CN101453988A - 高血糖素样肽1（glp-1）药物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了在体内和体外均稳定的一种组合物，所述组合物包含与二酮哌嗪(DKP)组合的高血糖素样肽1(GLP－1)颗粒。该组合物可用作治疗疾病的药物制剂，所述疾病如糖尿病、癌症和肥胖症但不仅限于这类疾病或病症。本组合物尤其可用作肺部递送的药物制剂。

Description

高血糖素样肽1(GLP-1)药物制剂
相关申请的交叉引用
本申请是2003年7月22日递交的美国申请No.10/632,878的部分继续申请(continuation-in-part)，并根据35U.S.C.§119(e)要求2006年4月14日递交的美国临时申请No.60/744,882的优先权。每份上述优先权申请通过引用整体并入本文中。
技术领域
本发明涉及药物制剂的领域。本发明公开了包含与高血糖素样肽1(Glucagon-Like Peptide 1，GLP-1)组合的二酮哌嗪(DKP)颗粒的干粉制剂。本发明可用作治疗疾病的药物制剂，所述疾病如糖尿病、癌症和肥胖症但不仅限于这类疾病。本发明更尤其可用作肺部递送的药物制剂。
背景技术
文献中公开的高血糖素样肽1(GLP-1)是30或31个氨基酸的增泌素(incretin)，其响应来自进餐的脂肪、碳水化合物摄取和蛋白质而从肠内分泌L细胞中被释放。发现在患有2型糖尿病的个体中该肽激素的分泌受损，使其成为治疗该疾病和其他相关疾病的可能候选者。
在无疾病的状态下，GLP-1响应经口摄取的养分(尤其是糖)从肠L细胞中分泌，刺激来自胰腺的进餐诱导的胰岛素释放，抑制来自肝的高血糖素释放，以及对消化道和脑的其他效应。胰腺中的GLP-1效应是依赖于葡萄糖的，使得外源肽施用期间的低血糖风险最小化。GLP-1还促进了胰岛素生物合成中的所有步骤，并直接刺激β-细胞生长和存活以及β-细胞分化。这些效应的组合导致提高的β-细胞量。另外，GLP-1受体信号转导导致β-细胞凋亡的减少，这进一步有助于提高的β-细胞量。
在胃肠道中，GLP-1抑制GI活动力，提高响应葡萄糖的胰岛素分泌，并降低高血糖素的分泌，从而有助于减少葡萄糖偏差(glucoseexcursion)。啮齿类中GLP-1的中枢施用已经显示抑制食物摄取，提示外周降低的GLP-1可直接影响脑。这是可行的，因为已经显示循环的GLP-1能够达到某些脑区中的GLP-1受体；即穹隆下器官和最后区。已知脑的这些区域涉及食欲和能量稳态的调解。有趣的是，胃膨胀激活孤束的动眼神经核中含GLP-1的神经元，预示着中枢表达的GLP-1作为食欲抑制剂的作用。这些假设由使用GLP-1受体拮抗剂——毒蜥外泌肽(9-39)的研究支持，所述研究中观察到相反作用。在人中，施用的GLP-1具有饱足效应(Verdich et al.，2001)，当在6周期间通过连续的皮下灌输提供时，糖尿病患者显示食欲降低，这导致体重的显著减轻(Zander et al.，2002)。
GLP-1还已显示在患有2型糖尿病的患者中有效，当作为连续皮下灌输提供时，其提高胰岛素分泌并使得禁食和餐后血糖二者正常化(Nauck etal.，1993)。另外，GLP-1的灌输已经显示降低下述患者的葡萄糖水平：先前用非胰岛素口服药物治疗的患者和磺酰脲治疗失败后需要胰岛素治疗的患者(Nauck et al.，1993)。然而，如本领域中和下面本文中所记录到的，单一皮下注射GLP-1的作用提供了令人失望的结果。尽管达到了免疫反应性GLP-1的高血浆水平，但是胰岛素分泌快速地返回处理前的值，血糖浓度未被正常化(Nauck et al.，1996)。只有进行重复的皮下施用时，对禁食血糖的作用才能够比得上静脉施用(Nauck et al.，1996)。连续皮下施用6周显示降低禁食和餐后葡萄糖浓度并降低HbA1c水平(Zander et al.，2002)。单一皮下注射GLP-1的短暂效果与其循环的不稳定性相关。有证据表明GLP-1由血浆体外代谢，酶二肽基肽酶-IV(DPP-IV)负责该降解(Mentlein et al.，1993)。
考虑到GLP-1在糖尿病患者中的生理学显著性和外源GLP-1在健康受试者和2型糖尿病受试者二者中被快速氨基酸末端降解的事实，许多研究已经致力于操作GLP-1的体内稳定性作为治疗糖尿病的抗糖尿病剂的新颖途径的可能性(Deacon et al.，2004)。已经研究了两种独立的途径：1)开发对酶降解不敏感的GLP-1类似物，和2)使用选择性酶抑制剂防止体内降解并提高完整的、生物活性肽的水平。已经在临床试验中研究了抗降解的、名为“增泌素模拟物”的长效GLP-1类似物(例如Liraglutide(NovoNordisk，Copenhagen，丹麦)；exenatide(毒蜥外泌肽-4；
Figure A200780013424D0008082134QIETU
)(AmylinInc.，San Diego，CA)和exenatide-LAR，Eli Lilly，Indianapolis，IN)。抑制负责增泌素降解的酶的二肽基肽酶IV抑制剂(例如由Novartis，Basel，瑞士开发的Vildagliptin(Galvus))和由Merck，Whitehouse Station，New Jersey开发的Januvia(sitagliptin))也在研究中(Deacon et al.，2004)。因此，GLP-1的多种作用模式(例如提高的胰岛素释放、延迟的胃排空和提高的饱满感)与其低的低血糖倾向似乎为它带来了超过目前可获得的疗法的优点。
然而，尽管GLP-1治疗中有这些途径/进步，目前糖尿病患者可获得的药物均不能够在所有的患者中达到目的(HbA1c、禁食血糖、葡萄糖偏差)，且它们均不能避免副作用如毒性、低血糖、体重增加、恶心和来自呕吐的压力。因此在本领域中，仍然需要作为药物施用时具有长期效用和最优吸收的稳定的GLP-1制剂。
发明内容
用作药物的稳定的、可吸入的高血糖素样肽1(GLP-1)制剂是本领域缺乏的。为了克服本领域中的缺陷，本发明提供了与二酮哌嗪(DKP)颗粒组合的、作为药物的GLP-1制剂。
因此，在本发明的具体的实施方案中，提供了包含GLP-1分子和二酮哌嗪或其可药用盐的干粉组合物。在其他实施方案中，本发明的干粉组合物包含选自下组的GLP-1分子，所述组由天然GLP-1、GLP-1代谢产物、GLP-1类似物、GLP-1衍生物、二肽酰-肽酶-IV(DPP-IV)保护的GLP-1、GLP-1模拟物、毒蜥外泌肽(exendin)、GLP-1肽类似物或生物合成的GLP-1类似物组成。还在本发明的又一实施方案中，干粉组合物包含具有式2，5-二酮-3，6-二(4-X-氨丁基)哌嗪的二酮哌嗪，其中X选自由琥珀酰基、戊二酰基、马来酰基和富马酰基组成的组。在另一实施方案中，干粉组合物包含二酮哌嗪盐。还在本发明的另一实施方案中提供了干粉组合物，其中二酮哌嗪为2，5-二酮-3，6-二(4-富马酰-氨丁基)哌嗪。
本发明还包括干粉组合物，其中GLP-1分子为天然的GLP-1或酰胺化的GLP-1分子，其中酰胺化的GLP-1分子是GLP-1(7-36)酰胺。
还在本发明的另一具体的实施方案中，提供了用于制备包含GLP-1分子和二酮哌嗪的颗粒的方法，所述方法包括步骤：提供包含GLP-1分子的GLP-1溶液；提供能形成颗粒的二酮哌嗪溶液或二酮哌嗪颗粒的悬浮液；和将GLP-1溶液与二酮哌嗪溶液或悬浮液组合。在本发明的其他具体的实施方案中，用于制备包含GLP-1分子和二酮哌嗪的颗粒的方法还包括通过冻干法、过滤或喷雾干燥从溶液或悬浮液中去除溶剂。还在又一实施方案中，本发明的颗粒通过去除溶剂形成，或在去除溶剂之前形成。
在本发明的一个实施方案中，在用于制备具有GLP-1分子和二酮哌嗪的颗粒的方法中，提供了选自下组的GLP-1分子，所述组由天然的GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1衍生物、二肽基肽酶-IV(DPP-IV)保护的GLP-1、GLP-1模拟物、毒蜥外泌肽、GLP-1肽类似物或生物合成的GLP-1类似物组成。在另一实施方案中，用于制备具有GLP-1分子和二酮哌嗪的颗粒的方法包括以颗粒悬浮液形式提供提供的二酮哌嗪。在又一实施方案中，二酮哌嗪在溶液中提供，且该方法包括调节溶液的pH，从而沉淀二酮哌嗪并形成颗粒。
在本发明的其他具体实施方案中，GLP-1溶液处于约1μg/ml-50mg/ml、更优选地约0.1mg/ml-10mg/ml的浓度。还在本发明另一具体的实施方案中，GLP-1溶液处于约0.25mg/ml的浓度。
在用于制备含GLP-1分子和二酮哌嗪颗粒的另一方法中，该方法还包括向溶液中添加一种试剂，其中所述试剂选自盐、表面活性剂、离子、渗透物(osmolyte)、离液剂(chaotrope)和感胶离子(lyotrope)、酸、碱和有机溶剂。该试剂促进GLP-1和二酮哌嗪颗粒之间的缔合，还改进GLP-1分子的稳定性和/或药物动力学。在本发明的一些实施方案中，该试剂为盐，例如但不限于氯化钠。还考虑了该试剂可以是表面活性剂，例如但不限于Tween、Triton、pluronic acid、CHAPS、cetrimide和Brij、H(CH2)7SO4Na。该试剂可以是离子，例如阳离子或阴离子。该试剂可以是渗透物(稳定剂)，例如但不限于己二醇(Hexylene-Glycol，Hex-Gly)、海藻糖、甘氨酸、聚乙二醇(PEG)、三甲胺n-氧化物(TMAO)、甘露醇和脯氨酸。该试剂可以是离液剂或感胶离子，例如但不限于氯化铯、柠檬酸钠和硫酸钠。该试剂可以是有机溶剂，例如选自甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、三氟代乙醇(TFE)和六氟异丙醇(HFIP)的醇。
在本发明的另一具体实施方案中，考虑了用于制备含GLP-1分子和二酮哌嗪的颗粒的方法，其中该方法包括将颗粒悬浮液的pH调节至约4或更大。在本发明的其他实施方案中，用于制备颗粒的方法包括GLP-1分子和二酮哌嗪，其中颗粒中的GLP-1分子具有更大的稳定性。
本发明中还考虑了对需要的受试者施用有效量的GLP-1分子的方法，包括对受试者提供GLP-1/二酮哌嗪颗粒。该施用方法可以是静脉内、皮下、经口、经鼻、经颊、经直肠或通过肺部递送，但不仅限于此。在一个实施方案中，施用方法是通过肺部递送。还在本发明的又一实施方案中，施用的方法包括治疗选自下组的病症或疾病，所述组由糖尿病、局部缺血、再灌注组织损伤、血脂障碍、糖尿病性心脏病、心肌梗塞、急性冠状动脉综合征、肥胖症、手术后的分解代谢改变、高血糖症、过敏性肠综合征、中风、神经变性病症、记忆和学习障碍、胰岛细胞移植和再生性治疗组成。
在本发明的另一实施方案中施用GLP-1/二酮哌嗪颗粒组合物的方法导致改进的GLP-1药物代谢动力学半衰期和生物利用度。
还在本发明的又一具体实施方案中，提供了制备具有改进的药物代谢动力学模式的干粉组合物的方法，该方法包括步骤：提供GLP-1分子的溶液；提供能形成颗粒的二酮哌嗪；形成颗粒；和将GLP-1与二酮哌嗪组合；和之后通过干燥的方法去除溶剂，获得干粉，其中所述干粉具有改进的药物代谢动力学模式。经改进的药物代谢动力学模式包括提高的GLP-1半衰期和/或经改进的GLP-1生物利用度。提高的GLP-1半衰期大于或等于7.5分钟。
在本发明的一个实施方案中，提供了包含GLP-1分子和二酮哌嗪组合物或其可药用盐的干粉组合物。在另一实施方案中，GLP-1分子选自由以下组成的组：天然GLP-1、GLP-1代谢产物、GLP-1类似物、GLP-1衍生物、二肽酰-肽酶-IV(DPP-IV)保护的GLP-1、GLP-1模拟物、GLP-1肽类似物或生物合成的GLP-1类似物。
在本发明的一个实施方案中，二酮哌嗪是具有式2，5-二酮-3，6-二(4-X-氨丁基)哌嗪的二酮哌嗪，其中X选自由琥珀酰基、戊二酰基、马来酰基和富马酰基组成的组。在另一实施方案中，二酮哌嗪是二酮哌嗪盐。在另一实施方案中，二酮哌嗪是2，5-二酮-3，6-二(4-富马酰-氨丁基)哌嗪。
在本发明的一个实施方案中，GLP-1分子是天然的GLP-1。在另一实施方案中，GLP-1分子是酰胺化的GLP-1分子。在另一实施方案中，酰胺化的GLP-1分子是GLP-1(7-36)酰胺。
在本发明的一个实施方案中，提供了形成包含GLP-1分子和二酮哌嗪的颗粒的方法，该方法包括步骤：提供GLP-1分子；提供下述形式的二酮哌嗪，所述形式选自能形成颗粒的二酮哌嗪、二酮哌嗪颗粒及其组合；和将GLP-1分子与二酮哌嗪以共溶液的形式组合，其中形成包含GLP-1分子和二酮哌嗪的颗粒。
在本发明的一个实施方案中，该方法还包括通过冻干法、过滤或喷雾干燥从所述共溶液中去除溶剂。在另一实施方案中，通过去除溶剂形成包含所述GLP-1分子和二酮哌嗪的颗粒。在另一实施方案中，在去除溶剂之前形成包含所述GLP-1分子和二酮哌嗪的颗粒。
在另一实施方案中，GLP-1分子选自由以下组成的组：天然的GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1衍生物、二肽基肽酶-IV(DPP-IV)保护的GLP-1、GLP-1模拟物、GLP-1肽类似物或生物合成的GLP-1类似物。在另一实施方案中，GLP-1分子以溶液的形式提供，所述溶液包含约1μg/ml-50mg/ml的GLP-1浓度。在另一实施方案中，GLP-1分子以溶液的形式提供，所述溶液包含约0.1mg/ml-10mg/ml的GLP-1浓度。在另一实施方案中，GLP-1分子以溶液的形式提供，所述溶液包含约0.25mg/ml的GLP-1浓度。
在本发明的另一实施方案中，二酮哌嗪以二酮哌嗪颗粒悬浮液的形式提供。在另一实施方案中，二酮哌嗪以包含能形成颗粒的二酮哌嗪的溶液的形式提供，该方法还包括调节溶液的pH以形成二酮哌嗪颗粒。在另一实施方案中，该方法还包括向所述溶液或悬浮液中添加下述试剂，其中所述试剂选自由盐、表面活性剂、离子、渗透物、离液剂和感胶离子、酸、碱和有机溶剂组成的组。在另一实施方案中，该试剂促进GLP-1分子和二酮哌嗪颗粒或能形成颗粒的二酮哌嗪之间的缔合。在另一实施方案中，该试剂改善GLP-1分子的稳定性或药物动力学。在另一实施方案中，该试剂为氯化钠。
在本发明的另一实施方案中，该方法还包括调节悬浮液或溶液的pH。在另一实施方案中，pH被调节至约4.0或更大。还在另一实施方案中，颗粒中的GPL-1分子具有比天然GPL-1更大的稳定性。
在另一实施方案中，共溶液包含约1μg/ml-50mg/ml的GLP-1浓度。在另一实施方案中，共溶液包含约0.1mg/ml-10mg/ml的GLP-1浓度。在另一实施方案中，共溶液包含约0.25mg/ml的GLP-1浓度。
还在本发明的另一实施方案中，该方法还包括向共溶液中添加下述试剂，其中所述试剂选自由盐、表面活性剂、离子、渗透物、离液剂和感胶离子、酸、碱和有机溶剂组成的组。在另一实施方案中，该试剂促进GLP-1分子和二酮哌嗪颗粒或能形成颗粒的二酮哌嗪之间的缔合。在另一实施方案中，该试剂改善GLP-1分子的稳定性或药物动力学。在另一实施方案中，该试剂为氯化钠。
在另一实施方案中，该方法还包括调节共溶液的pH。在另一实施方案中，pH被调节至约4.0或更大。
在本发明的一个实施方案中，提供了对需要的受试者施用有效量的GLP-1分子的方法，包括对受试者提供包含GLP-1和二酮哌嗪的颗粒。在另一实施方案中，通过静脉内、皮下、经口、经鼻、经颊、经直肠或通过肺部递送完成提供。在其他实施方案中，通过肺部递送完成提供。
在另一个实施方案中，该需要包括对选自下组的病症或疾病的治疗，所述组由糖尿病、局部缺血、再灌注组织损伤、血脂障碍、糖尿病性心脏病、心肌梗塞、急性冠状动脉综合征、肥胖症、手术后的分解代谢改变、高血糖症、过敏性肠综合征、中风、神经变性病症、记忆和学习障碍、胰岛细胞移植和再生性治疗组成。
在另一实施方案中，颗粒的提供导致与天然GLP-1分子相比改进的GLP-1药物代谢动力学半衰期和生物利用度。
在本发明的一个实施方案中，提供了形成具有改进的GLP-1药物代谢动力学模式的粉末组合物的方法，该方法包括步骤：提供GLP-1分子；提供溶液中的能形成颗粒的二酮哌嗪；形成二酮哌嗪颗粒；将GLP-1分子与溶液组合形成共溶液；和通过喷雾干燥从共溶液中去除溶剂，形成具有改进的GLP-1药物代谢动力学模式的粉末。
