립토판 원액(tryptophan stock solution)을 준비한 뒤, 희석시켜 0.5, 1, 2, 4, 8 μg/mL 농도의 트립토판 표준용액(tryptophan standard solutions)을 준비하였다. 도 5a는 트립토판의 농도에 따 른 형광성 세기를 나타낸 그래프로, 같은 시료를 3번 반복하여, 농도에 따른 형광성 세기를 측정하였다. 한편, 제조예 1 내지 3에 따른 anti-Flt1 펩타이드-히알루론산 컨쥬게이트 시료 0.5 mg을 0.5 M HCl 3 mL에 녹여 형광을 측정하였고, 그 결과를 도 5b에 나타내었다.
또한, 도 5c는 제조예4 내지 6에 따라 제조된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 내의 펩타이드 함량을 제조예 1 내지 3에 따른 방법과 동일하게 측정하여, 그래프로 나타낸 것이다.
한편, 도 6은 트립토판 형광성 분석법으로 정량한 제조예3에 따른HA-GGNQWFI 컨쥬게이트 내의 GGNQWFI (SEQ ID NO: 3) 함량 분석 결과 및 생접합 효율을 분석한 결과를 도시한 것이다.
3-2) 분석 결과
도 4에 나타난 바와 같이, 페닐알라닌(Phenylalanine)은 280 nm에서 여기(excitation) 시켰을 때 형광이 나타나지 않았다(도 4a). 반면, 트립토판(tryptophan)은 350 nm에서 선명한 방출 피크(sharp emission peak)를 보였다 (도 4b). GGNQWFI (SEQ ID NO: 3)와 제조예3에 따른 HA-GGNQWFI도 350 nm에서 선명한 방출 피크(sharp emission peak)를 보였고, 컨쥬게이션 전후의 방출 패턴(emission pattern)에 차이가 없는 것을 알 수 있었다 (도 4c 및 도 4d).
　 라이신(Lysine)을 GNQWFI (SEQ ID NO: 1)의 말단에 도입(K-GNQWFI)하여, 컨쥬게이션 반응을 진행한 경우(제조예 2에 따른 컨쥬게이트), 평균 생접합 효 율(average bioconjugation efficiency)은 라이신을 도입하지 않은 펩타이드에 비해 10% 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 5b). 한편, 글리신(Glycine)을 말단에 도입(G-GNQWFI) (SEQ ID NO: 3)하여, 컨쥬게이션 반응을 진행한 경우(제조예3에 따른 컨쥬게이트), 평균 생접합 효율(average bioconjugation efficiency)은 글리신을 도입하지 않은 펩타이드에 비해 40% 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 5b). 따라서, 이후의 실험에서는 가장 높은 생접합 효율를 보인 G-GNQWFI (SEQ ID NO: 3)와 HA의 컨쥬게이트(제조예 3에 따른 컨쥬게이트)를 사용했다.
한편, 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 제조예 3에 따른 HA-GGNQWFI 컨쥬게이트 내의 펩타이드 함량은 feed 내에서 HA 한 분자 당 반응시킨 펩타이드의 분자수에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다. Feed 내에서 HA 한 분자 당 반응시킨 펩타이드의 분자수를 4, 8, 16, 33, 55로 변화시켰을 때, HA 한 분자 당 결합한 펩타이드의 평균 분자수는 3에서 30까지 조절 가능했다.
생접합 효율(Bioconjugation efficiency) (%)은 반응용액에 첨가한 펩타이드에 대해 반응한 펩타이드의 몰 비로 표시했다. Feed 내에서 HA 한 분자 당 반응시킨 펩타이드의 분자수가 33 이하일 때는 생접합 효율이 약 65 %로 일정했다. Feed 내에서 HA 한 분자 당 반응시킨 펩타이드의 분자수가 55일 때는 생접합 효율이 53 %까지 감소하는 것을 알 수 있었다.
