MX2008013216A - Formulaciones farmaceuticas de peptido-1 tipo glucagon (glp-1). - Google Patents

Formulaciones farmaceuticas de peptido-1 tipo glucagon (glp-1).

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Andrea Leone-Bay
Wayman Wendell Cheatham
Cohava Gelber
Stephanie Greene
David Brandt
Mark King
Keith Oberg
Mark J Hokenson
Mary Faris
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Abstract

Se describe una composición que comprende partículas de péptido 1 tipo glucagón (GLP-1) en combinación con dicetopiperazina (DKP) que es estable tanto in vitro como in vivo. La composición tiene utilidad como una formulación farmacéutica para tratar enfermedades tales como diabetes, cáncer y de obesidad pero no se limita a dichas enfermedades y condiciones. En particular, la composición tiene actividad como una formulación farmacéutica para administración pulmonar.

Description

FORMULACIONES FARMACÉUTICAS DE PÉPTIDO-1 TIPO GLUCAGÓN (GLP-1) Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud es una continuación en parte de la Solicitud Norteamericana Serie No. 10/632,878, presentada 22 de julio del 2003, y las reivindicaciones, de acuerdo con el beneficio de 35 U.S.C. §119(e) de la Solicitud Norteamericana Serie No 60/744,882, presentada 14 de abril del 2006. Cada una de las solicitudes de prioridad antes mencionadas están incorporadas en si totalidad a la presente invención como referencia. Campo de la Invención La presente invención se refiere al campo de las formulaciones farmacéuticas. La presente invención describe formulaciones en polvo seco que comprenden partículas de dicetopiperazina (DKP) en combinación con péptido 1 tipo glucagón (GLP-1). La presente invención tiene utilidad como una formulación farmacéutica para tratar enfermedades tales como diabetes, cánceres, y obesidad, aunque no se limita a dichas enfermedades. Más particularmente, la presente invención tiene utilidad como una formulación farmacéutica para administración pulmonar. Antecedentes de la Invención El péptido 1 tipo glucagón (GLP-1) tal como se describe en la literatura es una incretina de 30 o 31 aminoácidos, liberada de las células-L endocrinas intestinales en respuesta a la ingestión se grasa, carbohidrato y proteína de una comida. La secreción de esta hormona de péptido se encuentra desajustada en individuos con diabetes melitus tipo 2, lo cual los hace candidatos potenciales para el tratamiento de éstas y otras enfermedades relacionadas. En el estado sin enfermedad, GLP-1 es secretado de la célula-L intestinal en respuesta a nutrientes incluidos en forma oral (particularmente azúcares), estimulando la liberación de insulina inducida por alimentos del páncreas, inhibiendo la liberación de glucagón del hígado, así como sus efectos en el trasto gastrointestinal y cerebro. El efecto GLP-1 en el páncreas es dependiente de glucosa, lo que minimiza el riesgo de hipoglucemia durante administración de péptido exógena. GLP-1 también promueve todos los pasos en la biosíntesis de insulina y estimula directamente el crecimiento y supervivencia de células-ß así como la diferenciación de célula-ß. La combinación de estos efectos da como resultado una masa incrementada de la célula ß. Además, la señalización del receptor GLP-1, da como resultado una reducción en la apoptosis de célula-ß, lo cual contribuye además a la masa incrementada de célula-ß. En el tracto gastrointestinal, GLP-1 inhibe la motilidad Gl, incrementa la secreción de insulina en respuesta a glucosa, y disminuye la secreción de glucagón, constituyendo de esta forma a una reducción de la excursión de glucosa. La administración central de GLP-1 ha mostrado inhibir la ingesta de alimentos en roedores, lo que sugiere que el GLP-1 liberado en forma periférica puede afectar directamente el cerebro. Esto es factible ya que se ha mostrado que el GLP-1 en la circulación pueda accesar los receptores GLP-1 en ciertas áreas del cerebro; es decir el órgano subfornical y el área postrema. Estas áreas del cerebro son conocidas por estar implicadas en la regulación de apetito y homeostasis de energía. En forma interesante, la distensión gástrica active GLP-1 que contiene neuronas en el núcleo caudal del tracto solitario, anticipando un desempeño del GLP-1 expresado en forma central como un supresor de apetito. Estas hipótesis están soportadas por estudios que emplean el antagonista del receptor GLP-1, exendina (9-39) en donde se observaron efectos opuestos. En humanos, el GLP-1 administrado tiene un efecto de saciedad (Verdich y asociados, 2001 ), y cuando se administra mediante infusión subcutánea continua durante un régimen de 6 semanas, los diabéticos mostraron una reducción de apetito, lo cual condujo a reducciones significativas en el peso corporal (Zander y asociados , 2002). GLP-1 también ha mostrado ser efectivo en pacientes con diabetes tipo 2, incrementando la secreción de insulina y normalizando las glucosas sanguíneas tanto del ayuno como postprandial cuado se administra como una infusión intravenosa continua (Nauck y asociados, 1993). Además, la infusión de GLP-1 ha mostrado disminuir los niveles de glucosa en pacientes tratados previamente con medicación oral sin insulina y en pacientes que requieren terapia de insulina después de la falla con la terapia de sulfonilurea (Nauck y asociados, 1993). Sin embargo, los efectos de una sola inyección subcutánea de GLP-1 proporcionaron resultados no concordantes, tal como se observa en la técnica y se describe más adelante. Auque se lograron niveles superiores en plasma de GLP-1 inmunoreactivo, la secreción de insulina regresó rápidamente a valores pre-tratamiento y no se normalizaron las concentraciones de glucosa (Nauck y asociados, 1996). Únicamente cuando se llevaron a cabo administraciones subcutáneas repetidas se obtuvo el defecto de glucosa sanguínea en ayuno comparable con la administración intravenosa (Nauck y asociados, 1996). La administración subcutánea continua durante 6 semanas, mostró reducir las concentraciones de glucosa en ayuno y post-pandriales y disminuir los niveles de HbA1c (Zander y asociados, 2002). La efectividad de corta vida de inyecciones subcutáneas siempre es de GLP-1, estuvo relacionada con su inestabilidad en la circulación. Se mostró que GLP-1 fue metabolizado mediante plasma in vitro y que la peptidasa-IV de dipeptidilo de enzimas (DPP-IV) fue la responsable de esta degradación (Mentlein y asociados, 1993). Con la significancia fisiológica de GLP-1 en diabetes y la demostración de que GLP-1 exógeno se degrada en forma amino terminal rápidamente tanto en sujetos saludables como en sujetos diabéticos tipo 2, muchos estudios se han dirigido a la posibilidad de manipular la estabilidad in vivo GLP-1, como un método novedoso para un agente anti-diabético para el tratamiento de diabetes (Deacon y asociados , 2004). Se han considerad o dos métodos separados:: 1) el desarrollo de análogos de GLP-1 que no son susceptibles a degradación enzimática y 2) el uso de inhibidores de enzima selectivas para evitar la degradación in vivo y aumentar los niveles de péptidos intactos, biológicamente activos. Los análogos GLP-1 de larga duración (por ejemplo, Liraglutide (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca)); exenatida (exendina-4; Byetta®) (Amylin Inc., San Diego, CA) y (exenatida-LAR, Eli Lilly, Indianapolis, IN)) que son resistentes a degradación, denominados "miméticos de incretina", han sido investigados en pruebas clínicas. Los inhibidores de peptidasa IV de dipeptidilo (por ejemplo, Vildagliptin (Galvus) desarrollados por Novartis, Basel, Suiza) y Januvia (sitagliptin) desarrollado Merck, Whitehouse Station, New Jersey)) que inhiben la enzima responsable de la degradación de incretina, también están bajo estudio (Deacon y asociados , 2004). Por lo tanto, los múltiples modos de acción de GLP-1 (por ejemplo, liberación de insulina incrementada, vaciamiento gástrico retardado y saciedad incrementada) junto con su baja propensión a hipoglucemia, parecen proporcionar ventajas con respecto a las terapias actualmente disponibles. Sin embargo, a pesar de estos métodos/avances en terapia GLP-1, ninguno de los fármacos actualmente disponibles para diabetes tienen la capacidad de lograr objetivos terapéuticos (HbA1c, glucosa sanguínea en ayuno, excursiones de glucosa) en todos los pacientes y ninguno de ellos están sin efectos secundarios tales como toxicidad, hipoglucemia, ganancia de peso, náusea y tensión por vómito. Por consiguiente, aún existe la necesidad en la técnica de formulaciones GLP-1 estables que tengan efectividad a largo plazo y absorción óptima cuando se administran como un farmacéutico. Breve Descripción de la Invención Las formulaciones de péptido 1 tipo glucagón (GLP-1) inhalables, estables para utilizarse como farmacéuticos son deficientes en la técnica. Para superar las deficiencias en la técnica, la presente invención proporciona