在另一实施方案中，改进的GLP-1药物代谢动力学模式包括提高的GLP-1半衰期。在另一实施方案中，提高的GLP-1半衰期大于或等于7.5分钟。在另一实施方案中，改进的GLP-1药物代谢动力学模式包括与天然GLP-1相比改进的GLP-1生物利用度。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，用于进一步说明本发明的特定方面。通过以下附图，并结合具体实施方式的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1A-1D.GLP-1在多种浓度下的结构分析(pH4，20℃)。图1A-GLP-1的远-UV圆二色性(CD)阐述了随着浓度的提高，肽的二级结构从主要为无组织的构象转化为螺旋构象。图1B-近-UV CD阐述了三级结构随着提高的肽浓度而增加，提示GLP-1的自身缔合。图1C-由280nm处色氨酸激发引起的多种浓度下GLP-1(pH4，20℃)的荧光发射。图1D-多种浓度下GLP-1(pH4，20℃)的透射FTIR。1656cm-1处的酰胺I条带表明在≥2mg/mL的浓度下GLP-1具有α-螺旋结构。
图2A-2D.在多种离子强度下(pH4，20℃)低浓度GLP-1的结构分析。图2A-1.0mg/mL GLP-1的远-UV CD阐明了提高盐浓度将无序的GLP-1结构转化为更有序的α-螺旋结构。图2B-1.0mg/mL肽的近-UV CD证实了提高NaCl浓度也增强GLP-1的三级结构。图2C-在280nm处色氨酸激发后多种NaCl浓度下(pH4，20℃)1.0mg/mL GLP-1的内荧光发射。在高肽浓度下，最大值强度降低并迁移至更短的波长，这指示了明确定义的三级结构。图2D-在多种离子强度下(pH4，20℃)10mg/mL GLP-1的三级结构分析。近-UV CD谱证实提高的离子强度增强了自身缔合的GLP-1的三级结构。
图3A-3B.多种温度下(pH4)10mg/mL GLP-1的结构分析。图3A-近-UV CD阐明了提高的温度下GLP-1寡聚物解离。图3B-多种温度下(pH4)10mg/mL GLP-1的结构分析。图3C-多种温度下(pH4)0.05mg/mLGLP-1的结构分析。远-UV CD阐明了肽对温度是不敏感的。
图4A-4B.多种pH下(20℃)GLP-1的结构分析。图4A-多种pH下(20℃)10mg/mL GLP-1的远-UV CD。当pH被提高时，自身缔合的GLP-1在pH6.3和7.6之间沉淀，但是在pH1.5和11.7时保留螺旋结构。图4B-放大pH7.6处的谱系揭示GLP-1的二级结构是无序的，由浓度降低引起。
图5.通过HPLC证实的1mg/mL GLP-1对脱酰胺作用和氧化作用二者的抗性。通过将GLP-1在pH10.5时于40℃孵育5天达到脱酰胺条件。通过将GLP-1在0.1％H2O2中于室温下孵育2小时达到氧化条件。
图6A-6B.搅动对1.5mg/mL GLP-1和9.4mg/mL GLP-1(pH4)的三级结构的影响。近-UV CD(图6A)和GLP-1的荧光发射(图6B)均阐明了GLP-1肽的三级结构不由于搅动而显著改变。样品在室温下搅动30和90分钟并在280nm处色氨酸激发后收集荧光发射谱。
图7A-7C.10次冻融循环对1.6、5.1和8.4mg/mL GLP-1(pH4)三级结构的影响。近-UV CD(图7A)和GLP-1的荧光发射(图7B)均显示肽的三级结构不因为多重冻融循环而显著改变。样品冷冻于-20℃下并在室温下解冻。在280nm处色氨酸激发后收集荧光发射谱。通过远-UV CD进行类似的实验，该实验显示11次冻融循环对10mg/mL GLP-1(pH4)二级结构的影响(图7C)。
图8A-8B.盐研究。作为pH和NaCl浓度的函数的GLP-1/FDKP负载曲线(图8A)。在5mg/mL FDKP和0.25mg/mL GLP-1下进行负载。NaCl浓度以mM表示。图8B-作为pH和NaCl浓度的函数，描述了在重建的无FDKP对照样品中检测的GLP-1量。
图9A-9B.表面活性剂研究。作为pH和表面活性剂的函数的GLP-1/FDKP负载曲线(图9A)。在5mg/mL FDKP和0.25mg/mL GLP-1下进行负载。图9B-作为pH和添加的表面活性剂的函数，描述了在重建的无FDKP对照样品中检测的GLP-1量。
图10A-10D.离子研究。作为pH和离子的函数的GLP-1/FDKP负载曲线。在5mg/mL FDKP和0.25mg/mL GLP-1下进行负载(图10A和11C)。离子浓度在图例中示出(mM)。右侧曲线描述1M NaCl的结果。图10B和10D-作为pH、离子和1M NaCl的函数，描述了在重建的无FDKP对照样品中检测的GLP-1量。
图11-11B.渗透物研究。作为pH的函数和存在常见稳定剂(渗透物)时的GLP-1/FDKP负载曲线(图11A)。在5mg/mL FDKP和0.25mg/mL GLP-1下进行负载。图11B-作为pH和渗透物的函数，描述了在重建的无FDKP对照样品中检测的GLP-1量。“N/A”表示样品中不存在渗透物。
图12A-12B.离液剂/感胶离子研究。作为pH3.0(图12A)和pH4.0(图12C)下离液剂或感胶离子浓度的函数的GLP-1/FDKP负载曲线。在5mg/mL FDKP和0.25mg/mL GLP-1下进行负载。图12B和12D-作为pH的函数和存在多种离液剂或感胶离子时，描述了在重建的无FDKP对照样品中检测的GLP-1量。“N/A”表示样品中不存在离液剂或感胶离子。
图13A-13B.醇研究。作为pH和醇的函数的GLP-1/FDKP负载曲线。在5mg/mL FDKP和0.25mg/mL GLP-1下进行负载。对每种醇评价四种醇浓度，5％、10％、15％和20％v/v(图13A)。TFE＝三氟代乙醇；HFIP＝六氟异丙醇。图13B-作为pH和醇(20％)的函数，描述了在重建的无FDKP对照样品中检测的GLP-1量。
图14A-14B.来自GLP-1/FDKP浓度研究的负载(图14A)。负载在5mg/mL FDKP下进行，分析的GLP-1浓度列于X轴中。图14B-多种GLP-1/FDKP配方(放大10000x倍)的扫描电子显微术(SEM)图像显示球形和棒状GLP-1/FDKP颗粒组成。(图A)0.5mg/mL GLP-1和2.5mg/mLFDKP；(图B)0.5mg/mL GLP-1和10mg/mL FDKP；(图C)20mM氯化钠、20mM乙酸钾和20mM磷酸钾，pH4.0中0.5mg/mL GLP-1和10mg/mL FDKP；和(图D)20mM氯化钠、20mM乙酸钾和20mM磷酸钾，pH4.0中10mg/mL GLP-1和50mg/mL FDKP。
图15.展示胁迫对多种GLP-1/FDKP制剂的影响。图例指出冻干前GLP-1对FDKP颗粒和溶液中存在的其他组分的质量-质量百分比。样品在40℃孵育10天。
图16A-16C.GLP-1的结构。图16A-描述GLP-1的甘氨酸-延伸的形式(SEQ ID NO.1)和酰胺化的形式(SEQ ID NO.2)。FIG.16B-抑肽酶对DPPIV活性的抑制。图16C-DPPIV抑制剂对DPPIV活性的抑制。
图17.在肺灌洗液中孵育后检测GLP-1。
图18A-18B.描述GLP-1在血浆中的定量。图18A显示1:2血浆稀释液中的定量。图18B显示1:10血浆稀释液中的定量。
图19A-19B.GLP-1和GLP-1类似物对细胞存活的影响。GLP-1对大鼠胰腺上皮(ARIP)细胞死亡的影响(图19A)。在单独存在和组合存在GLP-1和十字孢碱(Stau)时，锚定蛋白V染色显示抑制细胞凋亡(图19B)。GLP-1的浓度为15nM，十字孢碱的浓度为1μM。
图20.GLP-1类似物毒蜥外泌肽-4对细胞存活力的影响。用0、10、20和40nM毒蜥外泌肽将ARIP细胞处理16、24和48小时。
图21.多种GLP-1/FDKP制剂对十字孢碱诱导的细胞死亡的影响。用GLP-1样品预处理的ARIP细胞被暴露于5μM十字孢碱中4小时，并用Cell Titer-GloTM分析测定细胞存活力。在4℃和40℃将样品胁迫处理4周。右侧显示的对照样品(培养基、GLP-1、STAU、GLP+STAU)示出了培养基(不含GLP-1或十字孢碱)中、含GLP-1、含十字孢碱和含GLP-1与十字孢碱时细胞的存活力(注意：图例不适用于对照样品)。显示的所有结果是一式三份运行的平均值。
图22A-22B.药物代谢动力学研究描述使用多种浓度的GLP-1/FDKP制剂在大鼠中单一静脉注射(IV；图22A)和肺吹入法(IS；图22B)。图例指出分析的制剂中GLP-1对FDKP颗粒的质量-质量百分比。
图23A-23B.给药后2小时(图23A)和6小时(图23B)用GLP-1/FDKP制剂给药的大鼠中累积食物消耗的减少。
图24.雄性肥胖Zucker大鼠中通过肺吹入法施用的GLP-1/FDKP的药物动力学研究。数据描述了对照组(空气；第1组)和GLP-1/FDKP处理组(第2组)在第0、15、30、45、60和90分钟的葡萄糖测量结果。
图25.雄性肥胖Zucker大鼠中通过肺吹入法施用的GLP-1/FDKP的药物动力学研究。数据描述了对照组(空气；第1组)和GLP-1/FDKP处理组(第2组)在第0、15、30、45、60和90分钟的GLP-1测量结果。
图26.雄性肥胖Zucker大鼠中通过肺吹入法施用的GLP-1/FDKP的药物动力学研究。数据描述了对照组(空气；第1组)和GLP-1/FDKP处理组(第2组)在第0、15、30、45、60和90分钟的胰岛素测量结果。
图27.雌性大鼠中用通过肺吹入法施用的多种GLP-1浓度进行的GLP-1/FDKP药物动力学研究。数据描述了对照组(空气；第1组)和分别施用了5％、10％和15％GLP-1的GLP-1/FDKP处理第2、3和4组在第0、2、5、10、20、30、40和60分钟的GLP-1测量结果。
图28.雌性大鼠中用通过肺吹入法施用的多种GLP-1浓度进行的GLP-1/FDKP药物动力学研究。数据描述了对照组(空气；第1组)和分别施用了5％、10％和15％GLP-1的GLP-1/FDKP处理第2、3和4组在第0、2、5、10、20、30、40和60分钟的FDKP测量结果。
图29.雌性大鼠(n＝10)中的GLP-1/FDKP药物动力学研究，所述大鼠连续4天通过单一每日肺吹入法施用了含15％GLP-1(0.3mg GLP-1)的GLP-1/FDKP。数据显示连续4天在给药前、给药后1、2、4和6小时测量的平均食物消耗。
图30.雌性大鼠(n＝10)中的GLP-1/FDKP药物动力学研究，所述大鼠连续4天通过单一每日肺吹入法施用了含15％GLP-1(0.3mg GLP-1)的GLP-1/FDKP。数据显示连续4天在给药前、给药后1、2、4和6小时测量的平均体重。
图31.在猴子中的GLP-1/FDKP毒物代谢动力学研究，所述猴子连续5天通过每日一次(每天30分钟)口鼻施用施用了GLP-1/FDKP。数据显示雄性和雌性中GLP-1的血浆浓度峰值(Cmax)。动物接受对照(空气；第1组)、2mg/kg FDK(第2组)或0.3、1.0或2.0mg/kg GLP-1/FDKP(分别为第3、4和5组)。
优选的实施方案详述
用作药物的稳定的、可吸入的高血糖素样肽1(GLP-1)制剂是本领域缺乏的。这归因于GLP-1肽体内的不稳定性。GLP-1化合物在大量条件下趋向于保留在溶液中，并且当作为溶液制剂被施用时具有相对短的体内半衰期。另外，发现存在于多种生物学流体如肺和血中的二肽基-肽酶IV(DPP-IV)极大地降低GLP-1分子的生物学半衰期。例如，GLP-1(7-37)的生物学半衰期已经显示为3到5分钟；见美国专利No.5,118,666。GLP-1也已显示在胃肠外施用后经历快速的体内吸收。类似地，酰胺GLP-1(7-36)被皮下施用时具有约50分钟的半衰期；也参见美国专利No.5,118,666。
本领域现有技术中GLP-1组合物的快速清除和短半衰期代表了本发明克服的缺陷。本发明通过提供特别适用于肺部递送的最优化的天然GLP-1/FDKP(富马酰二酮哌嗪)制剂克服了本领域现有技术的缺陷。在其他具体的方面，本发明提供了天然GLP-1分子的制剂，所述制剂可在体内引起GLP-1应答。还考虑了在这类制剂中使用天然GLP-1的变体。
为了克服本领域现有技术的缺陷，本发明提供了与二酮哌嗪(DKP)颗粒组合的GLP-1的制剂。在本发明具体的实施方案中，提供了GLP-1/DKP制剂用于施用给受试者。在其他具体的实施方案中，GLP-1/DKP制剂包含富马酰二酮哌嗪(FDKP)但不仅限于此，并可包括其他KDP(不对称的DKP、xDKP)如2，5-二酮-3，6-二(4-琥珀酰基-氨丁基)哌嗪(SDKP)，不对称的二酮哌嗪，包括仅在DKP环上一个位置取代的那些(例如FDKP的“单臂”类似物)，和DKP盐。在本发明的其他具体的实施方案中，通过肺部递送施用GLP-1/FDKP制剂。
开发GLP-1分子的治疗制剂时，通过使用多种的生物物理学和分析技术评价溶液中GLP-1的结构特征，所述技术包括远紫外线圆二色性(远-UV CD)、近紫外线圆二色性(近-UV CD)、内荧光、傅立叶变换红外光谱学(FTIR)、高压液相色谱(HPLC)和质谱(MS)。圆二色性(CD)技术是用于分析多种实验条件下蛋白质结构改变的有力工具，并是本领域公知的。进行这些分析的实验条件包括：浓度、离子强度、温度、pH、氧化胁迫、搅动和多重冻融循环对GLP-1肽的影响。这些分析被设计为表征降解的主要途径以及确立操作GLP-1肽结构的条件从而达成优选的GLP-1/DKP制剂，所述制剂具有想要的药物代谢动力学(PK)和药物动力学(PD)特征。
观察到随着GLP-1浓度提高，肽的二级结构从主要是无组织的构象转化为更螺旋的构象。提高溶液中的离子强度引起GLP-1的结构增加，直到其可逆地沉淀为止。NaCl的存在提高了GLP-1的三级结构，这通过图2D中所示的近CD条带的强度提高显示。这甚至在不显示自身缔合的低肽浓度下发生。提高的离子强度容易地将无组织的GLP-1转化为α-螺旋形式(如图2A中朝向208nm和222nm的远CD最小值迁移所示)和自身缔合的构象(如使用提高的盐和近CD模式的图2B和2D中向更短波长的色氨酸激发迁移所示)。温度和pH有差异地影响GLP-1构象，因为GLP-1的无序结构不被这些参数中任一个所改变。另一方面，发现GLP-1的自身缔合构象对热变性是敏感的并其其溶解度对pH是敏感的，如图4A和4B中所示，该图显示在10mg/ml的肽浓度下，在pH6.3-7.6之间GLP-1肽可逆地沉淀。发现GLP-1的多种构象一般对搅动和多重冻融循环是稳定的。对GLP-1未观察到脱酰胺，也未观察到氧化。
还在多种条件下观察了GLP-1对FDKP颗粒的吸附，所述条件包括pH、GLP-1浓度的改变，和多种表面活性剂、盐、离子、离液剂和感胶离子、稳定剂和醇浓度的改变。发现GLP-1对FDKP颗粒的吸附受pH的强影响，特别是在约pH4.0或更大时发生结合。发现其他赋形剂对GLP-1对FDKP颗粒的吸附具有有限的影响。
在开发本发明的GLP-1/DKP制剂时，评价了可能影响或冲击其体内可递送性和吸收的大量参数。这类参数包括例如GLP-1肽的结构、在某配制条件下分子上的表面电荷、作为制剂的溶解度和稳定性，以及对丝氨酸蛋白酶降解的易感性和体内稳定性；这些均在产生可被容易地吸收且显示延长的生物学半衰期的制剂时起关键的作用。
在多种条件下体外和体内测试了获得的GLP-1/FDKP制剂的稳定性。通过HPLC分析和基于细胞的测定法分析了GLP-1的稳定性。另外，在肺灌洗液(其含有DPP-IV)中检查了GLP-1的稳定性。还发现天然GLP-1的稳定性在溶液中是浓度依赖性的。
还使用体外GLP-1生物活性研究用于GLP-1/FDKP负载的研究，并测定了体内效力。该策略有助于进一步鉴定领先的GLP-1/FDKP配制方法。另外，基于GLP-1已经显示通过抑制细胞凋亡、刺激β-细胞增殖和胰岛再生在提高β-细胞量中起作用的事实，通过基于细胞的测定法检查本发明的GLP-1/FDKP制剂的增殖和抗细胞凋亡潜能。
因此，本发明提供了包含与富马酰基二酮哌嗪(FDKP)组合的天然人GLP-1的最优化的制剂，该制剂是稳定的并且抗降解。
II.GLP-1分子
在本发明具体的实施方案中，提供了最优化的制剂，其包含与二酮哌嗪如富马酰基二酮哌嗪(FDKP)组合的天然人高血糖素样肽1(GLP-1)。本发明的这类GLP-1/FDKP制剂是稳定的并且抗降解。