4. 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트의 생물학적 활성도 분석( In vitro )
4-1) 분석 방법
인산완충용액 (Phosphate Buffered Saline, PBS)내의 VEGF165 용액의 농도가 0.5 μg/mL인 용액을 96-black well-plate에 넣고 4℃에서 overnight시켜 VEGF165 coated wells를 준비하였다. PBS로 세척한 후, 억제 완충액(blocking buffer)으로 인산완충용액에 용해된 3 wt%의 소혈청알부민(3 wt% bovine serum albumin, in PBS)으로 well을 block하고 (상온에서 2시간 동안) PBS로 다시 세척하였다. 인산완충용액에 용해된 1 wt% 소혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA) 용액에 2 μM 의 펩타이드, 50 ng/mL 의 Flt1-Fc를 함유한 anti-Flt1 펩타이드 (GGNQWFI) (SEQ ID NO: 3), 및 anti-Flt1 펩타이드-히알루론산 컨쥬게이트 용액을 웰에 첨가한 후 상온에서 한 시간 배양시켰다. 0.05 wt% of Tween 20를 함유한 PBS로 세 번 세척한 후, anti-human IgG-HRP-Fc in 0.3 wt% BSA solution in PBS를 넣고 상온에서 한 시간 배양시켰다. 0.05 wt% of Tween 20를 함유한 PBS로 세 번 세척하고 PBS로 한 번 세척한 후, 결합한 Flt1-Fc의 양을 BM chemiluminescence ELISA substrate system (Victor 3 luminometer, PerkinElmer, MA)으로 측정하였다.
4-2) 분석결과
Anti-Flt1 펩타이드를 처리하지 않은 양성 대조군(positive control)의 luminous value를 100%로 설정한 후 다른 실험자료는 표준화(normalize)시켰다. 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, GGNQWFI (SEQ ID NO: 3)를 처리했을 때, 약 35%의 VEGF165가　Flt1-Fc와 결합해 ELISA로 측정되었다. 제조예 3에 따른 HA-GGNQWFI 컨쥬게이트를 처리했을 때, 약 28%의 VEGF165가　Flt1-Fc와 결합해 ELISA로 측정되었다. 결과적으로 제조예 3에 따른 HA-GGNQWFI 컨쥬게이트는 GGNQWFI (SEQ ID NO: 3)와 비슷한 정도로 Flt1-Fc 와 VEGF16의 결합 저해 효과를 보여 생물학적 활성도(biological activity)가 확인되었다.
5. 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트에 의한 각막 신생혈관 형성 저해 실험( In vivo )
5-1) 분석 방법
평균 체중이 250g인 실험용 쥐(Albino Sprague Dawley male rats) 5마리를 실험에 사용하였다. 모든 동물 실험(animal procedures)은 guidelines of the Catholic University of Korea and the principles of laboratory animal care (NIH publication No. 85-23 revised in 1985)를 따라 수행하였다. 실험용 쥐들의 내부복막(intra-peritoneal)에 염산케타민(ketamine hydrochloride) 20 mg/kg과 자일라진 하이드로클로라이드(xylazine hydrochloride) 2.5 mg/kg의 혼합물을 주사하여 마취시켰다. 또한, 상기 실험용 쥐들의 오른쪽 각막(Right corneas)의 중앙부를 75% 의 질산은(silver nitrate) 및 25% 질산칼륨(potassium nitrate)으로 구성된 질산은 면봉(silver nitrate applicator stick)을 사용하여, 마비시켰다. 상기 질산은 면봉은 1 mm의 직경을 갖는 것으로, 이를 10 초 동안 각막(cornea)에 접촉시키는 방법을 통해, 마비시켰다. 질산은면봉으로 마비시키고, 3일 후, 각 20 μL의 펩타이드 의약품(control, Avastin®, GGNQWFI (SEQ ID NO: 3), 제조예 3에 따라 준비된 HA-GGNQWFI 컨쥬게이트의 네 가지 샘플)을 결막하(subconjunctiva)에 주사하였다. 각막 신생혈관 생성(Corneal neovascularization)에 대한 저해 효과는 디지털 카메라가 장착된 안과용 현미경(ophthalmic microscope) (제조사: Olympus, Tokyo, Japan)로 관찰하였다. 포착된 이미지(Captured images)는 이미지 분석 프로그램(Ver. 1.38, National Institute of Health, MD)으로 분석하였다.