formulaciones de GLP-1 en combinación con partículas de dicetopiperazina (DKP) como un farmacéutico. Por consiguiente, en modalidades particulares de la presente invención, se proporciona una composición en polvo seco que comprende una molécula GLP-1 y dicetopiperazina o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En modalidades adicionales, la composición de polvo seco de la presente invención comprende una molécula GLP-1 seleccionada del grupo que consiste en GLP-1 nativo, un metabolito GLP-1, un análogo de GLP-1, un derivado de GLP-1, un GLP-1 protegido con dipeptidil-peptidasa-l V (DPP-IV), un mimético de GLP-1, una exendina, un análogo de péptido GLP-1, o un análogo de GLP-1 biosintético. Aún en una modalidad adicional de la presente invención, la composición de polvo seco comprende una dicetopiperazina que tiene la fórmula 2,5-diceto-3,6-di(4-X-aminobutil)piperazina, en donde X es seleccionada del grupo que consiste en succinilo, glutarilo, maleilo, y fumarilo. En otra modalidad, la composición de polvo seco comprende una sal de dicetopiperazina. Aún en otra modalidad de la presente invención, se proporciona una composición en polvo seco, en donde la dicetopiperazina es 2,5-diceto-3,6-di(4-fumaril-aminobutil)piperazina. La presente invención contempla además una composición en polvo seco en donde la molécula GLP-1 es una GLP-1 nativa, o una molécula GLP-1 amidada, en donde la molécula GLP-1 amidada es amida de GLP-1 (7-36). Aún en otra modalidad particular de la presente invención, se proporciona un proceso para preparar una partícula que comprende una molécula GLP-1 y una dicetopiperazina que comprende los pasos de: proporcionar una solución GLP-1 que comprende una molécula GLP-1; proporcionar una solución de una dicetopiperazina que forma partículas o una suspensión de partículas de dicetopiperazina; y combinar la solución GLP-1 con la solución o suspensión de dicetopiperazina. En otras modalidades particulares de la presente invención, el proceso para preparar una partícula que comprende una molécula GLP-1 y una dicetopiperazina comprende además eliminar el solvente de la solución o suspensión mediante liofilización, filtración, o secado con rocío. Aún en una modalidad adicional, la partícula de la presente invención se forma eliminando el solvente o se forma antes de eliminar el solvente. En una modalidad de la presente invención, en el proceso para preparar una partícula que tiene una molécula GLP-1 y una dicetopiperazina, se proporciona una molécula GLP-1 seleccionada del grupo que consiste en GLP-1 nativa, un análogo de GLP-1, un derivado de GLP-1, una GLP-1 protegida con dipeptidil-peptidasa-IV (DPP-IV), un mimético de GLP-1, una exendina, un análogo de péptido GLP-1, o un análogo de GLP-1 biosintético. En otra modalidad, el proceso para preparar una partícula que tiene una molécula GLP-1 y una dicetopiperazina comprende una dicetopiperazina proporcionada como una suspensión de partículas. En una modalidad adicional, la dicetopiperazina se proporciona en solución y el proceso incluye ajustar el pH de la solución para precipitar la dicetopiperazina y formar partículas. En otras modalidades particulares de la presente invención, la solución GLP-1 está en una concentración de aproximadamente 1 g/ml-50 mg/ml, más preferentemente aproximadamente 0.1 mg/ml-10 mg/ml. Aun en otra modalidad particular de la presente invención, la solución GLP-1 está en una concentración de aproximadamente 0.25 mg/ml. En otro proceso para preparar una partícula que comprende una molécula GLP-1 y una dicetopiperazina, el proceso comprende además agregar un agente a la solución, en donde el agente es seleccionado de sales, tensoactivos, iones, osmolitos, caotropos y liotropos, solventes ácidos, base, y orgánicos. El agente promueve la asociación entre el GLP-1 y a partícula de dicetopiperazina y también mejora la estabilidad y/o farmacodinámicas de la molécula GLP-1. En algunas modalidades de la presente invención, el agente es una sal, tal como, pero sin limitarse a cloruro de sodio. También se contempla que el agente pueda ser un tensoactivo tal como pero sin limitarse a Tween, Tritón, ácido plurónico, CHAPS, cetrimida, y Brij, H(CH2)7S04Na. El agente puede ser un ión, por ejemplo, un catión o anión. El agente puede ser un osmolito (estabilizador, tal como pero sin limitarse a Hexileno-Glicol (Hex-Gly), trehalosa, glicina, polietilenglicol (PEG), n-óxido de trimetilamina (TMAO), manitol, y prolina. El agente puede ser caotropo o liotropo, tal como, pero sin limitarse a, cloruro de cesio, citrato de sodio, y sulfato de sodio. El agente puede ser un solvente orgánico por ejemplo, un alcohol seleccionado de metanol (MeOH), etanol (EtOH), trifluoroetanol (TFE), y hexafluoroisopropanol (HFIP). En otra modalidad particular de la presente invención, se contempla un proceso para preparar una partícula que comprende una molécula GLP-1 y una dicetopiperazina, en donde el proceso comprende ajustar el pH de la suspensión de partículas a aproximadamente 4 o más. En modalidades adicionales de la presente invención, el proceso para preparar una partícula comprende una molécula GLP-1 y una dicetopiperazina, en donde la molécula GLP-1 en la partícula tiene mayor estabilidad. Se contempla demás en la presente invención un método para administrar una cantidad efectiva de una molécula GLP-1 a un sujeto que necesita del mismo, que comprende proporcionar al sujeto una partícula de GLP-1 /dicetopiperazina. El método de administración puede ser administración intravenosa, subcutánea, oral, nasal, bucal, rectal, o pulmonar pero no se limita a éstas. En una modalidad, el método de administración es mediante administración pulmonar. Aún en otra modalidad de la presente invención, el método de administración comprende tratar una condición o enfermedad seleccionada del grupo que consiste en diabetes, isquemia, lesión de tejido reperfusionado, dislipidemia, cardiomiopatía diabética, infarto al miocardio, síndrome coronario agudo, obesidad, cambios catabólicos después de cirugía, hiperglucemia, síndrome de intestino irritable, ataque, trastornos neurodegenerativos, trastornos de memoria y aprendizaje, trasplante de célula de islote y terapia regenerativa. En otra modalidad de la presente invención, el método para administrar la composición de partículas GLP-1 /dicetopiperazina puede dar como resultado una vida media farmacocinética y biodisponibilidad de GLP- 1 mejoradas. Aún en una modalidad particular adicional de la presente invención, se proporciona un método para preparar una composición en polvo seco con un perfil farmacocinética mejorado que comprende los pasos de: proporcionar una solución de una molécula GLP-1; proporcionar una dicetopiperazina que forma partículas; formar partículas; y combinar el GLP-1 y la dicetopiperazina; y posteriormente eliminar el solvente a través de un método de secado para obtener un polvo seco, en donde el polvo seco tiene un perfil farmacocinética mejorado. El perfil farmacocinético mejorado comprende una vida media incrementada de GLP-1 y/o biodisponibilidad mejorada de GLP-1. La vida media incrementada en GLP-1 es mayor o igual a 7.5 minutos. En una modalidad de la presente invención, se proporciona una composición en polvo seco que comprende una molécula GLP-1 y una dicetopiperazina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otra modalidad, la molécula GLP-1 se selecciona del grupo que consiste en GLP-1 nativa, un metabolito de GLP-1, un análogo de GLP-1, un derivado de GLP-1, una GLP-1 protegida con dipeptidil-peptidasa-IV (DPP-IV), un mimético de GLP-1, un análogo de péptido GLP-1, o un análogo de GLP-1 biosi ntético . En una modalidad de la presente invención, la dicetopiperazina es una dicetopiperazina que tiene la fórmula 2,5-diceto-3,6-di(4-X-aminobutil)piperazina, en donde X se selecciona del grupo que consiste en succinilo, glutarilo, maleilo, y fumarilo. En otra modalidad, la dicetopiperazina es una sal de dicetopiperazina. En otra modalidad, la dicetopiperazina es 2,5-diceto-3,6-di(4-fumaril-aminobutil)piperazina. En una modalidad de la presente invención, la molécula GLP-1 es GLP-1 nativa. En otra modalidad, la molécula GLP-1 es una molécula de GLP-1 amidada. En otra modalidad, la molécula GLP-1 amidada una amida GLP-1 (7-36). En una modalidad de la presente invención, se proporciona un proceso para formar una partícula que comprende una molécula GLP-1 y una dicetopiperazina en donde el proceso comprende los pasos de: proporcionar la molécula GLP-1; proporcionar una dicetopiperazina en una forma seleccionada de dicetopiperazina que forma partículas, partículas de dicetopiperazina, y combinaciones de los mismos; y combinar la molécula GLP- 1 y dicetopiperazina en la forma de una co-solución, en donde la partícula comprende la molécula GLP-1 y se forma la dicetopiperazina. En una modalidad de la presente invención, el proceso comprende