人GLP-1是本领域公知的，并且来源于远端回肠(distal ileum)中、胰腺中和脑中L-细胞合成的前高血糖素原(preproglucagon)多肽。GLP-1是30-31个氨基酸的肽，其以两种分子形式存在：7-36和7-37，其中7-36形式是主要的。前高血糖素原成为GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)延长形式的加工主要发生在L-细胞中。本领域已经显示在禁食状态下，GLP-1的血浆水平为约40pg/ml。进餐后，GLP-1血浆水平迅速提高至约50-165pg/ml。
本文使用的术语“GLP-1分子”是指GLP-1蛋白质、肽、多肽、类似物、模拟物、衍生物、同种型、片段等等。这类GLP-1分子可包括天然存在的GLP-1多肽(GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)NH2)和GLP-1代谢产物如GLP-1(9-37)。因此，在本发明具体的实施方案中，GLP-1分子包括：天然的GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1衍生物、二肽基肽酶-IV(DPP-IV)保护的GLP-1、GLP-1模拟物、GLP-1肽类似物或生物合成的GLP-1类似物。
本文使用的术语“类似物”包括与另一化合物的结构相似的化合物。例如，抗病毒化合物阿昔洛韦(acyclovir)是一种核苷类似物，其与衍生自碱基鸟嘌呤的核苷鸟苷结构上类似。因此，阿昔洛韦模拟鸟苷(生物学上与鸟苷类似)，并且通过置换病毒核酸中的鸟苷残基(或与之竞争)来干扰DNA合成并阻止翻译/转录。因此，与另一(亲本化合物)具有结构类似性的化合物是类似物，其模拟亲本化合物的生物学或化学活性。将化合物确定为类似物不需要最大或最小的基本或功能基团取代数量，只要类似物能够以一些相关的模式(同一地、补充地或竞争地)模拟亲本化合物的生物学特性或化学特性即可。类似物可以是并且通常是亲本化合物的衍生物(见下文“衍生物”)。本文公开的化合物的类似物可以具有等于、小于或大于它们亲本化合物的活性。
本文使用的“衍生物”是指天然地或合成地从亲本化合物制成(或衍生)的化合物。衍生物可以是类似物(见上文“类似物”)并从而可具有类似的化学或生物学活性。然而，与类似物不同，衍生物不必须模拟亲本化合物的生物学或化学活性。将化合物确定为衍生物不需要最大或最小的基本或功能基团取代数量。例如，尽管抗病毒化合物甘克洛韦(ganclovir)是阿昔洛韦的衍生物，但是甘克洛韦具有与阿昔洛韦不同的抗病毒活性谱系和不同的毒物学特性。本文公开的化合物的衍生物与其亲本化合物比较时可以具有相等、更小、更大或甚至不相似的活性。
本文使用的术语“代谢产物”是指代谢的任何中间产物或产物，并包括大分子和小分子。本文使用时和适当时，该定义适用于初级和次级代谢产物。初级代谢产物直接涉及活体生物正常的生长、发育和繁殖。次级代谢产物不直接涉及这些过程，但是典型地具有重要的生态学功能(例如抗生素)。
本文使用的术语“生物合成的”是指活体生物对化合物的任何生产。
本文使用的术语“能形成颗粒的”是指化学的、生物合成的或生物学实体或化合物，其能够形成固体颗粒，通常在液体培养基中形成。颗粒的形成典型地发生在能形成颗粒的实体暴露于某条件下时，所述条件例如为pH、温度、湿度和/或摩尔渗透压浓度/重量摩尔渗透压浓度。对所述条件的暴露可导致例如结合、聚结、凝固和/或脱水，从而形成颗粒。沉淀反应是能形成颗粒事件的一个例子。
本文使用的“共溶液”是由至少两种化学、生物学和/或生物合成的实体组成的任何介质。例如，可以通过将包含至少一种化学、生物学和/或生物合成的实体的液体与包含化学、生物学和/或生物合成的实体的固体组合来形成共溶液。在另一个例子中，可以通过将包含至少一种化学、生物学和/或生物合成的实体的液体与包含化学、生物学和/或生物合成的实体的另一种液体组合来形成共溶液。在又一个例子中，可以通过向单个溶液中添加至少两种固体形成共溶液，所述每种固体包含至少一种化学、生物学和/或生物合成的实体。
本发明中考虑的天然GLP-1是具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽。天然GLP-1肽在体内于数分钟内被快速的切割和灭活。
本发明的GLP-1类似物可包括毒蜥外泌肽，其为被发现是GLP-1受体激动剂的肽；这类类似物可还包括毒蜥外泌肽1到4。毒蜥外泌肽在毒蜥(Gila-monster)的毒液中被发现，并与哺乳动物GLP-1分享约53％的氨基酸同源性。毒蜥外泌肽还具有对GLP-1受体的类似亲合力。据报道毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4刺激胰腺腺泡细胞中的cAMP生产和淀粉酶从胰腺腺泡细胞中的释放(Malhotra et al.，1992；Raufman et al.，1992；Singh et al.，1994)。已经提出了毒蜥外泌肽-3作为促胰岛素剂用于治疗糖尿病和预防高血糖症的用途(美国专利No.5,424,286)。
毒蜥外泌肽的羧基末端片段如毒蜥外泌肽[9-39](羧基酰胺化的分子)和穿过9-39的片段3-39已经被报道为是GLP-1的有力的和选择性的拮抗剂(Goke et al.，1993；Raufman et al.，1991；Schepp et al.，1994；Montrose-Rafizadeh et al.，1996)。文献还证实了毒蜥外泌肽[9-39]在体内封闭内源GLP-1，导致减少的胰岛素分泌(Wang et al.，1995；D′Alessio et al.，1996)。毒蜥外泌肽-4有效结合分泌胰岛素的β-TCl细胞上的GLP-1、来自胰腺的分散的腺泡细胞和来自胃的壁细胞。毒蜥外泌肽-4肽也在经分离的胃中刺激促生长素抑制素释放和抑制胃泌素释放中起作用(Goke et al.，1993；Schepp et al.，1994；Eissele et al.，1994)。在用克隆的GLP-1受体转染的细胞中，毒蜥外泌肽-4被报道为激动剂(即其促进cAMP)，而毒蜥外泌肽[9-39]被定义为拮抗剂(即其阻断毒蜥外泌肽-4和GLP-1的刺激作用)。还发现毒蜥外泌肽是抗降解的。
本发明的另一实施方案考虑了肽模拟物的用途。如本领域技术人员已知的，肽模拟物是生物学上模拟激素、细胞因子、酶底物、病毒或其他生物分子上活性决定簇的肽，并可拮抗、刺激或以其他方式调节天然配体的生理活性。参阅例如BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY，Pezzuto et al.，Eds.，Chapman and Hall，New York(1993)中的Johnson et al.，＂Peptide TurnMimetics＂。使用肽模拟物的潜在原理是蛋白质的肽主链主要以确定氨基酸侧链方向有助于分子相互作用的方式存在。预计肽模拟物允许与天然分子相似的分子相互作用。
在其他实施方案中，本发明的GLP-1分子会具有天然GLP-1的至少一种生物活性，例如与GLP-1受体结合并引发导致促胰岛素活性的信号转导途径的能力。在本发明的其他实施方案中，GLP-1分子可以是肽、多肽、蛋白质、类似物、模拟物、衍生物、同种型、片段等等，其维持天然存在的GLP-1的至少一种生物活性。GLP-1分子还可包括可药用盐和前药，和前药的盐，天然存在的人GLP-1的多形体(polymorph)、水合物、溶剂合物、生物活性片段、生物活性变体和立体异构体，以及天然存在的人GLP-1的激动剂、模拟物和拮抗剂变体。包括毒蜥外泌肽1到4的毒蜥外泌肽家族，及其多肽融合物。本发明的GLP-1分子也可以包括二肽基肽酶-IV(DPP-IV)保护的GLP-1，其阻止或抑制GLP-1的降解。
本发明的GLP-1分子包括肽、多肽、蛋白质及其衍生物，其含有氨基酸取代、改进溶解度、赋予对氧化的抗性、提高生物效力，或提高循环中的半衰期。因此，本发明中考虑的GLP-1分子包含氨基酸取代、删除或添加，其中所述氨基酸选自本领域公知的那些。分子的N端或C端也可以被修饰，例如但不限于被酰化、乙酰化、酰胺化。因此，在本发明中，术语“氨基酸”是指天然存在的和非天然存在的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，其以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥功能。天然编码的氨基酸是20种常见的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰氨、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰氨、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)和焦赖氨酸(pyrolysine)和硒代半胱氨酸(selenocysteine)。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，所述基本化学结构即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍、瓜氨酸、羟基谷氨酸、羟基脯氨酸和praline。这类类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)，但是保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。本发明中考虑的氨基酸还包括与α-氨基酸相似的β-氨基酸，因为它们含有氨基端和羧基端。然而，在β-氨基酸中，两个碳原子分开这些功能性末端。带有特定侧链的β-氨基酸能够作为α(C2)碳或β(C3)碳上的R或S异构体存在。这导致对任何给定的侧链而言总共四种可能的非对映异构体。
本发明的GLP-1分子也可包括杂种GLP-1蛋白、其融合蛋白、寡聚体和多聚体、同系物、糖基化模式变体和突变蛋白质，其中GLP-1分子保持天然分子的至少一种生物活性，并且与其合成或制造方法无关，所述方法包括但不限于重组(无论是从cDNA、基因组DNA、合成的DNA或其它形式的核酸产生)、合成和基因激活方法。重组DNA技术是本领域普通技术人员公知的(见Russell，D.W.，et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001)。
III.二酮哌嗪
二酮哌嗪因为其形成微粒的能力而是本领域公知的，所述能力适用于药物递送和稳定。在本发明中，使用二酮哌嗪有助于GLP-1分子的吸收，从而提供抗降解的稳定制剂。
可使用多种方法，其中二酮哌嗪可以形成整和GLP-1分子的颗粒，或GLP-1分子能够吸附在上面的颗粒。这可涉及将二酮哌嗪溶液与GLP-1分子的溶液或悬浮液混合然后沉淀，随后形成包含二酮哌嗪和GLP-1的颗粒。或者，可以沉淀二酮哌嗪形成颗粒，并随后与GLP-1分子的溶液混合。二酮哌嗪颗粒与GLP-1分子之间的缔合可以通过溶剂去除来进行，或在干燥之前可以包括特定的步骤(如pH调节)，从而促进缔合。
在一个优选的实施方案中，本发明的二酮哌嗪包括但不限于3，6-二(4-富马酰-氨丁基)-2，5-二酮哌嗪，也已知为(E)-3，6-二[4-(N-羧基-2-丙烯基)氨丁基]-2，5-二酮哌嗪(其也被称作富马酰二酮哌嗪或FDKP)。
本发明中考虑的其他二酮哌嗪包括，但不限于3，6-二(4-氨丁基)-2，5-二酮哌嗪的衍生物例如：3，6-二(琥珀酰-4-氨丁基)-2，5-二酮哌嗪(在本文中也称作3，6-二(4-羧丙基)氨丁基-2，5-二酮哌嗪；琥珀酰二酮哌嗪或SDKP)；3，6-二(马来酰-4-氨丁基)-2，5-二酮哌嗪；3，6-二(柠康酰-4-氨丁基)-2-5-二酮哌嗪；3，6-二(戊二酰-4-氨丁基)-2，5-二酮哌嗪；3，6-二(丙二酰-4-氨丁基)-2，5-二酮哌嗪；3，6-二(草酰-4-氨丁基)-2，5-二酮哌嗪及其衍生物。在其它实施方案中，本发明考虑了二酮哌嗪盐的用途。这类盐可包括例如任何可药用的盐，如二酮哌嗪的Na、K、Li、Mg、Ca、铵或单、二或三烷基铵(如衍生自三乙胺、丁胺、二乙醇胺、三乙醇胺或吡啶等等)盐。盐可以是单盐、二盐或混合的盐。也考虑了二酮哌嗪的更高级的盐，其中R基团含有多于一个酸基。在本发明的其它方面，试剂的基本形式可以与二酮哌嗪混合形成二酮哌嗪的药物盐，从而该药物是二酮哌嗪的平衡阳离子(counter cation)。本文考虑的盐的一个例子以非限制性的方式包括FDKP二钠。美国专利申请No：11/210,710教导了使用DKP的药物递送，其涉及DKP盐的所有内容通过参考并入本文。
如本文中别处所公开的，本发明还使用了新颖的FDKP不对称类似物xDKP，例如(E)-3-(4-(3，6-二氧代哌嗪-2-基)丁基氨基甲酰基)-丙烯酸；(E)-3-(3-(3，6-二氧代哌嗪-2-基)丙基-氨基甲酰基)丙烯酸；和(E)-3-(4-(5-异丙基-3，6-二氧代哌嗪-2-基)-丁基氨基甲酰基)丙烯酸，并在题为＂AsymmetricalFDKP Analogs for Use as Drug Delivery Agents＂的美国临时专利申请中公开，该申请在与此一致的日期提交并以其整体并入本文(代理人案号No.51300-00041)。
二酮哌嗪可以如下形成：如Katchalski，et al.，(J.Amer.Chem.Soc.68：879-80；1946)所述通过氨基酸酯衍生物的环二聚体作用，如Kopple，etal.，(J.Org.Chem.33：862-64；1968)所述通过二肽酯衍生物的环化或通过氨基酸衍生物在高沸点溶剂中的热脱水，所述文件的教导被引入本文。
用于合成和制备二酮哌嗪的方法是本领域普通技术人员公知的，并公开于美国专利5,352,461；5,503,852；6,071,497；6,331,318；6,428,771和美国专利申请No.20060040953中。美国专利No.6,444,226和6,652,885描述了在水性悬浮液中制备和提供二酮哌嗪微粒，所述水性悬浮液中被添加了活性试剂的溶液，从而使活性试剂与颗粒结合。这些专利还描述了通过冻干法去除液体介质产生包含活性剂的微粒的方法，改变这类悬浮液的溶剂条件以促进活性试剂与颗粒的结合则在美国专利申请系列No：60/717,524和11/532,063(二者均题为＂Method of Drug Formulation Based on Increasingthe Affinity of Active Agents for Crystalline Microparticle Surfaces＂)和11/532,065(题为“Method of Drug Formulation Based on Increasing theAffinity of Active Agents for Crystalline Microparticle Surfaces.”)中教导。还参阅美国专利No.6,440,463和2005年8月23日提交的美国专利申请系列No：11/210,709和美国专利申请No.11/208,087。在一些情况下，考虑到通过例如2006年2月22日提交的题为＂A Method For Improving thePharmaceutic Properties of Microparticles Comprising Diketopiperazine and anActive Agent.”的美国专利申请系列No.11/678,046中公开的喷雾干燥方法干燥本发明的被负载的二酮哌嗪颗粒。每份专利和专利申请针对它们涉及二酮哌嗪的内容通过参考并入本文。
IV.GLP-1/DKP颗粒的治疗制剂
本发明还提供了用于施用给需要治疗的受试者的GLP-1/FDKP制剂。本发明中考虑的受试者可以是家居宠物或人。在某些实施方案中，治疗是针对II型糖尿病、肥胖症、癌症或其任何相关疾病和/或病症。人是尤其优选的受试者。
本发明中考虑的其它疾病或病症包括，但不限于肠易激综合征、心肌梗死、缺血、再灌注组织损伤、血脂障碍、糖尿病心肌病、急性冠状动脉综合征、代谢综合征、手术后分解代谢改变、神经变性病症、记忆和学习障碍、胰岛细胞移植和再生治疗或中风。本发明考虑的其它疾病和/或病症包括与上文所列的相关的任何疾病和/或病症，其可以通过对需要的受试者施用GLP-1/FDKP干粉制剂来治疗。本发明的GLP-1/FDKP干粉制剂也可以用于治疗II型糖尿病和高血糖症的人细胞中β细胞分化的诱导。