5-2) 분석 결과
도 8에 나타난 바와 같이, 제조예 3에 따라 준비된HA-GGNQWFI 컨쥬게이트의 각막 신생혈관 형성(corneal neovascularization) 저해 효율이 가장 높았고, 다음이 GGNQWFI (SEQ ID NO: 3), 그 다음이 Avastin® 이였다.
또한, 도 9에 나타난 바와 같이, 신생혈관 형성 면적(Neovascularized area)의 평균 퍼센트는 대조군은 90.8 ± 5%, 양성 대조군인 Avastin®은 35.4 ± 6.6%, GGNQWFI 는 27 ± 5.7%, 제조예 3에 따라 준비된HA-GGNQWFI 컨쥬게이트는17.4 ± 5.6%로 나타나는 것을 알 수 있었다.
6. 기도과민성 테스트( In vivo )
6-1) 분석 방법
제조예 3에 따른 HA-GGNQWFI의 생물학적 활성도를 메타콜린(methacholine)에 대한 반응을 통해 측정하였다. 구체적으로 기도과민반응(airway hyper-responsiveness, AHR)을 in vivo 상태에서, 실험용 쥐를 마취 하지 않고 자연상태의 운동을 유지하면서 체적변동 측정기(plethysmography)를 사용하여 하기 수학식 1로 표현되는 기도의 폐식을 반영하는 수치인 enhanced pause(Penh)를 측정하였다. 본 실험에서는 실험용 쥐를 보정하거나 마취하지 않은 상태에서 측정하는 비침습적 방법(non-invasive method)을 사용하였다.
[수학식 1]
Penh=[(Te/RT-1)X(PEF/PIF)]
상기 수학식 1에서, Te는 expiratory time (seconds), RT는 relaxation time (seconds), PEF는 peak expiratory flow (ml), PIF는 peak inspiratory flow (ml/s)을 의미한다.
구체적으로, Mouse 천식 모델을 만들기 위하여 6주령의 C57BL/6 WT mouse에 75 ㎍의 난백알부민(Ovalbumine, OVA)과 10 ㎍의 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, LPS)를 0, 1, 2, 7일차에 비강을 통해 투여하여 감작하였다.
14, 15, 21, 22일 째에 50 ㎍의 OVA와 HA, peptide(GGNQWFI) (SEQ ID NO: 3), HA-peptide conjugate(HA-GGNQWFI)를 각각 혼합하여 역시 비강을 통해 투여하였다. 음성대조군으로는 모든 기간에 PBS만을 투여하였으며, 양성대조군의 경우 14, 15, 21, 22일 째에 OVA만 투여하였다.
폐 기능은 23일째에 비 마취 상태의 생쥐를 비침습성 전신 체적기록진단법을 이용하여 측정하였다. 실험용 쥐를 체적 기록 진단기 chamber에 놓고, PBS 에어로졸 (기본 측정)과 각각 6.25, 12.25, 25, 50 mg/mL의 농도의 메타콜린(metahcholine) 에어로졸에 노출시켰다. 에어로졸은 초음파 흡입기를 이용하여 제조되었으며, 실험용 쥐는 메타콜린(Methacholine)에 3분간 노출시키고 이후 5분간 Penh 를 측정하였다.
6-2) 분석 결과
도 10에서 볼 수 있는 바와 같이, 제조예 3에 따른 HA-GGNQWFI 컨쥬게이트는 양성대조군이나, GGNQWFI (SEQ ID NO: 3) 펩타이드에 비하여, 기도 과민성(Airway hyperresponsiveness, AHR)이 많이 억제되는 양상을 볼 수 있다.
도1은 본 발명의 일 구현예에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법에 관한 화학적 스킴을 간략히 도시한 것이다.
도 2는 히알루론산(도 2a) 및 본 발명의 일 제조예에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬케이트(도 2b)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 제조예에 따른 방법으로 제조된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트(a 내지 e는 순차적으로 제조예 1 내지 제조예 3, 제조예 6, 및 제조예 7에 따른 방법으로 제조된 히알루론산-펩타이트 컨쥬게이트)의 GPC 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 페닐알라닌(a), 트립토판(b), GGNQWFI (SEQ ID NO: 3)(c), 본 발명의 일 제조예에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트(HA-GGNQWFI)(d)의 형광 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 트립토판의 농도에 따른 형광성(a) 및 본 발명의 제조예들에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트에 포함되는 펩타이드 함량(b)을 나타낸 것이다.
