TW201716087A - 包含ｇｌｐ－１／升糖素雙重激動劑連接子玻尿酸接合物之前藥 - Google Patents

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Abstract

本發明關於一種前藥或其醫藥上可接受之鹽，其包含GLP-1/升糖素激動劑連接子接合物Z-L1-L2-L-Y-R20，其中Y代表GLP-1/升糖素激動劑部分；且-L為由式(Ia)表示的連接子部分，□其中虛線表示藉由形成醯胺鍵與GLP-1/升糖素激動劑部分的胺基之一的連接。本發明還關於包含所述前藥的醫藥組合物以及它們作為治療或預防可由GLP-1/升糖素激動劑治療的疾病或病症的藥物的用途。

Description

包含GLP-1/升糖素雙重激動劑連接子玻尿酸接合物之前藥
本發明關於GLP-1/升糖素雙重激動劑前藥，包含所述前藥的醫藥組合物以及它們作為治療或預防可由GLP-1/升糖素雙重激動劑治療的疾病或病症的藥物的用途，例如用於治療代謝症候群的病症(包括糖尿病和肥胖)，以及用於減少過量食物攝入。
GLP-1激動劑
毒蜥外泌肽(Exendin)-4是一種39個胺基酸的肽，其分離自分泌毒液的吉拉毒蜥(Gila monster)(美國毒蜥(Heloderma suspectum))的唾液分泌物。它與升糖素樣肽家族的幾個成員具有一些序列相似性，其中具有最高的53%同源性的是升糖素樣肽-1[7-36]-醯胺(GLP-1)。在離體大鼠胰島中，毒蜥外泌肽-4充當對GLP-1受體的激動劑並帶有GLP-1樣胰島素促分泌素(sectretagogue)作用。毒蜥外泌肽-4是高效力激動劑且截短的GLP-1激動劑-(9-39)-醯胺是在分泌胰島素的β細胞的升糖素樣肽1-(7-36)-醯胺受體處的拮抗劑(參見例如J.Biol.Chem.268(26)：19650-19655)。毒蜥外泌肽-4(“艾塞那肽(exenatide)”)最近在美國和歐盟被批准用於在患有2型糖尿病且服用二甲 雙胍和/或磺脲類的患者中改善血糖控制，但還沒有達到足够的血糖控制。
毒蜥外泌肽-4的胺基酸序列如SEQ ID NO：1中所示：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2
GLP-1(7-36)-醯胺的胺基酸序列如SEQ ID NO 2中所示：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2
升糖素是一種29個胺基酸的肽，其在循環葡萄糖低的時候釋放至血流中。升糖素的胺基酸序列在SEQ ID NO：3中顯示：HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-OH
在低血糖期間，當血糖水平降低至低於正常時，升糖素向肝發送分解糖原並釋放葡萄糖的信號，導致血糖水平升高達到正常水平。低血糖是具有由於糖尿病而引起的高血糖症(升高的血糖水平)的經胰島素治療的患者中的常見副作用。因此，升糖素在葡萄糖調節中最主要的作用是抵消胰島素作用以及保持血糖水平。
Holst(Holst,J.J.Physiol.Rev.2007,87,1409)和Meier(Meier,J.J.Nat.Rev.Endocrinol.2012,8,728)描述了GLP-1受體激動劑，諸如GLP-1、利拉魯肽(liraglutide)和毒蜥外泌肽-4，具有在患有T2DM的患者中藉由降低空腹和餐後血糖(FPG和PPG)來改善血糖控制的3種主要藥理學活性：(i)增加葡萄糖依賴性胰島素分泌(改善第一和第二階段)，(ii)在高血糖條件下的升糖素抑制活性，(iii)延遲胃排空速率從而導致餐源性葡萄糖吸收遲緩。
GLP-1/升糖素(Glc)激動劑
Pocai等人(Obesity.2012；20：1566-1571；Diabetes 2009,58,2258)和Day等人(Nat Chem Biol 2009；5：749)描述了GLP-1和升糖素受體的雙重活化，例如，藉由使GLP-1和升糖素的功能組合於一個分子中導致具有抗糖尿病作用和明顯的體重降低效果的治療成分。
結合並活化升糖素和GLP-1受體兩者(Hjort等人Journal of Biological Chemistry,269,30121-30124,1994；Day JW等人，Nature Chem Biol,5：749-757,2009)並抑制體重增加且降低食物攝入的肽描述於專利申請WO 2008/071972、WO 2008/101017、WO 2009/155258、WO 2010/096052、WO 2010/096142、WO 2011/075393、WO 2008/152403、WO 2010/070251、WO 2010/070252、WO 2010/070253、WO 2010/070255、WO 2011/160630、WO 2011/006497、WO 2011/152181、WO 2011/152182、WO2011/117415、WO2011/117416和WO 2006/134340中，藉由引用的方式將其內容並入本申請。
此外，不僅活化GLP-1和升糖素受體，還活化GIP受體(胃抑制性多肽)的三重共激動劑肽描述於WO 2012/088116中並由VA Gault等人描述(Biochem Pharmacol,85,16655-16662,2013；Diabetologia,56,1417-1424,2013)。
Bloom等人(WO 2006/134340)揭露可將結合並活化升糖素和GLP-1受體兩者的肽構建成來自升糖素和毒蜥外泌肽-4的雜合分子，其中N-末端部分(例如殘基1-14或1-24)源自升糖素而C-末端部分(例如殘基15-39或25-39)源自毒蜥外泌肽-4。
Otzen等人(Biochemistry,45,14503-14512,2006)揭露N-和C-末端疏水性片段(patch)涉及升糖素的原纖維化(fibrillation)，這是由於潜在殘基的疏水性和/或高的β-片層傾向。
WO2014/056872披露了結合並活化升糖素和GLP-1受體兩者且衍生自毒蜥外泌肽-4的肽，其中至少在位置14的胺基酸帶有延長半衰期的側鏈。
本發明使用的肽為毒蜥外泌肽-4肽類似物，其包含位置10的亮胺酸和位置13的穀胺酸且描述於WO2015/086731、WO2015/086732、WO2015/086733中。
另一本發明使用的肽為毒蜥外泌肽-4肽類似物，其包含位置28的β-丙胺酸且描述於EP15305899.5中。
再一本發明使用的肽為毒蜥外泌肽-4肽類似物，其包含位置3的穀胺酸、位置28的β-丙胺酸及位置29和位置34的D-丙胺酸。
本發明使用的肽較佳不僅在中性pH可溶，而且在pH 4.5可溶。此外，在4.5至5的pH值的化學穩定性是長效前藥產品的一個重要標準。所述前藥較佳在該pH範圍配製，從而獲得在4℃至少6個月的貯存期(shelflife)。
長效GLP-1/升糖素激動劑
理想的情况下，所述肽以這樣的方式配製：在向人體施用後，在人中提供持續的血漿水平達至少一周，導致每周一次或更長的注射頻率。
使用長效GLP-1激動劑的當前療法是Bydureon®，其為呈儲庫(depot)懸浮液形式的毒蜥外泌肽-4，基於聚(二醇-共乳酸)使用23號針每周一次注射。
WO2012/173422描述了每周投予的與免疫球蛋白的Fc區域接合的GLP-1/升糖素激動劑，其中所述肽衍生自胃泌酸調節素(oxyntomodulin)。
載體連接的前藥
為了增强藥物的體內物理化學或藥物動力學性質，諸如其半衰期，此類藥物可與載體接合。如果該藥物暫時結合至載體和/或連接子，此類系統通常被指定為載體連接的前藥。根據IUPAC提供的定義(如在2009年7月 22日訪問的http：//www.chem.qmul.ac.uk/iupac.medchem所給出)，載體連接的前藥為含有給定活性物質與暫時載體基團的臨時連接的前藥，其可產生改善的物理化學或藥物動力學性質且通常經水解裂解可容易地在體內除去。
此類載體連接的前藥中使用的連接子可為暫時性，意味著它們在生理學條件(含水緩衝液pH 7.4,37℃)下為非酶性水解性可降解的(可裂解的)，其中半衰期範圍為例如一小時至三個月。合適的載體為聚合物且可直接或經由非裂解性間隔基(spacer)接合至連接子。
藉由無痕迹前藥連接子的暫時性聚合物偶聯結合了以下優點：由於聚合物連接而延長滯留時間，以及從聚合物接合物釋放後恢復天然肽的原始藥理學。
使用聚合物-連接子肽接合物，向患者施用後，天然不變的肽慢慢釋放，僅由連接子的釋放動力學和聚合物載體的藥物動力學所控制。理想的情况下，釋放動力學將獨立於體液中酶(如蛋白酶或酯酶)的存在，以保證一致且均勻的釋放模式。
WO2008/148839、WO2009/095479和WO2012/035139是指包含藥物連接子接合物的前藥，其中所述連接子經由可裂解的鍵連接至生物學活性部分，諸如GLP 1-激動劑毒蜥外泌肽-4。經過由環狀醯亞胺形成的環化-活化，所述生物學活性部分從前藥中釋放。釋放動力學獨立於pH值且是用於在4.5至5的pH值儲存前藥的最小值並在7.4至7.5左右的生理學pH到達其預期的釋放速率。描述了GLP-1激動劑-前藥，其中所述連接子基於L-丙胺酸且所述聚合物載體為基於PEG-賴胺酸的水凝膠。沒有描述雙重GLP-1/升糖素激動劑-前藥。
玻尿酸(HA)
Dhal等人(Journal of Biomedical Nanotechnology,vol 9,2013,1-13)報道了作為藥物接合物的合適載體的玻尿酸。Kong等人(Biomaterials 31(2010),4121-4128)報道了一種毒蜥外泌肽-4-玻尿酸接合物，其顯示在小鼠中持續3天的葡萄糖降低作用。所使用的HA為直鏈聚合物，其中藥物載量範圍為約2.4至12.%。
在本發明中，選擇交聯的玻尿酸的水凝膠，因為它們作為局部儲庫在施用部位比可溶性HA具有更長的滯留時間。
對於使用玻尿酸(HA)作為載體聚合物的重要標準是最終藥物產品中可達到的藥物載量，其由聚合物本身的藥物載量和最終溶液/懸浮液的濃度確定。事實上，皮下儲庫的注射體積實際上被限制到等於/小於1mL，較佳等於/小於0.6mL。
HA的聚合物溶液/懸浮液越濃，製劑的黏性越大，其對前體藥物製劑的可注射產生負面影響。黏性溶液需要更大直徑的注射針頭，以限制按壓注射器的柱塞上的力。另外，注射的時間更長。
本發明的一個目的是提供用於作為皮下儲庫投予的GLP-1/升糖素激動劑前藥，其歷經投予之間至少6天的時間段釋放呈活性形式的GLP-1/升糖素激動劑且可藉由26號針注射甚至為了良好的患者順應性藉由更小直徑的針頭注射。
本發明的一個目的是前藥或其醫藥上可接受之鹽，其包含式(I)的藥物連接子接合物Z-L1-L2-L-Y-R20 (I)
其中Y為具有式(II)的肽His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-Asp-Glu-Gln-X18-Ala-X20-X21-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-X28-Gly-Gly-Pro-X32-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (II)
X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自Arg和Lys的胺基酸殘基，X20代表選自Lys、Gln和His的胺基酸殘基，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表選自Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基，或者其中Y為具有式(III)的肽His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-Asp-Glu-Gln-X18-Ala-X20-X21-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-X28-Gly-Gly-Pro-X32-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (III)
X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自Leu和His的胺基酸殘基，X20代表選自His、Arg、Lys和Gln的胺基酸殘基，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表選自Lys、Ser和Ala的胺基酸殘基， X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基，或者其中Y為具有式(IV)的肽His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Leu-Leu-Asp-Glu-Gln-X18-Ala-Lys-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-X32-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (IV)
X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自Arg和Leu的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基，或其鹽或溶劑合物；或者其中Y為具有式(IVa)的肽H2N-His-Aib-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-X15-Glu-Gln-Leu-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Bal-X29-Gly-X31-X32-Ser-X34-X35-Pro-Pro-Pro-X39-R20 (IVa)
X15代表選自Asp和Glu(較佳Asp)的胺基酸殘基，X29代表選自Gly、D-Ala和Pro(較佳Gly、D-Ala)的胺基酸殘基，X31代表選自Pro、His和Trp(較佳Pro)的胺基酸殘基，X32代表選自Ser、His、Pro和Arg(較佳Ser、His、Pro)的胺基酸殘基， X34代表選自Gly和D-Ala的胺基酸殘基，X35代表選自Ala、Pro和Lys(較佳Ala、Pro)的胺基酸殘基，X39代表Ser或Pro-Pro-Pro，或其鹽或溶劑合物；或者其中Y為具有式(IVb)的肽H2N-His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Leu-Leu-Glu-Glu-Gln-Arg-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Bal-D-Ala-Gly-Pro-Pro-Ser-D-Ala-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-R20；或其鹽或溶劑合物；R20為OH或NH2；L為式(Ia)的連接子，
其中虛線指示藉由形成醯胺鍵與Y的N-末端的連接；X為C(R4R4a)；N(R4)；R1、R1a獨立地選自由下列組成之群組：H；和C1-4烷基；R2、R2a獨立地選自由下列組成之群組：H；和C1-4烷基；R4、R4a獨立地選自由下列組成之群組：H；和C1-4烷基；其中R2、R2a、R4或R4a取代有一個基團L2-L1-Z；其中L2為單一化學鍵或為C1-20烷基鏈，其視情况被一個或多個獨立地選自-O-和C(O)N(R3aa)的基團中斷且視情况取代有一個或多個獨立地選自OH和 C(O)N(R3aaR3aaa)的基團，其中R3aa和R3aaa獨立地選自由下列組成之群組：H和C1-4烷基；且L2經由選自由下列組成之群組的末端基團連接於L1 其中L2連接於以虛線指示的一個位置且L1連接於以另一虛線指示的位置；且L1為C1-20烷基鏈，其視情况被一個或多個獨立地選自-O-和C(O)N(R5aa)的基團中斷且視情况取代有一個或多個獨立地選自OH和C(O)N(R5aaR5aaa)的基團，其中R5aa和R5aaa獨立地選自由下列組成之群組：H和C1-4烷基；且L1經由末端胺基連接於Z，所述末端胺基與Z的玻尿酸的β-1,3-D-葡糖醛酸的羧基形成醯胺鍵；Z為交聯的玻尿酸水凝膠，其中0.05至20%的單體二糖單元藉由交聯劑交聯；且0.2至8.5%的單體二 糖單元帶有L1-L2-L-Y-R20基團。
本發明關於前藥，其提供歷經投予之間至少6天的時間段釋放呈活性形式的GLP-1/升糖素激動劑。
這有助於患者減少注射頻率，同時能够保持最優控制GLP-1/升糖素激動劑的血清水平和最終的血糖。
本發明的交聯玻尿酸載體的其它優點為藉由26號針頭或甚至更小內徑針頭的良好可注射性。
圖1a、圖1b、圖1c示出合成玻尿酸水凝膠的多種交聯化學。
圖2a. 在不同時間點採集的HA水凝膠在注射部位的磁共振(MR)圖像。
圖2b. 在不同時間點採集的含有1：1(w/w)HA水凝膠-800kDa水溶性HA的聚合物懸浮液在注射部位的磁共振(MR)圖像。
圖3. 每周投予的具有連接子的毒蜥外泌肽-4 Seq ID No.26雙重激動劑由HA水凝膠的體外釋放動力學(實例18)。半衰期為5天。
圖4. HA水凝膠-雙重激動劑(Seq ID No.26)接合物對db/db小鼠的非空腹血糖的體內效應：針對不同劑量，示出以mmol/L為單位的血糖的差異水平vs動物的治療時間。
圖4b. HA水凝膠-雙重激動劑(Seq ID No.26)接合物對db/db小鼠的非空腹血糖的體內效應：針對不同水凝膠構建物：可溶性和交聯的玻尿酸，示出以mmol/L為單位的血糖的差異水平vs動物的治療時間。
圖4c. HA水凝膠-雙重激動劑(Seq ID No.45、46和48)接合物對db/db小鼠的非空腹血糖的體內效應：示出以mmol/L為單位的血糖的水平vs動物 的治療時間。
圖4d. HA水凝膠-雙重激動劑(Seq ID No.49)接合物對db/db小鼠的非空腹血糖的體內效應：示出以mmol/L為單位的血糖的水平vs動物的治療時間。
圖5. 可注射性研究：對具有不同肽載量的HA水凝膠的注射器柱塞的擠壓力。
本發明的胺基酸序列含有天然存在的胺基酸的常規單字母和三字母代碼，以及其它胺基酸的普遍接受三字母代碼，諸如Aib(α-胺基異丁酸)。
此外，下列代碼用於下表中所示的胺基酸。
與連接子結合的GLP-1/升糖素激動劑被稱為“GLP-1/升糖素激動劑部分”。
“保護基”是指在合成過程中臨時保護分子的化學官能團，從而在隨後的化學反應中獲得化學選擇性的部分。醇的保護基為例如苄基和三苯甲基，胺的保護基為例如第三丁基氧基羰基、9-芴基甲基氧基羰基和苄基，且硫醇的保護基的實例為2,4,6-三甲氧基苄基、苯基硫基甲基、乙醯胺基甲基、對甲氧基苄基氧基羰基、第三丁基硫基、三苯基甲基、3-硝基-2-吡啶基硫基、4-甲基三苯甲基。
“經保護的官能團”意指由保護基保護的化學官能團。
“醯化劑”意指結構為R-(C=O)-的部分，其在醯化反應中提供醯基並任選與離去基團連接，諸如醯氯、N-羥基琥珀醯亞胺、五氟苯酚和對硝基苯酚。
“烷基”意指直鏈或支化碳鏈。烷基碳的每個氫可被取代基替代。
“芳基”是指衍生自單環芳族環、多環芳族環或稠合芳族環(包括雜環)的任意取代基，例如苯基、噻吩基、吲哚基、萘基、吡啶基，所述取代基可視情况被進一步取代。
“醯基”意指結構為R-(C=O)-的化學官能團，其中R為烷基或芳基。
"C1-4烷基"是指具有1-4個碳原子的烷基鏈，例如如果存在於分子末端，則所述烷基鏈為：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基，或者例如當兩個分子的部分經烷基連接時，所述烷基鏈為-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-、-C(CH3)2-。C1-4烷基碳的每個氫可被取代基替代。
"C1-6烷基"意指具有1-6個碳原子的烷基鏈，例如如果存在於分子末端，則所述烷基鏈為：C1-4烷基、甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、正己基，或者例如當兩個分子部分經烷基連接時，所述烷基鏈為-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-、-C(CH3)2-。C1-6烷基碳的每個氫可被取代基替代。
因此，“C1-18烷基”是指具有1至18個碳原子的烷基鏈且“C8-18烷基”意指具有8至18個碳原子的烷基鏈。因此，“C1-50烷基”意指具有1至50個碳原子的烷基鏈。
"鹵素"意指氟、氯、溴或碘。通常較佳的是，鹵素為氟或氯。
“玻尿酸”意指β-1,3-D-葡糖醛酸和β-1,4-N-乙醯基-D-葡糖胺及其相應鈉鹽組成的二糖的聚合物。這些聚合物是線性的。
“二糖單元”意指由β-1,3-D-葡糖醛酸和β-1,4-N-乙醯基-D-葡糖胺及其相應鈉鹽組成的二糖，且為HA的單體構造塊。
“交聯玻尿酸”意指“玻尿酸”的聚合物，其中HA的不同鏈可藉由交聯劑共價連接，形成3維聚合物網狀結構。交聯程度是指聚合物網狀結構中二糖單元與交聯劑單元的莫耳比。
“交聯的玻尿酸”可藉由不同方法衍生。HA與交聯劑的反應，經修飾的(活化的)HA與交聯劑的反應，兩種不同的經修飾的HA與交聯劑的反應。實例可描述於Oh等人，Journal of Controlled Release 141(2010),2-12中。實例11描述了未經修飾的HA與二乙烯基碸的交聯。用於製備交聯的HA的其它方法還描繪於圖1a、圖1b和圖1c中：醛(二醇氧化)和後續的胺還原胺化，羥基介導的烷基化，醯胺形成反應，Michael加成交聯(硫基-馬來醯亞胺)，二醇-環氧化物化學等。
“交聯劑”可為線性或支化分子或化學基團，較佳為在每個遠端具有至少化學官能團的線性分子。
“官能化玻尿酸”意指其中HA被基團L1化學修飾的“玻尿酸”的聚合物，該基團L1在其遠端帶有化學官能團。官能化的程度是指聚合物中二糖單元與L1單元的莫耳比。
術語“化學官能團”是指但不限於羧酸及活化衍生物、胺基、馬來醯亞胺、巰基和衍生物、磺酸和衍生物、碳酸酯和衍生物、胺基甲酸酯和衍生物、羥基、醛、酮、肼、異氰酸酯、異硫氰酸酯、磷酸和衍生物、膦酸和衍生物、鹵代乙醯基、烷基鹵化物、丙烯醯基和其它α-β不飽和michael受體、芳基化劑如芳基氟化物、羥基胺、二硫化物如吡啶基二硫化物、乙烯基碸、乙烯基酮、重氮烷、重氮乙醯基化合物、環氧乙烷和氮丙啶。
如果化學官能團與另一種化學官能團偶聯，所得的化學結構被稱作“連接(linkage)”。例如，胺基與羧基反應得到醯胺連接。
“反應性官能團”為骨架部分的化學官能團，其與高度支化部分連接。
“官能團”為用於“反應性官能團”、“可降解的互連官能團(degradable interconnected functional group)”或“接合物官能團”的總稱。
術語“阻隔基團(blocking group)”或“封端基團(capping group)”同義使用並且是指與反應性官能團不可逆連接從而使它們不能與例如化學官能團反應的部分。
術語“保護基”或“保護基團”是指與反應性官能團可逆性連接從而使它們在特定條件下不能與例如其它化學官能團反應的部分。
術語“衍生物”是指適當取代有保護基和/或活化基團的化學官能團或是指本領域技術人員已知的相應化學官能團的活化形式。例如，羧基的活化形式包括但不限於活性酯，諸如琥珀醯亞胺基酯、苯並三唑基酯(benzotriazyl ester)、硝基苯基酯、五氟苯基酯、氮雜苯並三唑基酯、醯基鹵化物、混合或對稱酸酐、醯基咪唑。