还在本发明的又一个实施方案中，考虑到受试者可以是家居宠物或动物，包括大鼠、兔子、仓鼠、荷兰猪、沙土鼠(gerbil)、旱獭、猫、犬、绵羊、山羊、猪、牛、马、猴子和猿(包括猩猩、长臂猿和狒狒)。
还考虑到本发明的GLP-1/FDKP颗粒制剂可以通过本领域普通技术人员公知的和用于临床或非临床目的的多种施用途径施用。本发明的GLP-1/FDKP组合物可以被施用至任何靶向的生物膜，优选受试者的粘膜。施用可以通过任何途径进行，所述途径包括但不限于经口、经鼻、经颊、全身性静脉注射、皮下、通过血或淋巴提供的分区施用、直接施用至受侵袭的位点或甚至通过局部手段进行。在本发明优选的实施方案中，GLP-1/FDKP组合物的施用通过肺部递送。
本发明中可以使用的其它备选的施用途径可包括：真皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、玻璃体内、阴道内、直肠的、瘤内、肌内、血管内(intravesicular)、粘膜的、心包内、支气管局部施用，使用气雾剂，注射、灌输、连续灌输、集中灌注直接沐浴靶细胞，通过导管、通过灌洗，在霜剂中、在液体组合物(例如脂质体)中，或通过本领域常规计数人员会制造的其它方法或前述的任何组合(参阅例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，1990，其涉及给药方法的全部内容通过参考并入本文)。
作为干粉制剂，本发明的GLP-1/DKP颗粒可以通过吸入被递送至呼吸系统的特定区域，这取决于颗粒的大小。另外，GLP-1/DKP颗粒可以被制造成足够小而能掺入静脉注射悬浮液剂型中。对于经口递送而言，可以可以被掺入悬浮液、片剂或胶囊中。GLP-1/DKP组合物可以从吸入装置被递送，所述吸入装置例如雾化器、压力定量气雾剂、干粉吸入器和喷雾器。
在其它实施方案中，考虑向需要的患者施用“有效量”的GLP-1/DKP制剂。本发明中考虑的“有效量”的GLP-1/DKP干粉制剂是指GLP-1化合物、类似物或肽模拟物等等的量，该用量会在一些程度上缓解被治疗的疾病、病症或障碍的一个或多个症状。在一个实施方案中，“有效量”的GLP-1/DKP干粉制剂应当是通过将血浆胰岛素水平提高、禁食血糖水平减少或降低和胰腺β-细胞量提高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多(但不限于此)来治疗糖尿病的GLP-1分子的量。在另一优选的实施方案中，本发明考虑通过对需要这类治疗的受试者施用药物有效量的GLP-1分子来治疗肥胖症。在这类情况下，“有效量”的GLP-1/DKP干粉制剂应当是通过将体重减少或降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多(但不限于此)的GLP-1分子的量。本发明还考虑了施用“有效量”的GLP-1/DKP干粉制剂用于通过对需要这类治疗的受试者施用药物有效量的GLP-1分子来控制饱满感。就非限制性的方式而言，GLP-1分子可以是毒蜥外泌肽分子如毒蜥外泌肽-1或-4。在这类情况下，“有效量”的GLP-1/DKP干粉制剂应当是将饥饿感受和食物摄入(例如通过质量或卡路里含量测量)减少至少约5％，6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、35％、40％、45％、50％或更多(但不限于此)的GLP-1分子的量。“有效量”的GLP-1/DKP干粉制剂还可以被定义为足够可检测地和可重复地改善、减少、最小化或限制疾病或病症或其症状的程度的量。也可能使用“有效量”的本发明制剂消除、清除或治愈疾病或病症。
在对需要的受试者施用本发明的GLP-1/FDKP组合物时，组合物的实际剂量可以以物理和生理因素为基础确定，所述因素如体重、病症的严重性、被治疗的疾病类型、先前或共存的治疗干涉、患者的特发病(idiopathy)和施用途径。技术人员应当能够基于一个或多个这些因素确定实际的剂量。
本发明的GLP-1/DKP制剂可以被施用一次或多于一次，取决于待治疗的疾病或病症。GLP-1/DKP制剂的施用可以以下述间隔被提供给受试者，所述间隔在数分钟、数小时、数天、数周或数月的范围内变化。在一些情况下，治疗方案的计时可涉及施用后GLP-1分子的半衰期。在其它实施方案中，例如在治疗具体的或复杂的疾病或病症如癌症时，例如可期望施用含药物赋形剂或试剂的本发明的GLP-1/DKP制剂。在这类情况下，可以由药物赋形剂或试剂指导施用方案。
V.实施例
以下的实施例包括在本文中用于阐述本发明的某些实施方案。本领域技术人员应当明白，实施例中公开的技术阐明了在本发明的实践中适当地发挥功能的代表性技术。然而，本领域的技术人员在本发明的启发下应当明白，可以在公开的特定实施方案中进行许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果，而不偏离本发明的宗旨和范围。
实施例1
GLP-1结构的生物物理学分析和分析法分析
为了分析GLP-1的结构和行为，使用了大量的生物物理学技术和分析技术。这些技术包括远紫外线圆二色性(远-UV CD)、近紫外线圆二色性(近-UV CD)、内荧光、傅立叶变换红外光谱学(FTIR)、高压液相色谱(HPLC)和质谱(MS)；其均是本领域普通技术人员公知的。使用大范围的条件研究浓度、离子强度、温度、pH、氧化胁迫、搅动和多重冻融循环对GLP-1肽的影响；其均在下文更详细地描述。也使用这些分析表征降解的主要途径，并确立操作GLP-1的肽结构从而达成某GLP-1/DKP制剂的条件。
实验步骤
GLP-1购自American Peptide(Sunnyvale，CA)或AnaSpec(San Jose，CA)，或内部制造(MannKind Corporation，Valencia，CA)。在pH4.0和20℃(除非另有说明)下分析多种浓度的水性GLP-1样品。样品一般是新鲜制备的并在每次实验前与适当的添加剂(例如盐、pH缓冲液、H2O2等，如果有的话)混合。用远-UV CD和透射傅立叶转换红外光谱(FTIR)收集多种条件下GLP-1的二级结构测量结果。另外，使用近-UV CD和内荧光，通过监测其芳香族残基(即色氨酸)周围的环境来分析GLP-1的三级结构。
GLP-1的浓度依赖性结构
使用圆二色性(CD)谱分析分子(如蛋白质或肽)可能显示的α-螺旋、随机卷曲、β-折叠片层、β-转角和随机卷曲。具体地，使用远-UV CD测定蛋白质和肽中二级结构的类型，例如纯α-螺旋、β-片层等。另一方面，使用近-UV CD分析分子的三级结构。因此，为了检查浓度对GLP-1的影响，使用远-UV CD和近-UV CD技术二者。
图1A中的远UV-CD证实了在大范围的浓度(例如1.8、4.2、5.1、6.1、7.2和8.6mg/ml)下，GLP-1形成两种不同的结构，所述结构包括α-螺旋和随机卷曲。通过205nm处的巨大单个最小值确定，在低浓度(≤2mg/mL)下GLP-1主要是无组织的。通过208nm和224nm处的两个最小值确定，当浓度提高时肽采取α-螺旋结构(图1A)。
三级结构分析提示高浓度的GLP-1结构是自身缔合的构象(即寡聚物)。近-UV CD和荧光发射数据均支持该假设。近-UV CD(图1B)中250-300nm之间的阳性条带揭示了GLP-1具有确定的三级结构，该结构在更高的浓度下增加。更特别地，这些条带表明肽的芳香族残基被大量地固定，并存在于明确定义的环境中。
类似地，多种浓度下(pH4.0，20℃)GLP-1的荧光发射显示芳香族残基色氨酸(其也在近-UV CD谱中显示强烈的条带)存在于明确定义的三级结构中；显示的数据得自280nm处的色氨酸激发(图1C)。对低浓度GLP-1而言355nm处的荧光最大值表明色氨酸被暴露于溶剂中，且不存在显著的三级结构。在高肽浓度下，最大值强度降低并迁移至更短的波长，表明更多确定的三级结构。
为了进一步测定GLP-1自身缔合构象的潜在的二级结构，在多种浓度下(pH4.0，20℃)进行FTIR分析。1656cm-1处的酰胺I条带清楚地表明在≥2mg/mL的浓度下GLP-1具有α-螺旋结构(图1D)。因此，GLP-1不形成β-片层结构；取而代之，在高浓度下肽更可能产生螺旋束。
另外，实验显示这些不同的GLP-1结构不是通过样品处理产生的。与将肽直接溶于缓冲液中制备的GLP-1相比，来自浓缩的储存溶液的稀释液产生类似的远-UV CD、近-UV CD和荧光发射谱。
离子强度对GLP-1的影响
还进行了一些研究来测定离子强度对GLP-1肽的影响。图2A(远-UV-CD)阐述了提高盐的浓度(从100mM到1000mM)将无序的GLP-1结构转化为α-螺旋构象，如208nm和224nm处的最小值所揭示的那样。将NaCl浓度提高至1M后，很多肽(在1.0mg/mL时)从溶液中沉淀出来(图2A)。然而，这种类型的沉淀显示用水稀释后溶解，从而确定了在高离子强度下GLP-1可以被可逆地沉淀。
盐还显示产生并促进GLP-1的三级结构。这在图2B(近-UV-CD)中例证，其中1.0mg/mL GLP-1在无盐时不显示信号，但是显示清楚的三级结构，该三级结构随着提高的离子强度而强化。280nm处色氨酸激发后在多种NaCl浓度下(pH4.0，20℃)1.0mg/mL GLP-1的荧光发射(图2C)证实了这些结果。提高的离子强度引起荧光最大值迁移至更短的波长，表明1.0mg/mL GLP-1的三级结构既被产生又被增强。
另外，使用近-UV CD谱在多种离子强度下(pH4.0，20℃)对10mg/mLGLP-1的三级结构分析证实提高的离子强度也增强了GLP-1的自身缔合构象(图2D)。
因此，数据提示离子强度对GLP-1的结构具有巨大的影响，引起蛋白质既采取α-螺旋构象又缔合成为寡聚体。另外，提高溶液中的离子强度引起GLP-1的寡聚化提高，直到其可逆地沉淀为止。该事件在低肽浓度(其中最初不存在三级结构)以及高肽浓度(其已经显示大量二级和三级结构)下是明显的。因此，提高的离子强度容易地将无组织的GLP-1转化为α-螺旋和自身缔合的构象。另外，观察到的分光镜结果与先前显示的提高的肽浓度的影响是可比较的。
温度和pH对GLP-1的影响
还进行了研究来测定GLP-1的自身缔合的构象是否对温度或pH的改变敏感。图3A(近-UV-CD)证实随着温度提高，10mg/mL GLP-1的三级结构显著地离解。另一方面，在多种温度和pH4.0下，温度对低浓度(0.05mg/mL)的GLP-1不具有影响；见图3B和3C(远-UV-CD)。远-UV CD阐明了肽对温度是不敏感的。因此，提高的分子运动显著地妨碍了GLP-1的自身缔合。
相反，图4A(远-UV-CD)证实α-螺旋GLP-1构象的溶解度是pH敏感的。尽管在pH4.4和以下时，10mg/mL GLP-1的结构是相对均一的(即GLP-1保持螺旋)，但是当pH提高至接近或处于中性(pH6.3和7.6之间)时，一些沉淀发生并产生无序的谱系。其中发生了沉淀的样品具有更低的强度，因为溶液中存在更少的可溶性GLP-1。该无序的结构通过图4A(远-UV-CD)中208nm处观察到的单个最小值确定，这在图4B(近-UV-CD)中进一步描述并且有可能得自沉淀后溶液中GLP-1的减少。当pH提高至高于GLP-1的5.5的pI时，可发生该沉淀。然而，随着pH从接近中性提高至11.7，大部分沉淀再溶解，表明该沉淀是可逆的。在pH11.7剩余的未溶解的GLP-1沉淀会引起溶液中肽量降低，从而降低远-UVCD谱系的强度，如图4A中所观察到的。还观察到当冻干的GLP-1粉末与pH9缓冲液混合为高浓度GLP-1时，GLP-1是极端不溶的。
GLP-1的稳定性
通过测定GLP-1肽对脱酰胺作用和氧化作用的抗性以及对搅动和冻融循环影响的抗性来测定其稳定性。
将处于pH10.5的GLP-1(1mg/mL)在40℃孵育5天，之后进行反相HPLC和电喷射质谱(MS)用于脱酰胺作用和氧化作用分析。也使用HPLC和MS对GLP-1样品(1mg/mL)进行氧化研究，所述样品在存在0.1％H2O2时孵育2小时。
图5描述了GLP-1在脱酰胺和氧化条件下的稳定性。HPLC色谱图阐明了GLP-1在相同的滞留时间下洗脱，并且所分析的失稳条件没有产生降解峰。另外，MS分析对所有样品产生了类似的质量3297g/mol，表明该质量未被改变。数据还阐明了在多种条件下孵育时肽保持纯净和完整。因此，未观察到GLP-1的脱酰胺。GLP-1也显示对氧化胁迫是稳定的，如在存在0.1％H2O2时所观察的那样，其中GLP-1的纯度和质量保持完整，如通过HPLC和MS分别测定的那样。总之，不存在滞留时间或质量值的改变，并且未产生降解峰，从而证实了GLP-1肽对脱酰胺和氧化均是抗性的。
搅动和连续的冻融循环对多种浓度的GLP-1的影响用近-UV CD和内荧光分析。9.4和1.5mg/mL GLP-1的搅动不产生肽的显著改变，如通过近-UV CD(图6A)和荧光发射(图6B)所观察到的那样。将样品在室温下搅动30和90分钟，并在280nm处色氨酸激发后收集荧光发射谱。在独立的冻融研究中，将含1.6、5.1和8.4mg/mL GLP-1(pH4.0)的溶液在-20℃冷冻并在室温下熔化。通过近-UV CD(图7A)和荧光发射(图7B)指导和分析10次冻融循环对GLP-1的影响。在280nm处色氨酸激发后收集荧光发射谱。两种分析均显示肽的三级结构不由于多重冻融循环而可观地改变。在类似的实验中，分析11次冻融循环对10mg/mL GLP-1(pH4.0)二级结构的影响(图7C)。远-UV CD阐明了肽的二级结构不因为多重冻融循环而显著改变。
总之，得自以上实验的生物物理学分析显示GLP-1肽的结构受其在溶液中浓度的强烈影响。当GLP-1的浓度被提高时，α-螺旋更加突出。另外，提高离子强度增强(在一些情况下产生)三级GLP-1结构。
实施例2
GLP-1/FDKP吸附研究
通过进行吸附研究评价悬浮液中GLP-1与二酮哌嗪(DKP)颗粒的相互作用。吸附研究中的变量探究了静电、氢键、水结构、蛋白质柔性和特异的盐-配对相互作用对GLP-1/DKP相互作用的影响。另外，测试了若干种常见的蛋白质稳定剂对GLP-1与DKP表面吸附的影响。
使用预先形成的DKP悬浮液颗粒(即FDKP)，研究了GLP-1吸附至预先形成的DKP颗粒表面的条件。FDKP颗粒悬浮液(其中FDKP颗粒是预先形成的)与3X pH缓冲液和3X添加剂或赋形剂的溶液组合。最终溶液具有5，mg/ml的FDKP浓度和0.25，mg/ml(5％w/w)的GLP-1浓度。上清液中未结合的GLP-1从悬浮液中滤除。用100，mM碳酸氢铵溶解FDKP颗粒与结合的GLP-1蛋白质，并过滤以分离任何聚集的GLP-1蛋白质。通过HPLC定量上清液和重建的级分中的GLP-1量。进行一系列实验，其中使用的条件包括使用添加剂(例如盐、表面活性剂、离子、渗透物、离液剂、感胶离子)和多种浓度的GLP-1。得自这些研究的结果在下文描述。
盐研究。-通过HPLC分析观察盐对GLP-1与FDKP颗粒结合的影响。在存在0、25、50、100、250、500、1000和1500mM NaCl时于5mg/mL FDKP和0.25mg/mL GLP-1下进行GLP-1/FDKP颗粒的负载(图8A)。还作为pH和NaCl浓度的函数，评价了在重建的无FDKP对照样品中检测的GLP-1量(图8B)。两组数据组中的pH均用20mM磷酸盐/20mM乙酸盐混合物控制。
如在图8A中所观察到的，GLP-1对FDKP的最佳结合(吸附)受到悬浮液pH的强烈影响。在4和以上的pH下，溶液中GLP-1/FDKP比例为5％w/w时，观察到约3.2％到约4％的GLP-1对FDKP的结合。在存在0和25mM NaCl时，在pH2.0下基本上没有明显的GLP-1对FDKP颗粒的吸附，但是用提高的离子强度观察到一些明显的负载。在含≥1M NaCl的无FDKP对照中观察到GLP-1沉淀，图8B。在≥1M NaCl下该明显的负载是GLP-1肽在高离子强度下可逆沉淀(盐析)的结果。不含FDKP颗粒的高盐GLP-1对照也在重建的样品中显示高GLP-1水平，表明收集上清液时GLP-1已经被滤器捕获。低于1M NaCl时，不存在FDKP颗粒的情况下没有GLP-1沉淀的迹象。