도 6는 본 발명의 일 제조예에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 하나의 히알루론산 체인에 포함된 펩타이드 분자수 및 펩타이드 분자수에 따른 생접합 효율을 나타낸 것이다.
도 7은 펩타이드와 본 발명의 일 제조예에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 생체 결합율을 간단히 비교하여 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 제조예에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 각막 신생혈관 형성 저해 효과를 대조군 및 다른 펩타이드와 비교하여 나타낸 것이다.
도 9은 본 발명의 일 제조예에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 각막 신혈광 형성 저해 효과를 나타내기 위하여, 생성된 각막 신혈광 형성 면적을 간단히 비교하여 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 제조예에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 기도과민성 테스트 결과를 비교하여 나타낸 것이다.
<110> Kyo Chul Kang; POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Preparation Method of Hyaluronic Acid-Peptide Conjugate, and Hyaluronic Acid-Peptide Conjugate Prepared Therefrom <130> DPP20090695KR <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Flt1 peptide <400> 1 Gly Asn Gln Trp Phe Ile 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Flt1 peptide <400> 2 Lys Gly Asn Gln Trp Phe Ile 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Flt1 peptide <400> 3 Gly Gly Asn Gln Trp Phe Ile 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FPRL1 receptor antagonist peptide <220> <221> MUTAGEN <222> (2) <223> D-Trp <400> 4 Gly Trp Trp Arg Trp Trp Met 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FPRL1 receptor antagonist peptide <400> 5 Gly Trp Arg Trp Trp Trp Trp 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FPRL1 receptor antagonist peptide <220> <221> MUTAGEN <222> (2) <223> D-Trp <400> 6 Lys Trp Trp Arg Trp Trp Met 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FPRL1 receptor antagnosit peptide <400> 7 Lys Trp Arg Trp Trp Trp Trp 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FPRL1 agonist peptide <220> <221> MUTAGEN <222> (7) <223> D-Met <400> 8 Gly Trp Arg Tyr Met Val Met 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FPRL1 receptor agonist peptide <220> <221> MUTAGEN <222> (8) <223> D-Met <400> 9 Gly Trp Lys Tyr Tyr Met Val Met 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FPRL1 receptor agonist peptide <220> <221> MUTAGEN <222> (7) <223> D-Met <400> 10 Lys Trp Arg Tyr Met Val Met 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FPRL1 receptor agonist peptide <220> <221> MUTAGEN <222> (7) <223> D-Met <400> 11 Lys Trp Lys Tyr Met Val Met 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FPRL1 receptor agonist peptide <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> D-Met <400> 12 Trp Arg Tyr Met Val Met 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FPRL1 receptor agonist peptide <220> <221> MUTAGEN <222> (7) <223> D-Met <400> 13 Trp Lys Tyr Tyr Met Val Met 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FPRL1 receptor antagonist peptide <220> <221> MUTAGEN <222> (1) <223> D-Trp <400> 14 Trp Trp Arg Trp Trp Met 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FPRL1 receptor antagonist peptide <400> 15 Trp Arg Trp Trp Trp Trp 1 5

Claims (15)

  1. 히알루론산(Hyaluronic acid, HA), 또는 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체와 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드(Tetra-n-butyl ammonium hydroxide, TBA-OH)를 반응시켜 HA-TBA 를 형성하는 단계;
    말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드를 준비하는 단계; 및