術語“非酶可斷裂的連接子”是指在無酶活性的生理學條件下水解可斷裂的連接子。
術語“間隔基”、“間隔基團”、“間隔基分子”和“間隔基部分”可互換使 用，並且如果是用於描述存在於本發明水凝膠載體中的一部分，其是指適於連接兩個部分的任意部分，諸如C1-50烷基，該片段任選被一個或多個選自以下的基團中斷：-NH-、-N(C1-4烷基)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)N(C1-4烷基)-、-O-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-。
術語“終端(terminal)”、“末端(terminus)”或“遠端(distal end)”是指官能團或連接子在分子或部分內的位置，其中所述官能團可為化學官能團，所述連接可為可降解的或永久性連接，其特徵在於位於兩個部分之間的連接子的附近或位於兩個部分之間的連接子內，或者位於寡聚物鏈或多聚物鏈的端部。
短語“結合形式(in bound form)”或“部分”是指為大分子的部分的亞結構。短語“結合形式”用於藉由命名或列舉本領域公知的試劑、起始物質或假定的起始物質簡化對部分的提及，並且藉由“結合形式”是指在試劑或起始物質中存在的例如一個或多個氫基(-H)或一個或多個活化基團或保護基不存在於所述部分中。
應當理解的是，包含聚合部分的所有試劑和部分是指已知就分子量、鏈長或聚合度或官能團的數目而言展現出變化性的大分子實體。因此，針對交聯試劑和交聯部分所顯示的結構僅為代表性實例。
試劑或部分可為線性或支化的。如果所述試劑或部分具有兩個末端基團，則其被稱為線性試劑或部分。如果所述試劑或部分具有多於兩個的末端基團，則認為其是支化的或多官能試劑或部分。
此類載體連接的前藥中使用的連接子是暫時性的，意味著它們在生理學條件(含水緩衝液pH 7.4,37℃)下為非酶性水解性可降解的(可裂解的)，其中半衰期範圍為例如一小時至三個月。
術語“GLP-1/升糖素激動劑水凝膠前藥”是指載體連接的GLP-1/升糖 素激動劑的前藥，其中所述載體為水凝膠。術語“水凝膠前藥”和“水凝膠連接的前藥”是指暫時性連接至水凝膠的生物學活性劑的前藥且可同義使用。
“水凝膠”可被定義為能够吸收大量水的三維、親水性或兩親性聚合網狀結構。所述網狀結構由均聚物或共聚物構成，並且由於存在共價化學交聯或物理(離子性、疏水性相互作用、纏結(entanglement))交聯而為不溶性的。所述交聯提供網狀結構和物理完整性。水凝膠表現出與水的熱力學相容性，這使它們在水性介質中溶脹。所述網狀結構的鏈按存在孔隙的方式連接，並且這些孔隙中的大部分的尺寸在1nm至1000nm之間。
藥物的“游離形式”是指所述未經修飾的藥理學活性形式的藥物，特別是GLP-1/升糖素激動劑，諸如從聚合物接合物中釋放之後。
術語"藥物"、"生物活性分子"、"生物活性部分"、"生物活性劑"、"活性劑"同義地使用且是指GLP-1/升糖素激動劑，呈其結合形式或游離形式。
本申請使用的GLP-1/升糖素激動劑的"治療有效量"是指足以治愈、緩解或部分阻止給定疾病及其並發症臨床表現的量。將足以完成該目標的量定義為"治療有效量"。用於每種目的的有效量依賴於疾病或損害的嚴重程度以及受試者的體重和一般狀態。應當理解的是，可藉由以下方式使用常規實驗確定合適劑量：構建數值矩陣(matrix of value)並測試所述矩陣中的不同點，該方式在訓練有素的醫師所掌握的常規技術範圍之內。
“穩定的”和“穩定性”意指在所指示的儲存時間內，所述水凝膠接合物保持為接合的，且不會很大程度水解並且展現出可接受的與GLP-1/升糖素激動劑有關的雜質分布。含有小於5%游離形式藥物的組合物被認為是穩定的。
術語“醫藥上可接受之”意指經管理機構諸如EMEA(歐洲)和/或FDA(美國)和/或任何其它國家管理機構批准，在動物較佳人中使用。
"醫藥組合物"或“組合物”意指一種或多種活性成分和一種或多種惰性成分以及由以下方式直接或間接得到的任意產物：所述成分中的任意兩種或多種的組合(combination)、複合(complexation)或聚集(aggregation)；所述成分中的一種或多種的解離(dissociation)；或所述成分中的一種或多種的其它類型的反應或相互作用。因此，本發明的醫藥組合物涵蓋藉由本發明化合物與醫藥上可接受之賦形劑(醫藥上可接受之載體)混合製備的任意組合物。
“乾燥組合物(dry composition)”意指以置於容器中的乾燥形式提供的GLP-1/升糖素激動劑水凝膠前藥組合物。用於乾燥的適當方法為例如噴霧乾燥和凍乾(冷凍乾燥)。GLP-1/升糖素激動劑水凝膠前藥的此類乾燥組合物具有最高10%的殘餘含水量，較佳小於5%和更較佳小於2%(根據Karl Fischer法確定)。較佳的乾燥方法為凍乾。“凍乾的組合物”意指先將GLP-1/升糖素激動劑水凝膠聚合物前藥組合物冷凍，隨後借助於減壓使其經歷水減少(water reduction)。該術語並不排除在將所述組合物填裝在最終容器之前在製備過程中發生的額外乾燥步驟。
“凍乾”(冷凍乾燥)為脫水過程，特徵為使組合物冷凍，然後降低環境壓力，並且任選加熱以使所述組合物中的冷凍水直接從固相昇華為氣體。通常，藉由去昇華收集昇華的水。
“重構(Reconstitution)”意指向乾燥組合物中加入液體以使其恢復至液體或懸浮液組合物的形式。應當理解的是，術語“重構”不限於加入水，而是指加入任何液體，包括例如緩衝液或其它水溶液。
“重構溶液”是指用於在投予至有此需要的患者之前用於重構GLP-1/升 糖素激動劑水凝膠前藥的乾燥組合物的液體。
“容器”意指其中包含GLP-1/升糖素激動劑水凝膠前藥組合物並可在重構前一直儲存的任意容器。
“緩衝物(Buffer)”或“緩衝劑(buffering agent)”是指將pH保持在所期望範圍內的化合物。生理學耐受的緩衝物為例如磷酸鈉、琥珀酸鹽、組胺酸、碳酸氫鹽、枸櫞酸鹽和乙酸鹽、丙酮酸鹽。也可使用抗酸劑(Antacid)諸如Mg(OH)2或ZnCO3。可調整緩衝能力以與對pH穩定性最敏感的條件相匹配。
“賦形劑”是指與治療劑一起投予的化合物，例如緩衝劑、等滲調節劑、防腐劑、穩定劑、抗吸附劑、氧化保護劑或其它助劑。然而，在一些情况下，一種賦形劑可具有雙重或三重功能。
"凍乾保護劑(lypprotectant)"為當與感興趣的蛋白結合時顯著預防或降低所述蛋白經一般乾燥時並且尤其是在凍乾和隨後的儲存過程中的化學和/或物理不穩定性的分子。示例性凍乾保護劑包括糖，諸如蔗糖或海藻糖；胺基酸，諸如精胺酸、甘胺酸、穀胺酸或組胺酸；甲基胺，諸如甜菜碱；易溶性鹽(lyotropic salt)，諸如硫酸鎂；多元醇，諸如三元或更高級的糖醇，例如甘油(glycerin)、赤蘚醇、丙三醇(glycerol)、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇；乙二醇；丙二醇；聚乙二醇；普流羅尼類(pluronics)；羥基烷基澱粉，諸如羥基乙基澱粉(HES)和它們的組合。
“表面活性劑”是指降低液體的表面張力的潤濕劑。
“等滲調節劑”是指使疼痛最小化的化合物，所述疼痛是由注射儲庫的滲透壓差導致的細胞損傷引起的。
術語“穩定劑”是指用於穩定聚合物前藥的化合物。藉由以下方式實現穩定作用：增强蛋白穩定力、使變性狀態脫穩定化或賦形劑與所述蛋白直 接結合。
“抗吸附劑”是指用於塗覆或競爭性吸附在組合物容器的內表面的主要為離子性或非離子性的表面活性劑或其它蛋白或可溶性聚合物。所選擇的賦形劑濃度和類型取决於待避免的作用，但通常在恰高於CMC值的界面形成一單層表面活性劑。
“氧化保護劑”是指抗氧化劑諸如抗壞血酸、四氫甲基嘧啶羧酸(ectoine)、谷胱甘肽、甲硫胺酸、單硫代丙三醇、桑色素(morin)、聚乙烯亞胺(PEI)、沒食子酸丙酯、維生素E、螯合劑諸如枸櫞酸、EDTA、六磷酸鹽、巰基乙酸。
“抗菌劑”是指殺死或抑制微生物生長和/或摧毀病毒的化學物質，該微生物為諸如細菌、真菌、酵母菌、原生動物。
“將容器密封”意指將所述容器按使其密閉、不允許內外氣體交換和保持內容物無菌的方式封閉。
術語“試劑”或“前體”是指在得到本發明前藥的組裝過程(assembly process)中使用的中間體或起始物質。
本發明的一個目的為前藥或其醫藥上可接受之鹽，其包含式(I)的藥物連接子接合物Z-L1-L2-L-Y-R20 (I)
其中Y為具有式(II)的肽His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-Asp-Glu-Gln-X18-Ala-X20-X21-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-X28-Gly-Gly-Pro-X32-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (II)
X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自Arg和Lys的胺基酸殘基，X20代表選自Lys、Gln和His的胺基酸殘基，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表選自Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基，或者其中Y為具有式(III)的肽His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-Asp-Glu-Gln-X18-Ala-X20-X21-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-X28-Gly-Gly-Pro-X32-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (III)
X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自Leu和His的胺基酸殘基，X20代表選自His、Arg、Lys和Gln的胺基酸殘基，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表選自Lys、Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基，或者其中Y為具有式(IV)的肽 His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Leu-Leu-Asp-Glu-Gln-X18-Ala-Lys-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-X32-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (IV)
X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自Arg和Leu的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基，或其鹽或溶劑合物；或其鹽或溶劑合物；R20為OH或NH2；L為式(Ia)的連接子，
其中虛線指示藉由形成醯胺鍵與Y的N-末端的連接；X為C(R4R4a)；N(R4)；R1、R1a獨立地選自由下列組成之群組：H；和C1-4烷基；R2、R2a獨立地選自由下列組成之群組：H；和C1-4烷基；R4、R4a獨立地選自由下列組成之群組：H；和C1-4烷基；其中R2、R2a、R4或R4a取代有一個基團L2-L1-Z；其中L2為單一化學鍵或為C1-20烷基鏈，其視情况被一個或多個獨立地選自-O-和C(O)N(R3aa)的基團中斷且視情况取代有一個或多個獨立地選自OH和C(O)N(R3aaR3aaa)的基團，其中R3aa和R3aaa獨立地選自由下列組成之群組：H 和C1-4烷基；且L2經由選自由下列組成之群組的末端基團連接於L1 其中L2連接於以虛線指示的一個位置且L1連接於以另一虛線指示的位置；且L1為C1-20烷基鏈，其視情况被一個或多個獨立地選自-O-和C(O)N(R5aa)的基團中斷且視情况經一個或多個獨立地選自OH和C(O)N(R5aaR5aaa)的基團取代，其中R5aa和R5aaa獨立地選自由下列組成之群組：H和C1-4烷基；且L1經由末端胺基連接於Z，該末端胺基與Z的玻尿酸的β-1,3-D-葡糖醛酸的羧基形成醯胺鍵；Z為交聯的玻尿酸水凝膠，其中0.05至20%的單體二糖單元藉由交聯劑交聯；且0.2至8.5%的單體二糖單元帶有L1-L2-L-Y-R20基團。
L、L1、L2、Z和Y的其它具體實例。
在另一具體實例中L為式(Ib)的連接子部分， 其中虛線指示藉由形成醯胺鍵與Y的連接；R1、R1a、R2a獨立地選自由下列組成之群組：H和C1-4烷基；L2-L1-Z如上文所定義。
在另一具體實例中L為式(Ib)的連接子部分，其中R1為CH3；R1a為H；R2a為H；且L2-L1-Z如上文所定義。
在另一具體實例中L為式(Ib)的連接子部分，其中R1為H； R1a為CH3；R2a為H；且L2-L1-Z如上文所定義。
在另一具體實例中L為式(Ib)的連接子部分，其中R1為CH3；R1a為CH3；R2a為H；且L2-L1-Z如上文所定義。
在另一具體實例中L為式(Ic)的連接子部分-L，
其中虛線指示藉由形成醯胺鍵與Y的連接；R1選自H或C1-4烷基，較佳H；R1a選自H或C1-4烷基，較佳H；R2、R2a獨立地選自由下列組成之群組：H和C1-4烷基；其中L2-L1-Z如上文所定義。
在另一具體實例中L為式(Ic)的連接子部分-L，
其中虛線指示藉由形成醯胺鍵與Y的連接；R1和R1a為H；R2、R2a獨立地選自由下列組成之群組：H和CH3；其中L2-L1-Z如上文所定義。
在另一具體實例中L為式(Ic)的連接子部分-L，其中R1和R1a為H；R2為H和R2a為CH3；其中L2-L1-Z如上文所定義。
在另一具體實例中L2為C1-10烷基鏈，其視情况被一個或兩個獨立選自-O-和C(O)N(R3aa)的基團中斷，且其中R3aa獨立地選自由下列組成之群組：H和C1-4烷基；且L2經由選自由下列組成之群組的末端基團連接於L1 其中L2連接於以虛線指示的一個位置且L1連接於以另一虛線指示的位置；且在另一具體實例中L2為C1-6烷基鏈，其視情况被一個選自-O-和C(O)N(R3aa)的基團中斷，且其中R3aa獨立地選自由下列組成之群組：H和C1-4烷基；且L2經由選自由下列組成之群組的末端基團連接於L1 其中L2連接於以虛線指示的一個位置且L1連接於以另一虛線指示的位置。
在另一具體實例中L2為-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)NH- or -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-且經由末端基團連接於L1 其中L2連接於以虛線指示的硫原子且L1連接於以虛線指示的氮原子。
在另一具體實例中L1為C1-10烷基鏈，其中一個胺基位於一側遠端，其視情况被一個或兩個獨立選自-O-和C(O)N(R5aa)的基團中斷，且其中R5aa獨立地選自由下列組成之群組：H和C1-4烷基。
進一步的具體實例關於前藥，其中Z為交聯的玻尿酸水凝膠，其中0.05至15%的單體二糖單元藉由交聯劑交聯。
進一步的具體實例關於前藥，其中Z為交聯的玻尿酸水凝膠，其中1至10%的單體二糖單元藉由交聯劑交聯。
進一步的具體實例關於前藥，其中Z為交聯的玻尿酸水凝膠，其中0.2至8.5%的單體二糖單元帶有L1-L2-L-Y-R20基團。
進一步的具體實例關於前藥，其中 Z為交聯的玻尿酸水凝膠，其中0.2至6%的單體二糖單元帶有L1-L2-L-Y-R20基團。
進一步的具體實例關於前藥，其中Z為交聯的玻尿酸水凝膠，其中0.2至5%的單體二糖單元帶有L1-L2-L-Y-R20基團。
進一步的具體實例關於前藥，其中Z為交聯的玻尿酸水凝膠，其中0.4至4%的單體二糖單元帶有L1-L2-L-Y-R20基團。
在另一具體實例中，所述GLP-1/升糖素激動劑前藥具有由式(V)所代表的結構
在另一具體實例中，所述GLP-1/升糖素激動劑前藥具有由式(VI)所代表的結構(Aib-連接子)
在另一具體實例中，所述GLP-1/升糖素激動劑前藥具有由式(VI)所代表的結構
進一步的具體實例關於具有式(II)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表Arg X20代表選自Lys、Gln和His的胺基酸殘基，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表選自Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
進一步的具體實例關於具有式(II)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表D-Ser X3代表His，X18代表Arg X20代表Lys，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基， X28代表選自Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
進一步的具體實例關於具有式(II)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表D-Ser，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表Arg，X20代表Lys，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表Ala，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
進一步的具體實例關於具有式(II)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表His，X18代表Arg，X20代表Lys，X21代表Asp，X28代表Ala，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
進一步的具體實例關於具有式(II)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基， X18代表選自Arg和Lys的胺基酸殘基，X20代表Lys，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表選自Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
進一步的具體實例關於具有式(II)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自Arg和Lys的胺基酸，X20代表選自的胺基酸殘基Lys、Gln和His，X21代表Asp，X28代表選自Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
進一步的具體實例關於具有式(II)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自Arg和Lys的胺基酸，X20代表選自Lys、Gln和His的胺基酸殘基，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表選自Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表Ser。
進一步的具體實例關於具有式(II)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表Arg X20代表Lys，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表Ala，X32代表Val。
進一步的具體實例關於具有式(III)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表Leu X20代表選自His、Arg、Lys和Gln的胺基酸殘基，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表選自Lys、Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
進一步的具體實例關於具有式(III)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表Aib，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自His和Leu的胺基酸殘基；X20代表選自His、Arg、Lys和Gln的胺基酸殘基，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基， X28代表選自Lys、Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
進一步的具體實例關於具有式(III)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表Aib，X3代表His，X18代表Leu，X20代表Lys，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表選自Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
進一步的具體實例關於具有式(III)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表His，X18代表選自His和Leu的胺基酸殘基，X20代表選自His、Arg、Lys和Gln的胺基酸殘基，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表選自Lys、Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
進一步的具體實例關於具有式(III)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表Gln， X18代表Leu，X20代表Lys，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表Ala，X32代表Ser。
進一步的具體實例關於具有式(III)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自His和Leu的胺基酸殘基，X20代表Lys，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表選自Lys、Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
進一步的具體實例關於具有式(III)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自His和Leu的胺基酸殘基，X20代表選自His、Arg、Lys和Gln的胺基酸殘基，X21代表Asp，X28代表選自Lys、Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