además eliminar un solvente de la co-solución mediante liofilización , filtración, o secado con rocío. En otra modalidad, la partícula comprende la molécula GLP-1 y la dicetopiperazina se forma eliminando el solvente. En otra modalidad, la partícula que comprende la molécula GLP-1 y la dicetopiperazina se forma antes de eliminar el solvente. En otra modalidad, la molécula GLP-1 se selecciona del grupo que consiste en GLP-1 nativo, un análogo de GLP-1, un derivado de GLP-1, un GLP-1 protegido con dipeptidil-peptidasa-IV (DPP-IV), un mimético de GLP-1, un análogo de péptido GLP-1, o un análogo de GLP-1 biosintético. En otra modalidad, la molécula GLP-1 se proporciona en la forma de una solución que comprende una concentración GLP-1 de aproximadamente 1 pg/ml - 50 mg/ml. En otra modalidad, la molécula GLP-1 se proporciona en la forma de una solución que comprende una concentración GLP-1 de aproximadamente 0.1 mg/ml - 10 mg/ml. En otra modalidad, la molécula GLP-1 se proporciona en la forma de una solución que comprende una concentración GLP-1 de aproximadamente 0.25 mg/ml. En otra modalidad de la presente invención, la dicetopiperazina se proporciona en la forma de una suspensión de partículas de dicetopiperazina. En otra modalidad, la dicetopiperazina se proporciona en la forma de una solución que comprende una dicetopiperazina que forma partículas, en donde el proceso comprende además ajustar el pH de la solución para formar partículas de dicetopiperazina. En otra modalidad, el proceso comprende además agregar a un agente la solución o suspensión, en donde el agente se selecciona del grupo que consiste en sales, tensoactivo, iones, osmolitos, caotropos y liotropos, solventes ácidos, bases, y orgánicos. En otra modalidad, el agente promueve la asociación entre la molécula GLP-1 y las partículas dicetopiperazina o la dicetopiperazina que forma partículas. En otra modalidad, el agente mejora la estabilidad o farmacodinámica de las moléculas GLP-1. En otra modalidad, el agente es cloruro de sodio. En otra modalidad de la presente invención, el proceso comprende además ajustar el pH de la suspensión o solución. En otra modalidad, el pH se ajusta aproximadamente 4.0 o mayor. Aún en otra modalidad, la molécula GLP-1 en la partícula tiene mayor estabilidad que GLP-1 nativa. En otra modalidad, la solución conjunta comprende una concentración GLP-1 de aproximadamente 1 pg/ml-50 mg/ml. En otra modalidad, la co-solución comprende una concentración GLP-1 de aproximadamente 0.1 mg/ml- 10 mg/ml. En otra modalidad, la co-solución comprende una concentración GLP-1 de aproximadamente 0.25 mg/ml. Aún en otra modalidad adicional de la presente invención, el proceso comprende además agregar un agente a la co-solución, en donde el agente se selecciona del grupo que consiste en sales, tensoactivo, iones, osmolitos, caotropos y liotropos, solventes ácidos, bases, y orgánicos. En otra modalidad, el agente promueve la asociación entre la molécula GLP-1 y las partículas de dicetopiperazina o la dicetopiperazina que forma partículas. En otra modalidad, el agente mejora la estabilidad o farmacodinámicas de la molécula GLP-1. En otra modalidad, el agente es cloruro de sodio. En otra modalidad, el proceso comprende además ajustar el pH de la co-solución. En otra modalidad, el pH se ajusta a aproximadamente 4.0 o más. En una modalidad de la presente invención, se proporciona un método para administrar una cantidad efectiva de una molécula GLP-1 a un sujeto que necesita de la misma, en donde el método comprende proporcionar al sujeto una partícula que comprende GLP-1 y dicetopiperazina. En otra modalidad, se lleva a cabo el suministro en forma intravenosa, subcutánea, oral, nasal, bucal, rectal o pulmonar. En otra modalidad, el suministro se lleva a cabo mediante administración pulmonar. En otra modalidad, la necesidad comprende el tratamiento de una condición o enfermedad seleccionad del grupo que consiste en diabetes, isquemia, lesión de tejido reperf usionado, dislipidemia, cardiomiopatía diabética, infarto al miocardio, síndrome coronario agudo, obesidad, cambios catabólicos después de cirugía, hiperglucemia, síndrome de intestino irritable, ataque, enfermedades neurodegenerativas, trastornos de memoria y aprendizaje, trasplante de célula de islote y terapia regenerativa. En otra modalidad, la provisión de la partícula da como resultado una vida media farmacocinética mejorada y una biodisponibilidad de GLP-1 mejorada en comparación con GLP-1 nativo. En una modalidad de la presente invención, se proporciona un método para formar una composición en polvo con un perfil farmacocinética GLP-1 mejorado, en donde el método comprende los pasos de: proporcionar una molécula GLP-1; proporcionar a una dicetopiperazina que forma partículas en una solución; formar partículas de dicetopiperazina; combinar la molécula GLP-1 y la solución para formar una co-solución; y, eliminar el solvente de la co-solución mediante secado con rocío para formar un polvo con un perfil farmacocinético GLP-1 mejorado. En otra modalidad, el perfil farmacocinético GLP-1 mejorado comprende una vida media GLP-1 incrementada. En otra modalidad, la vida media GLP-1 incrementada es mayor o igual a 7.5 minutos. En otra modalidad, el perfil farmacocinético GLP-1 mejorado comprende una biodisponibilidad mejorada de GLP-1 en comparación con GLP-1 nativo.
Breve Descripción de los Dibujos Los dibujos que se encuentran a continuación forman parte de la presente especificación y están incluidos para demostrar en forma adicional ciertos aspectos de la presente invención. La presente invención podrá ser mejora comprendida a través de la referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las modalidades específicas aquí presentadas. Las figuras 1A-1D. Análisis estructural de GLP-1 en varias concentraciones (pH 4, 20°C). Figura 1A - El dicroismo circular UV-distante (CD) de GLP-1 ilustra que conforme incrementa la concentración, se transforma la estructura secundaria del péptido de una conformación predominantemente no estructurada a una conformación helicoidal. Figura 1B - el CD-UV cercano ilustra que incrementa la estructura terciaria con la concentración en incremento del péptido lo que sugiere que GLP-1 se auto-asocia. Figura 1C - Emisión de fluorescencia de GLP-1 en varias concentraciones (pH 4, 20°C) que resulta de la excitación de triptofan en 280 nm. Figura 1D - Transmisión FTIR de GLP-1 en varias concentraciones (pH 4, 20°C). La banda de amida I en 1656 cm"1 indica que GLP-1 tiene una estructura a-helicoidales en concentraciones > 2 mg/ml. Las figuras 2A-2D. El análisis estructural de la baja concentración de GLP-1 en varias fuerzas iónicas (pH 4, 20°C). Figura 2A - El CD UV-distante de 1.0 mg/ml GLP-1 ilustra que el incremento de la concentración de sal convierte la estructura no ordenada de GLP-1 en estructuras a-helicoidales más ordenadas. Figura 2B - El CD de UV cercano del 1.0 mg/ml de péptido demuestra que el incremento de la concentración NaCI también aumenta la estructura terciaria de GLP-1. Figura 2C -Emisión de fluorescencia intrínseca de 1.0 mg/ml GLP-1 en diversas concentraciones de NaCI (pH 4, 20°C) después de excitación de triptofan en 280 nm. En concentraciones de péptido altas, la disminución máxima en intensidad y cambia a una longitud de onda menor, lo cual indica una estructura terciaria bien definida. Figura 2D - Análisis estructural terciario de 10 mg/ml GLP-1 en diversas fuerzas iónicas (pH 4, 20°C). El espectro CD UV-cercano demuestra que la fuerza iónica incrementada aumenta la estructura terciaria de GLP-1 auto-asociado. Las figuras 3A-3B. El análisis estructural de 10 mg/ml GLP-1 a varias temperaturas (pH 4). Figura 3A - El CD UV-cercano ilustra que los oligómeros GLP-1 se disocian con la temperatura de incremento. Figura 3B - El análisis estructural de 10 mg/ml GLP-1 a varias temperaturas (pH 4). Figura 3C - El análisis estructural de 0.05 mg/ml GLP-1 a varias temperaturas (pH 4). El CD UV-distante ilustra que el péptido es insensible a la temperatura. Las figuras 4A-4B. Análisis estructural de GLP-1 en pH diverso (20°C). Figura 4A - El CD UV-distante de 10 mg/ml GLP- 1 en pH diversos (20°C). Conforme incrementa el pH, se precipita el GLP-1 auto-asociado entre un pH 6.3 y 7.6 aunque retiene una estructura helicoidal en un pH 1.5 y 11.7. Figura 4B - El alargamiento del espectro en un pH 7.6 revela que la estructura secundaria de GLP-1 no está ordenada como un resultado de la disminución de concentración. Figura 5. Resistencia de 1 mg/ml GLP-1 tanto a desamidación como a oxidación tal como se demuestra mediante HPLC. Se lograron condiciones de desamidación incubando GLP-1 en pH 10.5 durante 5 días a una temperatura de 40°C. Se lograron condiciones oxidativas incubando GLP-1 en 0.1 % H202 durante 2 horas a temperatura ambiente. Las figuras 6A-6B. El efecto de agitación en la estructura terciaria