    상기 HA-TBA 및 상기 말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드를 유기 용매 존재 하에 반응하는 단계를 포함하는 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 HA-TBA 의 형성은 양이온 교환수지에 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드(Tetra-n-butyl ammonium hydroxide, TBA-OH)를 반응시키는 단계, 및 히알루론산, 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체를 추가로 첨가하여 반응하는 단계를 포함하는 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 양이온 교환수지는 Dowex® 50WX2-200, Dowex® 50WX4-400, Dowex® 50WX2-100, Dowex® 50WX2-400, Dowex® 50WX8-100, Dowex® 50WX8-200, 및 Dowex® 50WX8-400로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 히알루론산-펩타이드 컨쥬 게이트의 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드는, 펩타이드 말단에 라이신 또는 글리신을 추가로 도입한 것인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 유기 용매는 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF), 디메틸아세트아미드(dimethylacetamide), N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP), 및 헥사메틸포스포아미드(hexamethylphosphoramide, HMPA)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 HA-TBA 및 말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드를 유기용매 존재 하에 반응하는 단계를 수행하기 전에, 상기 HA-TBA를 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포니움 헥사플로로포스페이트 (Benzotriazole-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, BOP), 1, 3-디시클로헥실카르보디이미드(1,3-Dicyclohexylcarbodiimide, DCC) 및 1, 3-다이아이소프로필카보다이이미드(1,3-Diisopropylcarbodiimide, DIC) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 활성제에 첨가하여 활성화시키는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 HA-TBA 및 상기 말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드를 유기용매 존재 하에 반응하는 단계는, N, N-디이소프로필 에틸아민(N,N-diisopropyl ethylamine, DIPEA), 2,2,6,6,-테트라메틸피페리딘(2,2,6,6-tetramethylpiperidine), 또는 이들의 혼합물을 추가로 첨가하여 상기 HA-TBA와 상기 말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드의 반응을 수행하는 것인 제조 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 히알루론산, 또는 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체는 분자량이 10,000내지 3,000,000 달톤(Da)인 제조 방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 HA-TBA 한 분자에 3 내지 60개 분자수의 펩타이드가 결합된 것인 제조 방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 anti-Flt1 펩타이드, FPRL1 수용체(receptor)에 대한 길항제 펩타이드(antagonist peptide), 또는 FPRL1 수용체(receptor)에 대한 작용제 펩 타이드(agonist peptide)인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 anti-Flt1 펩타이드는 GNQWFI (SEQ ID NO: 1), KGNQWFI (SEQ ID NO: 2), 및 GGNQWFI (SEQ ID NO: 3)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 FPRL1 수용체에 대한 길항제 펩타이드는 GwWRWWM (SEQ ID NO: 4), GWRWWWW (SEQ ID NO: 5), KwWRWWM (SEQ ID NO: 6), 및 KWRWWWW (SEQ ID NO: 7)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 FPRL1 수용체에 대한 작용제 펩타이드(agonist peptide)는 GWRYMVm (SEQ ID NO: 8), GWKYYMVm (SEQ ID NO: 9), KWRYMVm (SEQ ID NO: 10) 및 KWKYMVm (SEQ ID NO: 11) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법.
  14. 히알루론산과 GNQWFI (SEQ ID NO: 1), KGNQWFI (SEQ ID NO: 2), 및 GGNQWFI (SEQ ID NO: 3)로 이루어진 anti-Flt1 펩타이드군에서 선택되는 하나 이상의 수불용성 펩타이드; 또는GwWRWWM (SEQ ID NO: 4), GWRWWWW (SEQ ID NO: 5), KwWRWWM (SEQ ID NO: 6), 및 KWRWWWW (SEQ ID NO: 7)로 이루어진 FPRL1 수용체(receptor)에 대한 길항제 펩타이드(antagonist peptide) 군에서 선택되는 하나 이상의 수불용성 펩타이드; 또는 GWRYMVm (SEQ ID NO: 8), GWKYYMVm (SEQ ID NO: 9), KWRYMVm (SEQ ID NO: 10), 및 KWKYMVm (SEQ ID NO: 11) 로 이루어진 FPRL1 수용체(receptor)에 대한 작용제 펩타이드(agonist peptide)군에서 선택되는 하나 이상의 수불용성 펩타이드가 결합된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트는 히알루론산, 또는 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체와 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드(Tetra-n-butyl ammonium hydroxide, TBA-OH)를 반응시켜 형성된 HA-TBA;와
    말단 아미노기를 갖는 수불용성 펩타이드를 유기 용매 존재 하에 반응하는 단계를 통해 제조된 것인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트.
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