進一步的具體實例關於具有式(III)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表Aib，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表Leu，X20代表選自Lys和Gln的胺基酸殘基，X21代表Glu，X28代表Ala，X32代表Ser。
進一步的具體實例關於具有式(III)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自His和Leu的胺基酸殘基，X20代表選自His、Arg、Lys和Gln的胺基酸殘基，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表Ala，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
進一步的具體實例關於具有式(III)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自His和Leu的胺基酸殘基，X20代表選自His、Arg、Lys和Gln的胺基酸殘基，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基， X28代表選自Lys、Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
進一步的具體實例關於具有式(II)或(III)的肽部分Y的一組前藥，其中X2代表選自Aib和D-Ser的胺基酸殘基，X3代表His，X18代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表選自Leu和Arg的胺基酸殘基，X20代表Lys，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表選自Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
進一步的具體實例關於具有式(IV)的肽部分的一組前藥，其中X2代表D-Ser，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自Arg和Leu的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
進一步的具體實例關於具有式(IV)的肽部分的一組前藥，其中X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表His，X18代表選自Arg和Leu特別是Leu的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
進一步的具體實例關於具有式(IV)的肽部分的一組前藥，其中X2代表D-Ser，X3代表Gln，X18代表Arg，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
進一步的具體實例關於具有式(IV)的肽部分的一組前藥，其中X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自Arg和Leu的胺基酸殘基，X32代表Ser。
進一步的具體實例關於具有式(IVa)的肽部分的一組前藥H2N-His-Aib-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-X15-Glu-Gln-Leu-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Bal-X29-Gly-X31-X32-Ser-X34-X35-Pro-Pro-Pro-X39-R20 (IVa)
其中X15代表選自Asp和Glu(較佳Asp)的胺基酸殘基，X29代表選自Gly、D-Ala和Pro(較佳Gly、D-Ala)的胺基酸殘基，X31代表選自Pro、His和Trp(較佳Pro)的胺基酸殘基，X32代表選自Ser、His、Pro和Arg(較佳Ser、His、Pro)的胺基酸殘基， X34代表選自Gly和D-Ala的胺基酸殘基，X35代表選自Ala、Pro和Lys(較佳Ala、Pro)的胺基酸殘基，X39代表Ser或Pro-Pro-Pro，或其鹽或溶劑合物。
進一步的具體實例關於具有式(IVa)的肽部分的一組前藥，其中X15代表Asp，X29代表選自Gly、D-Ala和Pro的胺基酸殘基，X31代表選自Pro、His和Trp的胺基酸殘基，X32代表選自Ser、His、Pro和Arg的胺基酸殘基，X34代表選自Gly和D-Ala的胺基酸殘基，X35代表選自Ala、Pro和Lys的胺基酸殘基，X39代表Ser。
進一步的具體實例關於具有式(IVa)的肽部分的一組前藥，其中X15代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X29代表Gly，X31代表選自Pro、His和Trp的胺基酸殘基，X32代表選自Ser、His、Pro和Arg的胺基酸殘基，X34代表選自Gly和D-Ala的胺基酸殘基，X35代表選自Ala、Pro和Lys的胺基酸殘基，X39代表Ser或Pro-Pro-Pro。
進一步的具體實例關於具有式(IVa)的肽部分的一組前藥，其中 X15代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X29代表Gly，X31代表Pro，X32代表選自Ser、His和Pro的胺基酸殘基，X34代表Gly，X35代表Ala，X39代表Ser。
進一步的具體實例關於具有式(IVa)的肽部分的一組前藥，其中X15代表Asp，X29代表D-Ala，X31代表Pro，X32代表Pro，X34代表D-Ala，X35代表選自Ala和Pro的胺基酸殘基，X39代表Ser或Pro-Pro-Pro。
進一步的具體實例關於具有式(IVa)的肽部分的一組前藥，其中X15代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X29代表選自Gly、D-Ala和Pro的胺基酸殘基，X31代表Pro，X32代表選自Ser、His、Pro和Arg的胺基酸殘基，X34代表選自Gly和D-Ala的胺基酸殘基，X35代表選自Ala、Pro和Lys的胺基酸殘基， X39代表Ser或Pro-Pro-Pro。
進一步的具體實例關於具有式(IVa)的肽部分的一組前藥，其中X15代表Asp，X29代表Gly，X31代表His，X32代表Pro，X34代表Gly，X35代表選自Ala和Lys的胺基酸殘基，X39代表Ser。
進一步的具體實例關於具有式(IVa)的肽部分的一組前藥，其中X15代表Asp，X29代表選自Gly和Pro的胺基酸殘基，X31代表Pro，X32代表Ser，X34代表Gly，X35代表Ala，X39代表Ser。
進一步的具體實例關於具有式(IVa)的肽部分的一組前藥，其中X15代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X29代表選自Gly、D-Ala和Pro的胺基酸殘基，X31代表選自Pro、His和Trp的胺基酸殘基， X32代表Pro，X34代表選自Gly和D-Ala的胺基酸殘基，X35代表選自Ala、Pro和Lys的胺基酸殘基，X39代表Ser或Pro-Pro-Pro。
進一步的具體實例關於具有式(IVa)的肽部分的一組前藥，其中X15代表Asp，X29代表選自Gly和Pro的胺基酸殘基，X31代表Pro，X32代表His，X34代表Gly，X35代表Ala，X39代表Ser。
進一步的具體實例關於具有式(IVa)的肽部分的一組前藥，其中X15代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X29代表選自Gly、D-Ala和Pro的胺基酸殘基，X31代表選自Pro、His和Trp的胺基酸殘基，X32代表選自Ser、His、Pro和Arg的胺基酸殘基，X34代表Gly，X35代表選自Ala、Pro和Lys的胺基酸殘基，X39代表Ser或Pro-Pro-Pro。
進一步的具體實例關於具有式(IVa)的肽部分的一組前藥，其中 X15代表Asp，X29代表D-Ala，X31代表Pro，X32代表選自Ser和Pro的胺基酸殘基，X34代表D-Ala，X35代表選自Ala和Pro的胺基酸殘基，X39代表Ser或Pro-Pro-Pro。
進一步的具體實例關於具有式(IVa)的肽部分的一組前藥，其中X15代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X29代表選自Gly、D-Ala和Pro的胺基酸殘基，X31代表選自Pro、His和Trp的胺基酸殘基，X32代表選自Ser、His、Pro和Arg的胺基酸殘基，X34代表選自Gly和D-Ala的胺基酸殘基，X35代表Ala，X39代表Ser。
進一步的具體實例關於具有式(IVa)的肽部分的一組前藥，其中X15代表Asp，X29代表Gly，X31代表選自Pro和His的胺基酸殘基，X32代表Pro，X34代表Gly，X35代表Lys, X39代表Ser。
進一步的具體實例關於具有式(IVa)的肽部分的一組前藥，其中X15代表Asp，X29代表選自Gly和D-Ala的胺基酸殘基，X31代表Pro，X32代表Pro，X34代表選自Gly和D-Ala的胺基酸殘基，X35代表Pro，X39代表Pro-Pro-Pro。
進一步的具體實例關於具有式(IVa)的肽部分的一組前藥，其中X15代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X29代表選自Gly、D-Ala和Pro的胺基酸殘基，X31代表選自Pro、His和Trp的胺基酸殘基，X32代表選自Ser、His、Pro和Arg的胺基酸殘基，X34代表選自Gly和D-Ala的胺基酸殘基，X35代表選自Ala、Pro和Lys的胺基酸殘基，X39代表Ser。
在一個具體實例中，Y是指具有Seq.ID No 60的GLP-1/升糖素激動劑。
在一個具體實例中，Y是指選自序列Seq.ID No 4至60的GLP-1/升糖素激動劑。
在一個具體實例中，Y是指選自序列Seq.ID No 4至44的GLP-1/升糖素激動劑。
在一個具體實例中，Y是指選自序列Seq.ID No 4至22的GLP-1/升糖素激動劑。
在一個具體實例中，Y是指選自序列Seq.ID No 23至39的GLP-1/升糖素激動劑。
在一個具體實例中，Y是指選自序列Seq.ID No 40至44的GLP-1/升糖素激動劑。
在一個具體實例中，Y是指選自序列Seq.ID No 45至59的GLP-1/升糖素激動劑。
在一個具體實例中，Y是指選自序列Seq.ID No 18、21和26的GLP-1/升糖素激動劑。
在一個具體實例中，Y是指選自序列Seq.ID No 18、21、26、45、48、49和60的GLP-1/升糖素激動劑。
在包含式(I)化合物的GLP-1/升糖素激動劑前藥含有一個或多個酸性或鹼性基團的情况下，本發明還包括它們相應的藥學上或毒理學上可接受的鹽，特別是它們的藥學上可利用的鹽。因此，包含含有酸性基團的式(I)化合物的GLP-1/升糖素激動劑前藥可根據本發明使用，例如，作為鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽或作為銨鹽。此類鹽的更準確的實例包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽或者與氨或有機胺(諸如，乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或胺基酸)的鹽。包含含有一個或多個鹼性基團(即可被質子化的基團)的GLP-1/升糖素激動劑前藥可存在，並且可根據本發明以它們與無機酸或有機酸的加成鹽形式使用。合適的酸的實例包括氯化氫、溴化氫、磷酸、硫酸、硝酸、甲 磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸、草酸、乙酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、苯甲酸、甲酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富馬酸、馬來酸、蘋果酸、胺基磺酸、苯基丙酸、葡糖酸、抗壞血酸、異烟酸、枸櫞酸、己二酸，和本領域技術人員公知的其它酸。如果包含式(I)化合物的GLP-1/升糖素激動劑前藥在分子中同時含有酸性和鹼性基團，除了所提到的鹽形式，本發明還包括內鹽或內銨鹽(兩性離子)。包含式(I)的GLP-1/升糖素激動劑前藥的相應的鹽可藉由本領域技術人員公知的常規方法獲得，例如藉由使它們與有機酸或無機酸或者有機碱或無機碱在溶劑或分散劑中接觸，或者藉由與其它鹽進行陰離子交換或陽離子交換。本發明還包括包含式(I)化合物的GLP-1/升糖素激動劑前藥的所有鹽，其由於低的生理相容性，不直接適用於藥物的用途，但它可用作例如用於化學反應的中間體或用於醫藥上可接受之鹽的製備。
製備方法
所述肽Y可由本領域已知的簡便方法製備。
連接子L藉由實例中所述以及如WO2009/095479、WO2011/012718和WO2012/035139中所揭露的方法製備。
本發明的水凝膠-連接的GLP-1/升糖素激動劑前藥可藉由合成構造塊活化的玻尿酸水凝膠Z-L1*和活化的肽連接子接合物L2*-L-Y製備。
活化的基團L1*和L2*可用於使肽接合至聚合物。
流程1示出不同類型的連接化學，其可用於使具有自降解(self-immolative)連接子的肽與聚合物接合。因此，除了巰基-馬來醯亞胺化學之外，可使用其它雙正交化學。在流程1中，虛線指示其中L1和L2連接的位置。
在將GLP-1/升糖素激動劑-連接子接合物裝載至官能化玻尿酸水凝膠之後，所有剩餘官能團視情况用合適的阻隔試劑封端以免受不期望的副反應。
在含官能化馬來醯亞胺基團的HA-水凝膠條件下，含巰基的化合物諸如巰基乙醇是合適的阻隔基團。
流程1
本發明的另一態樣是包含GLP-1/升糖素激動劑-連接子接合物L2*-L-Y的官能化中間體。
GLP-1/升糖素激動劑-連接子接合物L2*-L-Y的一個具體實例包含巰基官能化，得到下式HS-L2-L-Y
其中L2、L和Y具有上文所述的含義。
巰基官能化的GLP-1/升糖素激動劑-連接子接合物L2*-L-Y的一個具體實例是式(VIII)的GLP-1/升糖素激動劑-連接子接合物
巰基官能化的GLP-1/升糖素激動劑-連接子接合物L2*-L-Y的一個具體實例是式(IX)的GLP-1/升糖素激動劑-連接子接合物
巰基官能化的GLP-1/升糖素激動劑-連接子接合物L2*-L-Y的一個具體實例是式(X)的GLP-1/升糖素激動劑-連接子接合物
醫藥組合物
本發明的另一態樣是一種醫藥組合物，其包含本發明的前藥或其醫藥上可接受之鹽以及醫藥上可接受之賦形劑的。所述醫藥組合物在以下段落中進一步描述。
GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的組合物可以懸浮液組合物或以乾燥組合物的形式提供。在一個具體實例中，GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的醫藥組合物為乾燥組合物。合適的乾燥方法為例如噴霧乾燥和凍乾(冷凍乾燥)。較佳地，GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的醫藥組合物藉由凍乾法乾燥。
在另一具體實例中GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的醫藥組合物準備使用懸浮液。
在另一具體實例中GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的醫藥組合物準備使用懸浮液，其中所述前藥在水/緩衝液中膨脹至濃度為0.5至8%(w/v)。
在另一具體實例中GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的醫藥組合物準備使用懸浮液其中所述前藥在水/緩衝液中膨脹至濃度為1至4%(w/v)。
在另一具體實例中GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的醫藥組合物準備使用懸浮液其中所述前藥在水/緩衝液中膨脹至濃度為1.5至3%(w/v)。
較佳地，所述GLP-1/升糖素激動劑水凝膠前藥在組合物中足量投予以在一次施用中提供至少三天的治療有效量的GLP-1/升糖素激動劑。更佳地，GLP-1/升糖素激動劑水凝膠前藥的一次施用在一周內是足量的。
本發明的GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的醫藥組合物含有一種或多種賦形劑。
在腸胃外組合物中使用的賦形劑可分為如下幾類：緩衝劑、等滲調節劑、防腐劑、穩定劑、抗吸附劑、氧化保護劑、增黏劑/黏度增强劑，或 其它輔助劑。在一些情况下，這些成分可具有雙重或三重功能。本發明的GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的組合物含有一種或多種賦形劑，其選自：
(i)緩衝劑：保持pH在理想範圍內的生理學耐受緩衝劑，諸如磷酸鈉、碳酸氫鈉、琥珀酸鈉、組胺酸鈉、枸櫞酸鈉和乙酸鈉、硫酸鈉、硝酸鈉、氯化鈉、丙酮酸鈉。也可使用抗酸劑諸如Mg(OH)2或ZnCO3。可調節緩衝能力以符合對pH穩定性最敏感的條件。
(ii)等滲調節劑：最小化可由細胞損傷導致的疼痛的化合物，所述細胞損傷由於在注射儲庫的滲透壓差異所導致。實例為甘油和氯化鈉。有效濃度可藉由使用對於血清為285-315mOsmol/kg的假定克分子滲透壓重量濃度(osmolality)進行滲透壓力測定法來確定。
(iii)防腐劑和/或抗菌劑：多劑量腸胃外製劑需要加入以最小化患者在注射後變為受感染的風險的足量濃度的防腐劑，且已經建立了相應的法規需要量。典型的防腐劑包括間甲酚、苯酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、氯丁醇、苄醇、苯基硝酸汞、硫柳汞、山梨酸、山梨酸鉀、苯甲酸、氯甲酚和苯扎氯銨。
(iv)穩定劑：穩定作用藉由加强蛋白質穩定力、變性狀態的去穩定化或賦形劑與蛋白質的直接結合來實現。穩定劑可為胺基酸諸如丙胺酸、精胺酸、天冬胺酸、甘胺酸、組胺酸、賴胺酸、脯胺酸，糖類諸如葡萄糖、蔗糖、海藻糖，多元醇諸如甘油、甘露醇、山梨醇，鹽類諸如磷酸鉀、硫酸鈉，螯合劑諸如EDTA、六磷酸鹽，配體諸如二價金屬離子(鋅離子、鈣離子等)，其它鹽類或有機分子諸如苯酚衍生物。此外，可使用寡聚體或聚合物諸如環糊 精、右旋糖酐、樹狀聚物(dendrimers)、PEG或PVP或魚精蛋白或HAS。
(v)抗吸附劑：用於與組合物或組合物容器的內表面競爭性塗覆或吸附的主要離子型或非離子型表面活性劑或其它蛋白質或可溶聚合物。例如，泊洛沙姆(Pluronic F-68)、PEG十二烷基醚(Brij 35)、聚山梨酸酯20和80、右旋糖酐、聚乙二醇、PEG-聚組胺酸、BSA和HAS和明膠。賦形劑的選擇濃度和類型取决於應避免的作用，但典型地在恰好高於CMC值在界面處形成單層的表面活性劑。
(vi)凍乾保護劑和/或冷凍保護劑：在冷凍乾燥或噴霧乾燥過程中，賦形劑可抵消由氫鍵斷裂和水除去引起的不穩定作用。對於該目的，可使用糖類和多元醇，但相應的正性作用也已經在表面活性劑、胺基酸、非水溶劑和其它肽中觀察到。海藻糖特別有效地降低潮濕引起的聚集且也改善了可能藉由將蛋白疏水基團暴露於水引起的熱穩定性。也可使用甘露醇和蔗糖作為單獨的凍乾保護劑/冷凍保護劑或彼此聯用，其中高比例的甘露醇：蔗糖已知為增强冷凍乾燥餅的物理穩定性。甘露醇也可與海藻糖組合。海藻糖也可與山梨醇或作為單獨保護劑使用的山梨醇組合。也可使用澱粉或澱粉衍生物。
(vii)氧化保護劑：抗氧化劑諸如抗壞血酸、四氫甲基嘧啶羧酸、蛋胺酸、谷胱甘肽、單硫代甘油、桑色素、聚乙烯亞胺(PEI)、沒食子酸丙酯、維生素E，螯合劑諸如枸櫞酸、EDTA、六磷酸鹽(酯)、巰基乙酸。
(viii)增黏劑或黏度增强劑：使用顆粒在小瓶和注射器中的延緩沉降以 促進顆粒的混合和重新混懸並且使得所述混懸液易於注射(即施加於注射器柱塞的力小)。合適的增黏劑或黏度增强劑為，例如，卡波姆增黏劑如Carbopol 940、Carbopol Ultrez 10，纖維素衍生物如羥基丙基甲基纖維素(羥丙甲纖維素、HPMC)或二乙基胺基乙基纖維素(DEAE或DEAE-C)，膠狀矽酸鎂(Veegum)或矽酸鈉，羥基磷灰石凝膠，磷酸三鈣凝膠，黃原膠，角叉藻聚糖如Satia樹膠UTC 30，脂族聚(羥基酸)諸如聚(D,L-或L-乳酸)(PLA)和聚(羥乙酸)(PGA)以及它們的共聚物(PLGA)，D,L-丙交酯、乙交酯和己內酯的三聚物，泊洛沙姆，親水性聚(氧乙烯)嵌段和疏水性聚(氧丙烯)嵌段以製成聚(氧乙烯)-聚(氧丙烯)-聚(氧乙烯)的三嵌段(例如Pluronic®)，聚醚酯共聚物諸如聚對苯二甲酸乙二醇酯/聚對苯二甲酸丁二醇共聚物，乙酸異丁酸蔗糖酯(SAIB)，右旋糖酐或其衍生物，右旋糖酐和PEG的組合，聚二甲基矽氧烷，膠原，殼聚糖，聚乙烯醇(PVA)和衍生物，聚烷基醯亞胺，聚(丙烯醯胺-共-二烯丙基二甲基銨(DADMA))，聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，葡萄糖胺聚糖(GAG)諸如硫酸皮膚素、硫酸軟骨素、硫酸角質素、肝素、硫酸乙醯肝素，透明質烷，由疏水性A-嵌段(諸如聚丙交酯(PLA)或聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA))和親水性B-嵌段(諸如聚乙二醇(PEG)或聚乙烯基吡咯烷酮)構成的ABA三嵌段或AB嵌段共聚物。此類嵌段共聚物以及上面提及的泊洛沙姆可展現出相反的熱量膠凝作用行為(在室溫為流體狀態以便於投予且在注射後在高於溶膠-凝膠轉換溫度在體溫為凝膠狀態)。
(ix)鋪展劑或分散劑：藉由在細胞間隔的細胞外基質中的組分(諸如但不限於玻尿酸，其為存在於結締組織的細胞間隙中的多糖)的水解 來修飾結締組織的滲透性。鋪展劑諸如但不限於玻璃酸酶，其暫時降低細胞外基質的黏度且促進注射藥物的分散。
(x)其它輔助劑：諸如濕潤劑、黏度修飾劑、抗生素、玻璃酸酶。酸和碱諸如鹽酸和氫氧化鈉為對於在製造過程中pH調節所必需的輔助劑。
在一個具體實例中，GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的組合物含有一種或多於一種增黏劑和/或黏度調節劑。
在另一具體實例中，GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的組合物含有作為增黏劑和/或黏度調節劑的玻尿酸。
在另一具體實例中，GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的組合物包含作為增黏劑和/或黏度調節劑的玻尿酸，其濃度為5至30wt%。
在另一具體實例中，GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的組合物包含作為增黏劑和/或黏度調節劑的玻尿酸，其分子量為200kDa至6百萬kDa。
在另一具體實例中，GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的組合物包含作為增黏劑和/或黏度調節劑的玻尿酸，其分子量為500kDa至3百萬kDa.