表面活性剂研究.-通过HPLC分析研究表面活性剂对GLP-1与FDKP颗粒结合的影响。负载在存在表面活性剂时5mg/ml FDKP和0.25mg/mLGLP-1下进行(图9A)。也作为pH和表面活性剂的函数评价了在重建的无FDKP对照样品中检测的GLP-1量(图9B)。pH和对照样品条件与上面描述的用于离子强度研究的条件相同。该研究中使用的表面活性剂包括：0.09mM的Brij 78、0.01mM的Tween 80、0.2mM的Triton X、0.12mM的Pluronic F68、0.9mM的H(CH2)7SO4Na、0.9mM的CHAPS、0.9mM的Cetrimide。存在每种表面活性剂时GLP-1的负载曲线作为pH的函数针对GLP-1/FDKP显示。
数据显示针对GLP-1/FDKP颗粒的pH吸附曲线不受接近其临界胶团浓度(CMC)的表面活性剂的存在影响，所述临界胶团浓度即分开下述界限的小范围的浓度：在其以下事实上检测不到聚集物/胶团的界限，且在其以上事实上所有额外的表面活性剂分子均形成聚集物的界限。因此，还提示了任何这些表面活性剂可被用于最优化如下所述的稳定性和/或药物代谢动力学(PK)。如上文盐研究中可证实的，GLP-1与FDKP颗粒的相互作用受悬浮液的pH影响。
离子研究。对该实验而言，进行两种不同的离子研究来测定离子对GLP-1与FDKP颗粒结合的影响。在两种研究中，Cl-为阳离子的平衡离子，Na+为阴离子的平衡离子。如先前实验所述进行GLP-1/FDKP颗粒的负载。如上文所述控制pH。在存在和不存在NaCl(其被用于更好地评价高离子强度的情况)时用pH3.0、3.5、4.0或5.0的pH缓冲液制备样品。个体样品中如下包含其他离子：20或250mM的LiCl、20或250mM的NH4Cl、20或250mM的NaF和20或250mM的NaCH3COO。
如图10A所示，来自第一个离子研究的数据显示作为pH和离子的函数的GLP-1/FDKP负载曲线。在无NaCl时，20或250mM浓度的氟化物强烈地影响(增强)低pH下的吸附，其中250mM的NaF浓度显示与pH无关的最大的结合。观察到该模式是由于溶液中的氟而不是钠，因为碳酸氢钠在20和250nM不具有相同的作用。另外，这些作用不是样品中钠的结果，因为如图8中所示，类似浓度的盐不显示该作用。存在1M NaCl时，所有的离子给出了高的“表观”负载。对1M NaCl，而言该“表观”负载由存在高离子强度时GLP-1肽从溶液中盐析引起。这在图10B中进一步阐明，所述图10B显示GLP-1存在于含1M NaCl的重建的无FDKP对照样品中。针对这些对照样品检测的GLP-1的量在更大的离子浓度下提高，因为它们增加了样品中的总离子强度。
在第二个离子实验(图10C)中，在存在20或250mM KCl、20或250mM咪唑、20或250mM NaI、或20或250mM NaPO4时制备GLP-1/FDKP样品。数据显示250mM咪唑在存在1M NaCl时降低负载，250mM磷酸盐和250mM均给出高的“表观”负载(图10C)。根据在0M和1M NaCl浓度下重建的无FDKP对照样品中检测的GLP-1量(图10D)，这些影响是由离子对GLP-1肽自身的影响而不是对肽与FDKP颗粒相互作用的影响引起。磷酸钠和碘化钠引起不存在NaCl时一些GLP-1的盐析。另外，咪唑帮助将GLP-1溶解于1M NaCl样品中，从而给出更低的“表观”负载。在250mM磷酸盐和碘化物的0M NaCl对照中也观察到了沉淀。
渗透物研究。也通过HPLC分析观察GLP-1对FDKP颗粒的结合。图11A显示存在常见的稳定剂(渗透物)时作为pH函数的GLP-1/FDKP负载曲线。如先前实验中所述进行GLP-1/FDKP颗粒的负载。类似地，如上文所述控制pH。在pH3.0和存在20、50、100、150、200或300mM的渗透物(稳定剂)时制备样品。渗透物为己二醇(Hex-Gly)、海藻糖、甘氨酸、PEG、TMAO、甘露醇或脯氨酸；N/A表示无渗透物。在类似的实验中，样品中渗透物(稳定剂)的浓度被保持恒定在100mM，pH从2.0到4.0变化。
研究的渗透物(稳定剂)均对GLP-1到FDKP表面的吸附没有可观的影响，无论pH被维持在pH3.0而渗透物的浓度变化(图11A；左侧曲线)还是渗透物浓度被维持恒定在100mM而改变pH(图11A；右侧曲线)。在重建的无FDKP对照样品中未检测到GLP-1沉淀(图11B)。这些渗透物可被用于最优化稳定性和/或药物代谢动力学。
离液剂和感胶离子研究。研究影响水和蛋白质结构的离子种类(离液剂和感胶离子)，确定这些因素在GLP-1对FDKP吸附中的作用。如先前的实验中所述进行GLP-1/FDKP颗粒的负载。类似地，如上文所述控制pH。在pH3.0和存在0、20、50、100、150、200或300mM下述离液剂或感胶离子时制备样品，所述离液剂或感胶离子为：NaSCN、CsCl、Na2SO4、(CH3)3N-HCl、Na2NO3、柠檬酸钠和NaClO4。在类似的实验中，样品中离液剂或感胶离子的浓度被保持恒定在100mM，pH从2.0到4.0变化。
图12A显示作为pH和离液剂和/或感胶离子的函数的GLP-1/FDKP负载曲线。在低pH(≤3)时，对于分析的不同离液剂发生了负载中的显著变化，特别是在较高的离液剂浓度下。然而在pH4时，未观察到变化(图12C)。因此，这些试剂显示在不利的较低pH下促进GLP-1对FDKP颗粒的结合，但是在对结合有利的较高pH条件下具有非常少的影响。来自重建的无FDKP对照样品的数据提示在pH3.0下观察到的负载改变部分归因于特定的离液剂在多种程度上影响GLP-1肽的盐析(沉淀)(图12B和12D)。这对强离液剂如NaSCN和NaClO4而言是显著的。
有机物研究。评价下述醇来确定螺旋构象在GLP-1对FDKP的吸附中所起的作用，所述醇已知通过提高氢键的键合强度在无组织的肽中诱导螺旋构象。如先前实验中所述进行GLP-1/FDKP颗粒的负载。类似地，如上文所述控制pH。在pH2.0、3.0、4.0和5.0下观察每种醇的作用。使用的醇为：甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、三氟代乙醇(TFE)或六氟异丙醇(HFIP)。在5％、10％、15％和20％v/v的浓度下评价每种醇。
图13A显示对每种浓度的每种醇而言作为pH函数的GLP-1/FDKP负载曲线。在pH3.0下，低浓度的HFIP(5％)导致高吸附，如GLP-1对FDKP颗粒的质量比所证实的那样。只有最强的H-键增强(成螺旋)醇HFIP对缓冲的悬浮液中的吸附具有影响。在更高浓度的HFIP(20％)下，GLP-1/FDKP吸附被抑制。图13B显示在20％的醇浓度下，在重建的无FDKP对照样品中未记录到显著的GLP-1沉淀。
这提示药物的构象柔性(即能够形成的FDKP-接触物的熵和数量)可在吸附中起作用。数据提示H-键合在上述条件下GLP-1与FDKP表面的相互作用中可起作用。基于该数据，还推测如果H-键合作为FDKP-GLP-1相互作用中主要的和一般的力作用，则应期待更多和更强的作用。
浓度研究。-在多种GLP-1浓度下研究了GLP-1对FDKP颗粒表面的吸附。图14A显示多种pH下作为GLP-1浓度函数的来自GLP-1/FDKP的负载曲线。GLP-1浓度为0.15、0.25、0.4、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、5.0或10mg/mL。样品的pH为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0。
当FDKP浓度被保持恒定在5mg/mL而GLP-1浓度提高时，观察到FDKP颗粒上GLP-1负载的提高。在pH4下当GLP-1的浓度为10mg/mL时，观察到FDKP颗粒上接近20％的GLP-1吸附。惊人的是，在高浓度GLP-1下未观察到FDKP颗粒上负载的GLP-1吸附饱和。该观察结果可能归因于GLP-1自身缔合成为多层体。
通过扫描电子显微镜(SEM)对GLP-1/FDKP制剂形态学的分析显示GLP-1/FDKP颗粒作为晶体或平板样结构存在，其能够形成包含多于一个GLP-1/FDKP颗粒的聚集物(图14B)。通过冻干溶液制备这些制剂，所述溶液含有：(图A)0.5mg/mL GLP-1和2.5mg/mL FDKP；(图B)0.5mg/mL GLP-1和10mg/mL FDKP；(图C)20mM氯化钠、20mM乙酸钾和20mM磷酸钾，pH4.0中0.5mg/mL GLP-1和10mg/mL FDKP；和(图D)20mM氯化钠、20mM乙酸钾和20mM磷酸钾，pH4.0中10mg/mL GLP-1和50mg/mL FDKP
结果概述
总之，对GLP-1与FDKP颗粒相互作用的吸附研究显示GLP-1以pH-依赖性的方式与DKP颗粒表面结合，在pH4或之上具有高吸附。发现DKP颗粒表面对GLP-1的吸附受到pH最强影响，在pH2.0时基本没有吸附，在pH≥4.0时有重大的相互作用。根据观察，在低pH下钠和氟离子增强吸附。其他添加剂如表面活性剂和常用的稳定剂仅对GLP-1与FDKP颗粒表面的吸附具有轻微影响。
另外，GLP-1自身的特性影响这些实验的结果。发现GLP-1的行为是非典型并且惊人的，因为未观察到饱和吸附，这归因于高浓度下GLP-1的自身缔合。高浓度下GLP-1的自身缔合允许可能的多层GLP-1肽对DKP颗粒的包裹，从而促进更高百分比的GLP-1肽负载。该惊人的自身缔合性质证实在制备稳定的GLP-1施用形式中是有益的。另外，GLP-1的自身缔合构象可以能够减少或延迟其在血中的降解。然而，注意到当操作缔合的GLP-1时必须小心，因为其对温度和高pH是敏感的。
实施例3
GLP-1/FDKP制剂的完整性分析
以来自实施例1和2中实验的结果为基础，选择了具有表1中所述特征的一系列GLP-1制剂用于本文讨论的细胞存活力测定。大部分制剂含有GRAS(“一般被认为安全的”)赋形剂，但是一些被选择以允许研究稳定性和吸附之间的关系。
表1.针对完整性相分析(Integrity Phase Analysis)选择的GLP-1/FDKP。
另外，以实施例1和2中获得的结果为基础，还选择了一系列制剂用于GLP-1/FDKP的相II完整性研究。下表2显示选择用于相II完整性的六种GLP-1制剂。制备粉末后，将它们与空白的FDKP掺合，在每种制剂中产生类似的大量GLP-1肽和FDKP。
表2.针对II期完整性选择的GLP-1/FDKP制剂。从20mM NaCl和pH4.0缓冲液中10mg/ml GLP-1制成的制剂被描述为盐-缔合制剂。
 
GLP-1浓度 质量比(GLP/FDKP) 水(无缓冲液)   20mM NaCl+pH4.0缓冲液
0.5mg/mL 0.05 X X
3.0mg/mL 0.10 X X
10mg/mL 0.20 X X
通过HPLC分析胁迫对表2中GLP-1/FDKP制剂的影响(图15)。含负载在H2O中5％、10％或20％GLP-1/FDKP的样品；或负载在NaCl+pH4.0缓冲液中5％或10％GLP-1/FDKP的样品在40℃孵育10天。HPLC色谱图证实GLP-1肽以相同的滞留时间洗脱并且不存在降解峰。另外，MS分析产生对所有样品而言类似的质量3297g/mol，表明该质量对所有分析的样品而言是均一的。数据显示冻干前GLP-1对FDKP颗粒和溶液中存在其他成分的质量-质量比例。总之，GLP-1/FDKP制剂显示对胁迫是稳定的。
实施例4
在肺灌洗液中孵育的GLP-1的稳定性
考虑到在生物流体中发现二肽基-肽酶IV(DPP-IV)切割并灭活GLP-1，分析生物流体(如肺流体和血)中GLP-1的稳定性。
二肽基-肽酶IV(DPP-IV)是一种细胞外膜结合的丝氨酸蛋白酶，其在若干种细胞类型(尤其是CD4+T细胞)的表面上表达。还在血和肺流体中发现了DPP-IV。DPP-IV已经涉及葡萄糖代谢的控制，因为其底物包括促胰岛素激素GLP-1，所述GLP-1通过其N-端氨基酸的去除而被灭活；见图16A。DPP-IV切割人GLP-1(GLP-1(7-36))的主要循环形式的Ala-Glu键，释放N-末端的两个残基。DPP-IV显示通过降解GLP-1从而降低肠降血糖素对胰腺β-细胞的作用来负调节葡萄糖处理。
进行一些研究测定存在抑肽酶或DPP-IV抑制剂时大鼠血和肺流体中的GLP-1降解。向收集后的样品中以1、2、3、4和5TIU/ml添加天然存在的丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶，其在本领域已知抑制蛋白质降解。然后通过检测发光底物的切割测量DPP-IV活性，所述底物含有DPP-IV识别的Gly-Pro序列。将支气管肺洗出液与前-荧光底物孵育30分钟，并通过发光检测切割产物。
如在具有递增的抑肽酶浓度的多种生物流体(如本文所述)中通过肽降解的抑制所检测的，数据显示DPP-IV活性抑制的提高(图16B)。向收集后样品中以1.25、2.5、5、10和20μl/ml添加DPP-IV抑制剂观察到类似的结果(图16C)。样品收集后抑制剂的添加允许更精确的样品评价。
还使用捕获ELISA mAb(其识别GLP-1氨基酸7-9)在肺洗出液中检查了GLP-1的稳定性。GLP-1在肺洗出液(LLF)中孵育2、5、20和30分钟。如图17所示，孵育条件为：1或10μg(w/w)LLF和1或10μg(w/w)GLP-1。单独在LLF中未检测到GLP-1。使用多种浓度的LLF和GLP-1的组合，存在可与单独的GLP-1相比的高GLP-1检测，表明在肺洗出液中GLP-1是随时间稳定的(图17)。在类似的研究中证实了未稀释的肺洗出液中GLP-1的稳定性；标注了20分钟时70-72％的GLP-1完整性(数据未示出)。
另外，检查了大鼠血浆中GLP-1的稳定性。血浆得自不同的大鼠(如图例中血浆1和血浆2所示)并被1:2或1:10(v/v)稀释。向10μl血浆或PBS中添加1毫克GLP-1。将样品在37℃孵育5、10、30或40分钟。在冰上终止反应并添加0.1U的抑肽酶。数据显示在测试的所有时间点1:2和1:10的血浆稀释液中高浓度的GLP-1(图18A和18B)。总之，数据表明GLP-1在发现了丝氨酸蛋白酶DPP-IV的肺洗出液和血浆中均是惊人的稳定的。
实施例5
GLP-1分子对细胞凋亡和细胞增殖的影响
为了检查GLP-1是否抑制细胞凋亡，进行筛选测定来确定GLP-1对β-细胞死亡抑制的影响。用0、2、5、10、15或20nM浓度的GLP-1将大鼠胰腺上皮(ARIP)细胞(用作胰腺β-细胞模型；购自ATCC，Manassas，VA)预处理10分钟。然后使细胞未处理或用5μM十字孢碱(细胞凋亡诱导物)处理4.5小时。使用Cell Titer-GloTM(Promega，Madison，WI)评价细胞存活力。在十字孢碱处理的细胞中，用高达10nM的GLP-1浓度提高记录到细胞死亡百分比的降低(图19A)
使用锚定蛋白V染色通过FACS分析确定了GLP-1对细胞凋亡的影响的进一步检查。锚定蛋白V染色是检测凋亡细胞的一个有用工具，并是本领域技术人员公知的。锚定蛋白与细胞膜的结合允许在与细胞凋亡相关的形态学改变发生之前和膜完整性丧失之前分析磷脂(PS)不对称的改变。因此，在用15nm GLP-1、1μM十字孢碱4小时、1μM十字孢碱+15nmGLP-1或既无十字孢碱又无GLP-1(实验对照)处理的细胞中测定GLP-1对细胞凋亡的影响。数据显示GLP-1将十字孢碱诱导的细胞凋亡抑制约40％(图19B)。
使用GLP-1类似物毒蜥外泌肽-4观察到类似的细胞凋亡抑制结果，所述毒蜥外泌肽-4以类似GLP-1的方式与GLP-1受体结合。在存在0、10、20或40nM毒蜥外泌肽时用5μM十字孢碱将ARIP细胞分别处理16、24或48小时。数据(图20)显示在10nM时，毒蜥外泌肽对抑制细胞凋亡是完全无效的，因为100％细胞死亡。在20和40nM下，毒蜥外泌肽相同程度抑制细胞凋亡，存在40nM毒蜥外泌肽-4时48小时约50％抑制。
实施例6
候选物GLP-1/FDKP制剂对细胞死亡的影响
进行基于细胞的测定实验来评价GLP-1/FDKP制剂(如实施例3、上表1中公开的)抑制细胞死亡的能力。这些GLP-1/FDKP颗粒制剂处于悬浮液中或被冻干。分析制剂在ARIP细胞中抑制十字孢碱诱导的细胞死亡的能力。用GLP-1样品预处理的ARIP细胞被暴露于5μM十字孢碱中4小时，并用Cell Titer-GloTM(Promega，Madison，WI)分析以确定细胞存活力。
将多种GLP-1/FDKP制剂的样品不胁迫或在4℃或40℃下胁迫4周。在基于细胞的测定法中以45nM使用每种GLP-1/FDKP样品，来确定它们抑制十字孢碱诱导的细胞死亡的能力。右侧所示对照样品阐明单独的培养基中，单独含GLP-1的、单独含十字孢碱的、或存在GLP-1和十字孢碱二者的培养基中细胞的存活力(注意：图例不适用于对照样品。每条代表独立的一式三份)。所有所示的结果是一式三份进行的平均值。