de 1.5 y 9.4 mg/ml GLP-1 (pH 4). El CD UV-cercano (figura 6A) y la emisión de fluorescencia de GLP-1 (figura 6B) ambos ilustran que la estructura terciaria del péptido GLP-1 no cambia significativamente debido a la agitación. Se agitaron muestras durante 30 y 90 minutos a temperatura ambiente y se recolectaron los espectros de emisión de fluorescencia después de la excitación de triptofan en 280 nm. Las figuras 7A-7C. El efecto de 10 ciclos de congelación-descongelación en la estructura terciaria de 1.6,5.1 y 8.4 mg/ml GLP-1 (pH 4). CD UV-cercano (figura 7A) y emisión de fluorescencia de GLP-1 (figura 7B) ambos muestran que la estructura terciaria del péptido no cambia notablemente debido a los múltiples ciclos de congelación-descongelación. Las muestras fueron congeladas a una temperatura de -20°C y fueron descongeladas a temperatura ambiente. Se recolectaron espectros de emisión de fluorescencia después de la excitación de triptofan 280 nm. Se llevaron a cabo (figura 7) experimentos similares que muestran el efecto de 11 ciclos de congelación-descongelación en estructura secundaria de 10 mg/ml GLP-1 (pH 4) mediante CD UV-distante. Las figuras 8A-8B. Estudios de sal. Curvas de carga de GLP-1 /FDKP como una función de pH y concentración de NaCI (figura 8A). La carga se llevó a cabo en 5 mg/ml FDKP y 0.25 mg/ml GLP-1. Se expresaron las concentraciones NaCI como mM. Figura 8B - Ilustra la cantidad de GLP-1 detectado en las muestras de control libres de FDKP reconstituidas como una función de pH y concentración de NaCI. Las figuras 9A-9B. Estudios de tensoactivo. Curves de carga de GLP-1 /FDKP como una función de pH y tensoactivo (figura 9A). La caga se llevó a cabo en 5 mg/ml FDKP y 0.25 mg/ml GLP-1. Figura 9B - Ilustra la cantidad de GLP-1 detectado en las muestras de control libre FDKP reconstituidas como una función de pH y tensoactivo agregado. Figuras 10A- 10D. Estudios de ión. Curvas de carga para GLP-1 /FDKP como una función de pH y iones. La carga se llevó a cabo en 5 mg/ml FDKP y 0.25 mg/ml GLP-1 figuras 10A y 11C). Las concentraciones de iones se indican en la leyenda de (mM). las curvas del lado derecho ¡lustran los resultados de 1 M NaCI. Figuras 10B y 10D - ilustran la cantidad de GLP-1 detectado en las muestras de control libres de FDKP reconstituidas como una función de pH, iones y 1 M NaCI. Figuras 11-11B. Estudios de osmolito. Curva de carga para GLP-1/FDKP como una función de pH y en la presencia de estabilizadores comunes (osmolitos, figura 11A). La carga se llevó a cabo en 5 mg/ml FDKP y 0.25 mg/ml GLP-1. Figura 11B -Ilustra la cantidad de GLP- 1 detectado en las muestras de control libres de FDKP reconstituidas como una función de pH y osmolito. "N/ A" indica que no hubo osmolito presente en la muestra. Figuras 12A-12B. Estudios de caotropo/liotropo. Curvas de carga para GLP-1/FDKP como una función de la concentración de caotropo o liotropo en pH 3.0 (figura 12A) y pH 4.0 (figura 12C). La carga se llevó a cabo en 5 mg/ml FDKP y 0.25 mg/ml GLP-1. Figuras 12B y 12D - Ilustran la cantidad de GLP-1 detectado en las muestras de control libres de FDKP reconstituidos como una función de pH en la presencia de varios caotropos o liotropos. "N/A" indica que no estuvieron presentes caotropos o liotropos en la muestra. Figuras 13A-13B. Estudios de alcohol. Curvas de carga para GLP-1/FDKP como una función de pH y alcoholes. Las cargas se llevaron a cabo en 5 mg/ml FDKP y 0.2 5 mg/ml GLP-1. Se evaluaron cuatro concentraciones de alcohol para cada alcohol 5%, 10%, 15%, y 20% v/v (figura 13A). TFE = trifluoroetanol; HFIP = hexafluoroisopropanol. Figura 13B Ilustra la cantidad de GLP-1 detectado para muestras de control libres de FDKP reconstituidas como una función de pH y alcohol (20%). Figuras 14A-14B. Carga de estudios de concentración GLP-1/FDKP (figura 14A). La carga se llevó a cabo en 5 mg/ml FDKP y la concentración GLP-1 analizada se describe en el eje-X. Figura 14B - Imágenes de Microscopio de Exploración con Electrones (SEM) GLP-1/FDKP de múltiples formulaciones (en magnificación 10000x) ilustra agrupaciones de formulaciones de partículas GLP-1/FDKP esféricas y tipo varilla. (Panel A) 0.5 mg/ml GLP-1 y 2.5 mg/ml FDKP; (Panel B) 0.5 mg/ml GLP-1 y 10 mg/ml FDKP; (Panel C) 0.5 mg/ml GLP-1 y 10 mg/ml FDKP en 20 mM en cloruro de sodio, 20 mM de acetato de potasio y 20 mM de fosfato de potasio, pH 4.0; y (Panel D) 10 mg/ml GLP-1 y 50 mg/ml FDKP en 20 mM de cloruro de sodio, 20 mM de acetato de potasio y 20 mM de fosfato de potasio, pH 4.0. Figura 15. Ilustra el efecto de tensión en múltiples formulaciones GLP-1/FDKP. La leyenda indica el porcentaje masa a masa de partículas GLP-1 a FDKP y los otros componentes estuvieron presentes en la solución antes de la liofilización . Las muestras se incubaron durante 10 días a una temperatura de 40°C. Figuras 16A-16C. Estructura de GLP-1. Figura 16A - Ilustra la forma extendida con glicina de GLP-1 (SEQ ID NO. 1) y la forma amidada (SEQ ID NO. 2). Figura 16B - Inhibición de actividad DPPIV en la aprotinina. Figura 16C - Inhibición de actividad DPPIV mediante inhibidor DPPIV. Figura 17. Detección de GLP-1 después de incubación en fluido de lavado de pulmón. Figuras 18A-18B. Ilustra la cuantificación de GLP-1 en plasma. Figura 18A muestra la cuantificación de una dilución 1:2 de plasma. Figura 18B muestra cuantificación de dilución 1:10 de plasma. Figuras 19A-19B. Efecto de GLP-1 y análogos GLP-1 en supervivencia celular. Efecto de GLP-1 en muerte de célula epitelial pancreática de rata (ARIP) (figura 19A). la tinción con anexina V muestra la inhibición de apoptosis en la presencia de GLP-1 y staurosporina (Stau) como agente simple y en combinación (figura 19B). La concentración de GLP-1 es 15nM y la concentración de stauropsorina es 1 µ?. Figura 20. Efecto de la exendina-4 de análogo GLP-1 en la viabilidad celular. Las células ARIP se trataron con 0, 10, 20 y 40 nM de exendina 4 durante 16, 24 y 48 horas. Figura 21. El efecto de múltiples formulaciones GLP-1/FDKP en muerte celular indicada por staurosporina. Células ARIP pre-tratadas con muestras GLP-1 se expusieron a 5 µ? de staurosporina durante 4 horas y se analizaron con Cell Titer-Glo™ para determinar la viabilidad celular. Las muestras se tensionaron en temperaturas de 4o y 40°C durante 4 semanas. Las muestras de control mostradas en el lado derecho (Media, GLP-1, STAU, GLP + STAU), ilustran viabilidad de células en el medio (sin GLP-1 o stauroporina), con GLP-1, con staurosporina y con GLP-1 y staurosporina (nota: la leyenda de la gráfica no aplica a las muestras de control). Todos los resultados mostrados son promedios de corrida por triplicado. Figuras 22A-22B. Estudios farmacocinéticos que ilustran inyección intravenosa simple (IV; Figura 22A) e insuflación pulmonar (IS; Figura 22B) en ratas utilizando varias concentraciones de formulaciones GLP-1/FDKP. Las leyendas indican el porcentaje de masa a masa de GLP-1 a partículas FDKP para las formulaciones analizadas. Figuras 23A-23B. Disminución en el consumo de alimentos acumulativos en ratas dosificadas con formulaciones GLP-1/FDKP en 2 horas (figura 23A) y 6 horas (figura 23B) por dosis. Figura 24. Estudio farmacodinámico de GLP-1/FDKP se administraron mediante insuflación pulmonar en ratas Zucker macho obesas. Los datos ilustran las medidas de glucosa en 0, 15, 30, 45, 60 y 90 minutos para el control (aire; grupo 1) y tratado con GLP-1/FDKP (grupo 2). Figura 25. Estudio farmacodinámico de GLP-1/FDKPse administraron mediante insuflación pulmonar en ratas Zucker macho obesas. Los datos ilustran las medidas GLP-1 en O, 15, 30, 45, 60 y 90 minutos para el control (aire; grupo 1) y tratado con GLP-1 /FDKP (grupo 2). Figura 26. Estudio farmacodinámico de GLP-1/FDKP administrado mediante insuflación pulmonar en ratas Zucker macho obesas. Los datos ilustran las medidas de insulina en 0, 15, 30, 45, 60 y 90 minutos para el control (aire; grupo 1) y el tratado con GLP-1/FDKP (grupo 2). Figura 27. Estudio farmacocinético de GLP-1/FDKP con varias concentraciones GLP-1 administradas mediante insuflación pulmonar en ratas hembra. Los datos ilustran las medidas GLP-1 en 0, 2, 5, 10, 20, 30, 40 y 60 minutos para el control (aire; grupo 1) y grupos tratados con GLP-1/FDKP 2, 3 y 4 a los que se les administró 5%, 10% y 15% GLP-1 respectivamente. Figura 28. Estudio farmacocinético de GLP-1/FDKP con varias concentraciones GLP-1 administradas mediante insuflación pulmonar en ratas hembra. Los datos ilustran las medidas FDKP en 0, 2, 5, 10, 20, 30, 40 y 60 minutos para el control (aire; grupo 1) y grupos tratados con GLP-1/FDKP 2, 3 y 4 a los que se les administró 5%, 10% y 15% GLP-1 respectivamente. Figura 29. Estudio farmacodinámico de GLP-1/FDKP en ratas hembra a las que se les administró GLP-1/FDKP que contiene 15% GLP-1 (0.3 mg GLP-1) a través de una insuflación pulmonar diario simple (n = 10) durante 4 días consecutivos.