術語"賦形劑"較佳地是指與治療藥物一起投予的稀釋劑、佐劑或媒介物。此類藥物賦形劑可為無菌液體。當醫藥組合物口服投予時，水為較佳的賦形劑。當醫藥組合物靜脈內投予時，鹽水和葡萄糖水溶液為較佳的賦形劑。鹽水溶液和葡萄糖水溶液及甘油溶液較佳地用作可注射溶液的液體賦形劑。
合適的藥物賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述組合物也可含有少量的潤濕劑或乳化劑或pH緩衝劑。這些組合物可採用溶液劑、懸浮劑、 乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉末劑、持續釋放製劑等形式。此類組合物將含有治療有效量的治療藥物(較佳地為純化形式)以及合適量的賦形劑以對患者提供適當投予的形式。該製劑適合投予模式。
在一般具體實例中，無論是呈乾燥形式還是懸浮液或呈其它形式的本發明的醫藥組合物可作為單一或多劑量組合物來提供。
在本發明的一個具體實例中，GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的乾燥組合物作為單一劑量來提供，這表示提供它的容器中含有一個藥物劑量。
因此，在本發明的另一態樣，所述組合物作為單一劑量組合物來提供。
在本發明的另一態樣，所述組合物包含在容器中。在一個具體實例中，所述容器為雙室注射器。特別地在雙室注射器的第一室中提供本發明的乾燥組合物且在雙室注射器的第二室中提供重構溶液。
在對有此需要的患者施用GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的乾燥組合物之前，重構所述乾燥組合物。可在容器中進行重構，在該容器中GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的乾燥組合物可在諸如小瓶、注射器、雙室注射器、安瓿和藥筒中提供。藉由將預定量的重構溶液加入至所述乾燥組合物中完成重構。重構溶液為無菌液體，諸如水或緩衝液，其可進一步含有添加劑，諸如防腐劑和/或抗菌劑。如果GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥組合物作為單一劑量提供時，則所述重構溶液可含有一種或多種防腐劑和/或抗菌劑。較佳地，所述重構溶液為無菌水。
本發明的另一態樣關於投予重構的GLP-1/升糖素激動劑水凝膠前藥組合物的方法。所述GLP-1/升糖素激動劑水凝膠前藥組合物可藉由包括皮內、皮下、肌內、靜脈內、骨內和腹膜內的注射或輸注的方法來投予。
另一態樣為製備重構的組合物的方法，所述組合物包含治療有效量的GLP-1/升糖素激動劑水凝膠前藥以及任選一種或多種醫藥上可接受之賦形劑，其中該GLP-1/升糖素激動劑與水凝膠暫時連接，所述方法包括以下步驟：
˙使本發明組合物與重構溶液接觸。
另一態樣為重構的組合物，其包含治療有效量的GLP-1/升糖素激動劑水凝膠前藥以及任選一種或多種醫藥上可接受之賦形劑，其中所述GLP-1/升糖素激動劑與藉由上面方法得到的水凝膠暫時連接。
本發明的另一態樣為製備GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的乾燥組合物的方法。在一個具體實例中，此類混懸液組合物如下製備： (i)使GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥與一種或多種賦形劑混合，(ii)轉移相當於單一或多劑量的量的組合物於適當的容器中，(iii)在該容器中乾燥組合物，和(iv)密封該容器。
合適的容器為小瓶、注射器、雙室注射器、安瓿和藥筒。
另一態樣為套組(kit of parts)。當投予裝置僅為皮下注射器時，所述套組可包含注射器、針頭以及與注射器一起使用的包含乾燥的GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥組合物的容器和包含重構溶液的第二容器。在更較佳的具體實例中，所述注射裝置不是簡單的皮下注射器，且由此含有重構的GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的分開的容器適於與注射裝置接合以使得在使用時在容器中的液體組合物與注射裝置的出口流體連接。投予裝置的實例包括但不限於皮下注射器和筆式注射裝置。特別較佳的注射裝置為筆式注射器，在該情况下所述容器為藥筒，較佳地為可更換的藥筒。
較佳的套盒包括針頭以及含有本發明組合物且視情况進一步含有重構溶液的容器，所述容器適於與針頭一起使用。較佳地，所述容器為雙室注射器。
在另一態樣，本發明提供與筆式注射器裝置一起使用的含有如上所述的GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的組合物的藥筒。所述藥筒可含有單一劑量或者多劑量的GLP-1/升糖素激動劑。
在本發明的一個具體實例中，GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥的懸浮液組合物不僅包含GLP-1/升糖素激動劑-水凝膠前藥以及一種或多種賦形劑，而且還含有游離形式或作為前藥的其它生物活性劑。較佳地，此類另外的一種或多種生物活性劑為前藥，更佳地為水凝膠前藥。此類生物活性劑包括但不限於以下各類的化合物：
可注射性
較佳地，所述製劑可藉由注射器經內徑小於0.26mm(26號(Gauge))的針頭投予，甚至更較佳經內徑小於0.18mm(28號)的針頭投予，且最佳經內徑小於0.16mm(30號)的針頭投予。
應當理解的是，術語“可藉由注射投予”、“可注射的”或“可注射性”是指因素的組合，所述因素為諸如向含有本發明的生物可降解的HA水凝膠(在液體中在特定濃度(w/v)和在特定溫度溶脹)的注射器的柱塞施加一定的力、與所述注射器的出口相連的給定內徑的針頭和從注射器中藉由針頭擠出一定體積的本發明的生物可降解的水凝膠所需的時間。
為了提供注射性，體積為1mL的溶脹於水中且包含於注射器(裝有直 徑為4.7mm的柱塞)中的本發明的GLP-1/升糖素激動劑前藥可在室溫在10秒內藉由施加等於/小於20牛頓的力經26號針擠出。較佳的可注射性為體積為1mL的溶脹於水中且包含於注射器(裝有直徑為4.7mm的柱塞)中的本發明的GLP-1/升糖素激動劑前藥可在室溫在10秒內藉由施加等於/小於20牛頓的力經30號針擠出。
令人驚奇地發現，聚合物上的肽載量越高，本發明的HA載體需要用於注射的力越小(圖5)。
為了提供注射性，體積為1mL的溶脹於水/緩衝液中至濃度為至少1.5%(w/v)且包含於注射器(裝有直徑為4.7mm的柱塞)中的本發明的GLP-1/升糖素激動劑前藥可在室溫在10秒內藉由施加小於30牛頓的力經30號針擠出。
對於溶脹於水/緩衝液中至濃度為至少2%(w/v)的本發明的GLP-1/升糖素激動劑前藥，更佳的可注射性可藉由施加小於30牛頓的力經30號針實現。
對於溶脹於水/緩衝液中至濃度為至少2%(w/v)的本發明的GLP-1/升糖素激動劑前藥，最佳的可注射性可藉由施加小於20牛頓的力經30號針實現。
該前藥的一個重要特徵是它停留在施用部位形成穩定的儲庫(depot)。聚合物的降解應當在藥物釋放之後啟動。
組合療法
本發明的前藥，即針對GLP-1和升糖素受體的雙重激動劑，可以廣泛地與其它藥理學活性化合物，諸如在Rote Liste 2015中提及的所有藥物進行組合，如，和Rote Liste 2012，第1章中提及的所有減體重劑，在Rote Liste 2015，第58章中提及的所有降脂藥，在Rote Liste 2015中提及的所有抗高血壓藥和腎保護藥，或在Rote Liste 2015，第36章中提及的所有利尿藥進行組合。
所述活性成分組合可特別用於作用的協同性改善。它們或者可藉由分開向患者投予所述活性成分而施用，或者可以組合產品(其中多種活性成分存在於一個藥物製劑中)的形式施用。當藉由活性成分分開投予來施用活性成分時，這可同時或連續地實現。
本文以下提及的大部分活性成分揭露於USP Dictionary of USAN和International Drug Names,US Pharmacopeia,Rockville 2011。
適於此類組合的其它活性物質具體包括例如使一種或多種活性物質對所述適應症之一的治療效果增强的那些和/或允許一種或多種活性物質的劑量降低的那些。
適於組合的治療劑包括，例如，抗糖尿病藥，諸如：胰島素和胰島素衍生物，例如：甘精胰島素(Glargine)/Lantus®、270-330U/mL的甘精胰島素(EP 2387989 A)、300U/mL的甘精胰島素(EP 2387989 A)、賴穀胰島素(Glulisin)/Apidra®、地特胰島素(Detemir)/Levemir®、賴脯胰島素(Lispro)/Humalog®/Liprolog®、德穀胰島素(Degludec)/DegludecPlus、天冬胰島素(Aspart)、基礎胰島素和類似物(例如，LY-2605541、LY2963016、NN1436)、PEG化賴脯胰島素、Humulin®、Linjeta、SuliXen®、NN1045、胰島素+Symlin、PE0139、速效和短效胰島素(例如Linjeta、PH20、NN1218、HinsBet)、(APC-002)水凝膠、口服、可吸入、經皮和舌下胰島素(例如Exubera®、Nasulin®、Afrezza、Tregopil、TPM 02、Capsulin、Oral-lyn®、Cobalamin®口服胰島素、ORMD-0801、NN1953、NN1954、NN1956、VIAtab、Oshadi口服胰 島素)。額外包括的是藉由雙功能連接子與白蛋白或其它蛋白質鍵接的那些胰島素衍生物。
GLP-1、GLP-1類似物和GLP-1受體激動劑，例如：利西拉來(Lixisenatide)/AVE0010/ZP10/Lyxumia、艾塞那肽(Exenatide)/毒蜥外泌肽-4/Byetta/Bydureon/ITCA 650/AC-2993、利拉魯肽(Liraglutide)/Victoza、司美魯肽(Semaglutide)、他泊魯肽(Taspoglutide)、Syncria/阿比魯肽(Albiglutide)、度拉魯肽(Dulaglutide)、r毒蜥外泌肽-4、CJC-1134-PC、PB-1023、TTP-054、Langlenatide/HM-11260C、CM-3、GLP-1 Eligen、ORMD-0901、NN-9924、NN-9926、NN-9927、Nodexen、Viador-GLP-1、CVX-096、ZYOG-1、ZYD-1、GSK-2374697、DA-3091、MAR-701、MAR709、ZP-2929、ZP-3022、TT-401、BHM-034。MOD-6030、CAM-2036、DA-15864、ARI-2651、ARI-2255、艾塞那肽-XTEN和升糖素-Xten。
DPP-4抑制劑，例如：阿格列汀(Alogliptin)/Nesina、Trajenta/利格列汀(Linagliptin)/BI-1356/Ondero/Trajenta/Tradjenta/Trayenta/Tradzenta、沙格列汀(Saxagliptin)/Onglyza、西格列汀(Sitagliptin)/Januvia/Xelevia/Tesave/Janumet/Velmetia、Galvus/維格列汀(Vildagliptin)、阿拉格列汀(Anagliptin)、吉格列汀(Gemigliptin)、替格列汀(Teneligliptin)、美格列汀(Melogliptin)、曲格列汀(Trelagliptin)、DA-1229、奧格列汀(Omarigliptin)/MK-3102、KM-223、依格列汀(Evogliptin)、ARI-2243、PBL-1427、呱諾沙星(Pinoxacin)。
SGLT2抑制劑，例如：Invokana/卡格列淨(Canaglifozin)、Forxiga/達格列淨(Dapagliflozin)、Remoglifozin、舍格列淨(Sergliflozin)、依帕列淨(Empagliflozin)、伊格列淨(Ipragliflozin)、托格列淨(Tofogliflozin)、魯格列 淨(Luseogliflozin)、LX-4211、Ertuglifozin/PF-04971729、RO-4998452、EGT-0001442、KGA-3235/DSP-3235、LIK066、SBM-TFC-039。
雙胍類(例如二甲雙胍(Metformin)、丁福明(Buformin)、苯乙雙胍(Phenformin))、噻唑烷二酮類(例如吡格列酮(Pioglitazone)、利格列酮(Rivoglitazone)、羅格列酮(Rosiglitazone)、曲格列酮(Troglitazone))、雙重PPAR激動劑(例如阿格列扎(Aleglitazar)、莫格列扎(Muraglitazar)、替格列扎(Tesaglitazar))、磺脲類(例如甲苯磺丁脲(Tolbutamide)、格列本脲(Glibenclamide)、格列美脲(Glimepiride)/亞莫利(Amaryl)、格列吡嗪(Glipizide))、氯茴苯酸類(Meglitinides)(例如那格列奈(Nateglinide)、瑞格列奈(Repaglinide)、米格列奈(MItiglinide))、α-葡糖苷酶抑制劑(例如阿卡波糖(Acarbose)、米格列醇(Miglitol)、伏格列波糖(Voglibose))、胰澱素(Amylin)和胰澱素類似物(例如，普蘭林肽(Pramlintide)、Symlin)。
GPR119激動劑(例如GSK-263A、PSN-821、MBX-2982、APD-597、ZYG-19、DS-8500)，GPR40激動劑(例如呋格列泛(Fasiglifam)/TAK-875、TUG-424、P-1736、JTT-851、GW9508)。
其它合適的組合配對物為：Cycloset、11-β-HSD的抑制劑(例如LY2523199、BMS770767、RG-4929、BMS816336、AZD-8329、HSD-016、BI-135585)、葡糖激酶的激活劑(例如TTP-399、AMG-151、TAK-329、GKM-001)、DGAT的抑制劑(如LCQ-908)、蛋白質酪胺酸磷酸酯酶1的抑制劑(例如曲度奎明(Trodusquemine))、葡萄糖-6-磷酸酶的抑制劑、果糖-1,6-二磷酸酶的抑制劑、糖原磷酸化酶的抑制劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的抑制劑、糖原合成酶激酶的抑制劑、丙酮酸脫氫激酶的抑制劑、α2-拮抗劑、CCR-2拮抗劑、SGLT-1抑制劑(例如LX-2761)。
一種或多種降脂藥也適於作為組合配對物，諸如：HMG-CoA-還原酶 抑制劑(例如辛伐他汀(Simvastatin)、阿托伐他汀(Atorvastatin))、貝特類(例如苯扎貝特(BEzafibrate)、非諾貝特(Fenofibrate))、烟酸及其衍生物(例如尼克酸(Niacin))、PPAR-(α、γ或α/γ)激動劑或調節劑(例如阿格列扎(Aleglitazar))、PPAR-δ激動劑、ACAT抑制劑(例如阿伐麥布(Avasimibe))、膽固醇吸收抑制劑(例如依折麥布(Ezetimibe))、膽汁酸結合物質(例如考來烯胺(Cholestyramine)、考來維侖(colesevelam))、回腸膽汁酸轉運抑制劑、MTP抑制劑或PCSK9的調節劑。
升HDL化合物，諸如：CETP抑制劑(例如托塞曲匹(Torcetrapib)、安塞曲匹(Anacetrapid)、達塞曲匹(Dalcetrapid)、依塞曲匹(Evacetrapid)、JTT-302、DRL-17822、TA-8995)或ABC1調節物。
其它適合的組合配對物是一種或多種用於治療肥胖症的活性物質，諸如：西布曲明(Sibutramine)、替索芬辛(Tesofensine)、奧利司他(Orlistat)、大麻素-1受體的拮抗劑、MCH-1受體拮抗劑、MC4受體激動劑、NPY5或NPY2拮抗劑(例如維奈呱利(Velneperit))、β-3-激動劑、瘦素或瘦素模擬物、5HT2c受體激動劑(例如氯卡色林(Lorcaserin))或安非他酮(bupropione)/納曲酮(naltrexone)、安非他酮(bupropione)/唑尼沙胺(zonisamide)、安非他酮/芬特明(phentermine)或普蘭林肽(pramlintide)/美曲普汀(metreleptin)的組合。
其它合適的組合配對物為：另外的胃腸肽諸如肽YY 3-36(PYY3-36)或其類似物、胰多肽(PP)或其類似物。
升糖素受體激動劑或拮抗劑、GIP受體激動劑或拮抗劑、葛瑞林(ghrelin)拮抗劑或反激動劑、類爪蟾肽(Xenin)及其類似物。
此外，具有用於影響高血壓、慢性心力衰竭或動脈粥樣硬化的藥物 的組合是合適的，所述藥物諸如：血管緊張素II受體拮抗劑(例如替米沙坦(telmisartan)、坎地沙坦(candesartan)、纈沙坦(valsartan)、氯沙坦(losartan)、依普羅沙坦(eprosartan)、厄貝沙坦(irbesartan)、奧美沙坦(olmesartan)、他索沙坦(tasosartan)、阿齊沙坦(azilsartan))、ACE抑制劑、ECE抑制劑、利尿藥、β-阻斷劑、鈣拮抗劑、中樞作用性降壓藥、α-2-腎上腺素能受體拮抗劑、中性肽鏈內切酶抑制劑、凝血細胞聚集作用抑制劑等或它們的組合。
用途
在另一態樣，本發明關於與至少一種上面描述的作為組合配對物的活性物質進行組合的本發明的前藥或其生理學上可接受的鹽，用於製備適於治療或預防疾病或病症的藥物的用途，其藉由結合GLP-1受體和升糖素受體和藉由調節它們的活性能够影響所述疾病或病症。
所述組合物可用於以GLP-1/升糖素激動劑和GLP-1/升糖素激動劑激動劑治療或預防已知的疾病或病症的方法，例如，用於治療和預防高血糖症及用於治療和預防的任何類型的糖尿病，例如胰島素依賴型糖尿病、非胰島素依賴型糖尿病，前驅糖尿病或妊娠糖尿病，用於預防和治療代謝症候群和/或肥胖和/或進食障礙，胰島素抵抗症候群，降低血脂水平，降低心臟病風險，減少食欲，減少體重等。
本發明化合物在可用於治療或預防脂肪肝(hepatosteatosis)，較佳非酒精性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(steatohepatitis)(NASH)。
本發明的前藥或其生理學上可接受的鹽，與一種或多種活性物質的組合使用可同時、單獨或順序地發生。
本發明的前藥或其生理學上可接受的鹽，與另一種活性物質的組合 使用可同時發生或在錯開的時間發生，但特別地在短的時間間隔內發生。如果它們同時施用，所述兩種活性物質一起投予患者；如果它們在錯開的時間使用，所述兩種活性物質在少於或等於12小時的時期內投予患者，但特別地在少於或等於6小時的時期內投予患者。
因此，在另一態樣，本發明關於藥物，其包含本發明的前藥或此類化合物的生理學上可接受的鹽以及至少一種上面描述的作為組合配對物的活性物質，以及視情况和一種或多種惰性載體和/或稀釋劑。
本發明的化合物，或其生理學上可接受的鹽或溶劑合物，以及要與其組合的額外的活性物質，均可一起存在於一種製劑中，例如懸浮劑中，或者分開在兩個相同或不同的製劑中，例如所謂的套組。
本發明的另一個態樣是在需要治療的哺乳動物患者(較佳人類)中治療、控制、延遲或預防一種或多種病症的方法，所述方法包括向所述患者投予治療有效量的本發明的前藥或本發明的醫藥組合物或其醫藥上可接受之鹽。
實例
材料和方法
所使用的縮寫如下：
AA 胺基酸
AcOH 乙酸
AcOEt 乙酸乙酯
cAMP 環磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate)
Bn 苄基
Boc 第三丁基氧基羰基
BOP (苯並三唑-1-基氧基)三(二甲基胺基)鏻鎓六氟磷酸鹽
BSA 牛血清白蛋白