数据显示所有胁迫的GLP-1/FDKP冻干制剂抑制十字孢碱诱导的细胞死亡(图21)。然而，许多GLP-1/FDKP悬浮液制剂不抑制细胞死亡。
实施例7
GLP-1/DKP颗粒的肺吹入法
为了检查GLP-1/FDKP的药物代谢动力学，在雌性Sprague Dawley大鼠中评价GLP-1的血浆浓度，所述雌性大鼠通过静脉(IV)注射或肺吹入法施用了多种GLP-1/FDKP制剂。在初步的研究中，使用占GLP-1/FDKP颗粒制剂约4％和16％(w/w)的GLP-1。大鼠被随机化为12组，其中第1、4、7和10组接受通过肺液体滴注或IV注射施用的GLP-1溶液。第2、5、8和11组接受通过肺吹入法或IV注射施用的GLP-1/FDKP盐结合的制剂(图表2中公开的)。第3、6、9、12组接受通过肺吹入法或IV注射施用的GLP-1/FDKP盐结合的混合制剂。GLP-1/FDKP制剂是约16％负载的盐结合的制剂。为了达到约4％的负载，将16％的制剂与DKP颗粒在3:1的混合物中掺合。对0.08mg的总GLP-1剂量而言，肺吸入法或静脉注射为0.5或2.0mg的颗粒(分别为16％或4％GLP-1负载)。
在独立的动物组(第7-12组)中，在第2天重复施用。对第1、4、7和10组施用80μg GLP-1溶液。对第2、5、8和11组施用GLP-1/DKP盐结合的制剂(～16％GLP-1负载)。第3、6、9、12组接受GLP-1/DKP盐结合的掺合制剂(～4％GLP-1负载)。
使用相同的制剂将实验进行两次，在连续的两天中给药和收集血。对每组而言在给药当天，在给药前(时间0)、给药后2、5、10、20、30、60和120分钟取血样。在每个时间点，将来自尾缘静脉的约150μL全血收集在含约3U/mL抑肽酶和0.3％EDTA的cyro-vial管中，倒置并储存于冰上。将血样在4000rpm离心并将40μl血浆用移液管移至96-孔平板中，所述平板被储存于-80℃，之后按照制造商的推荐(Linco Research，StCharles，MO)通过ELISA分析GLP-1水平。测定了最佳条件是只存在血清(5％FBS)而无基质的情况下当测定缓冲液为GLP-1时。
静脉施用：第5、6、10、11和12组静脉(IV)接受了多种GLP-1/FDKP制剂和GLP-1溶液(图22A)。第5组和第6组被施用给15.8％GLP-1/FDKP，第11和12组在相连的一天被施用给15.8％GLP-1/FDKP的另一种剂量；第10组被施用给作为对照的GLP-1溶液。在第0、2、5、10、20、40、60、80、100和120分钟的时间点检测GLP-1/FDKP的浓度。所有的组在静脉施用后显示GLP-1血浆水平的可检测提高，在处理后2分钟观察到最大的浓度。对所有组而言处理后20分钟活性GLP-1的血浆水平返回背景水平。通过静脉注射施用时，这些多种GLP-1/FDKP制剂和GLP-1溶液的动力学未观察到显著差异。注意到在通过静脉注射处理的大鼠中，给药后10-20分钟GLP-1的血浆水平回复至基线水平，提示生理动力学(即约95％的GLP-1在10分钟内被消除)。
单一吹入法施用：第1、2、3、7、8和9组通过肺吹入法接受了多种GLP-1/FDKP配方或GLP-1溶液(图22B)。第1组通过肺液体吹入法(LIS)施用了80μg的GLP-1对照；第2组通过肺吹入法(IS)施用了15.8％GLP-1/FDKP；第3组通过肺吹入法(IS)施用了3.8％GLP-1/FDKP；第7组通过肺液体吹入法(LIS)施用了80μg的GLP-1对照；第8组通过肺吹入法(IS)施用了15.8％GLP-1/FDKP；和第9组通过肺吹入法(IS)施用了3.8％GLP-1/FDKP。在第0、2、5、10、20、40、60、80、100和120分钟的时间点测量GLP-1/FDKP的浓度。
所有的组在肺施用后显示血浆GLP-1浓度的可检测提高。GLP-1最大血浆浓度随使用的制剂/组合物而变化。如AUC所指示的，第2组和第8组显示在处理后10-20分钟的最大GLP-1血浆水平，而第3组和第9组显示在第5-10分钟的显著活性GLP-1水平，第1组和第7组显示活性GLP-1血浆水平的更快速和瞬时的提高。在第2、3、7和8组中，处理后60分钟活性GLP-1的血浆水平回归至背景水平，而第1和7组在处理后20分钟达到背景水平。
在糖尿病大鼠模型中8纳摩尔的GLP-1似乎是有效的；GLP-1剂量为80μg(大于报道的有效剂量3000倍)；在给药后30分钟使用肺递送的血浆GLP-1水平与3小时灌输(Chelikani et al.，2005)相比高10倍；通过肺吹入法递送的GLP-1/FDKP的生物利用度为71％。这些结果在下表4中进一步报道。在通过肺递送处理的大部分大鼠中，给药后30-60分钟GLP-1的血浆水平回复至基线水平。除了第2组中的1号大鼠外，所有的大鼠在静脉注射或肺吹入多种GLP-1/FDKP制剂后显示GLP-1血浆浓度的提高。
结论：在GLP-1/FDKP制剂的药物代谢动力学模式中观察到了与GLP-1溶液相比的差异。相对于用GLP-1溶液处理的大鼠而言，通过GLP-1/FDKP制剂肺吹入法处理的大鼠中GLP-1的血浆浓度更加持久。在给药后20到60分钟之间，所有的动物显示GLP-1血浆浓度的降低。这些结果显示连续2天进行的2个实验的相对一致性。
表4.GLP-1/FDKP制剂的生物利用度
 
组 制剂 GLP-1剂量(μg)/μM 途径 T1/2(min) Tmax(min) Cmax(pM) 给药后30分钟(～pM) AUC(pM＊min/mL)
1 GLP-1 80/24 LIS 1.0 5 1933 0 29350
2 FDKP-GLP-1 80/24 IS 9.9 10 3154 1000 145082
3 FDKP-GLP-1* 80/24 IS 7.7 10 2776 400 60171
*与FDKP颗粒3:1掺合
实施例8
GLP-1/FDKP减少大鼠的食物摄入
本领域还已知GLP-1在大脑中作用，以触发饱满的感觉并减少食物摄入。根据GLP-1在饱满感和食物摄入中的该作用，进行实验确定本发明的GLP-1/FDKP制剂是否作为减少饲养的试剂是有效的并从而具有控制肥胖症的潜能。
通过肺吹入法用对照(空气)或2mg/天剂量的15.8％GLP-1/FDKP制剂(0.32mg GLP-1/剂)对两组雌性Sprague Dawley大鼠给药。对照组由五只大鼠组成，测试组由十只大鼠组成。每个大鼠连续5天被提供给单一剂量，并在每次给药后2和6小时测量食物摄入。每天收集每只大鼠的体重。
初步的数据显示在给药后2和6小时，在用GLP-1/FDKP制剂给药的大鼠中存在累积食物消耗的整体减少(图23A和23B)。在第4天给药后2小时该减少更显著(p＝0.01)。第1天和第2天6小时时该减少更显著(p<0.02)。给药后24小时没有对食物消耗的影响。
实施例9
毒性研究
进行重复的剂量毒性研究，以评价多次施用后GLP-1/DKP的可能的毒性作用和毒物代谢动力学模式。进行了大鼠中14天的研究和猴子中28天的研究。通过吸入途径每天进行GLP-1/DKP给药。在对动物给药28天的研究中，一部分动物要在给药方案后立即处死，而其它动物允许在处死前有至多一个月的恢复周期。评价所有动物的临床体征，多种生理参数，包括GLP-1、葡萄糖、胰岛素、器官重量和临床病理学和多种器官的组织病理学。
进行一系列GLP诱变性研究，以评价二酮哌嗪颗粒的诱变潜能。这些研究包括体外Ames和染色体畸变测定法，其均是本领域技术人员公知的。另外，也进行了技术人员已知的体内小鼠微核测定法。遗传毒性数据显示没有证据表示二酮哌嗪颗粒有诱变性或遗传毒性的潜能。
还进行一些研究评价二酮哌嗪颗粒对繁殖毒性的影响。这些研究包括在大鼠和兔子中的生育力、胚胎-胎儿发育和出生后发育研究。通过皮下注射施用的二酮哌嗪颗粒在大鼠中不损伤生育力或植入，并且没有在大鼠或兔子中致畸性的证据。二酮哌嗪颗粒并未不利地影响生育力和早期胚胎发育、胚胎发育或出生前或出生后发育。
考虑到大量药物已经由于它们引起LQT综合征(获得性LQTS或长期Q-T综合征是一种在用药人群中发生的罕见的心脏电节律的遗传性异常)的倾向而从临床市场中被去除，使用hERG测定法检查二酮哌嗪颗粒的药理学。考虑到引起获得性LQT的大部分药物通过封闭人醚-à-go-go相关基因(hERG)钾通道而引起获得性LQT的，因此使用hERG测定法，所述钾通道负责心室贲门动作电位(ventricular cardiac action potential)的复极化。来自hERG测定法的结果表明二酮哌嗪颗粒的IC50>100μM。另外，来自二酮哌嗪非临床研究的结果显示对QTc间隔(心率校正的QT间隔)没有影响，因为在犬中未观察到延长(9个月或安全药理学心血管研究)。静脉内施用时，二酮哌嗪颗粒对在安全药理学核心电池组中评价的CND或心血管系统没有影响。
实施例10
GLP-1对β-细胞质量的影响
已知GLP-1促进胰岛素生物合成中的所有步骤并直接刺激β-细胞生长和存活以及β-细胞分化。这些作用的组合导致增加的β-细胞质量。另外，GLP-1受体信号转导导致β-细胞凋亡的减少，这进一步有助于增加β-细胞质量。已知GLP-1通过三种可能的途径调节β-细胞质量：增强β-细胞增殖；抑制β-细胞凋亡；和分化导管上皮中推定的干细胞。
为了证实GLP-1对β-细胞的影响，在第1、3和5天用GLP-1/FDKP处理细胞并与未处理的细胞比较。如文献中所述，活性GLP-1的施用将β-细胞质量至多提高2倍(Sturis et al.，2003)。另外，多种GLP-1受体(GLP-1R)激动剂对糖尿病的影响的检查证实GLP-1R激动剂预防或延迟了糖尿病的发生或发展。
在雄性Zucker糖尿病肥胖/肥胖(ZDF)大鼠(n＝8/组)中评价GLP-1/FDKP对β-细胞增殖、胰岛素和葡萄糖的影响。动物连续3天接受对照(空气)或含15％(0.3mg)GLP-1的2mg GLP-1/FDKP。进行腹膜内(IP)葡萄糖耐受测试，并在给药前、给药后15、30、45、60和90分钟收集血样用于血浆GLP-1和葡萄糖分析。收集胰腺组织用于通过免疫组织化学分析胰岛素分泌、β-细胞质量和细胞凋亡。
在给药的第4天进行IP葡萄糖耐受测试(IPGTT，图24)。过夜禁食后在第3天，动物通过腹膜内注射接受葡萄糖推注，随后立即通过肺吹入法接受对照(空气)或GLP-1/FDKP施用。在葡萄糖激发前和至给药后90分钟的多个时间点收集血。在给药后30分钟，第1组显示与给药前相比47％的葡萄糖水平提高，而第2组(GLP-1/FDKP)显示与给药前值相比17％的葡萄糖水平提高。在葡萄糖耐受测试后所有的时间点中，处理与对照动物相比，葡萄糖水平显著更低(p<0.05)。
还在给药的第3天测量GLP-1水平(图25)。第2组中血浆GLP-1水平的最大浓度是给药后15分钟的10,643pM。
另外，与IP葡萄糖耐受测试后的葡萄糖测量一起，在第3天的多个时间点测量胰岛素水平。对照(空气)第1组和第2组(GLP-/DKP)均证实给药后15分钟相对于给药前水平而言分别46％和30％的胰岛素浓度初始降低(图26)。然而，在给药后30分钟，第2组中的胰岛素水平回归至基线，而第1组中的胰岛素水平持续降低至给药前值的64％。在被处理的动物中，45分钟、60分钟和90分钟的胰岛素水平接近给药前值，偏差少于1.5％。
制备了用于胰岛素免疫染色和显微镜评价胰岛素表达的载玻片。根据通过光学显微镜对胰岛素表达的定量评价，雄性ZDF大鼠的胰中存在处理相关的胰岛素表达提高(其为剂量相关的)，尽管未达到统计学显著性(p＝0.067)；这通过表达胰岛素的β胰岛细胞的百分比所确定。
还对ZDF大鼠的胰腺组织进行了细胞凋亡分析。通过TUNEL测定法评价外分泌和内分泌的胰腺细胞(Tornusciolo D.R.et al.，1995)。对胰中约10,000个细胞(外分泌的和内分泌的)评分。大部分TUNEL-阳性细胞是外分泌的。在处理和对照组中没有细胞凋亡标记指数的差异。
另外，在Zucker糖尿病肥胖大鼠的胰中评价了β细胞增殖，所述大鼠通过肺吹入法用对照(空气)或GLP-1/FDKP每天一次给药3天。制备了使用免疫组织化学对胰岛素和Ki67(增殖标记物)共定位的载玻片。在总计17只ZDF大鼠的胰岛素阳性的胰岛和外分泌胰腺中进行细胞增殖的显微镜评价。根据细胞增殖的定量评价，雄性ZDF大鼠的胰岛β-细胞或胰腺外分泌细胞中没有对细胞增殖的处理相关的影响。
总之，该研究显示通过肺吹入法以2mg或0.3mg GLP-1施用的GLP-1/FDKP在葡萄糖耐受测试后降低糖尿病肥胖小鼠(II型糖尿病的模型)中的血糖水平，并提高每个胰岛的胰岛素分泌细胞数量。
实施例11
GLP-1/FDKP颗粒制剂的制备
还使用了制备GLP-1/FDKP颗粒制剂的备选方法。制剂如下制备：通过将1份GLP-1(按重量计)添加进9份去离子水中并添加小量的冰醋酸形成澄清溶液来制备10wt％GLP-1储存溶液。将FDKP颗粒的储存悬浮液(约10wt％的颗粒)分为三部分。向每部分悬浮液中添加合适量的GLP-1储存溶液，提供按干燥粉末计5和15wt％GLP-1的靶组合物。添加蛋白质溶液后，悬浮液的pH约为3.5。然后将悬浮液调节至约pH4.4-4.5，之后将悬浮液在液氮中制成小球并冻干除去冰。
粉末的气体动力学用填充量可吸入级分比(respirable fraction on fill)(RFBased on Fill)来表征，即以药筒中粉末的量计可吸入范围内的粉末百分比(％)，其如下测定：用5mg的粉末手工填充五个药筒并通过MannKind’s
Figure A200780013424D0049084225QIETU
吸入器(描述于美国专利申请No.10/655,153中)排放。
该方法产生具有良好的填充量RF的制剂。具有5wt％GLP-1的粉末被测量为48.8％RF/填充量，而含约15wt％GLP-1的粉末为32.2％RF/填充量。
实施例12
含多种GLP-1浓度的GLP-1/FDKP的药物代谢动力学
为了评价具有多种GLP-1浓度的GLP-1/FDKP的药物代谢动力学，将称重在192.3克到211.5克之间的十八只雄性Sprague Dawley大鼠分为四个处理组：对照GLP-1(第1组，n＝3)；GLP-1/FDKP制剂(第2-4组，n＝5/组)。动物接受以下的测试物品之一：通过肺吹入法的对照(空气)；含5％GLP-1的2.42mg GLP-1/FDKP(0.12mg GLP-1)；通过肺吹入法的含10％GLP-1的1.85mg GLP-1/FDKP(0.19mg GLP-1)，或含15％GLP-1的2.46mg GLP-1/FDKP(0.37mg GLP-1)。收集血样并测定给药前和给药后多个时间点(2、5、10、20、30、40和60分钟)血清FDKP和血浆GLP-1水平。
施用GLP-1/FDKP(5％制剂)后的最大血浆GLP-1浓度(Cmax)为：给药后5分钟Tmax处的2321pM；给药后10分钟Tmax处的4,887pM(10％制剂)；和给药后10分钟Tmax处的10,207pM(15％制剂)。如图27所示，直到给药后30分钟仍观察到显著的GLP-1水平。第1-4组的GLP-1水平的曲线下面积(AUC)分别为10622、57101、92606、227873pM*分钟。对10％或15％GLP-1负载的GLP-1/FDKP估计的GLP-1半衰期为10分钟。
如图28所示，5％、10％和15％GLP-1的GLP-1/FDKP制剂的最大FDKP浓度分别被测定为8.5μg/mL(第2组)、4.8μg/mL(第3组)和7.1μg/mL(第4组)。到最大浓度的时间(Tmax)为10分钟。该数据显示FDKP和GLP-1显示类似的吸附动力学，类似量的FDKP被吸附而与颗粒上的GLP-1负载无关。
总之，研究显示在Sprague Dawley大鼠中通过肺吹入法单一剂量施用GLP-1/FDKP后，血浆GLP-1水平被检测为显著水平。观察到血浆GLP-1水平的剂量相关提高约在给药后10分钟达到最大浓度，在给药后40分钟具有可观察的GLP-1水平。所有的动物存活，直到研究结束时为止。
实施例13
通过肺吹入法施用的GLP-1/FDKP的药物动力学特性
为了评价GLP-1/FDKP的药物动力学特性，将雌性Sprague Dawley大鼠分为2个处理组。动物(n＝10)连续4天通过单一的每日肺吹入法接受对照(空气；n＝5)或含15％GLP-1(0.3mg GLP-1)的2mg GLP-1/FDKP。