Los datos ilustran el consumo de alimentos por medio medido en pre-dosis, 1, 2, 4 y 6 horas posteriores a la dosis durante 4 días consecutivos. Figura 30. Estudio farmacodinámico de GLP-1/FDKP en ratas hembra a las que se les administró GLP-1/FDKP que contiene 15% GLP-1 (0.3 mg GLP-1) a través de una insuflación pulmonar diaria simple (n = 10) durante 4 días consecutivos. Los datos ilustran el peso corporal promedio medido en la predosis 1 , 2, 4 y 6 horas por dosis durante 4 días consecutivos. Figura 31. Estudio toxicocinético de GLP-1/FDKP en monos a los que se les administró GLP-1/FDKP mediante administración oronasal una vez al día (30 minutos un día) durante 5 días consecutivos. Los datos ilustran las concentraciones en plasma pico (Cmax) de GLP-1 en machos y hembras. Los animales recibieron control (aire; grupo 1), 2 mg/kg FDKP (grupo 2) ó 0.3, 1.0, o 2.0 mg/kg GLP-1/FDKP (grupos 3, 4, y 5 respectivamente). Descripción Detallada de la Invención Las formulaciones de péptido 1 tipo glucagón inhalables, estables (GLP-1) para utilizarse como farmacéuticos son deficientes en la técnica. Esto se debe a la inestabilidad del péptido GLP-1 in vivo. Los compuestos GLP-1 tienden a permanecer en la solución bajo un número de condiciones, y tienen una vida media in vivo relativamente corta cuando se administran como una formulación de solución. Además, dipeptidil-peptidasa IV (DPP-IV), el cual se encuentra en varios fluidos biológicos, tales como pulmón y sangre, reducen en gran medida la vida media biológica de las moléculas GLP-1. Por ejemplo, la vida media biológica de GLP-1 (7-37) ha mostrado ser de 3 a 5 minutos; ver la Patente Norteamericana No. 5,118,666. GLP-1 también ha mostrado pasar por una rápida absorción in vivo después de la administración parenteral. En forma similar el GLP-1 (7-36) de amida tiene una vida media de aproximadamente 50 minutos, cuando se administra en forma subcutánea; ver también Patente Norteamericana No. 5,118,666. E despeje rápido y la vida media corta de composiciones GLP-1 en la técnica presentan una deficiencia la cual la presente invención puede superar. La presente invención supera las deficiencias en la técnica, proporcionando una formulación GLP-1 /FDKP nativa optimizada (dicetopiperazina de fumarilo) adaptada especialmente para administración pulmonar. En otros aspectos particulares, la presente invención proporciona formulaciones de una molécula GLP-1 nativa que puede provocar una respuesta GLP-1 in vivo. El uso de variantes de GLP-1 nativos en dicha formulación también se contempla. Para superar las deficiencias en la técnica, la presente invención proporciona formulaciones de GLP-1 en combinación con partículas dicetopiperazina (DKP). En modalidades particulares de la presente invención, las formulaciones GLP-1/DKP se proporciona para administración a un sujeto. En modalidades particulares adicionales, las formulaciones GLP-1/DKP comprenden dicetopiperazina de fumarilo (FDKP), aunque no se limitan a éstas, y pueden incluir otras DKPs (DKPs, xDKPs asimétricas) tales como 2,5-diceto-3,6-di(4-succinil-aminobutil)piperazina (SDKP), dicetopiperazinas asimétricas que incluyen las sustituidas únicamente en una posición en el anillo DKP (por ejemplo análogos "de un brazo" de FDKP), y sales DKP. En otras modalidades particulares de la presente invención, la administración de la formulación GLP-1 /FDKP es mediante administración pulmonar. En el desarrollo de formulaciones terapéuticas de moléculas GLP-1, las características estructurales de GLP-1 en la solución fueron evaluadas empleando varias técnicas biofísicas y analíticas las cuales incluyeron dicroismo circular ultravioleta-distante (CD U V-distante), dicroismo circular ultravioleta-cercano (CD UV-cercano), fluorescencia intrínseca, espectroscopia infrarroja de transformación fourier (FTIR), cromatografía líquida de alta presión (HPLC), y espectroscopia de masa (MS). La técnica de dicroismo circular (CD) es una herramienta potente utilizada para analizar los cambios estructurales de una proteína bajo diversas condiciones experimentales, y es bien conocida en el arte. Las condiciones experimentales bajo las cuales estos análisis se llevaron a cabo incluyeron: los efectos de concentración, fuerza iónica, temperatura, pH, tensión oxidativa, agitación y múltiples ciclos de congelación-descongelación en el péptido GLP-1. Estos análogos se diseñaron para caracterizar las rutas importantes de degradación así como para establecer condiciones que manipulan la estructura del péptido GLP-1 con el objeto de logras que las formulaciones GLP-1/DKP referidas tengan características farmacocinéticas (PK) y farmacodinámicas (PD) deseables. Se observó que conforme incrementa la concentración de GLP-1, la estructura secundaria del péptido fue transformada de una conformación predominantemente no estructurada, a una conformación más helicoidal. El incremento de la fuerza iónica en la y asociados originó que la estructura de GLP-1 incremente hasta que se precipite en forma irreversible. La presencia de NaCI incrementó la estructura terciaria de GLP-1 como es evidente a través de un incremento en intensidad de las bandas CD cercanas tal como se ilustra en la figura 2D. Esto ocurre incluso para las bajas concentraciones de péptido en donde no hay evidencia de auto-asociación. La fuerza iónica incrementada convirtió fácilmente el GLP-1 no estructurado en la forma a-helicoidal tal como se ¡lustra medíante los cambios mínimos CD distante hacia 208 nm y 222 nm, (figura 2A) y las conformaciones auto-asociadas tal como se ilustran mediante cambios de emisión de triptofan a longitudes de onda menores con sal incrementada y los patrones CD cercanos en figuras 2B y 2D. La temperatura y pH afectaron las conformaciones de GLP-1 en forma diferencial, en cuanto a que la estructura no ordenada de GLP-1 no fue alterada por cualquiera de estos parámetros. Por otra parte, la conformación auto-asociada de GLP-1 se encontró como sensible a desnaturalización térmica y su solubilidad sensible a pH tal como se ilustra en figura 4A y 4B lo cual muestra que el péptido GLP-1 se precipita en forma reversible entre pH 6.3-7.6 en una concentración de péptido de 10 mg/ml. Las diversas conformaciones de GLP-1 se encontraron como generalmente estables en la agitación y múltiples ciclos de congelación-descongelación. Ni la desamidación ni la oxidación se observaron en GLP-1. La absorción de GLP-1 a partículas FDKP también se observó bajo una variedad de condiciones que incluyeron variación en pH, concentración GLP-1 y en la concentración de varios tensoactivos, sales, iones, caotropos y liotropos, estabilizadores y alcoholes. Se descubrió que la absorción de partículas GLP-1 a FDKP será afectada fuertemente por el pH, específicamente, el enlace ocurrió en un pH de aproximadamente 4.0 o mayor. Se descubrió que otros excipientes tienen un efecto limitado en la absorción de partículas GLP-1 a FDKP. En el desarrolló de las formulaciones GLP-1/DKP de la presente invención, se evaluó un número de parámetros que pueden afectar o impactar su capacidad y suministro y absorción in vivo. Dichos parámetros incluyen, por ejemplo, la estructura del péptido GLP-1, las cargas de superficie en la molécula bajo ciertas condiciones de formulación, solubilidad y estabilidad como una formulación, así como susceptibilidad a degradación de proteasa de serina y estabilidad in vivo; todas de las cuales juegan un papel importante en la generación de una formulación que puede ser absorbida fácilmente, la cual exhibe una vida media biológica prolongada. La estabilidad de formulaciones GLP-1/FDKP obtenidas se probó en forma adicional bajo una variedad de condiciones tanto in vitro como in vivo. La estabilidad de GLP-1 fue analizada mediante análisis HPLC y ensayos a base de células. Además, la estabilidad de GLP-1 fue revisada en el fluido de lavado de pulmón (el cual contiene DPP-IV). También se descubrió que la estabilidad de GLP-1 nativo fue dependiente de la concentración en la solución. También se emplearon estudios de actividad biológica de GLP-1 in vitro, para estudios de carga GLP-1/FDKP, y determinar el efecto in vivo. Esta estrategia contribuyo a la identificación adicional de los métodos de formulación GLP-1/FDKP principales. Además, con base en el hecho de que GLP-1 ha mostrado jugar un papel importante en incrementar la masa de células-ß inhibiendo la apoptosis, estimulando la proliferación de células-ß y neogénesis de islote, se revisaron a través de un ensayo a base de células el potencial proliferativo y anti-apoptótico de las formulaciones GLP- 1/FDKP de la presente invención. Por lo tanto, la presente invención proporciona formulaciones optimizadas que comprenden GLP-1 humano nativo combinado con dicetopiperazina de fumarilo (FDKP) que son estables y resistentes a degradación. II. Moléculas GLP-1 En modalidades particulares de la presente invención, se proporcionan formulaciones optimizadas que comprenden el péptido 1 tipo glucagón humano nativo (GLP-1) combinado con una dicetopiperazina tal como dicetopiperazina de fumarilo (FDKP). Dichas formulaciones GLP-1 /FDKP de la presente invención son estables y resistentes a degradación. GLP-1 humano es bien conocido en la técnica y se propina del polipéptido de pre-proglucagon sintetizado en las células L en el ileo distal, en el páncreas y en el cerebro. GLP-1 es un péptido de 30 a 31 aminoácidos que existen en dos formas moleculares, 7-36 y 7-37, siendo 7-36 la forma dominante. El procesamiento de pre-glucagón a amida GLP-1 (7-36) y la forma extendida de GLP-1 (7-37) ocurrió principalmente en células-L. Esto ha mostrado en la técnica que, en el estado en ayuno, los niveles en plasma de GLP-1 son de aproximadamente 40 pg/ml. Después de los alimentos, los niveles en plasma de GLP-1 se incrementan rápidamente a aproximadamente 50-165 pg/ml. El término "moléculas GLP-1" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a proteínas GLP-1, péptidos, polipéptidos, análogos, miméticos, derivados, isoformas, fragmentos y similares. Dichas moléculas GLP-1 pueden incluir polipéptidos GLP-1 que ocurren naturalmente (GLP-1 (7-37)OH, GLP-1(7- 30)NH2) y metabolitos GLP-1 tales como GLP-l(9-37). Por lo tanto, en modalidades particulares de la presente invención, las moléculas GLP-1 incluyen un GLP-1 nativo, un análogo de GLP-1, un derivado de GLP-1, un GLP-1 protegido con dipeptidil-peptidasa-l V (DPP-IV), un mimético de GLP-1, un análogo de péptido GLP-1, o un análogo de GLP-1 biosintético.
Tal como se utiliza en la presente invención, un "análogo" incluye compuestos que tienen similitud estructural con otro compuesto. Por ejemplo, el compuesto antiviral aciclovir, es un análogo de nucleósido y es estructuralmente similar a la guanosina de nucleósido que se deriva de la guanina base. Por lo tanto, el aciclovir mimetiza la guanosina (es biológicamente análogo con) e interfiere con la síntesis de ADN reemplazando (o compitiendo con) residuos de guanosina en el ácido nucleico viral y evita la traducción/transcripción. Por lo tanto, los compuestos que tienen similitud estructural (un compuesto de origen) que mimetizan con la actividad biológica o química del compuesto de origen, son los análogos. Existe números mínimos o máximos de sustituciones de grupos elementales o funcionales requeridas para calificar un compuesto como un análogo, siempre que el análogo tenga la capacidad de mimetizar, en algún modo relevante, ya sea en forma idéntica, en forma complementaria o competitiva, con las propiedades biológicas o químicas del compuesto de origen. Con frecuencia los análogos pueden ser derivados del compuesto de origen (ver más adelante "infra"). Los análogos de los compuestos aquí descritos pueden tener una actividad igual, menor o mayor a la de los compuestos de origen. Tal como se utiliza en la presente invención, un "derivado" es un compuesto elaborado de (o derivado de), ya sea en forma natural o sintética, un compuesto de origen. Un derivado puede ser un análogo (ver "análogo" supra) y de esta forma posee actividad química o biológica similar. Sin embargo, a diferencia de un análogo, un derivado no tiene necesariamente que mimetizar la actividad biológica o química del compuesto de origen. No existen números mínimos o máximos de sustituciones de grupos elementales o funcionales requeridos para calificar un compuesto como un derivado. Por ejemplo, aunque el compuesto anti-viral ganclovir es un derivado de aciclovir, ganclovir tiene un espectro diferente de actividad antiviral y diferentes propiedades toxicológicas que el aciclovir. Los derivados de los compuestos aquí descritos pueden tener una actividad igual, menor o mayor o incluso no similar cuando se comparan con sus compuestos de origen.