tBu 第三丁基
DBU 1,3-二氮雜二環[5.4.0]十一碳烯
DCC N,N-二環己基碳二亞胺
DCM 二氯甲烷
Dde 1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亞環己基)-乙基
ivDde 1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亞環己基)3-甲基-丁基
DIC N,N'-二異丙基碳二亞胺
DIPEA N,N-二異丙基乙基胺
DMAP 二甲基胺基-吡啶
DMEM Dulbecco改良的Eagle培養基
DMF 二甲基甲醯胺
DMSO 二甲基亞碸
DTT DL二硫蘇糖醇
EDC 1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺
EDT 乙二硫醇
EDTA 乙二胺四乙酸
eq 化學計量當量
EtOH 乙醇
FBS 胎牛血清
Fmoc 芴基甲基氧基羰基
HATU O-(7-氮雜苯並三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽
HBSS Hanks平衡鹽溶液
HBTU 2-(1H-苯並三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基-脲鎓六氟磷酸鹽
HEPES 2-[4-(2-羥基乙基)呱嗪-1-基]乙磺酸
HOBt 1-羥基苯並三唑
HOSu N-羥基琥珀醯亞胺
HPLC 高效液相層析
HTRF 均相時間分辨螢光
IBMX 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤
LC/MS 液相層析/質譜
Mal 3-馬來醯亞胺基丙基
Mal-PEG6-NHS N-(3-馬來醯亞胺基丙基)-21-胺基-4,7,10,13,16,19-六氧雜-二十一碳烷酸NHS酯
Me 甲基
MeOH 甲醇
Mmt 4-甲氧基三苯甲基
MS 質譜/質譜法
MTBE 甲基第三丁基醚
MW 分子量
NHS N-羥基琥珀醯亞胺
Palm 棕櫚醯基
iPrOH 2-丙醇
PBS 磷酸鹽緩衝鹽水
PEG 聚乙二醇
PK 藥物動力學
PyBOP 苯並三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷子基-鏻鎓六氟磷酸鹽
Phth 鄰苯二甲醯亞胺基(phthalimido)
RP-HPLC 反相高效液相層析
rpm 轉/分鐘
RT 室溫
SEC 尺寸排阻層析
TCEP 三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽
TES 三乙基甲矽烷
TFA 三氟乙酸
THF 四氫呋喃
TMEDAN,N,N'N'-四甲基乙二胺
Tris 三(羥基甲基)胺基甲烷
Trt 三苯甲基
UPLC 超高效液相層析
UV 紫外線
V 體積
實例1
肽化合物的一般合成
材料：
使用不同的Rink-醯胺樹脂(4-(2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-胺基甲基)-苯氧基乙醯胺基-正亮氨醯基胺基甲基樹脂，Merck Biosciences；4-[(2,4-二甲氧基苯基)(Fmoc-胺基)甲基]苯氧基乙醯胺基甲基樹脂，Agilent Technologies)合成載量範圍為0.3-0.4mmol/g的肽醯胺。
Fmoc保護的天然胺基酸購自Protein Technologies Inc.,Senn Chemicals, Merck Biosciences,Novabiochem,Iris Biotech,Nagase或Bachem。在合成中使用下列標準胺基酸：Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Val-OH。
此外，下列特殊胺基酸購自與上文相同的供應商：Fmoc-L-Lys(ivDde)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Boc-L-His(Boc)-OH(可作為甲苯溶劑合物)和Boc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Nle-OH、Fmoc-L-Met(O)-OH、Fmoc-L-Met(O2)-OH、Fmoc-(S)MeLys(Boc)-OH、Fmoc-(R)MeLys(Boc)-OH、Fmoc-(S)MeOm(Boc)-OH和Boc-L-Tyr(tBu)-OH。
在例如Prelude Peptide Synthesizer(Protein Technologies Inc)或類似的自動合成儀上使用標準Fmoc化學和HBTU/DIPEA活化進行固相肽合成。使用DMF作為溶劑。脫保護：20%六氫吡啶/DMF,2 x 2.5min。洗滌：7 x DMF。偶聯2：5：10200mM AA/500mM HBTU/2M DIPEA於DMF中2 x,20min。洗滌：5 x DMF。
所有已合成的肽均用由82.5% TFA、5%苯酚、5%水、5%苯甲硫醚、2.5% EDT組成的King裂解混合物從樹脂上裂解。然後粗肽在乙醚或異丙醚中析出，離心，然後凍乾。肽藉由分析型HPLC分析並藉由ESI質譜核實。粗肽藉由常規製備型HPLC純化操作純化。
分析型HPLC/UPLC
方法A：在215nm檢測
柱：Aeris Peptide,3.6μm,XB-C18(250 x 4.6mm)在60℃
溶劑：H2O+0.1%TFA：ACN+0.1%TFA(流速1.5ml/min)
梯度：90：10(0min)至90：10(3min)至10：90(43min)至10：90(48min)至90：10(49min)至90：10(50min)
方法B：在220nm檢測
柱：Zorbax,5μm,C18(250 x 4.6mm)在25℃
溶劑：H2O+0.1%TFA：90% ACN+10% H2O+0.1%TFA(流速1.0ml/min)
梯度：100：0(0min)至98：2(2min)至30：70(15min)至5：95(20min)至0：100(25min)至0：100(30min)至98：2(32min)至98：2(35min)
方法C1：在210-225nm檢測，視情况偶聯至質量分析儀Waters LCT Premier，電噴霧正離子模式
柱：Waters ACQUITY UPLC® BEHTM C18 1.7μm(150 x 2.1mm)在50℃
溶劑：H2O+1%FA：ACN+1%FA(流速0.5ml/min)
梯度：95：5(0min)至95：5(1.80min)至80：20(1.85min)至80：20(3min)至60：40(23min)至25：75(23.1min)至25：75(25min)至95：5(25.1min)至95：5(30min)
方法C2：在210-225nm檢測，視情况偶聯至質量分析儀Waters LCT Premier，電噴霧正離子模式
柱：Waters ACQUITYUPLC® BEHTM C18 1.7μm(150 x 2.1mm)在50℃
溶劑：H2O+1%FA：ACN+1%FA(流速0.6ml/min)
梯度：95：5(0min)至95：5(1min)至65：35(2min)至65：35(3min)至45：55(23min)至25：75(23.1min)至25：75(25min)至95：5(25.1min)至95：5(30min)
方法C3：在210-225nm檢測，視情况偶聯至質量分析儀Waters LCT Premier，電噴霧正離子模式
柱：Waters ACQUITY UPLC ® BEH TM C18 1.7μm(150 x 2.1mm)在50℃
溶劑：H 2 O+1%FA：ACN+1%FA(流速1ml/min)
梯度：95：5(0min)至95：5(1min)至65：35(2min)至65：35(3min)至45：55(20min)至2：98(20.1min)至2：98(25min)至95：5(25.1min)至95：5(30min)
方法C4：在210-225nm檢測，視情况偶聯至質量分析儀Waters LCT Premier，電噴霧正離子模式
柱：Waters ACQUITY UPLC® BEHTM C18 1.7μm(150 x 2.1mm)在50℃
溶劑：H2O+1%FA：ACN+1%FA(流速1ml/min)
梯度：95：5(0min)至95：5(1.80min)至80：20(1.85min)至80：20(3min)至60：40(23min)至2：98(23.1min)至2：98(25min)至95：5(25.1min)至 95：5(30min)
方法D：在214nm檢測
柱：Waters X-Bridge C18 3.5μm 2.1 x 150mm
溶劑：H2O+0.5%TFA：ACN(流速0.55ml/min)
梯度：90：10(0min)至40：60(5min)至1：99(15min)
方法E：在210-225nm檢測，視情况偶聯至質量分析儀Waters LCT Premier，電噴霧正離子模式
柱：Waters ACQUITY UPLC® BEHTM C18 1.7μm(150 x 2.1mm)在50℃
溶劑：H2O+1%FA：ACN+1%FA(流速0.9ml/min)
梯度：95：5(0min)至95：5(2min)至35：65(3min)至65：35(23.5min)至5：95(24min)至95：5(26min)至95：5(30min)
一般製備型HPLC純化操作：
在Äkta Purifier System或在Jasco semiprep HPLC System上純化粗肽。取决於待純化的粗肽的量，使用不同尺寸和具有不同流速的製備型RP-C18-HPLC柱。採用乙腈+0.05至0.1% TFA(B)和水+0.05至0.1% TFA(A)作為洗脫劑。可選擇地，使用由乙腈和少量乙酸組成的緩衝系統。收集含產物的級分並凍乾以獲得純化的產物，通常為TFA鹽或乙酸鹽。
毒蜥外泌肽-4衍生物的溶解度和穩定性測試
在測試肽批次的溶解度和穩定性之前確定其含量。因此，研究兩個 參數，其純度(HPLC-UV)和該批次的鹽載量(離子層析法)。
實例2
對於溶解度測試，目標濃度為1.0mg/mL純化合物。因此，基於之前確定的含量，在不同的緩衝體系中從固體樣品製備濃度為1.0mg/mL化合物的溶液。在溫和攪拌上清液2h後進行HPLC-UV，所述上清液藉由在4000rpm離心20min獲得。
然後藉由與用純水或不同量的乙腈中濃度為2mg/mL的所述肽的儲備溶液獲得的UV峰面積(全部化合物溶解的光學對照)進行比較確定溶解度。該分析也作為穩定性測試的起點(t0)。
實例3
對於穩定性測試，針對溶解度獲得的上清液的等分試樣在25℃或40℃儲存7天。在該時間進程後，樣品在4000rpm離心20min並且用HPLC-UV分析上清液。
為了確定剩餘肽的量，比較了在t0和t7的目標化合物的峰面積，遵循以下方程式獲得“%剩餘肽”：%剩餘肽=[(峰面積肽t7) x 100]/峰面積肽t0。
從所有觀察到的雜質的峰面積之和減去在t0觀察到的峰面積之和的比較計算可溶性降解產物的量(即，確定新形成的肽相關物質的量)。該值以相對於在t0時肽的初始量的百分比給出，遵循以下方程式：%可溶性降解產物={[(雜質的峰面積之和t7)-(雜質的峰面積之和t0)]x 100}/峰面積t0。
“%剩餘肽”和“%可溶性降解產物”的總和與100%的潜在差異反映了在壓力條件下沒有保持可溶的肽的量，遵循方程式：%析出物=100-([%剩餘肽]+[%可溶性降解產物])。
該析出物包括不可溶降解產物、聚合物和/或原纖維，其已經藉由離心從分析中去除。
化學穩定性表示為“%剩餘肽”。
陰離子層析
儀器：Dionex ICS-2000，預柱：Ion Pac AG-18 2 x 50mm(Dionex)/AS18 2 x 250mm(Dionex)，洗脫劑：氫氧化鈉水溶液，流速：0.38mL/min，梯度：0-6min：22mM KOH,6-12min：22-28mM KOH,12-15min：28-50mM KOH,15-20min：22mM KOH，抑制器(suppressor)：ASRS 300 2mm，檢測：電導率。
作為HPLC/UPLC方法，已經使用方法D或E。
實例4：GLP-1和升糖素受體的體外數據
藉由使表達人升糖素受體(h升糖素R)或人GLP-1受體(hGLP-1 R)的細胞暴露於不斷增加濃度的所列化合物且如實例27所述測量所形成的cAMP來確定肽化合物在GLP-1受體和升糖素受體的效能。
結果示於表2中：表2. 毒蜥外泌肽-4衍生物在GLP-1受體和升糖素受體的EC50值(以pM為單位表示)
連接子合成
實例5
連接子試劑5c的合成
根據以下流程合成連接子試劑5c：
連接子試劑中間體5a的合成：
將間甲氧基三苯甲基氯(3g,9.71mmol)溶於DCM(20mL)中並滴加至乙二胺(6.5mL,97.1mmol)於DCM(20mL)中的溶液中。2小時後，將溶液傾入乙醚(300mL)中並用30/1(v/v)鹽水/0.1m NaOH溶液(各50ml)洗滌三次且用鹽水(50mL)洗滌一次。有機相經Na2SO4乾燥並減壓除去揮發物。未經進一步純化將Mmt-保護的中間體(3.18g,9.56mmol)用於下一步驟。
將Mmt-保護的中間體(3.18g,9.56mmol)溶於無水DCM(30mL)中。加入6-(S-三苯甲基巰基)己酸(4.48g,11.47mmol)、PyBOP(5.67g,11.47mmol)和DIPEA(5.0mL,28.68mmol)並將混合物在室溫(RT)振搖30min。溶液用乙醚洗滌並用30/1(v/v)鹽水/0.1m NaOH溶液(各50mL)洗滌三次且用鹽水(50mL)洗滌一次。有機相經Na2SO4乾燥並減壓除去揮發物。藉由快速層析純化5a。
產率：5.69g(8.09mmol)。
MS：m/z 705.4=[M+H]+(MW計算值=705.0)。
連接子試劑中間體5b合成：
向5a(3.19g,4.53mmol)於無水THF(50mL)中的溶液中加入BH3．THF (1m溶液，8.5mL,8.5mmol)並將溶液在室溫攪拌16h。加入另一部分BH3．THF(1m溶液，14mL,14mmol)並在室溫攪拌16h。藉由加入甲醇(8.5mL)淬滅反應混合物。加入N,N-二甲基-乙二胺(3mL,27.2mmol)並將溶液加熱至回流且攪拌3h。將反應混合物冷却下來至室溫，然後用乙酸乙酯(300mL)稀釋，用飽和Na2CO3水溶液(2 x 100mL)與飽和NaHCO3水溶液(2 x 100mL)洗滌。有機相經Na2SO4乾燥並減壓除去揮發物，得到粗胺中間體(3.22g)。
將胺中間體(3.22g)溶於DCM(5mL)中。將Boc2O(2.97g,13.69mmol)溶於DCM(5mL)中並加入DIPEA(3.95mL,22.65mmol)且將混合物在室溫攪拌30min。藉由快速層析純化混合物，得到粗Boc-保護和Mmt-保護的中間體(3.00g)。
MS：m/z 791.4=[M+H]+,519.3=[M-Mmt+H]+(MW計算值=791.1)。
將0.4m HCl水溶液(48mL)加至Boc-保護和Mmt-保護的中間體於乙腈(45mL)中的溶液中。混合物用乙腈(10mL)稀釋並在室溫攪拌1h。隨後，藉由加入5m NaOH溶液將反應混合物的pH值調至5.5。減壓除去乙腈並用DCM(4 x 100mL)萃取水溶液。合並的有機相經Na2SO4乾燥並減壓除去揮發物。未經進一步純化將粗品5b用於下一步驟。
產率：2.52g(3.19mmol)。
MS：m/z 519.3=[M+H]+(MW計算值=519.8g/mol)。
連接子試劑5c的合成：
中間體5b(985mg,1.9mmol)和氯甲酸對硝基苯酯(330mg,2.5mmol)溶於無水THF(10mL)中。加入DIPEA(0.653mL,3.7mmol)並將混合物在室溫攪拌2h。藉由加入乙酸(1mL)將溶液酸化。藉由RP-HPLC純化5c。
產率：776mg,(1.13mmol)。
MS m/z 706.3=[M+Na]+(MW計算值=706.3)。
肽連接子試劑的合成
a)肽合成
在Prelude Peptide Synthesizer(Protein Technologies Inc)或類似的自動合成儀上使用標準Fmoc化學和HBTU/DIPEA活化進行固相肽合成。DMF用作溶劑。去保護：20%六氫吡啶/DMF,2 x 2.5min。洗滌：7 x DMF。偶聯：2：5：10200mM AA/500mM HBTU/2M DIPEA在DMF中，2 x,20min。洗滌：5 x DMF。
b)具有D-Ala的N-末端延長
將如步驟a中所述合成的在N-末端具有游離胺基的0.9mmol樹脂結合的肽(相當於4g樹脂)分成五等份。將各部分懸浮於15ml DMF中，隨後加入2.5eq.Fmoc-D-Ala-OH、2.5eq.HATU、2.5eq.HOAt和2.5eq.DIPEA。將混合物在環境溫度振搖16h。然後經由過濾移去反應混合物並將樹脂用18ml DMF、18ml DCM、18ml異丙醇、18ml乙醚洗滌3次。真空除去剩餘溶劑。
c)Fmoc脫保護、連接子連接和裂解
將如步驟b中所述合成的在N-末端具有游離胺基的0.37mmol樹脂結合的肽(相當於1.6g樹脂)分成兩等份。將各部分懸浮於12ml 20%六氫吡啶於DMF中的溶液中並攪拌5min。除去溶劑並重複該操作兩次。
將樹脂結合的肽用12ml DMF洗滌5次。
然後將樹脂懸浮於10ml DMF中並加入2.5eq.(2-(((4-硝基苯氧基)羰基)胺基)乙基)(6-(三苯甲基硫基)己基)胺基甲酸第三丁酯5c和2.5eq.DIPEA。將混合物在環境溫度振搖16h。然後經由過濾移去反應混合物並將樹脂用15ml DMF、15ml DCM、15ml異丙醇、15ml乙醚洗滌3次。真空除去剩餘溶劑。藉由Kaiser檢測(Kaisertest)測試反應的完成。
然後加入TFA/DTT/TIS/H2O/苯甲硫醚/Bu4NBr(100/3/2/3/1/0.05)的混合物並將混合物振搖3.5h。過濾混合物並用1ml TFA洗滌樹脂。經合並的濾液加至100ml冷却的乙醚中。藉由離心分離析出物並將其用乙100ml醚洗滌2次。
經由使用乙腈/水梯度(兩種緩衝液均具有0,1% TFA)的製備型HPLC在Waters柱(XBridge,BEH130，製備型C18 5μM)上純化粗產物。立即將經純化的中間體凍乾並儲存於Ar氣氛中或直接用於下一步驟。
實例6
GLP-1/升糖素激動劑連接子試劑6d(Ala連接子)的合成
根據以下流程合成GLP-1/升糖素激動劑連接子試劑6d：
GLP-1/升糖素激動劑連接子試劑中間體6a的合成：
將在樹脂上具有游離N-末端的全側鏈保護的GLP-1/升糖素激動劑(2.00g,0.2mmol，裝載大約0.1mmol/g)轉移至20mL裝配有垂熔濾器的注射器中。將8mL無水DMF引入注射器中並振盪(600rpm)注射器15min以使樹脂預溶脹。棄去溶劑，將Fmoc-D-丙胺酸-OH(187mg,0.6mol)、PyBOP(312mg,0.6mmol)和DIPEA(174μL,1.0mmol)於無水DMF(4mL)中的溶液引入注射器中。在室溫和600rpm振盪注射器60min。放出溶液，並用DMF洗滌樹脂十次。
如上文所述進行Fmoc-保護。
GLP-1/升糖素激動劑連接子試劑中間體6b的合成：
將5c(137mg,0,4mmol)於無水DMF(3mL)中的溶液加至樹脂6a(0.2mmol)中，接著加入DIPEA(80μL,0.46mmol)於無水DMF(4.5mL)中的溶液，然後將反應混合物在22℃振盪(600rpm)15小時。
將樹脂用DMF洗滌十次並用DCM洗滌十次且真空乾燥。
GLP-1/升糖素激動劑連接子試劑中間體6c的合成：