连续4天在暗循环中于给药前、给药后1、2、4、和6小时测量食物消耗(图29)。与对照(空气)组相比，受处理的动物中在第1、2和3天通过肺吹入法每日单一剂量施用GLP-1/FDKP后食物消耗减少(p<0.05)。第1天的1小时和6小时时间点上和第2天的4小时、6小时和第3天的给药前，受处理组中的动物相对于对照(空气)存在统计学显著的食物消耗减少。
连续4天在给药前每天测量体重(图30)。给药起始时的体重在从约180到209克的范围内变化。尽管处理和对照(空气)动物之间未达到统计学显著性，但是处理的动物中体重更低。所有的动物存活直到预定的处死为止。
实施例14-16
毒物代谢动力学(TK)研究
下文实施例14到16公开了为了评价GLP-1/FDKP吸入粉末可能的毒性作用和毒物代谢动力学模式而在大鼠和猴子中进行的重复给药毒性研究。数据表明在高于计划的临床用途剂量若干倍的剂量下，GLP-1/FDKP吸入粉末没有明显的毒性。另外，在每个物种中显示雄性和雌性动物之间没有差异。
实施例14
通过猴子中肺吹入法施用5天的GLP-1/FDKP的毒物代谢动力学
进行研究测定GLP-1/FDKP的毒性和毒物代谢动力学模式，所述GLP-1/FDKP连续5天每天一次(每天30分钟)通过口鼻施用(预期的人治疗施用途径)给短尾猴(Macaca fascicularis)。口鼻施用涉及在猴子的口和鼻上佩戴面具并呼吸测试制剂30分钟。
在开始处理前十四天使动物适应限制(restraint)和给药步骤。在处理开始时(第1天)，雄性动物在30和56个月龄之间，体重范围从2.3到4.0kg；雌性在31和64个月龄之间，体重范围从1.6到3.4kg。如下文表5和表6中所示，将十只(5只雄性和5只雌性)非首次实验的短尾猴指定为5组(每组2只动物)。非首次实验的猴子是先前已接受待测试制剂的群体动物。然而，这些制剂具有短半衰期，并且预期在本文公开的给药实验期间不会显示或具有对猴子的任何影响。动物接受对照(空气)、2mg/kgFDKP或0.3(0.04mg GLP-1)、1.0(0.13mg GLP-1)或2.0(0.26mg GLP-1)mg/kg GLP-1/FDKP。
表5：目标的和评估的实际剂量水平(通过重量分析*测定)：
Figure A200780013424D00511
Figure A200780013424D00521
*通过在给药前、给药期间和给药后称重吸入腔中的滤纸进行重量分析，来计算腔中气溶胶的浓度和测定给药的持续时间。
1基于假定的2.5kg体重。
2基于测量的体重(对雄性和雌性平均)。
3列出的目标和实际的剂量水平假定产生的气体中GLP-1的比例为13％。总吸入剂量的估值假定在呼吸道中100％沉积。
表6：目标的和实际的平均气溶胶浓度(通过重量分析*测定)：
Figure A200780013424D00522
*通过在给药前、给药期间和给药后称重吸入腔中的滤纸进行重量分析，来计算腔中气溶胶的浓度和测定给药的持续时间。
1列出的目标和实际的气雾剂浓度假定产生的气体中GLP-1的比例为13％。总吸入剂量的估值假定在呼吸道中100％沉积。
在第5天的以下时间点获得全血样品(1.4mL/血样)：给药前、给药后10、30、45、60、90、120分钟。通过静脉穿刺从股静脉中收集血。将血样分为2等分；一份用于血浆GLP-1分析(0.8mL)，另一份(0.6mL)用于血清FDKP分析。对于血浆GLP-1分析而言，在每个时间点将全血(0.8mL)收集进1.3mL EDTA管(0.1％EDTA)中。在血收集后约5-10秒向管中添加(10μL/mL血)DPP-IV抑制剂(Millipore-Billerica，MA)，得到100μM的DPP-IV浓度。将管反转数次并立即置于湿润的冰上。全血样品保持在湿润的冰上，直到在4000rpm离心(2°-8℃)约10分钟产生血浆为止。将血浆样品转移至适当的管中，并在储存于-70(±10)℃冰箱前保持在干冰上。测定GLP-1的须将浓度(Cmax)、Tmax、AUC和T1/2。
连续4天吸入施用GLP-1/FDKP后，第5天在所有给药前样品中发现可检测的GLP-1水平。在第5天，给药施用后约10分钟内达到了GLP-1的血浆浓度峰值(Cmax)(图31)。
第5天在雄性和雌性猴子中均观察到作为剂量函数的GLP-1 Cmax和AUClast(从零时间到最后可计量浓度时间的浓度-时间曲线下的面积)的剂量相关增加。在研究的剂量范围中，在雄性和雌性猴子中用递增的剂量观察到少于与剂量成比例的GLP-1 AUClast增加，1mg/kg/天剂量水平的雄性除外。从0.3到2.0mg/kg/天的6.7倍剂量增加仅导致雄性中AUClast的2.9倍增加和雌性中AUClast的1.1倍增加。
当分别以0.3、1.0和2.0mg/kg/天的剂量水平施用GLP-1/FDKP时，平均的GLP-1浓度峰值在雄性中为17.2、93.1和214pg/mL，在雌性中为19.3、67.9和82.8pg/mL。GLP-1的血浆水平快速下降，其表观清除半衰期范围在4分钟到24分钟。
当分别以0.3、1.0和2.0mg/kg/天的剂量水平施用GLP-1/FDKP时，GLP-1的AUC值在雄性中为21.6、105和62.3pg*h/mL，在雌性中为33.4、23.7和35.4pg*h/mL。
在最低剂量水平观察的GLP-1 TK参数中不存在明显的性别差异。然而，在研究的中和高剂量水平下，雄性猴子始终展示比雌性猴子更高的AUClast值。来自运载体对照和对照(空气)猴子的一些样品显示可测量的GLP-1水平。这可由动物吸入的空气污染引起，或可以是这些具体猴子中内源GLP-1的度量。应当注意对照动物被暴露在与GLP-1/FDKP处理的动物不同的房间。
因为GLP-1的生物半衰期少于15分钟，所以来自GLP-1/FDKP施用的GLP-1在24小时内应当被完全清除。因此，GLP-1的内源水平可能解释第5天在所有GLP-1/FDKP处理的动物中收集的零时间样品中始终可计量的GLP-1水平。从观察到的给药后GLP-1浓度中减去零时间值会反映由于GLP-1/FDKP施用引起的GLP-1改变。
对于血清FDKP分析而言，在每个时间点将全血(0.6mL)收集进不含抗凝血剂的管中，允许在室温下凝结最少30分钟，并通过离心分离获得血清。FDKP分析并测定血清浓度(Cmax)、Tmax、AUC和T1/2。连续四天吸附施用GLP-1/FDKP后，第5天在所有给药后样品中发现可检测的FDKP水平。第5天，在给药施用后约10到30分钟达到FDKP的血浆浓度峰值(Cmax)。
第5天在雄性和雌性猴子中均观察到作为剂量函数的FDKP AUC∞(从零时间推至无限时间的浓度-时间曲线下的面积)的剂量相关增加。然而在雄性中，0.3和1.0mg/kg/天之间没有FDKP AUC∞的差异，但是在1和2mg/kg/天之间记录到剂量相关的提高。在观察到增加的所有情况下，其小于与剂量成比例。从0.3到2.0mg/kg/天的6.7倍剂量增加仅导致雄性中AUClast的2.7倍增加和雌性中AUC∞的3.0倍增加。当分别以0.3、1.0和2.0mg/kg/天的剂量水平施用GLP-1/DKP时，平均的FDKP浓度峰值(Cmax)在雄性中为200、451和339ng/mL，在雌性中为134、161和485ng/mL。当分别以0.3、1.0和2.0mg/kg/天的剂量水平施用GLP-1/FDKP时，平均的FDKP AUC∞值在雄性中为307、578和817ng.h/mL，在雌性中为268、235和810ng.h/mL。仅以2.1mg/kg/大施用FDKP的动物(第2组)中AUC∞和Cmax水平与接受2.13mg/kg/天GLP-1/FDKP的动物处于相同的数量级，例外是给药施用后30到45分钟的Tmax轻微更长。
总之，GLP-1/FDKP被良好耐受，没有临床体征或影响体重、食物消耗、临床病理学参数、肉眼或显微镜的评价。还记录到对短尾猴每天30分钟施用5天的GLP-1/FDKP吸入施用不具有任何剂量限制的毒性，所述施用的评估的实际剂量高达2.13mg/kg/天(对应于0.26mg/kg/天的GLP-1剂量)。
实施例15
通过肺吹入法在大鼠中施用14天的GLP-1/FDKP的毒物代谢动力学
该研究评价了连续14天通过肺吹入法每日施用后GLP-1/FDKP的可能毒性。大鼠连续14天(n＝24/性别/组)接受对照(空气)、10mg/kg的FDKP颗粒，或1(0.15mg GLP-1)、3(0.45mg GLP-1)或10(1.5mg GLP-1)mg/kg GLP-1/FDKP作为每日肺吹入。每天观察动物的毒性临床体征；也记录体重和食物消耗。
在第1天和第14天，在所有剂量组中于给药施用后约10到15分钟内达到了GLP-1 Cmax。在雄性和雌性中，10mg/kg/天GLP-1/FDKP下平均的GLP-1的浓度峰值分别为第1天6714和6270pg/mL和第14天2979和5834pg/mL。GLP-1的血浆水平下降，表观清除半衰期范围从0.7小时到4.4小时。在10mg/kg/天GLP-1/FDKP的最高剂量下，GLP-1的平均AUC水平在雄性中为2187pM*h，在雌性中为2703pM*h。观察到最小或没有GLP-1蓄积，并且Cmax、半衰期和Tmax没有性别差异。在所有剂量下，雌性大鼠中GLP-1的AUC值轻微高于雄性大鼠中。通过肺吹入法连续14天施用GLP-1/FDKP的大鼠中不可见的不良作用水平(NOAEL)为10mg/kg/天GLP-1/FDKP(1.5mg/kg/天GLP-1)。
最终给药后约24小时处死动物(12/性别/组)；进行临床病理学、肉眼的和显微镜评价。给药的第14天在最终血收集后处死动物代谢动力学(TK)随体动物(12/性别/组)。不存在与GLP-1/DKP相关的死亡或临床观察结果。对照和受处理的动物之间没有体重或食物消耗的差异。仅在10mg/kg GLP-1/FDKP的雌性中，肝重量和肝对体重的比例与对照(空气)组相比明显更低。
来自血液学、凝固、化学、尿液分析或尿化学的结果中，未记录到施用了运载体的大鼠和空气对照之间有明显的差异。组织中不存在下述肉眼发现或组织病理学发现，所述发现被确定为由于施用了GLP-1/FDKP而具有可能的毒性。
实施例16
猴子中通过肺吹入法施用28天的GLP-1/FDKP的毒物代谢动力学
该研究评价了至少4周通过吸入每天施用GLP-1/FDKP的毒性和毒物代谢动力学。为了评价任何作用的可逆性、持久性或晚发，存在4周的恢复周期。
动物接受以下的处理之一：第1组：对照(空气)；第2组：3.67mg/kg/天FDKP颗粒；第3组：0.3mg/kg/天GLP-1/FDKP(0.045mg/kg/天GLP-1)；第4组：1mg/kg/天GLP-1/FDKP(0.15mg/kg/天GLP-1)或第5组：2.6mg/kg/天GLP-1/FDKP(0.39mg/kg/天GLP-1)。
将四十二只短尾猴分为2组：第1、2和5组中的恢复(n＝2/性别/组)和主要研究(n＝3/性别/组)。第1组：空气对照，第2组：FDKP(～4mg/kg/天)；第3组：0.3mg/kg/天GLP-1/FDKP(低剂量)；第4组：.0mg/kg/天GLP-1/FDKP(中剂量)；第5组：2.6mg/kg/天GLP-1/FDKP(高剂量)。典型地，在猴子研究中只有高剂量和对照在恢复时评价。
每天两次观察动物的死亡率或发病率，至少每天一次在给药后30分钟观察异常和毒性症状。每周收集体重数据，每天评价定性的食物消耗。在第1、28和56天收集血用于毒物代谢动力学。在第29天将三只动物/性别/组麻醉、称重、放血和尸体剖检。在第57天将第1、2和5组中的剩余动物(n＝2/性别/组)麻醉、称重、放血和尸体剖检。尸体剖检时，将选定的器官称重，收集选定的组织并防腐。显微镜检查来自每个动物的所有组织。
所有组的体重存在偶然的波动；但是不存在与处理相关的对体重的影响。一般地，所有的动物在研究过程中维持体重或增加小量体重。在高剂量下观察到更高发病率和频率的松弛或液体粪便。未记录到被认为是与处理相关的任何临床化学参数的显著改变，例外是第29天(处理结束时)高剂量雌性中乳酸脱氢酶(LDH)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的中度增加；见表7。雄性中LDH的水平也轻微提高。这些改变在恢复周期结束时已经消除，并且与肝中任何显微镜发现不相关。高剂量雄性组中AST水平的改变主要归因于五个动物之一。
表7：ALT、AST和LDH的均值改变％
Figure A200780013424D00561
Figure A200780013424D00571
在高达2.6mg/kg/天GLP-1/FDKP的剂量水平下，不存在任何与处理相关的肉眼可见的改变或组织学改变的迹象。在高达2.6mg/kg/天GLP-1/FDKP(0.39mg/kg/天GLP-1)的剂量下，GLP-1/FDKP被良好耐受，没有显著的临床体征，不影响体重、食物消耗、血液学、尿液分析、胰岛素分析、检眼镜检查、ECG，没有观察到的肉眼可见的或显微镜下的改变。28天内以高达3.67mg/kg/天的评估的实际剂量用高达每天30分钟吸入施用FDKP也不与任何毒性相关。
第1天在雄性和雌性猴子中均观察到作为剂量函数的GLP-1和FDKPCmax和AUClast的剂量相关增加。在研究的剂量范围中，第28天在雄性和雌性猴子中用递增的剂量均观察到少于与剂量成比例的GLP-1Cmax增加，而未发现AUClast增加。2.6mg/kg/天GLP-1/FDKP下平均的GLP-1浓度峰值在雄性中为259pg/mL，在雌性中为164pg/mL。GLP-1的血浆水平降低，清除半衰期范围从0.6到2.5小时变化。高剂量下GLP-1的平均AUC值在雄性中为103pg*hr/mL，在雌性中为104pg*hr/mL。2.6mg/kg/天GLP-1/FDKP下平均的FDKP浓度峰值在雄性中为1800ng/mL，在雌性中为1900pg/mL。
总而言之，对短尾猴的GLP-1/FDKP吸入施用被临床良好地耐受，所述施用以高达2.6mg/kg/天GLP-1/FDKP或0.39mg/kg/天GLP-1的评估的实际剂量、以高达每天30分钟吸入施用GLP-1/FDKP。NOAEL为2.6mg/kg/天GLP-1/FDKP(0.39mg/kg/天GLP-1)。如下文实施例19中所述，I期研究中的最大人剂量应为每天1.5mg GLP-1/FDKP或～0.021mg/kg GLP-1(假定为70kg的人)。其它的研究剂量应为每天3.0mg GLP-1/FDKP或～0.042mg/kg GLP-1。
实施例17
制备毒蜥外泌肽/FDKP制剂
通过将酸性毒蜥外泌肽-4肽(SEQ ID No.3)溶液与FDKP颗粒悬浮液组合来制备毒蜥外泌肽-4/FDKP。酸性肽溶液为溶解在2％乙酸中的10％(w/w)肽。FDKP悬浮液含有约10％(w/w)FDKP颗粒。将酸性毒蜥外泌肽-4肽溶液添加进FDKP颗粒悬浮液中，同时柔和地混合。用25％氨溶液将毒蜥外泌肽-4/FDKP混合物逐步滴定至pH4.50。然后将混合物在液氮中制成小球并冻干。
15％毒蜥外泌肽-4/FDKP粉末的填充量可吸入级分％(％RF on Fill)含量为36％，药筒排空百分比(Percent Cartridge Emptying)为99％。以类似规模生产的15％GLP-1/FDKP粉末显示34％的％RF on Fill，药筒排空百分比为100％。
实施例18
通过肺吹入法施用的毒蜥外泌肽/FDKP的药物代谢动力学
进行重复的剂量初始毒性研究，以检查多种浓度下和通过肺部途径多次施用后毒蜥外泌肽-4(GLP-1类似物)的药物动力学和药物代谢动力学模式。
在大鼠和猴子中进行了28天的研究。通过吸入途径每天进行毒蜥外泌肽/FDKP给药。在对动物给药28天的研究中，一部分动物要在给药方案后立即处死，而其它动物允许在处死前有多达一个月的恢复周期。评价所有动物的临床体征，多种生理参数，包括毒蜥外泌肽-4、葡萄糖和胰岛素的血水平；器官重量和多种器官的临床病理学和组织病理学。
初始的研究组由每组五只动物组成并具有两个对照组：空气和静脉施用毒蜥外泌肽。存在六个肺吹入组，其接受约2.0mg剂量的，5％、10％、15％、20％和25％和30％毒蜥外泌肽负载(w/w)的毒蜥外泌肽/FDKP。收集全血用于血糖和毒蜥外泌肽浓度，直到8小时的时间点。
收集数据(Cmax、T1/2和Tmax)，其证实毒蜥外泌肽/FDKP制剂具有相对于GLP-1/FDKP可比较的或更好的药物代谢动力学。