Tal como se utiliza en la presente invención, un "metabolito" es un intermediario o producto de metabolismo o incluye moléculas naturales como pequeñas. Tal como se utiliza en la presente invención y cuando es adecuado, la definición aplica tanto a metabolitos primarios como secundarios. Un metabolismo primario está implicado directamente en el crecimiento, desarrollo o producción normal de organismos vivos. El metabolito secundario no está implicado directamente en dichos procesos, aunque normalmente tiene una función ecológica importante (por ejemplo antibiótico). Tal como se utiliza en la presente invención, el término "biosintético" se refiere a cualquier producción de un compuesto químico a través de un organismo vivo. Tal como se utiliza en la presente invención, "formación de partícula" se refiere a entidades químicas, biosintéticas, o biológicas o compuestos que tienen la capacidad de formar partículas sólidas, normalmente en un medio líquido. La formación de partículas normalmente ocurre cuando se expone una entidad que forma partículas a una cierta condición(s), tal como por ejemplo, cambios en pH, temperatura y humedad y/o osmolaridad/osmolalidad. La exposición a la condición(s) puede dar como resultado, por ejemplo, el enlace, coalición, solidificación y/o deshídratación , de modo que se forme una partícula. Una reacción de precipitación es un ejemplo de un evento que forma partículas.
Tal como se utiliza en la presente invención, "co-solución" es cualquier medio comprendido en al menos dos entidades químicas, biológicas y/o biosintéticas. Por ejemplo, una co-solución se puede formar combinando un líquido que comprende al menos una entidad química bióloga y/o biosintética con un sólido que comprende una entidad química biológica y/o biosintética. En otro ejemplo, una co-solución puede formarse combinando un líquido que comprende al menos una entidad química biológica y/o biosintética con otro líquido que comprende una entidad química, y/o biosintética. En un ejemplo adicional, se puede formar una co-solución agregando al menos dos sólidos, comprendiendo cada uno al menos una entidad química, biológica y/o biosintética en una sola solución. El GLP-1 nativo, tal como se contempla en la presente invención, es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 2. El péptido GLP-1 nativo pasa por una disociación y desactivación rápida en pocos minutos in vivo. Los análogos GLP-1 de la presente invención pueden incluir las exendinas, las cuales son péptidos encontrados como agonistas del receptor GLP-1; dichos análogos pueden incluir además exendinas 1 a 4. Las exendinas se encuentran en el veneno de Gila-monster y comparten aproximadamente el 53% de homología de aminoácido con GLP-1 de mamífero. Las exendinas también tienen afinidad de enlace similar para el receptor GLP-1 receptor. Se reportó que exendina-3 y exendina-4 estimulan la producción cAMP, en y la liberación de amilasa de células acinares pancreáticas (Malhotra y asociados, 1992; Raufman y asociados, 1992; Singh y asociados, 1994). El uso de exendina-3 y exendina-4 como agentes insulinotrópicos para el tratamiento de diabetes melitus y la prevención de hiperglucemia, también ha sido propuesto (Patente Norteamericana No. 5,424,286). Los fragmentos terminales carboxilo de exendina tales como exendina[9-39], una molécula carboxiamidada, y fragmentos 3-39 de 9-39 han sido reportados como antagonistas potentes y selectivos de GLP-1 (Goke y asociados, 1993; Raufman y asociados, 1991; Schepp y asociados, 1994; Montrose-Rafízadeh y asociados, 1996). La literatura también ha demostrado que exendina[9-39] bloquea GLP-1 endógeno in vivo, dando como resultado una secreción reducida de insulina (Wang y asociados, 1995; D'Alessio y asociados, 1996). Exendina-4 se enlaza potentemente a receptores GLP-1 en células ß-TCI que secretan insulina, para células acinares dispersadas del páncreas, y para células parietales del estómago. El péptido de exendina-4 también juega un papel importante en la estimulación de la liberación de somatostatina y la inhibición de liberación de gastrina en estómagos aislados (Goke y asociados, 1993; Schepp y asociados, 1994; Eissele y asociados , 1994). En células transfectadas con el receptor GLP- 1 clonado, exendina-4 se repostó como un agonista, es decir, incrementa cAMP, mientras que exendina[9-39] se identificó como un antagonista, es decir, bloquea las acciones estimuladoras de exendina-4 y GLP-1. La exendina también se ha encontrado como resistente a la degradación. Otra modalidad de la presente invención contempla el uso de miméticos de péptido. Los miméticos de péptido son conocidos para los expertos en la técnica, y son péptidos que mimetizan biológicamente determinantes activos en hormonas, citocinas, substratos de enzimas, viruses y otras biomoléculas y pueden antagonizar, estimular o modular de otra manera la actividad fisiológica de los ligandos naturales. Los miméticos de péptidos son especialmente útiles en el desarrollo de fármacos. Ver por ejemplo la Publicación de Johnson y asociados, "Peptide Turn Mimetics" in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto y asociados, Eds., Chapman y Hall, Nueva York (1993). El fundamento subyacente detrás del uso de miméticos de péptido, es que el esqueleto del péptido e las proteínas existen principalmente para orientar las cadenas laterales de aminoácidos en forma tal que se faciliten las interacciones moleculares. Un mimético de péptido se espera que permite interacciones moleculares similares en la molécula natural. En modalidades adicionales se contempla que las moléculas GLP-1 de la presente invención tendrán al menos una actividad biológica del GLP-1 nativo tal como la capacidad de enlazar al receptor GLP-1 e iniciar una trayectoria de transducción de señal que da como resultado la actividad insulinotrópica. En modalidades adicionales de la presente invención, una molécula GLP-1 puede ser un péptido, polipéptido, proteína, análogo, mimético, derivado, isoforma, fragmento y similar, que retenga al menos una actividad biológica del GLP-1 que ocurre naturalmente. Las moléculas GLP-1 también pueden incluir las sales o profármacos farmacéuticamente aceptables, y sales de los profármacos, polimorfos, hidratos, solvatos, fragmentos biológicamente activos, variantes biológicamente activas y estéreoisómeros del GLP-1 humano que ocurre naturalmente, así como variantes agonistas, miméticas, y antagonistas del GLP-1 humano que ocurre naturalmente, incluyendo la familia de exendinas, exendinas 1 a 4, y fusiones de polipéptido de las mismas. Una molécula GLP-1 de la presente invención también puede incluir un GLP-1 protegido por dipeptidil-peptidasa-l V (DPP-IV) que evita o inhibe la degradación de 1GLP-1. Las moléculas GLP-1 de la presente invención incluyen péptidos, polipéptidos, proteínas y derivados de los mismos que contienen sustituciones de aminoácidos, mejoran la solubilidad, confieren resistencia a oxidación, incrementa la potencia biológica o incrementan la vida media en la circulación. Por lo tanto, las moléculas GLP-1 como se contempla en la presente invención comprenden sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos, en donde el aminoácido es seleccionado de los conocidos en la técnica. El término N o C de la molécula también puede ser modificado tal como mediante acilación, acetilación, amidación, aunque no se limita a esto. Por lo tanto, la presente invención, el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos que ocurren naturalmente o que ocurren no naturalmente, así como análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan en una forma similar a los aminoácidos que ocurren naturalmente. Los aminoácidos codificaron naturalmente son 20 aminoácidos comunes (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofan, tirosina, y valina) y pirolisina y selenocisteína. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura que tienen la misma estructura química básica como un aminoácido que ocurre naturalmente, es decir un a carbono que está enlazado a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, tal como, homoserina, norleucina, norvalina, sulfóxido de metionina, sulfonio de metil metionina, citrulina, ácido hidroxil glutámico, hidroxiprolina, y pralina. Dichos análogos tienen grupos R modificados (tal como norleucina), aunque retienen la misma estructura química básica que un aminoácido que ocurre naturalmente. Los aminoácidos contemplados en la presente invención también incluyen aminoácidos-ß los cuales son similares a los aminoácidos-a en cuanto a que contienen un término amino y un término carboxilo. Sin en aminoácidos-ß, dos átomos de carbono separan estos términos funcionales. Los aminoácidos-ß con una cadena lateral específica pueden existir como los isómeros R o S ya sea en el carbono alfa (C2) el carbono beta (C3). Esto da como resultado un total de cuatro posibles diastereoisómeros para cualquier cadena lateral determinada. Las moléculas GLP-1 de la presente invención también pueden incluir proteínas GLP-1 híbridas, proteínas de fusión, oligomeros, y multímeros, homólogos, variantes de patrón de glucosilación y muteinas de las mismas, en donde la molécula GL-P-1 retiene al menos una actividad biológica de la molécula nativa, y sin importar además el método de síntesis o fabricación del mismo, incluyendo pero sin limitarse a, métodos recombinantes (ya sea producidos a partir de cADN, ADN genómico, ADN sintético u otra forma de ácido nucleico), sintéticos y de activación genética. La tecnología de ADN recombinante es bien conocida por los expertos en el arte (ver las Publicaciones de Russell, D. W., y asociados, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001 ). II!. Dicetopiperazinas Las dicetopiperazinas, son bien conocidas en la técnica por su capacidad de formar micropartículas que son útiles para el suministro y estabilización de fármacos. En la presente invención, las dicetopiperazinas se emplean para facilitar la absorción de moléculas GLP-1 proporcionando de esta forma una formulación estable que es resistente a degradación. Se pueden emplear varias metodologías en donde las dicetopiperazinas se puedan formar en partículas que incorporan moléculas GLP-1, o partículas en las cuales las moléculas GLP-1 pueden ser absorbidas. Esto puede implicar mezclar las soluciones de dicetopiperazina con soluciones o suspensiones de moléculas GLP-1 seguido de precipitación y formación subsecuente a partículas que comprenden dicetopiperazina y GLP-1. Como alternativa, la dicetopiperazina puede ser precipitada para formas partículas y mezclarse subsecuentemente con una solución de moléculas GLP-1. La asociación entre la partícula dicetopiperazina y la molécula GLP-1 puede conducirse a través de la eliminación de solvente o un paso específico, tal como ajuste de pH, que se pueden incluir antes del secado con el objeto de promover la asociación . En una modalidad preferida, las dicetopiperazinas de la presente invención incluyen pero no se limitan a 3,6-di(fumaril-4 aminobutil)-2,5-dicetopiperazina también conocido como (E)-3,6-bis[4-(N-carboxil-2-propenil)amidobutil]-2,5-dicetopiperazina (la cual también puede ser referida como dicetopiperazina de fumarilo o FDKP). Otras dicetopiperazinas contempladas en la presente invención incluyen sin limitación derivados de 3,6-di(4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina tales como: 3,6-di(succinil-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina (también referido en la presente invención como 3,6-bis(4-carboxipropil)amidobutil-2,5-dicetopiperazina; dicetopiperazina de succinilo o SDKP); 3,6-di(maleil-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina; 3,6-di(citraconil-4-aminobutil)-2-5-dicetopiperazina; 3,6-di(glutaril-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina; 3,6-di(malonil-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina; 3,6-di(oxalil-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina y derivados de las mismas. En otras modalidades, la presente invención contempla el uso de sales de dicetopiperazina. Dichas sales pueden incluir, por ejemplo, cualquier sal farmacéuticamente aceptable tal como las sales de dicetopiperazina de Na, K, Li, Mg, Ca, amonio, o mono-, di-o tri-alquilamonio (las derivadas de trietilamina, butilamina, dietanolamina, trietanolamina, o piridinas, y similares). Las sales pueden ser una sal mono-, di-, o mezclada. También se contemplan sales de orden superior para dicetopiperazinas en donde los grupos R contienen más de un grupo de ácido. En otros aspectos de la presente invención, se puede mezclar una forma básica del agente con la dicetopiperazina con el objeto de formar una sal de fármaco de la dicetopiperazina, de modo que la sal sea el contra catión de la dicetopiperazina. Un ejemplo de una sal se contempla en la presente invención, e incluye en una forma no limitante FDKP diNa. El suministro de fármacos utilizando sal de DKP se considera en la Solicitud de Patente Norteamericana No.111210, 710 , incorporada a la presente invención como referencia en cuanto a todos sus contenidos con respecto a las sales DKP. También se describe en la presente invención, el empleo de análogos asimétricos novedosos de FDKP, xDKPs tal como: ácido (E)-3-(4-(3,6-dioxopiperazin-2-il)butilcarbamoil)-acrílico; ácido (E)-3-(3-(3,6-dioxop¡peraz¡n-2-¡l)propil-carbamoil)acrílico; y ácido (E)-3-(4-(5-isopropil-3,6-dioxopiperazin-2-il)-butilcarbamoil)acrílico y se describe en la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana titulada "Análogos FDKP Asimétricos para Utilizarse como Agentes de Suministro de Fármaco" presentados en una fecha emparejada con la presente invención incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia (expediente legal No. 51300-00041 ). Las dicetopiperazinas se pueden formar mediante ciclodimerización de derivados de éster de aminoácido, tal como lo describe Katchalski, y asociados, (J. Amer. Chem. Soc. 68:879-80; 1946), a través del ciclado el derivado de éster dipéptido o mediante deshidratación térmica de los derivados de aminoácido en solventes de ebullición de alto nivel, tal como lo describe Kopple, y asociados, (J. Org. Chem. 33:862-64; 1968), cuyas enseñanzas están incorporadas a la presente invención como referencia. Los métodos para síntesis y preparación de dicetopiperazinas son bien conocidos para los expertos en la técnica y se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,352,461; 5,503,852; 6,071,497; 6,331,318; 6,428,771 y la solicitud de Patente Norteamericana No. 20060040953. Las Patentes Norteamericanas Nos. 6,444,226 y 6,652,885, describen la preparación y suministro de microparticulas de dicetopiperazinas en una suspensión acuosa la cual se agrega una solución de agente activo con el objeto de enlazar el agente activo a la partícula. Las patentes describen además un método para eliminar un medio líquido mediante liofilización para producir microparticulas que comprende un agente activo, alterando las condiciones del solvente de dicha suspensión para promover el enlace al agente activo a la partícula que se enseña en la solicitud de Patente Norteamericana No. 60/717,524 y 11/532,063 ambas tituladas "Método de Formulación de Fármacos con Base en el Incremento de Afinidad de Agentes Activos para Superficies de Micropartícula Cristalina"; y 11/532,065 titulada "Método de Formulación de Fármacos con Base en Incremento de Afinidad de Agentes Activos para Superficies de Microparticulas Cristalinas". Ver también la Patente Norteamericana No. 6,440,463 y la Solicitud de Patente Norteamericana Serie No. 11/210,709 presentada el 23 de agosto del 2005 y la Solicitud de Patente Norteamericana No. 11/208,087). En algunos casos, se contempla que las partículas de dicetopiperazina cargadas de la presente invención se sequen a través de un método de secado con rocío, tal como se describe, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Norteamericana Serie No. 11/678,046 presentada el 22 de febrero del 2006 y titulada "Método para Mejorar las Propiedades Farmacéuticas de Micropartículas que Comprenden Dicetopiperazina y un Agente Activo". Cada una de estas patentes y solicitudes de patentes están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia en lo que respecta a las dicetopiperazinas. IV. Formulaciones Terapéuticas de Partículas GLP- 1/DKP La presente invención proporciona además una formulación GLP-1 /FDKP para administración a un sujeto que necesita de tratamiento. Un sujeto, tal como se contempla en la presente invención, puede ser un animal doméstico o humano. En ciertas modalidades, el tratamiento es para diabetes tipo II, obesidad, cáncer y cualesquiera enfermedades relacionadas y/o condiciones de las mismas. Los humanos son particularmente los sujetos preferidos. Otras enfermedades o condiciones contempladas en la presente invención incluyen pero no se limitan a síndrome de intestino irritable, infarto al miocardio, isquemia, lesión de tejido reperfusionado, dislipidemia, cardiomiopatía diabética, síndrome coronario agudo, síndrome metabólico, cambios catabólicos después de cirugía, trastornos neurodegenerativos, trastornos de memoria y aprendizaje, trasplante de célula de islote y terapia regenerativa o ataque. Otras enfermedades y/o condiciones contempladas en la presente invención incluyen cualquier enfermedad y/o condición relacionada con las descritas anteriormente que pueden ser tratadas mediante la administración de una formulación de polvo seco GLP-1 /FDKP a un sujeto que necesita del mismo. La formulación de polvo seco GLP-1 /FDKP de la presente invención también puede ser empleada en el tratamiento de inducción de diferenciación de célula beta en células de humano de diabetes tipo II e hiperglucemia. En una modalidad adicional de la presente invención, se contempla que el sujeto pueda ser una mascota doméstica o animal, incluyendo ratas, conejos, hámster, cerdos de guinea, Gerbo, marmotas, gatos, perros, ovejas, cabras, cerdos, vacas, caballos, monos y chimpancés (incluyendo chimpancés gibbons, y babuinos). Se contempla además que las formulaciones de partículas GLP-1/FDKP de la presente invención pueden ser administradas a través de varias rutas de administración conocidas para los expertos en la técnica y para propósitos clínicos y no clínicos. Las composiciones GLP-1/FDKP de la presente invención pueden ser administradas a cualquier membrana biológica dirigida, preferentemente una membrana mucosa de un sujeto. La administración puede ser a través de cualquier ruta, incluyendo pero sin limitarse a rutas orales, nasales, bucales, de inyección, intravenosas, sistémicas, subcutáneas, administración regional a través de suministro de sangre o linfa, directamente a un sitio afectado o incluso a través de cualquier medio tópico. En modalidades preferidas de la presente invención, la administración de una composición GLP-1/FDKP es mediante suministro pulmonar. Otra ruta de administración alternativa que se pueden emplear en la presente invención pueden incluir: intradérmica, intraarterial, intraperitoneal , intralesional, intracranial, intraarticular, intraprostático, intrapleural, intratraqueal, intravitreal , ¡ntravaginal, rectal, intratumoral, intramuscular, intravesicular, mucosa, intrapericardial, administración bronqueal local, utilizando aerosol, inyección, infusión, infusión continúa, baño de perfusión localizado de dirección de células, a través de un catéter, a través de un lavado, en cremas, en composiciones de lípidos (por ejemplo, liposomas), o a través de otro método o cualquier combinación de lo anterior como lo puede saber un experto en la técnica (ver, por ejemplo, la Publicación Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990, incorporada a la presente invención con referencia a los métodos de administración). Como una formulación de polvo seco, las partículas GLP-1/DKP de la presente invención 'pueden ser suministradas mediante inhalación en áreas especificas del sistema respiratorio, dependiendo del tamaño de la partícula. Además, las partículas GLP-1/DKP pueden hacerse lo suficientemente pequeñas para la incorporación en una forma de dosificación de suspensión intravenosa. Para el suministro oral, las partículas pueden ser incorporadas a una suspensión, tabletas o cápsulas. La composición GLP-1/DKP puede ser suministrada desde un aparato de inhalación, tal como un nebulizador, un inhalador de dosis medida, un inhalador de polvo seco y un rociador. En modalidades adicionales, la administración de una "cantidad efectiva" de una formulación GLP-1/DKP a un paciente que necesita del mismo está también contemplado. Una "cantidad efectiva" de una formulación de polvo seco GLP-1/DKP tal como se contempla en la presente invención se refiere a la cantidad del compuesto GLP-1, análogo o péptido mimético o similar, la cual libera hasta cierto punto uno o más de los síntomas de la enfermedad o condición o trastorno que está siendo tratado. En una modalidad, una "cantidad efectiva" de una formulación de polvo seco GLP-1/DKP puede ser una cantidad tal de la molécula GLP-1 para tratar diabetes, incrementando niveles de insulina en plasma, reducir o disminuir los niveles de glucosa en la sangre en ayuno e incrementar la masa de células beta pancreáticas en al menos aproximadamente el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50%, o mayor, pero no se limitan a estos. En otra modalidad preferida, la presente invención contempla tratar obesidad administrando a un sujeto que necesita de dicho tratamiento una cantidad farmacéuticamente activa de la molécula GLP-1. En dichos casos, una "cantidad efectiva" de una formulación de polvo seco GLP-1/DKP puede ser una cantidad de la molécula GLP-1 para tratar obesidad, reduciendo o disminuyendo el peso corporal en al menos un 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50%, o más, aunque no se limita a estos. La presente invención también contempla administrar una "cantidad efectiva" de una formulación de polvo seco GLP-1/DKP para controlar la saciedad, administrando a un sujeto que necesita de dicho tratamiento, una cantidad farmacéuticamente efectiva de la molécula GLP-1. En una forma sin limitación, la molécula GLP-1 puede ser una molécula de exendina tal como exendina-1 ó -4. En dichos casos, una "cantidad efectiva" de una formulación de polvo seco GLP-1/DKP puede ser una cantidad de la molécula GLP-1 que reduzca la precipitación de la sensación de hambre e ingesta de alimentos tal como se mide a través de la masa o contenido calórico, por ejemplo) en un al menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50%, o mayor, aunque no se limita a estos. Una "cantidad efectiva" de una formulación de polvo seco GLP-1/DKP puede definir además que dicha cantidad es suficiente para disminuir, reducir, minimizar o eliminar en forma detectable o repetida el grado de la enfermedad o condición o síntomas de los mismos.