將3-硝基-2-吡啶-硫基氯(48mg,0.25mmol)加至含6b(0.05mmol,0.5g)的注射器中。將無水DCM(4mL)引入注射器中並將混合物在室溫振盪(600rpm)。2h後棄去溶液並將樹脂用DCM洗滌14次且真空乾燥。
GLP-1/升糖素激動劑連接子試劑中間體6d的合成：
在圓底燒瓶中，將鄰甲酚(1.5mL)、苯甲硫醚(1.5mL)、DTT(1.125g)、TES(1.125mL)和水(1.5mL)溶於TFA(37.5mL)中。在室溫將6c(0.15mmol,1.5g)加至經攪拌的(250-350rpm)溶液中以獲得均質懸浮液。持續攪拌45min。經由過濾從樹脂珠子中分離出溶液，用TFA洗滌珠子兩次(每次2mL)並將洗滌溶液與濾液合並。在氮氣氣流中從合並的溶液中除去TFA。
藉由加入乙醚(30mL)和劇烈振盪使粗品6d從濃縮的溶液(大約10mL)中析出。離心(2min,5000rpm)後，棄去上清液並用乙醚洗滌析出物兩次(每次20mL)。
將乾燥的析出物溶於TCEP(114mg,0.39mmol)於30ml含0.01% TFA(v/v)的1/19(v/v)乙腈/水中的溶液中。將混合物在室溫溫育15小時。藉由如材料與方法部分所述的使用150 x 30mm Waters XBridgeTM BEH300 C18 10μm柱和40ml/min流速的RP-HPLC純化6d。
柱上裝載至多12mL混合物。先後使用5%至30%溶劑B(5min)的線性梯度和30%至35%溶劑B(40min)的線性梯度進行洗脫。收集含產物6d的級分並凍乾。純度：86%(215nm)
產率：85.2mg(19.2μmol，自2.00g樹脂起始)。
MS m/z 1486.7=[M+3H]3+，(MW計算值=4460.0g/mol)。
實例7(Asn連接子)
連接子試劑7f的合成
根據以下流程合成連接子試劑7f：
向N-甲基-N-boc-乙二胺(0.5mL,2.79mmol)和NaCNBH3(140mg,2.23mmol)於MeOH(10mL)和乙酸(0.5mL)中的經冷却的(0℃)溶液中加入2,4,6- 三甲氧基苯甲醛(0.547mg,2.79mmol)於EtOH(10mL)中的溶液。將混合物在室溫攪拌2h，用2M HCl(1mL)酸化並用飽和Na2CO3水溶液(50mL)中和。蒸發所有揮發物，用DCM萃取所得水性漿液並濃縮有機性級分，得到N-甲基-N-boc-N’-tmob-乙二胺(7a)，其為粗油狀物，藉由RP-HPLC純化。
產率：593mg(1.52mmol)
MS：m/z 377.35=[M+Na]+，(計算值=377.14)。
將N-Fmoc-N-Me-Asp(OtBu)-OH(225mg,0.529mmol)溶於DMF(3mL)中並加入7a(300mg,0.847mmol)、HATU(201mg,0.529mmol)和可力丁(0.48mL,3.70mmol)。將反應混合物在室溫攪拌2h，得到7b。對於fmoc脫保護，加入六氫吡啶(0.22mL,2.16mmol)並繼續攪拌1h。加入乙酸(1mL)，並藉由RP-HLPC純化7c。
產率：285mg(0.436mmol，其為TFA鹽)
MS：m/z 562.54=[M+Na]+，(計算值=562.67)。
將6-三苯甲基巰基己酸(0.847g,2.17mmol)溶於無水DMF(7mL)中。加入HATU(0.825g,2.17mmol)和可力丁(0.8mL,6.1mmol)及7c(0.78g,1.44mmol)。將反應混合物在室溫攪拌60min，用AcOH(1mL)酸化並藉由RP-HPLC純化。用飽和NaHCO3水溶液中和產物級分並濃縮。用DCM萃取剩餘的水相並經蒸發溶劑分離7d。
產率：1.4g(94%)
MS：m/z 934.7=[M+Na]+，(計算值=934.5)。
向7d(1.40mg,1.53mmol)於MeOH(12mL)和H2O(2mL)中的溶液中加入LiOH(250mg,10.4mmol)並將反應混合物在70℃攪拌14h。用AcOH(0.8mL)酸化混合物並藉由RP-HPLC純化7e。用飽和NaHCO3水溶液中和產物級分並濃縮。用DCM萃取水相並經蒸發溶劑分離7e。
產率：780mg(60%)
MS：m/z 878.8=[M+Na]+，(計算值=878.40)。
向7e(170mg,0.198mmol)於無水DCM(4mL)中的溶液中加入DCC(123mg,0.59mmol)和N-羥基-琥珀醯亞胺(114mg,0.99mmol)，並將反應混合物在室溫攪拌1h。過濾混合物，並用0.5mL AcOH酸化濾液且藉由RP-HPLC純化7f。用飽和NaHCO3水溶液中和產物級分並濃縮。用DCM萃取剩餘的水相並經蒸發溶劑分離7f。
產率：154mg(0.161mmol)
MS：m/z 953.4=[M+H]+，(計算值=953.43)。
可選擇地，根據以下操作合成連接子試劑7f：
備選反應流程：
向N-甲基-N-boc-乙二胺(2g,11.48mmol)和NaCNBH3(819mg,12.63mmol)於MeOH(20mL)中的溶液中逐份加入2,4,6-三甲氧基苯甲醛(2.08mg,10.61mmol)。將反應混合物在室溫攪拌90min，用3M HCl(4mL)酸化並再攪拌15min。將反應混合物加至飽和NaHCO3溶液(200mL)中並用CH2Cl2萃取(5x)。合並的有機相經Na2SO4乾燥並真空蒸發溶劑。將所得N-甲基-N-boc-N’-tmob-乙二胺(7a)在高真空中完全乾燥並未經進一步純化用於下一反應步驟。
產率：3.76g(11.48mmol,89%純度，7a：雙Tmob保護的產物=8：1)
MS：m/z 355.22=[M+H]+，(計算值=354.21)。
向7a(2g,5.65mmol)於CH2Cl2(24ml)中的溶液中加入COMU(4.84g,11.3mmol)、N-Fmoc-N-Me-Asp(OBn)-OH(2.08g,4.52mmol)和可力丁(2.65mL,20.34mmol)。將反應混合物在室溫攪拌3h，用CH2Cl2(250mL)稀釋並用0.1M H2SO4(100ml)洗滌3次且用鹽水(100ml)洗滌3次。用CH2Cl2(100ml)再次萃取水相。合並的有機相經Na2SO4乾燥，過濾並濃縮殘餘物至體積為24mL。使用快速層析純化7g。
產率：5.31g(148%,6.66mmol)
MS：m/z 796.38=[M+H]+，(計算值=795.37)。
向7g[5.31g,max.4.51mmol參考N-Fmoc-N-Me-Asp(OBn)-OH]於THF(60mL)中的溶液中加入DBU(1.8mL,3% v/v)。將溶液在室溫攪拌12min，用CH2Cl2(400ml)稀釋並用0.1M H2SO4(150ml)洗滌3次且用鹽水(150ml)洗滌3次。用CH2Cl2(100ml)再次萃取水相。合並的有機相經 Na2SO4乾燥並過濾。經蒸發溶劑分離7h並未經進一步純化用於下一反應。
MS：m/z 574.31=[M+H]+，(計算值=573.30)。
將7h(5.31g,4.51mmol，粗品)溶於乙腈(26mL)中並加入COMU(3.87g,9.04mmol)、6-三苯甲基巰基己酸(2.12g,5.42mmol)和可力丁(2.35mL,18.08mmol)。將反應混合物在室溫攪拌4h，用CH2Cl2(400ml)稀釋並用0.1M H2SO4(100ml)洗滌3次且用鹽水(100ml)洗滌3次。用CH2Cl2(100ml)再次萃取水相。合並的有機相經Na2SO4乾燥，過濾並經蒸發溶劑分離7i。使用快速層析純化產物7i。
產率：2.63g(62%,94%純度)
MS：m/z 856.41=[M+H]+，(計算值=855.41)。
向7i(2.63g,2.78mmol)於i-PrOH(33mL)和H2O(11mL)中溶液中加入LiOH(267mg,11.12mmol)並將反應混合物在室溫攪拌70min。將混合物用CH2Cl2(200ml)稀釋並用0.1M H2SO4(50ml)洗滌3次且用鹽水(50ml)洗滌3次。用CH2Cl2(100ml)再次萃取水相。合並的有機相經Na2SO4乾燥，過濾並經蒸發溶劑分離7e。使用快速層析純化7j。
產率：2.1g(88%)
MS：m/z 878.4=[M+Na]+，(計算值=878.40)。
向7e(170mg,0.198mmol)於無水DCM(4mL)中的溶液中加入DCC(123mg,0.59mmol)，並加入催化量的DMAP。5min後加入N-羥基-琥珀醯亞胺(114mg,0.99mmol)並將反應混合物在室溫攪拌1h。將反應混合物過濾，真空除去溶劑並將殘餘物吸收於90%乙腈+0.1% TFA(3.4ml)中。藉由RP-HPLC純化粗混合物。用0.5M pH 7.4磷酸鹽緩衝液中和產物級分並濃縮。用DCM萃取剩餘水相並經蒸發溶劑分離7f。
產率：154mg(81%)
MS：m/z 953.4=[M+H]+，(計算值=953.43)。
實例8
連接子試劑8e的合成
根據以下流程合成連接子試劑8e：
在氮氣氣氛進行連接子試劑中間體8b的合成。將胺8a(1.69g,4.5mmol，對於製備參見WO-A 2009/133137)於30mL THF(無水的，分子篩)中的溶液冷却至0℃。加入氯甲酸第三丁酯(630μl,4.95mmol)於3mL THF(無水的，分子篩)中的溶液和DIPEA(980μl,5.63mmol)。將混合物在0℃攪拌10min，移開冷却並將混合物在室溫再攪拌20min。加入1M LiAlH4/THF(9mL,9mmol)並將混合物回流1.5h。藉由慢慢加入甲醇(11mL)和100mL飽和酒石酸Na/K溶液淬滅反應混合物。用乙酸乙酯萃取混合物，有機層經Na2SO4乾燥並減壓除去溶劑。未經進一步純化將粗產物8b(1.97g)用於下一步驟。
MS：m/z 390.2=[M+H]+(MW計算值=389.6)。
將粗產物8b(1.97g)、N-(溴乙基)-鄰苯二甲醯亞胺(1.43g,5.63mmol)和K2CO3(1.24g,9.0mmol)於120mL乙腈中的溶液回流6h。加入60mL飽和NaHCO3溶液並用乙酸乙酯萃取混合物3次。將合並的有機物乾燥(Na2SO4)並減壓除去溶劑。藉由使用庚烷(含0.02% NEt3)和上升量的乙酸乙酯(含0.02% NEt3)作為洗脫劑在矽膠上純化鄰苯二甲醯亞胺8c。
產率：0.82g(1.46mmol)
MS：m/z 563.3=[M+H]+(MW計算值=562.8)。
將鄰苯二甲醯亞胺8c(819mg 1.46mmol)溶於35mL乙醇中並加入水合肼(176μl,3,64mmol)。將混合物回流3h。濾出析出物。減壓除去溶劑並用15mL二氯甲烷處理殘餘物。濾出析出物並減壓除去二氯甲烷。藉由RP HPLC純化殘餘物。藉由加入NaHCO3將收集的HPLC級分調節至pH 7並用二氯甲烷萃取若干次。將合並的有機物乾燥(Na2SO4)並減壓除去溶劑，得到胺8d。
產率：579mg(1.34mmol)
MS：m/z 433.3=[M+H]+(MW計算值=432.7)。
將氯甲酸對硝基苯酯(483mg,2.40mmol)溶於10mL二氯甲烷(無水的，分子篩)中。加入胺8d(1.00g,2.31mmol)於5mL二氯甲烷(無水的，分子篩)和1.8mL sym-可力丁中的溶液並將混合物在室溫攪拌40min。減壓除去二氯甲烷，用乙酸乙酯酸化殘餘物並藉由RP-HPLC純化，得到胺基甲酸對硝基苯酯8e。
產率：339mg(0.57mmol)
MS：m/z 598.3=[M+H]+(MW計算值=597.8)。
肽連接子-聚合物接合物的合成
實例9
根據以下流程合成GLP/升糖素激動劑巰基連接子1：
向於肽合成容器中在rink樹脂上的400mg樹脂連接的Fmoc-保護的毒蜥外泌肽-4 Seq.ID.26中加入4ml 20%六氫吡啶/DMF並將反應混合物攪拌5分鐘。重複該過程三次。隨後將樹脂連接的肽用4ml DMF洗滌三次。
向80mg(2,5eqv.)連接子1a和60mg(3.0eqv.)PyBOP中加入5mL無水DMF。向該溶液中加入16μl(3.0eqv.)二異丙基乙基胺(DIPEA)。將所得溶液加至上文處理的樹脂連接的毒蜥外泌肽-4 Seq ID.3126-樹脂。將混合物在25℃處理18h。在該時間結束時，過濾樹脂並用無水DMF(5ml x 5)、二氯甲烷(5ml x 5)、異丙醇(5ml x 5)和乙醚(5ml x 5)洗滌。
將上述樹脂連接的肽-連接子接合物用10ml含三氟乙酸(TFA)/三乙基甲矽烷(TES)/二硫蘇糖醇(DTT)/苯甲硫醚/水(100/2/3/1/2)的溶液處理。將反應混合物在25℃振盪3h。在反應結束時，濾出溶劑並用二氯甲烷(5 x 10ml)洗滌樹脂。減壓濃縮濾液。將殘餘物傾入50ml冰冷的醚中。白色固體析出。將混合物離心並傾析。用乙醚(2 X 20ml)洗滌固體。藉由反相HPLC (30 x 100mm C18柱，25-40% AcCN/H2O w/0.1% TFA於20min內)純化肽-連接子。收集適當級分並蒸發至乾，得到16mg期望產物，其為白色固體。藉由質譜鑒定產物(分子離子峰，m/z 1469,z=3)。
實例10
根據以下流程合成GLP/升糖素巰基連接子2：
向於肽合成容器中在rink樹脂上的1.8g樹脂連接的Fmoc-保護的毒蜥外泌肽-4 Seq.ID.26中加入20ml 20%六氫吡啶/DMF並將反應混合物攪拌5分鐘。重複該過程三次。隨後將樹脂連接的肽用20ml DMF洗滌三次。
向163mg(2,5eqv.)Fmoc-D-Ala-OH、199mg(2,5eqv.)HATU和71mg(2.5eqv.)HOAt中加入15ml無水DMF中。向該溶液中加入92μl(2.5eqv.)二異丙基乙基胺(DIPEA)。將所得溶液加至上文處理的樹脂連接的毒蜥外泌肽-4 Seq ID.26-樹脂中。將混合物在25℃處理16h。在該時間結束時，過濾樹脂並用無水DMF(20ml x 5)、二氯甲烷(20ml x 5)、異丙醇(20ml x 5)和乙醚(20ml x 5)洗滌。
向於肽合成容器中在rink樹脂上的上述樹脂連接的D-Ala-毒蜥外泌肽- 4-Seq ID.26中加入15ml 20%六氫吡啶/DMF並將反應混合物攪拌5分鐘。重複該過程三次。隨後將樹脂連接的肽用15ml DMF洗滌三次。
向352mg(2,5eqv.)連接子2a中加入15mL無水DMF。向該溶液中加入92μl(2.5eqv.)二異丙基乙基胺(DIPEA)。將所得溶液加至上文處理的樹脂連接的D-Ala-毒蜥外泌肽-4 Seq ID.26-樹脂中。將混合物在25℃處理16h。在該時間結束時，將樹脂過濾並用無水DMF(15ml x 5)、二氯甲烷(15ml x 5)、異丙醇(15ml x 5)和乙醚(15ml x 5)洗滌。
將上述樹脂連接的肽-連接子接合物用40ml含三氟乙酸(TFA)/三乙基甲矽烷(TES)/二硫蘇糖醇(DTT)/苯甲硫醚/水(100/2/3/1/2)的溶液處理。將反應混合物在25℃振盪1h。在反應結束時，過濾溶劑。將濾液傾至400ml冰冷的水中。白色固體析出。將混合物離心並傾析。用乙醚(2 X 200ml)洗滌固體。藉由反相HPLC(30 x 100mm C18柱，25-40% AcCN/H2O w/0.1% TFA於20min內)純化肽-連接子。收集適當的級分並蒸發至乾，得到104mg期望產物，其為白色固體。藉由質譜鑒定產物(分子離子峰，m/z 1465.3,z=3和m/z 1099.2,z=4)。
玻尿酸水凝膠的合成
實例11.
根據以下流程合成二乙烯基碸交聯的玻尿酸：
實例11a
伴隨攪拌向0.2M氫氧化鈉(168.9g)中加入氯化鈉(23.4g)直至溶解。在快速機械攪拌下向溶液中加入玻尿酸鈉(25.4g,400-500KDa)，繼續攪拌2h。所得聚合物溶液的濃度為約12%w/w。製備二乙烯基碸(0.41mL,0.48g)於異丙醇(1.6mL)中的溶液並歷時約30秒加入(5 x 0.4mL)。將混合物再攪拌2min並傾入23x28x6.5cm玻璃盤中且用塑料罩密封。在室溫靜置4h後，將作為單獨部分的凝膠轉移至1M鹽酸(100.1g)於0.9%鹽水(3kg)中的溶液中。將其在室溫溫和振搖。24h後，溶液的pH為2.28。棄去溶液留下凝膠(416.2g)。然後向凝膠中加入0.9%鹽水(3kg)並將其在室溫溫和振搖18h。在0、2、4、6和8h向混合物中加入1M氫氧化鈉(9.7mL)。將凝膠在室溫再溫和振搖24h，此時凝膠的pH為6.65。將凝膠在2-8℃儲存120h，然後加入10mM磷酸鈉溶液pH 7.4(2L)。將凝膠再振搖21h並棄去洗液留下凝膠(1036.2g)，最終聚合物濃度為2.4%.
實例11b. 二乙烯基碸交聯的玻尿酸的備選合成
向35g玻尿酸鈉中加入946mL無菌水。將反應混合物在2-8℃保持7天，在此期間形成澄清溶液。先該溶液中加入1M 111mL 1.0M氫氧化鈉水溶液並將所得反應混合物劇烈攪拌5min。將反應混合物在2-8℃保持 90min。隨後將6.7mL二乙烯基碸於10mL無菌水中的懸浮液加至聚合物溶液中並將所得反應混合物劇烈攪拌5分鐘。隨後，將反應混合物在2-8℃儲存150分鐘，接著在25℃儲存90分鐘。將由此形成的聚合物凝膠用0.9%無菌鹽水洗滌四天。用1.)M NaOH或1.0M HCl將懸浮液的pH調節至7.0。凝膠懸浮液的最終濃度為0.58%。
實例12
1-(第三丁氧基羰基)胺基3-(3-馬來醯亞胺基丙基)胺基丙烷的合成。
在250ml圓底燒瓶中加入3.0g 1-(第三丁氧基羰基)胺基3-胺基丙烷)和100mL無水氯仿。將反應混合物在25℃攪拌直至形成澄清溶液。伴隨攪拌向該溶液中加入3-馬來醯亞胺基丙酸N-琥珀醯亞胺基酯(5.05g)直至溶解，接著加入3.42mL二異丙基乙基胺。將所得反應混合物在25℃攪拌18h。將溶液用1M鹽酸(50mL)、10%鹽水(50mL)、飽和碳酸氫鈉(50mL)、半飽和鹽水(50mL)洗滌。分離有機相並經無水硫酸鈉乾燥。經由過濾除去硫酸鈉後，減壓濃縮溶液並藉由使用乙酸乙酯：己烷梯度作為流動相的矽膠柱層析純化殘餘物。減壓除去溶劑，接著真空乾燥，得到期望產物，其為灰白色固體(4.03g)。
實例13.
1-(第三丁基氧基羰基)胺基8-(3-馬來醯亞胺基丙基)胺基-3,6-二氧雜辛烷的合成
在100mL圓底燒瓶中加入1-(第三丁基氧基羰基)胺基8-胺基-3,6-二氧雜辛烷(1.007g)和25mL無水乙腈(25mL)。將反應混合物在氮氣下攪拌直至溶解。向該溶液中加入3-馬來醯亞胺基丙酸N-琥珀醯亞胺基酯(1.302g)並經反應混合物在氮氣下在25℃攪拌6h。在該時間結束時，減壓除去溶劑。藉由使用含2-6%甲醇的二氯甲烷的矽膠柱層析純化殘餘物。減壓除去溶劑並真空乾燥殘餘物後，得到1.08g期望產物，其為灰白色固體。
實例14.
3-(3-馬來醯亞胺基-丙基)胺基丙烷官能化的玻尿酸的合成。
向15g二乙烯基碸交聯的懸浮液(實例1)中加入45ml去離子(DI)水並將所得懸浮液在25℃攪拌10分鐘。向懸浮液中加入45ml乙醇後，將其再攪拌60min。接著加入60mL乙醇並攪拌10分鐘。向該懸浮液中加入溶於5mL乙醇中的0.24g 4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-嗎啉鎓氯化物(DMT-MM)。將所得反應混合物在25℃攪拌60分鐘。向溶於2mL無水二氯甲烷中的70mg 1-(第三丁氧基羰基)胺基3-(3-馬來醯亞胺基丙基)胺基丙烷(實例2)中加入2mL三氟乙酸。將所得反應混合物在室溫攪拌2h。減壓濃縮該溶液。將所得殘餘物用3mL甲醇處理並蒸發至乾。再一次重複該過程 後，將殘餘物溶於乙醇(5mL)中並用10% N-甲基嗎啉/乙醇將pH調節至6-6.5。將所得溶液加至上述玻尿酸懸浮液中。用乙醇(5mL)淋洗小瓶並向其中加入漿液。在25℃攪拌18h後，向反應混合物中加入飽和鹽水(2mL)。將懸浮液用乙醇(3 x 30mL,2 x 15mL)處理，使聚合物凝膠析出。將反應混合物在4000rpm離心並傾析上清液。將殘餘物在DI水(20mL)中水化約20min並從乙醇(4 x 10mL)中析出。葡糖醯胺測定方法表明取代的程度為19mole%。
實例15.