实施例19
大鼠中通过肺吹入法施用的GLP-1/xDKP的药物代谢动力学
为了确定不同的DKP是否可以影响GLP-1/FDKP制剂的药物代谢动力学模式，如题为＂Asymmetrical FDKP Analogs for Use as Drug DeliveryAgents＂的美国临时专利申请所公开，制造多种GLP-1/xDKP制剂，所述申请在与本文一致的日期提交并以其整体并入本文(代理人案号No.51300-00041)。
在被分为6个处理组的大鼠中进行研究，所述组由每组5只动物组成。对照组(n＝3)通过液体滴注接受GLP-1。还使用通过肺吹入施用的GLP-1/FDKP(0.3mg GLP-1)作为第二对照。每个GLP-1/xDKP处理的组通过肺吹入以负载10％和15％GLP-1的～2.0mg的xDKP剂量接受GLP-1/xDKP制剂。使用的xDKP为(E)-3-(4-(3，6-二氧代哌嗪-2-基)丁基氨基甲酰基)-丙烯酸)、(3，6-二(4-羧丙基)氨基丁基-2，5-二酮哌嗪)和((E)-3，6-二(4-(羧基-2-丙烯基)氨基丁基)-2，5-二酮哌嗪二钠盐)负载。在给药后5、10、20、30、45、60直到90分钟收集全血用于评价GLP-1浓度。
实施例20
健康成年雄性受试者中GLP-1/FDKP吸入粉末的1a期、单一剂量、开放 标签、递增剂量、受控的安全性和耐受性试验
通过静脉(iv)或皮下(sc)灌输或通过多重皮下注射给予时，GLP-1已经显示在人中控制提高的血糖。因为激素的半衰期非常短，可能需要连续皮下灌输或多次每日皮下注射。这些途径均不适用于长期临床用途。动物实验显示通过吸入施用GLP-1时可达到治疗水平。
GLP-1的若干种作用(包括减少胃排空、提高饱满感和抑制不适当的高血糖素分泌)似乎与进餐开始时的GLP-1释放爆发有关。通过用GLP-1/FDKP吸入粉末补充GLP-1的该早期波动，可以在糖尿病动物中引起药物动力学应答。另外，可以通过餐后施用GLP-1/FDKP吸入粉末模拟与提高的胰岛素分泌相关的天然GLP-1的晚期波动。
GLP-1/FDKP吸入粉末的1a期临床试验被设计为在人受试者中第一次测试选定剂量的新型吸入式血糖控制治疗产品的安全性和可耐受性。给药利用了先前测试过的
Figure A200780013424D0060084954QIETU
吸入器设备。该临床试验的主要目的在于鉴定通过肺吸入的GLP-1/FDKP吸入粉末的剂量范围，所述剂量范围是安全的、可耐受的并可在临床试验中进一步用于建立有效性和安全性的证据。针对1a期临床试验选择的剂量是以下述动物安全性结果为基础的，所述动物安全性结果来自上述实施例中描述的GLP-1/FDKP吸入粉末在大鼠和灵长类中的非临床试验。
二十六(26)个受试者被登记在5队中，达到第1和2队中每队多达4个可评估的受试者，第3到5队中每队多达6个可评估的受试者，所述可评估的受试者满足合格标准并且完成临床试验。每个受试者用作为GLP-1/FDKP吸入粉末的高血糖素样肽-1(GLP-1)给药一次，剂量水平如下：第1队：0.05mg；第2队：0.45mg；第3队：0.75mg；第4队：1.05mg和第5队：1.5mg的GLP-1。不替换中途退出者。这些剂量假定70kg的体重。本领域技术人员能够根据上文公开的研究确定额外的剂量水平。
该试验的目的是确定健康成年的男性受试者中递增剂量的GLP-1/FDKP吸入粉末的安全性和耐受性。将评价递增剂量的GLP-1/FDKP吸入粉末的耐受性，其通过监测药理学或对变量的不利作用确定，包括报道的不利事件(AE)、生命体征、物理检查、临床实验室测试和心电图(ECG)。
第二个目的是评价另外的安全性和药物动力学参数。这包括另外的安全性参数，表述为肺和其它AE的发病率和调查1(筛选)与调查3(随访)之间肺功能的改变；用GLP-1/FDKP吸入粉末给药后血浆GLP-1和血清富马酰二酮哌嗪(FDKP)的药物代谢动力学(PK)参数，通过AUC0-120(分钟)血浆GLP-1和AUC0-480分钟血清FDKP测量；和另外的血浆GLP-1PK参数，包括：tmax血浆GLP-1；Cmax血浆GLP-1；和T1/2血浆GLP-1。另外的血清FDKP PK参数包括：Tmax血清FDKP；Cmax血清FDKP；和T1/2血清FDKP。
试验终末点(endpoint)基于在试验受试者群体中测定的以下药理学和安全性参数的比较。初级终末点应包括：安全性终末点将根据报道的AE(包括咳嗽和呼吸困难、恶心和/或呕吐)发病率和严重性、来自生命体征筛选的改变、临床实验室测试和物理检查来评价。次级终末点应包括：血浆GLP-1和血清FDKP的PK分布(AUC0-120分钟血浆GLP-1和AUC0-480分钟血清FDKP)；另外的血浆GLP-1 PK参数(Tmax血浆GLP-1、Cmax血浆GLP-1、T1/2血浆GLP-1)；另外的血清FDKP PK参数(Tmax血清FDKP，Cmax血清FDKP)；和另外的安全性参数(肺功能测试(PFTs))和ECG。
1a期、单一剂量试验整合了开放标签、递增剂量结构和符合21 CFR312，Good Clinical Practice：Consolidated Guidance(ICH-E6)和Guidance onGeneral Considerations for Clinical Trials(ICH-E8)的设计策略，用于测定研究的药物产品(IMP)安全性和耐受性。
临床试验应由3个临床调查组成：1)一个筛选调查(调查1)；2)一个治疗调查(调查2)；和3)调查2后8-14天的一个随访调查(调查3)。单一剂量的GLP-1/FDKP吸入粉末的施用将在调查2期间发生。
该临床试验会评价每队中的安全性参数。在主要调查人(PI)回顾第一次给药或先前给药的所有安全性和耐受性数据之前，不对计划接受下一剂量浓度的小队进行给药。应在每队的受试者之间执行半小时的给药滞后时间，以确保受试者安全。如果小队中3个或更多的受试者经受严重的恶心和/或呕吐，或当达到最大剂量时，或在PI的判断下，可中止给药。
要评价5种剂量的GLP-1/FDKP吸入粉末(0.05、0.45、0.75、1.05和1.5mg的GLP-1)。为了适应所有的剂量，配制好的GLP-1/FDKP将与FDKP吸入粉末混合。将原样使用或与适当量的FDKP吸入粉末混合使用含10mg干粉的单一剂量药筒，所述干粉由GLP-1/FDKP吸入粉末组成(15％重量比重量的GLP-1/FDKP)，以获得想要的GLP-1(0.05mg、0.45mg、0.75mg、1.05mg和1.5mg)剂量：1.最低的2个剂量水平将在每队4个受试者的2队中评价，3个较高的剂量食品将在每队6个受试者的3队中评价。每个受试者仅接受待评价的5个剂量水平中的1个剂量。除了取血进行GLP-1(活性的和总体的)和FDKP测量外，取样用于高血糖素、葡萄糖、胰岛素和C-肽测定。
在该说明书全文中已经引用了大量专利和印刷的出版物。每个上述参考文献和印刷的出版物通过引用以其整体个别地并入本文。
除非另有指明，本说明书和权利要求书中使用的表示成分数量，以及分子量、反应条件等性质的所有数字都应当被理解为：在所有情况下，用术语“约”加以了修饰。因此，除非有相反含义的说明，本说明书和所附权利要求书中示出的数量参数都是约数，它们可以根据本发明想要获得的性质而变动。至少，并且并非对权利要求书范围等同原则的应用加以限制，每个数量参数至少应按照报道的有效数字的数，以及应用普通的凑整技术来解释。虽然示出本发明宽广范围的数字范围和参数是约数，但是特别实施例中所示的数值却被尽可能地精确报道。但是，任何数值，必然含有一定误差，这是它们各自的检验测量方法中发现的标准偏差必然导致的。
本领域技术人员容易理解，在不脱离本发明的范围和精神的前提下，可对本发明进行各种改进。
在本文中，在权利要求书和/或说明书中与“包括”一起使用的“一个”一般表示“一个”，但其表示的意思与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”也是一致的。
本文所述的任何方法或组合物可通过本文所述的任何其它方法或组合物来实现。
除非明确指出某个可选方式或可选方式之间互相排斥，权利要求中所用术语“或”是指“和/或”。
在本文中，术语“约”所表示的值包括确定该值所用设备或方法的标准偏差。
根据实施例以及权利要求书提供的先前描述，可以清楚地看出本发明的其它目的、特征和优点。然而应当理解，详细描述和具体实施例仅为示例性，而本领域技术人员根据这些详细描述在本发明的精神和范围内可以作出各种改变和改进。
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在提供补充本文公开内容的示范性步骤或其它细节的程度上，以下的参考文献通过引用被明确地并入本文。
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序列表
<110>MannKind Corporation
     Hokenson，Mark
     Brandt，David
     King，Mark
     Green，Stephanie
     Faris，Mary
     Oberg，Keith
     Cheatham，Wendell
     Gelber，Cohava
     Leone-Bay，Andrea
<120>高血糖素样肽1(GLP-1)药物制剂
<130>51300-00028
<150>60/744,882
<151>2006-04-14
<150>10/632878
<151>2003-08-01
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>31
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
Figure A200780013424D00651
<210>2
<211>30
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
Figure A200780013424D00652
<210>3
<211>39
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>3
Figure A200780013424D00661

Claims (43)

1.一种干粉组合物，其包含GLP-1分子和二酮哌嗪或其可药用盐。
2.权利要求1的干粉组合物，其中所述GLP-1分子选自由以下物质组成的组：天然的GLP-1、GLP-1代谢产物、GLP-1类似物、GLP-1衍生物、二肽基肽酶-IV(DPP-IV)保护的GLP-1、GLP-1模拟物、GLP-1肽类似物或生物合成的GLP-1类似物。
3.权利要求1的干粉组合物，其中所述二酮哌嗪是具有式2，5-二酮-3，6-二(4-X-氨丁基)哌嗪的二酮哌嗪，其中X选自由琥珀酰基、戊二酰基、马来酰基和富马酰基组成的组。
4.权利要求1的干粉组合物，其包含二酮哌嗪盐。
5.权利要求3的干粉组合物，其中所述二酮哌嗪是2，5-二酮-3，6-二(4-富马酰-氨丁基)哌嗪。
6.权利要求1的干粉组合物，其中所述GLP-1分子是天然的GLP-1。
7.权利要求1的干粉组合物，其中所述GLP-1分子是酰胺化的GLP-1分子。
8.权利要求7的干粉组合物，其中所述酰胺化的GLP-1分子是GLP-1(7-36)酰胺。
9.用于形成包含GLP-1分子和二酮哌嗪的颗粒的方法，所述方法包括步骤：
提供GLP-1分子；
提供下述形式的二酮哌嗪，所述形式选自能形成颗粒的二酮哌嗪、二酮哌嗪颗粒及其组合；和
将所述GLP-1分子与所述二酮哌嗪以共溶液的形式组合，
其中形成包含所述GLP-1分子和所述二酮哌嗪的所述颗粒。
10.权利要求9的方法，其还包括通过冻干法、过滤或喷雾干燥从所述共溶液中去除溶剂。
11.权利要求10的方法，其中通过去除所述溶剂形成包含所述GLP-1分子和所述二酮哌嗪的所述颗粒。
12.权利要求10的方法，其中在去除所述溶剂之前形成包含所述GLP-1分子和所述二酮哌嗪的所述颗粒。
13.权利要求9的方法，其中所述GLP-1分子选自由以下物质组成的组：天然的GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1衍生物、二肽基-肽酶-IV(DPP-IV)保护的GLP-1、GLP-1模拟物、GLP-1肽类似物或生物合成的GLP-1类似物。
14.权利要求9的方法，其中所述GLP-1分子以溶液的形式提供，所述溶液包含约1μg/ml-50mg/ml的GLP-1浓度。
15.权利要求9的方法，其中所述GLP-1分子以溶液的形式提供，所述溶液包含约0.1mg/ml-10mg/ml的GLP-1浓度。
16.权利要求9的方法，其中所述GLP-1分子以溶液的形式提供，所述溶液包含约0.25mg/ml的GLP-1浓度。
17.权利要求9的方法，其中所述二酮哌嗪以二酮哌嗪颗粒悬浮液的形式提供。
18.权利要求9的方法，其中所述二酮哌嗪以包含能形成颗粒的二酮哌嗪的溶液的形式提供，所述方法还包括调节所述溶液的pH以形成二酮哌嗪颗粒。
19.权利要求17或18的方法，其还包括向所述溶液或悬浮液中添加试剂，其中所述试剂选自由盐、表面活性剂、离子、渗透物、离液剂和感胶离子、酸、碱和有机溶剂组成的组。
20.权利要求19的方法，其中所述试剂促进所述GLP-1分子和所述二酮哌嗪颗粒或所述能形成颗粒的二酮哌嗪之间的缔合。
21.权利要求19的方法，其中所述试剂改善所述GLP-1分子的稳定性或药物动力学。
22.权利要求19的方法，其中所述试剂为氯化钠。
23.权利要求17或18的方法，其还包括调节所述悬浮液或溶液的pH。
24.权利要求23的方法，其中所述pH被调节至约4或更大。
25.权利要求9的方法，其中所述颗粒中的所述GLP-1分子具有更高的稳定性。
26.权利要求9的方法，其中所述共溶液包含约1μg/ml-50mg/ml的GLP-1浓度。
27.权利要求9的方法，其中所述共溶液包含约0.1mg/ml-10mg/ml的GLP-1浓度。
28.权利要求9的方法，其中所述共溶液包含约0.25mg/ml的GLP-1浓度。
29.权利要求9的方法，其还包括向所述共溶液中添加试剂，其中所述试剂选自由盐、表面活性剂、离子、渗透物、离液剂和感胶离子、酸、碱和有机溶剂组成的组。
30.权利要求29的方法，其中所述试剂促进所述GLP-1分子和所述二酮哌嗪颗粒或所述能形成颗粒的二酮哌嗪之间的缔合。
31.权利要求29的方法，其中所述试剂改善所述GLP-1分子的稳定性或药物动力学。
32.权利要求29的方法，其中所述试剂为氯化钠。
33.权利要求9的方法，其还包括调节所述共溶液的pH。
34.权利要求33的方法，其中所述pH被调节至约4或更大。
35.对需要的受试者施用有效量GLP-1分子的方法，所述方法包括对所述受试者提供包含GLP-1和二酮哌嗪的颗粒。
36.权利要求35的方法，其中所述提供通过静脉内、皮下、经口、经鼻、经颊、经直肠或通过肺部递送进行。
37.权利要求35的方法，其中所述提供通过肺部递送进行。
38.权利要求35的方法，其中所述需要包括治疗选自下组的病症或疾病，所述组由糖尿病、局部缺血、再灌注组织损伤、血脂障碍、糖尿病性心脏病、心肌梗塞、急性冠状动脉综合征、肥胖症、手术后的分解代谢改变、高血糖症、过敏性肠综合征、中风、神经变性病症、记忆和学习障碍、胰岛细胞移植和再生性治疗组成。
39.权利要求35的方法，其中所述颗粒的所述提供导致与天然GLP-1相比改善的药物代谢动力学半衰期和GLP-1生物利用度。
40.形成具有改善的GLP-1药物代谢动力学模式的粉末组合物的方法，所述方法包括步骤：
提供GLP-1分子；
提供溶液中的能形成颗粒的二酮哌嗪；
形成二酮哌嗪颗粒；
将所述GLP-1分子与所述溶液组合形成共溶液；和
通过喷雾干燥从所述共溶液中去除溶剂，形成具有改善的GLP-1药物代谢动力学模式的粉末。
41.权利要求40的方法，其中所述改善的GLP-1药物代谢动力学模式包含提高的GLP-1半衰期。
42.权利要求41的方法，其中所述提高的GLP-1半衰期大于或等于7.5分钟。
43.权利要求40的方法，其中所述改善的GLP-1药物代谢动力学模式包括与天然GLP-1相比改善的GLP-1生物利用度。
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