3-(3-馬來醯亞胺基-丙基)胺基丙烷官能化的玻尿酸的合成。
向20g二乙烯基碸交聯的懸浮液(實例1)中加入60ml去離子(DI)水並將所得懸浮液在25℃攪拌10分鐘。向懸浮液中加入60ml乙醇後，將其再攪拌60min。接著加入60mL乙醇並攪拌10分鐘。向該懸浮液中加入溶於10mL乙醇中的0.325g DMT-MM。將所得反應混合物在25℃攪拌60分鐘。向溶於2.5mL無水二氯甲烷中的0.38g 1-(第三丁氧基羰基)胺基3-(3-馬來醯亞胺基丙基)胺基丙烷(實例2)中加入2.5mL三氟乙酸。將所得反應混合物在室溫攪拌2h。減壓濃縮該溶液。用3mL甲醇處理所得殘餘物並蒸發至乾。再一次重複該過程，將殘餘物溶於乙醇(5mL)中並用10% N-甲基嗎啉/乙醇調節pH至6-6.5。將所得溶液加至上述玻尿酸懸浮液中。用乙醇(5mL)淋洗小瓶中並向其中加入漿液。在25℃攪拌18h後，向反應混合物中加入飽和鹽水(2mL)。將懸浮液用乙醇(3 x 30mL,2 x 15mL)處理使聚合物凝膠析出。將反應混合物在4000rpm離心並將上清液傾析。將殘餘物在DI水(20mL)中水化約20min並從乙醇(4 x 10mL)中析出。葡糖醯胺測定方法表明取代的程度為24mole%。
實例16a
用於合成3-(3-馬來醯亞胺基-丙基)胺基丙烷官能化的HA水凝膠的一般方法
向適量二乙烯基碸交聯的HA懸浮液(實例11b)中加入無菌鹽水，以獲得濃度為約1% w/v的凝膠。將所得懸浮液在25℃攪拌15-30分鐘。將水混溶性有機溶劑(較佳乙醇)加至懸浮液中並將所得懸浮液再攪拌30-60min。向該懸浮液中加入適量4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-嗎啉鎓氯化物(DMT-MM)的乙醇溶液。將含DMT-MM溶液的容器用乙醇淋洗兩次並將洗液加至上述懸浮液中。將所得反應混合物在25℃攪拌90分鐘。將適量1-(第三丁氧基羰基)胺基3-(3-馬來醯亞胺基丙基)胺基丙烷溶於二氯甲烷中。向該溶液中加入三氟乙酸，得到1：1(v/v)溶液。在室溫攪拌60-90分鐘後，將反應混合物減壓蒸發至乾。將殘餘物溶於乙醇中並加至上述懸浮液中。將含馬來醯亞胺衍生物的容器用乙醇淋洗兩次並將洗液加至懸浮液中。使用有機碱或無機碱(例如10%N-甲基嗎啉/乙醇)將懸浮液的pH調節至pH 6.4-6.6。在25℃攪拌16-20h後，將懸浮液用乙醇處理至體積為60-65% v/v。藉由在120G離心接著傾析上清液或者向系統施加輕微超壓的N2氣體並經垂熔玻璃或濾膜過濾從反應混合物中除去溶劑。隨後在pH 3.8用20mM琥珀酸鹽鹽水(0.9%)處理殘餘物約15-20min並藉由加入乙醇至體積為60-65% v/v使其析出。遵循上述操作從反應混合物中除去溶劑。再一次重複該操作。
實例16b
取代程度為20mole%的3-(3-馬來醯亞胺基-丙基)胺基丙烷官能化的 HA水凝膠的合成。
向5.65g HA水凝膠懸浮液(實例11b)中加入7.5mL無菌鹽水並將所得懸浮液溫和攪拌15分鐘。向該懸浮液中加入3mL乙醇並將所得反應混合物溫和攪拌60min。向該懸浮液中加入溶於3mL乙醇中的94mg DMT-MM。用乙醇(2 x 1mL)洗滌含DMT-MM的小瓶並將洗液加至懸浮液中。將反應混合物在環境溫度溫和攪拌90分鐘。向21.7mg 1-(第三丁氧基羰基)胺基3-(3-馬來醯亞胺基丙基)胺基丙烷中加入0.25mL二氯甲烷並將反應混合物溫和混合直至形成澄清溶液。向該溶液中加入0.25mL三氟乙酸並在環境溫度溫和混合75min。隨後，將溶液蒸發至乾。將殘餘物溶於3mL乙醇中並將所得溶液加至上述水凝膠懸浮液中。用乙醇(2 x 1mL)洗滌含馬來醯亞胺試劑的小瓶並將洗液加至反應混合物中。然後使用10% v/v N-甲基嗎啉/乙醇將反應混合物的pH調節至6.41並將所得反應混合物在環境溫度溫和振盪18小時。在該時間結束時，藉由用1.0M HCl處理將反應混合物的pH調節至pH 3.89。藉由加入乙醇(4 x 3.5mL)使凝膠析出。將懸浮液在120G在20℃離心2min並使用移液管小心地除去上清液。藉由溫和振盪/混合將殘餘物於12mL 20.0mM SBS緩衝液(pH 3.8)中再次水化15分鐘。使懸浮液經受額外的乙醇處理(4 x 5ml,1 x 4mL)。每次乙醇處理後，將懸浮液在120G在20℃離心2min，接著小心除去上清液。最後，將小瓶倒置，使其排空15分鐘並傾析上清液得到0.8876g濕凝膠。
實例16c
3-(3-馬來醯亞胺基-丙基)胺基丙烷官能化的玻尿酸的合成。
向10g二乙烯基碸交聯的懸浮液(實例11a)中加入40ml去離子(DI)水並將所得懸浮液在25℃攪拌10分鐘。向懸浮液中加入30ml乙醇後，將其再攪 拌60分鐘。接著加入60mL乙醇並攪拌10分鐘。向該懸浮液中加入溶於7.5mL乙醇中的0.162g DMT-MM。將所得反應混合物在25℃攪拌60分鐘。向溶於0.5mL無水二氯甲烷中的29mg 1-(第三丁氧基羰基)胺基3-(3-馬來醯亞胺基丙基)胺基丙烷(實例2)中加入0.5mL三氟乙酸。將所得反應混合物在室溫攪拌2h。減壓濃縮該溶液。用2mL甲醇處理所得殘餘物並蒸發至乾。再一次重複該過程後，將殘餘物溶於乙醇(7.5mL)和9.5μL N-甲基嗎啉中。將該溶液加至上述玻尿酸懸浮液中並使用N-甲基嗎啉將pH調節至7.1。用乙醇(5mL)淋洗小瓶並加至漿液中。在25℃攪拌21h後，加入飽和鹽水(2mL)並藉由加入乙醇(4 x 15mL)使凝膠析出。使漿液沉降15min並傾析上清液。將水凝膠於20mM PBS pH5(35mL)中水化並藉由加入乙醇(5 x 15mL)使其析出。重複該過程，將樣品在2500rpm離心1.5min，並傾析上清液。葡糖醯胺測定方法表明取代的程度為24mole%。
實例17
8-(3-馬來醯亞胺基丙基)胺基-3,6-二氧雜辛烷官能化的玻尿酸的合成。
在250mL圓底燒瓶中加入0.5g凍乾的HA(實例11a)和50mL 0.9%鹽水溶液。將反應混合物在25℃溫和攪拌1小時。向該懸浮液中加入40mL乙醇並將懸浮液攪拌5min。在10mL小瓶中加入0.35g DMT-MM和5mL乙醇。將溶液加至HA懸浮液中。用5mL乙醇淋洗小瓶並加至懸浮液中。將所得反應混合物在25℃攪拌1h。隨後，將溶於0.5mL無水二氯甲烷中的86mg 1-(第三丁基氧基羰基)胺基8-(3-馬來醯亞胺基丙基)胺基-3,6-二氧雜辛烷用0.5mL三氟乙酸處理。將溶液在室溫攪拌1h。減壓濃縮該溶液，溶於2mL乙醇中並減壓蒸發至乾。重複乙醇處理兩次。將殘餘物溶於5mL乙醇/水 (1：1)中並使用N-甲基嗎啉(60μL)調節溶液的pH至6.5。將所得溶液加至上述懸浮液中。在25℃攪拌4h，用0.1M HCl將懸浮液的pH調節至3.75並藉由加入乙醇(7 x 25mL)使凝膠析出。使漿液沉降30min並藉由傾析除去80%上清液。將剩餘懸浮液在1500rpm離心5min。除去溶劑後，將殘餘物用0.9%鹽水處理並從乙醇(7 x 15mL)中析出。藉由凍乾將殘餘物乾燥。藉由葡糖醯胺測定確定，發現取代的程度為7.3mol%。
實例18
含2-吡啶基二巰基的玻尿酸的合成。
以滴加的方式向快速攪拌的溶於24mL去離子水中的200mg玻尿酸鈉(分子量=500kDa)中加入16mL乙腈。完成加入乙腈後，先後向反應混合物中加入17.6mg氯二甲氧基三嗪於2mL水/乙腈(1：1)中的溶液和2078L N-甲基嗎啉。將反應混合物在25℃攪拌1h。隨後，加入溶於1mL去離子水中的26.8mg 2-((3-硝基吡啶-2-基)硫基)乙胺鹽酸鹽。將反應混合物攪拌18h。藉由加入1M HCl將反應混合物的pH調節至6.0。向所得反應混合物中加入15mL預先洗滌的Amberlite® CG-120(Na+形式)並將反應混合物攪拌20分鐘。濾出樹脂並用去離子水(2 x 5mL)洗滌。重複Amberlite® CG-120(Na+形式)處理過程兩次。用水稀釋該溶液，形成含20vol%乙腈的溶液。使用Macrosep®離心設備(30K分子量篩截(molecular weight cutoff))將溶液自旋過濾。用去離子水(5 x 200ml)洗滌截留物。將截留物合並且凍乾，得到120mg產物，其為灰白色固體。修飾的程度為10%。遵循類似的操作，使用分子量為70kDa的玻尿酸鈉合成另一種含2-吡啶基二巰基的玻尿酸。
實例19
可溶性馬來醯亞胺官能化的HA的合成
在100mL燒瓶中加入200mg玻尿酸鈉鹽(分子量=500kDa)和24ml DI水。將其攪拌直至獲得澄清溶液。向快速攪拌的HA溶液中加入16mL乙醇。與N-甲基嗎啉(2078l,0.2mmol)一起加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓氯化物(55mg,0.2mmol)於水/乙醇中的溶液並將反應混合物陳化1小時。加入1-(2-(2-胺基乙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮‧三氟乙酸鹽(60mg,0.2mmol)的水溶液。將反應混合物放置過夜。將pH調節至微酸性並向反應混合物中加入預先洗滌的Amberlite® CG-120,Na+形式(15ml)且攪拌20分鐘。濾出樹脂並用水洗滌。向濾液中再次加入預先洗滌的Amberlite® CG-120,Na+形式(15ml)並進行如上所述相同的操作。再一次重複整個循環。用水稀釋溶液形成含<20%乙醇的水溶液。使用四台Macrosep®離心設備(PALL,30K分子量篩截，5000rpm,15分鐘自旋時間)將溶液自旋過濾。每次藉由在其上輕觸刮刀並劇烈振盪密封設備來清理膜。用去離子水(>200ml)洗滌截留物若干次。合並所得經修飾的HA濃縮物且凍乾。回收率為50-75%。根據NMR，修飾的程度為約20%。
實例20
玻尿酸水凝膠中馬來醯亞胺含量的估計。
藉由比色分析法進行摻入HA水凝膠中的馬來醯亞胺基團的估計。如下製備5-硫基2-硝基苯甲酸：在pH 7.5在PBS緩衝液中用三-(2-羰基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)還原5,5’-二硫基雙-(2-硝基苯甲酸)。使用20mol%過量的5,5’-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)以防止與TCEP的副反應。將預定量的馬來醯亞胺官能化的水凝膠懸浮於pH 3.5的20mM琥珀酸鹽緩衝鹽水(SBS)中。向水凝膠懸浮液中加入上述5-硫基2-硝基苯甲酸溶液並將反應混合物渦旋混合(2 x 10秒)且隨後在25℃溫和攪拌45min。隨後將懸浮液在25℃離心10min並取出上清液的等分試樣。在412nm測量上清液的吸收度。使用校準曲線估計溶液中5-硫基2-硝基苯甲酸的濃度。水凝膠中的馬來醯亞胺濃度等於所反應的巰基的莫耳數，其從所加的5-硫基2-硝基苯甲酸的量與上清液中存在的量的差異來計算。
實例21
近紅外染料(IRDye800CW)接合的HA水凝膠的合成。
實例21 a. 3-硝基-2-(2’-胺基-乙基二硫烷基)吡啶鹽酸鹽(NEA)接合的二乙烯基碸交聯的玻尿酸的合成。
將含5.1g(23mg/g水)二乙烯基碸交聯的玻尿酸水凝膠(實例5)和20mL無菌水的懸浮液在25℃溫和攪拌15min。向該懸浮液中加入乙醇(20mL)並將所得反應混合物在25℃攪拌1小時。向該懸浮液中加入溶於5mL乙醇中的0.081g DMT-MM。用2.5mL乙醇淋洗含有DMT-MM溶液的小瓶並將洗液加至懸浮液中。將反應混合物在25℃攪拌1小時，接著加入0.017g NEA。將反應混合物在25℃攪拌22h後，向凝膠中加入2mL鹽水。藉由離心除去溶劑並藉由多次乙醇處理(4 x 10mL,1 x 5mL)洗滌殘餘物。將懸浮液在2500rpm離心5min，接著在5000rpm離心5min(離心的溫度保持在5℃)。傾析上清液並使殘餘物在無菌水(20mL)中平衡20min。隨後，使其經受兩次 乙醇處理(4 x 10mL)。使漿液沉降30min並傾析上清液。再一次重複乙醇處理過程並將濕凝膠儲存在2℃直至下一步驟。
實例21b. NIR染料接合的HA水凝膠的合成。
在無菌條件下，將0.224g NEA修飾的玻尿酸(實例15a)和13mL無菌水置於50mL無菌反應小瓶中並將混合物在25℃溫和振盪15min。向該懸浮液中加入20mL乙醇並將懸浮液在25℃攪拌1小時。隨後，向懸浮液中加入14mg TCEP並將反應混合物在25℃攪拌16小時。在反應結束時，向反應混合物中加入2mL鹽水。隨後，使凝膠經受5個循環的乙醇處理(5mL)和離心(5000rpm,5min.,5℃)。除去上清液後，用10mL 0.9%無菌鹽水處理殘餘物，接著如上所述進行5輪乙醇(5mL)處理和離心。將殘餘物懸浮於10mL無菌0.9%鹽水中。使用無菌脫氫濾器向該懸浮液中加入溶於無菌0.9%鹽水(3mL)中的1.8mg馬來醯亞胺官能化的IRDye800CW。用5mL乙醇和乙醇/鹽水1：1(2 x 5mL)淋洗濾器並將洗液加至反應混合物中。將反應容器在25℃暗處溫和振搖2小時並在2℃保持66h。隨後，向反應混合物中加入溶於3mL乙醇中的11.5mg N-甲基馬來醯亞胺並將懸浮液在25℃再溫和振盪3小時。反應結束時，將懸浮液離心(5000rpm,5℃,2 x 15min)並除去20mL上清液。剩餘懸浮液從乙醇(5 x 5mL)中析出並進一步離心(5000rpm,5℃,5min)，然後傾析上清液。先後向殘餘物中加入10mL 0.9%無菌鹽水和5mL乙醇。將懸浮液離心(5000rpm,5min,5℃)並傾析懸浮液。重複乙醇處理和離心過程四次。用10mL無菌0.9%鹽水處理殘餘物並藉由用鋁箔包裹小瓶在暗處在2℃儲存。
連接子硫基肽與馬來醯亞胺官能化的HA水凝膠的接合
實例22
帶有以巰基結尾的示踪-連接子的肽與馬來醯亞胺官能化的HA水凝膠的一般操作。
在具有中度多孔性玻璃料或濾器的無菌和脫氫反應器中加入適量馬來醯亞胺修飾的HA水凝膠(實例3)。隨後，向反應混合物中加入適量無菌過濾的20mMol SB緩衝液(含15% v/v聚乙二醇和0.01% w/v Tween 20,pH 3.8)，從而使得所得懸浮液的濃度為約1%w/w。伴隨溫和振盪使懸浮液混合30-90分鐘。在該時間結束時，向反應器中加入適量溶於無水過濾的20mMol SB緩衝液(含15% v/v聚乙二醇和0.01% w/v Tween 20,pH 3.8)中的帶有以巰基結尾的示踪-連接子的肽並使所得反應混合物在環境溫度溫和振盪1.5-24小時。在反應結束時，藉由使用輕微過大壓力的氮氣過濾或藉由將懸浮液離心除去上清液。用無菌過濾的20mM SBS緩衝液(含15% v/v聚乙二醇和0.01% w/v Tween 20,pH 3.0)處理殘餘物製備懸浮液0.7w/v%，振盪3分鐘，離心並藉由傾析除去上清液。重複該過程五次。用溶於無菌過濾的20mM SBS緩衝液(含15% v/v聚乙二醇和0.01% w/v Tween 20,pH 3.0)中的10mM 1-羥基-2-巰基乙烷的溶液處理殘餘物製備約1wt%懸浮液並伴隨溫和振盪/混合而溫和攪拌30分鐘。先後藉由如上所述的離心和傾析除去溶劑。重複1-羥基-2-巰基乙烷處理的過程四次。將殘餘物懸浮於無菌過濾的20mM SBS緩衝液(含15% v/v聚乙二醇和0.01% w/v Tween 20,pH 3.0)中製備濃度為約0.5wt%的懸浮液，然後混合3分鐘，接著藉由離心和傾析除去。將所得殘餘物懸浮於20mM SBS緩衝液(含15% v/v聚乙二醇和0.01% w/v Tween 20,pH 6.5)中製備0.7wt%懸浮液並攪拌20分鐘且過濾。再一次重複該過程後，將殘餘物懸浮於20mM SBS緩衝液(含15% v/v聚乙二醇和0.01% w/v Tween 20,pH 4.5)中製備0.5wt.%懸浮液，攪拌15分鐘，然後過濾。重複該過程一次。將殘餘物懸浮於無菌水(pH 4.5)中，攪拌5分鐘，然 後過濾。重複該過程五次。使用無菌膜濾器無菌過濾殘餘物並凍乾。
含連接子7的巰基官能化的毒蜥外泌肽-4 Seq ID No.26與馬來醯亞胺官能化的玻尿酸的接合。
向53mg 3-(3-馬來醯亞胺基丙基)胺基丙烷修飾的DVS-HA水凝膠(實例15)中加入7mL含0.01wt% Tween® 20，聚乙二醇(15% v/v)的20mM SBS。緩衝液的pH為3.8。將懸浮液在25℃溫和振搖90min。向該懸浮液中加入溶於1ml上述緩衝液中的2.1mg具有實例7的連接子的巰基官能化的毒蜥外泌肽-4 Seq ID 26。用緩衝液(2 x 0.5mL)淋洗肽小瓶並將洗液加至懸浮液中。將反應混合物在25℃溫和振搖18h。隨後將懸浮液在1750rpm離心2min並小心地傾析上清液。將水凝膠懸浮於10mL 20mM含0.01wt% Tween® 20、丙二醇15% v/v的SBS緩衝液(pH 3)中，攪拌2min，在1750rpm離心2min，然後傾析溶劑。再重複該過程四次。用溶於20mM SBS pH 3中的2mL 10mM 1-羥基-2-巰基乙烷處理殘餘物並使反應進行30min。將反應混合物在2000rpm離心2min並傾析溶劑。再重複該過程三次。將殘餘物懸 浮於10mL含0.01wt% Tween® 20的20mM SBS(pH 3)中，攪拌2min，在離心並傾析溶劑。隨後將殘餘物懸浮於10mL含0.01wt% Tween® 20的酸化的無菌水(pH 3.5)中，攪拌10min，在5000rpm離心5min並傾析溶劑。用8mL、7mL和6mL上述酸化的無菌水重複該過程。凍乾樣品得到78mg HA水凝膠接合的肽，其為灰白色固體，水凝膠中的肽載量為4wt.%。
實例23
含連接子的巰基官能化的毒蜥外泌肽-4 Seq ID 26與馬來醯亞胺官能化的玻尿酸的接合。
使用脫氧的緩衝液且在氮氣氣氛下進行反應和後處理。向36mg 3-(3-馬來醯亞胺基丙基)胺基丙烷修飾的DVS-HA水凝膠(實例15)中加入6mL 20mM SBS(含0.01wt% Tween® 20,10% v/v丙二醇)。將介質的pH調節至6。將懸浮液在25℃溫和振盪30min。向該懸浮液中加入溶於1ml上述緩衝液(pH 6)中的2.4mg具有連接子的巰基官能化的毒蜥外泌肽-4 Seq ID 26(實例7)。用緩衝液(2 x 0.5mL)淋洗肽小瓶並將洗液加至懸浮液中。將反應混合物在25℃溫和振盪90min。隨後將懸浮液在4000rpm離心2min並小心地傾析上清液。將水凝膠懸浮於10mL 20mM SBS緩衝液(pH 3)(含0.01wt% Tween® 20和丙二醇15% v/v)中，混合2min，在3005G離心2min，然後傾析溶劑。再重複該過程四次。用溶於20mM SBS pH 3中的2mL 10mM 1-羥基-2-巰基乙烷處理殘餘物，在4000rpm離心2min並傾析溶劑。再重複該過程三次。將殘餘物懸浮於10mL含0.01wt% Tween® 20的20mM SBS(pH 3)中，混合2min，在4000rpm離心2min並傾析溶劑。再重複該過程四次。將殘餘物懸浮於含0.01wt% Tween® 20的酸化的(pH 3.5)無菌水中，混合10min，在5000rpm離心5min並傾析溶劑。用8mL、7mL和6mL上述無菌 水重複該過程。凍乾殘餘物得到31mg HA接合的肽，其為灰白色固體，水凝膠中的肽載量為2.4wt%。
實例24
用於估計水凝膠-肽接合物中肽載量的操作。
將預定量HA水凝膠-肽接合物懸浮於CHES緩衝液(pH9.5)中並使懸浮液在70℃溫和攪拌。將懸浮液離心並藉由HPLC方法分析等分試樣的肽含量。該HPLC方法包括使用q C-18 Kinetics柱(內徑=4.6mm和長度=100mm，粒徑2.6μm,Phenomenex)，使用Agilent 1100 LC。流動相A的組成為90%水/10%乙腈/0.1%三氟乙酸(TFA)且流動相B的組成為10%乙腈/90%水/0.09% TFA。梯度在8分鐘內由流動相25% B至55% B。流速保持在1mL/min。純肽用作定量從水凝膠中釋放的肽的標準物。
實例25
HA水凝膠的體內滯留時間的確定。
藉由磁共振(MR)成像研究皮下區域中水凝膠體內滯留時間。水凝膠內水質子對比度的强度用於評估水凝膠體內滯留時間。為此，使用CAnN.Cg-Foxnlnu/Crl小鼠作為實驗動物。遵循所有經批准的動物護理流程使用31G針頭注射該水凝膠。在一段時間內定時採集注射部位的MR圖像。在一組中，注射該水凝膠，而在另一組中，使用含1：1(w/w)混合物水凝膠和800,000Da可溶性HA的懸浮液。在純水凝膠的情况下，凝膠歷時3周是明顯的，伴隨强度的緩慢損失(圖2)。另一態樣，對於含可溶性HA的混合物，在第1天强烈的MR信號在第4天顯著降低(2)。這表明，為了改善聚合物載體的滯留時間，需要將其交聯以獲得非常高的分子量。
圖2a. 作為時間的函數的HA水凝膠在注射部位的圖像的MR。
圖2b. 作為時間的函數的含1：1(w/w)HA水凝膠-800kDa可溶性HA的聚合物懸浮液在注射部位的圖像的MR。
實例26
體外釋放動力學
將GLP-1/升糖素激動劑連接子水凝膠8(0.5mg GLP-1/升糖素激動劑)的等分試樣轉移至裝配有垂熔濾器的注射器中並用pH 7.4磷酸緩衝液(60mM,3mM EDTA,0.01% Tween-20)洗滌5次。將水凝膠懸浮於相同緩衝液中並在37℃溫育。在規定的時間點(各自在1-7天溫育時間後)交換上清液並藉由RP-HPLC在215nm定量所釋放的GLP-1/升糖素激動劑。將對應於所釋放的GLP-1/升糖素激動劑的UV-信號積分並針對溫育時間作圖。
應用曲線擬合軟件估計對應的釋放半衰期。
圖3. 具有連接子的毒蜥外泌肽-4 Seq ID 26雙重激動劑從HA水凝膠(實例23)中的體外釋放動力學。半衰期為約5天。
實例27
對GLP-1受體、升糖素受體和GIP受體效力的體外細胞測定
藉由功能測定確定肽對所述受體的激動作用，所述功能測定測量穩定表達人GIP、GLP-1或升糖素受體的HEK-293細胞系的cAMP應答。
使用來自Cisbio Corp.的基於HTRF(均相時間分辨螢光(Homogeneous Time Resolved Fluorescence))的套組(目錄號62AM4PEC)確定細胞的cAMP含量。對於製備，細胞被分至T175培養瓶並在培養基(DMEM/10% FBS)中生長過夜至接近匯合。然後去除培養基且用不含鈣和鎂的PBS洗滌細 胞，隨後用Accutase(Sigma-Aldrich目錄號A6964)進行蛋白酶處理。洗滌脫離的細胞並重懸於測定緩衝液(1 x HBSS；20mM HEPES，0.1% BSA，2mM IBMX)並確定細胞密度。其然後被稀釋至400000個細胞/ml且25μl-等分試樣被分配至96孔板的孔中。對於測量，將25μl於測定緩衝液中的測試化合物添加至孔中，接著在室溫溫育30分鐘。在添加稀釋於裂解緩衝液(套組組分)的HTRF試劑後，將測定板溫育1小時，接著在665/620nm測量螢光比率。藉由確定引起最大應答的50%活化的濃度(EC50)來定量激動劑的體外效力。
實例28
雌性糖尿病dbdb-小鼠中的葡萄糖降低
使用在研究開始時24-27周齡的雌性糖尿病dbdb-小鼠(BKS.CG-m +/+ Lepr(db)/J)。使達到10-13周齡的小鼠適應餵養和居住條件至少1周，然後用於第一個研究中，並在至少2周的清除期(washout period)後最終再用於本研究。研究開始前19天，確定個體的HbA1c值以用於將動物分級，然後將動物分配至4組(每組N=8)，以提供盡可能相等的平均HbA1c值。在整個研究期間動物可隨意獲取食物和水。在研究的第一天，利用媒介物(無菌琥珀酸鹽緩衝液)或稀釋於媒介物中的劑量為50、100和200nmol/kg的實例23的GLP-1/升糖素激動劑Seq.ID 26的HA-接合物進行單獨皮下處理(08：00-09：00 am)，在該處理前和處理後4小時確定來自尾尖切口的血糖。此後在接下來的16天均在類似的白天時間(08：00-09：00 am)進行每日血糖測量，除了第11天和第12天(周末)之外。此外，每天監測食物攝取和水消耗。藉由雙因素ANOVA對重複的測量值分析葡萄糖數據，接著進行Dunnett事後檢驗，顯著性水平為p<0.05。先後使用顯著性水平為p<0.05的單因素 ANOVA和Dunnett事後檢驗完成葡萄糖AUC分析。
圖4示出一次注射不同劑量的具有Seq.ID 26的HA-GLP-1/升糖素激動劑接合物後，相對於時間的血糖濃度(相對於基線)。
實例28b雌性糖尿病dbdb-小鼠中的葡萄糖降低效應
雌性、肥胖性糖尿病db/db-小鼠(BKS.CG-m+/+Lepr(db)/J和健康、瘦的對照(BKS.Cg-m +/+ Lepr(db)/J)達到10-11周齡並適應餵養和飼養條件。在12-13周齡，確定個體的HbA1c值以用於將動物分級，然後將動物分配至不同的組(每組N=8)。目的是提供盡可能相等的平均HbA1c值。在13-14周齡，2組db/db小鼠接受皮下注射(s.c.)100nmol/kg體重的單劑量的可溶性或交聯HA與Seq.ID 26的接合物。與此同時以及在第7天的第二時間，第三組db/db小鼠和健康瘦的對照小鼠接受皮下注射比例為1：1的琥珀酸鹽緩衝液和可溶性HA。在所有組中，注射5ml/kg體重的總體積。在臨處理前(08：00-09：00 am)和處理後四小時以及此後每天08：00-09：00 am，測定晨飼(Morning-fed)血糖濃度。從尾尖切口收集血液並經手持式血糖儀(Accu Check)確定濃度。在整個研究期間動物可隨意獲取食物和水。
圖4b示出一次注射具有Seq.ID 26的交聯和可溶性HA-GLP-1/升糖素激動劑接合物後，相對於時間的血糖濃度(相對於基線)。
實例28c
雌性糖尿病db/db-小鼠中的葡萄糖降低效應
到達後，使雌性、肥胖性糖尿病db/db-小鼠(BKS.CG-m +/+ Lepr(db)/J)適應餵養和飼養條件並在開始研究時為12周齡。在預投予階段的第10天確定個體的HbA1c值用於將動物分級，然後將動物分配至不同的 組(每組N=8)。目的是提供盡可能相等的平均HbA1c值。在投予階段的第1天，db/db小鼠接受皮下注射單劑量12.75mg/kg體重的任一具有Seq ID 45、46、48和49的接合物。媒介物組的Db/db動物接受皮下PBS注射。在所有組中，注射10ml/kg體重的總體積。在投予階段的第1天在臨處理前(08：00-09：00 am)和處理後四小時以及此後每天08：00-09：00 am，測定晨飼血糖濃度。從尾尖切口收集血液並經手持式血糖儀(Accu Check)確定濃度。在整個研究期間動物可隨意獲取食物和水。
圖4c示出一次注射不同劑量的具有Seq.ID 45、46、48的HA-GLP-1/升糖素激動劑接合物後，相對於時間的血糖濃度(相對於基線)。
圖4d示出一次注射不同劑量的具有Seq.ID 49的HA-GLP-1/升糖素激動劑接合物後，相對於時間的血糖濃度(相對於基線)。
實例29
可注射性研究
藉由將適量肽接合物分散至20mM琥珀酸鹽緩衝鹽水(SBS)(pH 4.5)中製備3.75%(mg/mL)HA-肽接合物的懸浮液。在另一小瓶中，藉由將凍乾的HA溶於20mM SBS(pH 4.5)中製備天然HA聚合物的2%(mg/mL)溶液。使兩種樣品均在2-8℃水化24至48小時。使小瓶升至室溫。在室溫平衡後，在3mL注射器中取1mL肽-HA水凝膠接合物懸浮液和HA。向該懸浮液中加入0.25mL可溶性HA溶液。所得懸浮液在兩隻3mL注射器間經受20次來回混合。將大約220μl該懸浮液加至1ml注射器中。該注射器與30g,½英寸針頭連接。確保針頭未填裝受試物質。將含該懸浮液的注射器裝載至Instron儀器的注射器固定裝置中並使Instron的十字頭與注射器的柱塞對齊。調整十字頭的速度以達到目標注射速率。開始進行測試。對於每種樣 品，進行三次測量且所呈現的結果為這些測量值的平均數。針對不同肽-HA水凝膠接合物的注射力的結果示於表4。
圖5示出藉由按壓液體經過與1mL注射器連接的2.5cm長30G針頭的平均擠壓力。清楚地表明，HA水凝膠上越高的肽載量導致越低的擠壓力並由此增强可注射性。
<110> SANOFI
<120> 包含GLP-1/升糖素雙重激動劑連接子玻尿酸接合物之前藥
<130> DE2015/xxx EP-60235P EP
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> PRT
<213> 美國毒蜥(Heloderma suspectum)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 1
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 2
<210> 3
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
<210> 4
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 4
<210> 5
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 5
<210> 6
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is D-Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 6
<210> 7
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is D-Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 7
<210> 8
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 8
<210> 9
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 9
<210> 10
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exeudin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 10
<210> 11
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 11
<210> 12
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 12
<210> 13
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 13
<210> 14
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 14
<210> 15
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 15
<210> 16
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 16
<210> 17
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is D-Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 17
<210> 18
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is D-Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 18
<210> 19
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 19
<210> 20
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 20
<210> 21
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is D-Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 21
<210> 22
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is D-Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 22
<210> 23
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 23
<210> 24
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 24
<210> 25
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is D-Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 25
<210> 26
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 26
<210> 27
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 27
<210> 28
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 28
<210> 29
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 29
<210> 30
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 30
<210> 31
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 31
<210> 32
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 32
<210> 33
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is D-Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 33
<210> 34
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 34
<210> 35
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 35
<210> 36
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 36
<210> 37
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 37
<210> 38
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 38
<210> 39
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 39
<210> 40
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is D-Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 40
<210> 41
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 41
<210> 42
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is D-Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 42
<210> 43
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is D-Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 43
<210> 44
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽(Exendin)-4類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化C-末端
<400> 44

Claims (28)

  1. 一種前藥或其醫藥上可接受之鹽，其包含式(I)的藥物連接子接合物Z-L1-L2-L-Y-R20 (I)其中Y為具有式(II)的肽部分His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-Asp-Glu-Gln-X18-Ala-X20-X21-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-X28-Gly-Gly-Pro-X32-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (II)X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自Arg和Lys的胺基酸殘基，X20代表選自Lys、Gln和His的胺基酸殘基，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表選自Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基，或者其中Y為具有式(III)的肽部分His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-Asp-Glu-Gln-X18-Ala-X20-X21-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-X28-Gly-Gly-Pro-X32-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (III)X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自Leu和His的胺基酸殘基，X20代表選自His、Arg、Lys和Gln的胺基酸殘基，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基， X28代表選自Lys、Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基，或者其中Y為具有式(IV)的肽部分His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Leu-Leu-Asp-Glu-Gln-X18-Ala-Lys-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-X32-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (IV)X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自Arg和Leu的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基，或其鹽或溶劑合物；或者其中Y為具有式(IVa)的肽部分H2N-His-Aib-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-X15-Glu-Gln-Leu-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Bal-X29-Gly-X31-X32-Ser-X34-X35-Pro-Pro-Pro-X39-R20 (V)X15代表選自Asp和Glu(較佳Asp)的胺基酸殘基，X29代表選自Gly、D-Ala和Pro(較佳Gly、D-Ala)的胺基酸殘基，X31代表選自Pro、His和Trp(較佳Pro)的胺基酸殘基，X32代表選自Ser、His、Pro和Arg(較佳Ser、His、Pro)的胺基酸殘基，X34代表選自Gly和D-Ala的胺基酸殘基，X35代表選自Ala、Pro和Lys(較佳Ala、Pro)的胺基酸殘基， X39代表Ser或Pro-Pro-Pro，或其鹽或溶劑合物；或者其中Y為具有式(IVb)的肽部分H2N-His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Leu-Leu-Glu-Glu-Gln-Arg-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Bal-D-Ala-Gly-Pro-Pro-Ser-D-Ala-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-R20；或其鹽或溶劑合物；R20為OH或NH2；L為式(Ia)的連接子， 其中虛線表示藉由形成醯胺鍵與Y的N-末端的連接；X為C(R4R4a)；N(R4)；R1、R1a獨立地選自由下列組成之群組：H；和C1-4烷基；R2、R2a獨立地選自由下列組成之群組：H；和C1-4烷基；R4、R4a獨立地選自由下列組成之群組：H；和C1-4烷基；其中R2、R2a、R4或R4a取代有一個基團L2-L1-Z；其中L2為單一化學鍵或為C1-20烷基鏈，其視情况被一個或多個獨立地選自-O-和C(O)N(R3aa)的基團中斷且視情况經一個或多個獨立地選自OH和C(O)N(R3aaR3aaa)的基團取代，其中R3aa和R3aaa獨立地選自由下列組成之群組：H和C1-4烷基；且L2經由選自由下列組成之群組的末端基團連接於L1： 其中L2連接於以虛線指示的一個位置且L1連接於以另一虛線指示的位置；且L1為C1-20烷基鏈，其視情况被一個或多個獨立地選自-O-和C(O)N(R5aa)的基團中斷且視情况經一個或多個獨立地選自OH和C(O)N(R5aaR5aaa)的基團取代，其中R5aa和R5aaa獨立地選自由下列組成之群組：H和C1-4烷基；且L1經由末端胺基連接於Z，該末端胺基與Z的玻尿酸的β-1,3-D-葡糖醛酸的羧基形成醯胺鍵；Z為交聯的玻尿酸水凝膠，其中0.05至20%的單體二糖單元藉由交聯劑交聯；且0.2至8.5%的單體二糖單元帶有L1-L2-L-Y-R20基團。
  2. 如請求項1的前藥或其醫藥上可接受之鹽，其包含式(I)的藥物連接子接合物Z-L1-L2-L-Y-R20 (I) 其中Y為具有式(II)的肽部分His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-Asp-Glu-Gln-X18-Ala-X20-X21-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-X28-Gly-Gly-Pro-X32-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (II)X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自Arg和Lys的胺基酸殘基，X20代表選自Lys、Gln和His的胺基酸殘基，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表選自Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基，或者其中Y為具有式(III)的肽部分His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-Asp-Glu-Gln-X18-Ala-X20-X21-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-X28-Gly-Gly-Pro-X32-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (III)X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自Leu和His的胺基酸殘基，X20代表選自His、Arg、Lys和Gln的胺基酸殘基，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表選自Lys、Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基，或者其中Y為具有式(IV)的肽部分 His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Leu-Leu-Asp-Glu-Gln-X18-Ala-Lys-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-X32-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (IV)X2代表選自Ser、D-Ser和Aib的胺基酸殘基，X3代表選自Gln和His的胺基酸殘基，X18代表選自Arg和Leu的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基，或其鹽或溶劑合物；R20為OH或NH2；L為式(Ia)的連接子， 其中虛線表示藉由形成醯胺鍵與Y的N-末端的連接；X為C(R4R4a)；N(R4)；R1、R1a獨立地選自由下列組成之群組：H；和C1-4烷基；R2、R2a獨立地選自由下列組成之群組：H；和C1-4烷基；R4、R4a獨立地選自由下列組成之群組：H；和C1-4烷基；其中R2、R2a、R4或R4a取代有一個基團L2-L1-Z；其中L2為單一化學鍵或為C1-20烷基鏈，其視情况被一個或多個獨立地選自-O-和C(O)N(R3aa)的基團中斷且視情况經一個或多個獨立地選自OH和C(O)N(R3aaR3aaa)的基團取代，其中R3aa和R3aaa獨立地選自由下列組成之群組：H和C1-4烷基；且L2經由選自由下列組成之群組的末端基團連接於L1： 其中L2連接於以虛線指示的一個位置且L1連接於以另一虛線指示的位置；和L1為C1-20烷基鏈，其視情况被一個或多個獨立地選自-O-和C(O)N(R5aa)的基團中斷且視情况取代有一個或多個獨立地選自OH和C(O)N(R5aaR5aaa)的基團，其中R5aa和R5aaa獨立地選自由下列組成之群組：H和C1-4烷基；且L1經由末端胺基連接於Z，該末端胺基與Z的玻尿酸的β-1,3-D-葡糖醛酸的羧基形成醯胺鍵；Z為交聯的玻尿酸水凝膠，其中0.05至20%的單體二糖單元藉由交聯劑交聯；且0.2至8.5%的單體二糖單元帶有L1-L2-L-Y-R20基團。
  3. 如請求項1的前藥，其中L為式(Ib)的連接子部分， 其中虛線表示藉由形成醯胺鍵與Y的連接；R1、R1a、R2a獨立地選自由下列組成之群組：H和C1-4烷基；L2-L1-Z係如請求項1中所定義。
  4. 如請求項1的前藥，其中L為式(Ic)的連接子部分-L， 其中虛線表示藉由形成醯胺鍵與Y的連接；R1和R1a為H；R2、R2a獨立地選自由下列組成之群組：H和CH3；其中L2-L1-Z係如請求項1所定義。
  5. 如請求項1至4中任一項的前藥，其中L2為C1-6烷基鏈，其視情况被一個選自-O-和C(O)N(R3aa)的基團中斷，且其中R3aa獨立地選自由下列組成之群組：H和C1-4烷基；且L2經由選自由下列組成之群組的末端基團連接於L1： 其中L2連接於以虛線指示的一個位置且L1連接於以另一虛線指示的位置。
  6. 如請求項1至5中任一項的前藥，其中其中Y為具有式(II)的肽部分His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-Asp-Glu-Gln-X18-Ala-X20-X21-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-X28-Gly-Gly-Pro-X32-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (II)其中X2代表D-Ser X3代表His，X18代表Arg X20代表Lys，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表選自Ser和Ala的胺基酸殘基，X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基；或者其中Y為具有式(III)的肽部分His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-Asp-Glu-Gln-X18-Ala-X20-X21-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-X28-Gly-Gly-Pro-X32-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (III)其中X2代表Aib，X3代表His，X18代表Leu，X20代表Lys，X21代表選自Asp和Glu的胺基酸殘基，X28代表選自Ser和Ala的胺基酸殘基， X32代表選自Ser和Val的胺基酸殘基。
  7. 如請求項1至5中任一項的前藥，其中Y為具有式(IVa)的肽部分H2N-His-Aib-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-X15-Glu-Gln-Leu-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Ba1-X29-Gly-X31-X32-Ser-X34-X35-Pro-Pro-Pro-X39-R20 (IVa)X15代表選自Asp和Glu(較佳Asp)的胺基酸殘基，X29代表選自Gly、D-Ala和Pro(較佳Gly、D-Ala)的胺基酸殘基，X31代表選自Pro、His和Trp(較佳Pro)的胺基酸殘基，X32代表選自Ser、His、Pro和Arg(較佳Ser、His、Pro)的胺基酸殘基，X34代表選自Gly和D-Ala的胺基酸殘基，X35代表選自Ala、Pro和Lys(較佳Ala、Pro)的胺基酸殘基，X39代表Ser或Pro-Pro-Pro。
  8. 如請求項1至5中任一項的前藥，其中Y為具有式(IVb)的肽部分H2N-His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Leu-Leu-Glu-Glu-Gln-Arg-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Bal-D-Ala-Gly-Pro-Pro-Ser-D-Ala-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-R20。
  9. 如請求項1至8中任一項的前藥，其中Y為選自序列Seq.ID No 4至60的GLP-1/升糖素激動劑。
  10. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至9中任一項的前藥或其醫藥上可接受之鹽以及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。
  11. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至9中任一項的前藥或其醫藥上可接受之鹽以及至少一種醫藥上可接受之賦形劑和黏度調節劑。
  12. 如請求項11的醫藥組合物，其中所述黏度調節劑為玻尿酸。
  13. 如請求項10至12的醫藥組合物，其呈可注射製劑形式。
  14. 如請求項10至13的醫藥組合物，其呈懸浮液形式。
  15. 如請求項10至14的醫藥組合物，其呈懸浮液形式，其中如請求項1至6中任一項的前藥的濃度為0.5至8重量/體積百分比。
  16. 如請求項10至14的醫藥組合物，其呈懸浮液形式，其中如請求項1至6中任一項的前藥的濃度為1.5至3重量/體積百分比。
  17. 如請求項10至16中任一項的組合物，其中該前藥在組合物中足量投予以在一次施用中提供至少6天的治療有效量的GLP-1/升糖素激動劑。
  18. 如請求項10至17中任一項的組合物，其中該組合物為單劑量組合物。
  19. 如請求項1至9中任一項的前藥或如請求項10至18中任一項的醫藥組合物，其用作藥物。
  20. 如請求項1至9中任一項的前藥或如請求項10至18中任一項的醫藥組合物，其用於治療或預防可由GLP-1/升糖素激動劑治療的疾病或病症的方法。
  21. 如請求項1至9中任一項的前藥或如請求項10至18中任一項的醫藥組合物，其用於治療或預防糖尿病的方法。
  22. 如請求項1至7中任一項的前藥或如請求項10至18中任一項的醫藥組合物，其用於治療或預防血脂異常的方法。
  23. 如請求項1至9中任一項的前藥或如請求項10至18中任一項的醫藥組合物，其用於治療或預防代謝症候群的方法。
  24. 如請求項1至9中任一項的前藥或如請求項10至18中任一項的醫藥組合物，其用於治療或預防脂肪肝，較佳非酒精性肝病(NAFLD)和 非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法。
  25. 一種GLP-1/升糖素激動劑-連接子接合物中間體L2*-L-Y，其具有式(VIII) 其中Y為Seq ID 4至60的肽。
  26. 一種GLP-1/升糖素激動劑-連接子接合物中間體L2*-L-Y，其具有式(IX) 其中Y為Seq ID 4至60的肽。
  27. 一種GLP-1/升糖素激動劑-連接子接合物中間體L2*-L-Y，其具有式(X) 其中Y為Seq ID 4至60的肽。
  28. 如請求項18的組合物，其中該前藥懸浮液可藉由注射經內徑小於0.26mm的針頭投予。
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