La eliminación, erradicación, o cura de la enfermedad o condición también puede ser posible utilizando una "cantidad efectiva" de la formulación de la presente invención. En la administración de una composición GLP-1 /FDKP de la presente invención a un sujeto que necesita de la misma, la cantidad de dosis real de la composición puede ser determinada con base en los factores físicos y fisiológicos tales como pero corporal, severidad de condición, el tipo de enfermedad que esté siendo tratada, intervenciones terapéuticas, previas o concurrentes, idiopatía del paciente y la ruta de administración. Un experto en la técnica podrá tener la capacidad de determinar las dosis reales con base en uno o más de estos factores. La formulación GLP-1/DKP de la presente invención pueden ser administrada una vez o más veces, dependiendo de la enfermedad o condición que será tratada. La administración de la formulación GLP- 1/DKP puede ser proporcionada a un sujeto en intervalos que fluctúan de minutos, horas, días, semanas o mese. En algunos casos, la sintonización del régimen terapéutico puede estar relacionada con la vida media de la molécula GLP-1 al momento de la administración. En modalidades adicionales, en el tratamiento de enfermedades o condiciones particulares o complejas tales como cáncer, por ejemplo, puede ser deseable administra una formulación GLP-1/DKP de la presente invención con un excipiente o agente farmacéutico. En dichos casos, se puede indicar un régimen de administración a través el excipiente o agente farmacéutico. V. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos incluyen para demostrar ciertas modalidades de la presente invención. Los expertos en la técnica deberán apreciar que las técnicas descritas en los ejemplo, aclaran técnicas representativas que funcionan en la práctica de la presente invención. Sin embargo, los expertos en la técnica, a la luz de la presente descripción, deben apreciar que se pueden realizar muchos cambios en las modalidades específicas que se describen y obtener aún un resultado similar o parecido sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención. Ejemplo 1 Análisis Biofísicos y Analíticos de la Estructura de GLP-1 Para analizar tanto la estructura como comportamiento de GLP-1, se empleo un número de técnicas biofísicas y analíticas. Estas técnicas incluyeron dicroismo circular u Itravioleta-distante (CD U V-distante), dicroismo circular u Itravioleta-cercano (CD UV-cercano), fluorescencia intrínseca, espectroscopia infrarroja de transformación fourier (FTIR), cromatografía líquida de alta presión (HPLC), y espectroscopia de masa (MS); las cuales todas son conocidas por los expertos en la técnica. Se empleo un alto rango de condiciones para investigar los efectos de la concentración, fuerza iónica, temperatura, pH, tensión oxidativa, agitación, y múltiples ciclos de congelación-descongelación en el péptido GLP-1; los cuales todos se describen con detalle más adelante. Estos análisis se emplearon también para caracterizar las rutas principales de degradación y establecer las condiciones que manipulan la estructura de péptido GLP-1 con el objeto de lograr ciertas formulaciones GLP-1/DKP. Procedimiento Experimental Se compró GLP-1 ya sea en American Peptide (Sunnyvale, CA) o AnaSpec (San José, CA), o se preparó localmente (MannKind Corporation, Valencia, CA). Las muestras GLP-1 acuosas, de diversas concentraciones, fueron analizadas en un pH de 4.0 y a una temperatura de 20°C (a menos que se indique lo contrario). Las muestras se prepararon generalmente en forma reciente y se mezclaron con el aditivo adecuado (por ejemplo, sal, amortiguador de pH, H202 etc., si es que existen), antes de cada experimento. las medidas estructurales secundarias de GLP-1 bajo diversas condiciones se recolectaron con CD UV-distante y espectrometría infrarroja de transformación fourier de transmisión (FTIR). Además, tanto CD UV-cercano como la fluorescencia intrínseca se emplearon para analizar la estructura terciaria de GLP-1 monitoreando los ambientes que rodean sus residuos aromáticos, es decir tri ptofa n . Estructuras de GLP-1 dependientes de la Concentración Se utilizaron espectros de dicroismo circular (CD) para analizar la a-hélice, espiral aleatorio, hoja plegada-ß, vueltas-ß y espiral aleatorio, que pueden desplegarse a través de una molécula tal como una proteína o péptido. En particular, se utilizó CD UV-distante para determinar el tipo de estructura secundaria, por ejemplo, a-hélice pura, ß-hoja, etc, en proteínas y péptidos. Por otra parte, se utilizó CD UV-cercano para analizar las estructuras terciarias de una molécula. Por lo tanto, con el objeto de revisar el efecto de la concentración en estructuras GLP-1 se emplearon técnicas CD UV-distante y cercano. La CD UV-distante en la figura 1A demostró que GLP-1 forma dos estructuras distintas que incluyen a-hélices y espiral aleatorios, en un amplio rango de concentraciones (por ejemplo: 1.8, 4.2, 5.1, 6.1, 7.2 y 8.6 mg/ml). En bajas concentraciones (< 2 mg/ml), GLP-1 está principalmente no estructurada, tal como se determina a través de la mínima simple grande de 205 nm. Como conforme incrementa la concentración, el péptido adopta una estructura a-helicoidal tal como es determinado por las dos mínimas en 208 nm y 224 nm (figura 1A). El análisis estructural terciario sugiere que las estructuras de concentración alfa de GLP-1 son conformaciones auto-asociadas (es decir, oligomeros). Los datos tanto de CD UV-cercano como de emisión de fluorescencia soportan esta hipótesis. Las bandas positivas entre 250 - 300 nm en CD UV-cercano (figura 1B) revelan que GLP-1 tiene una procedimiento terciaria definida que incrementa en mayores concentraciones. Más específicamente, estas bandas indican que los residuos aromáticos de péptido son inmovilizadas en gran parte y existe en un ambiente bien definido. En forma similar, la emisión de fluorescencia de GLP-1 en varias concentraciones (pH 4.0, 20°C) mostró que el triptofan de residuo aromático (el cual también despliega bandas intensas en espectros CD UV-cercano) existe en una estructura terciaria bien definida; los datos mostrados resultaron de la excitación de triptofan en 280 nm (figura 1C). La máxima de fluorescencia en 355 nm para bajas concentraciones de GLP-1 indicó que el triptofan está expuesto al solvente y que no existe una estructura terciaria significativa. En las concentraciones de péptido superiores, la máxima disminuyó en intensidad y cambió a una longitud de onda inferior, lo que indica una estructura terciaria más definida. Con el objeto de determinar la estructura secundaria subyacente de la conformación auto-asociada de GLP-1, se llevó a cabo análisis FTIR en varias concentraciones (pH 4.0, 20°C). La banda de amida 1 en 1656 cm"1 indica claramente que GLP-1 tiene una estructura a-helicoidal en concentraciones de > 2 mg/ml (figura ID). Por consiguiente, GLP-1 no forma estructuras de hoja-ß; más bien es probable que el péptido genere un manojo de hélices en altas concentraciones. Además, se mostró en forma experimental que estas diversas estructuras de GLP-1 no fueron generadas a través de un manejo de muestras. Las diluciones de una solución de reserva concentradas comparadas con GLP-1 preparadas mediante disolución directa del péptido en un amortiguador, generaron espectros CD UV-distante, CD UV-cercano, y de emisión de fluorescencia similares. Efecto de Resistencia Iónica en GLP-1 También se llevaron a cabo estudios para determinar el efecto de fuerza iónica en el péptido GLP-1. Figura 2A (far-UV-CD) ilustra que el incremento de la concentración de sal (de 100 mM a 1000 mM) convierte la estructura no ordenada de GLP-1 en una conformación a-helicoidal, tal como lo revelan las mínimas en 208 y 224 nm. Al momento de elevar la concentración NaCI a 1M, gran parte del péptido (1.0 mg/ml) se precipita fuera de la solución (figura 2A). Sin embargo, este tipo precipitado mostró disolverse al momento de la dilución con agua, estableciendo de esta forma que en una resistencia iónica alta GLP-1 puede ser precipitado en forma reversible. La sal también mostró generar y mejorar la estructura terciaria de GLP-1. Esto se ejemplifica en la figura 2B (CD UV-cercano) en donde 1.0 mg/ml GLP-1 no despliega señal en la ausencia de sal, pero exhibe una estructura terciaria clara que se intensifica con la fuerza iónica en incremento. Estos resultados se confirmaron con la emisión de fluorescencia de 1.0 mg/ml GLP-1 (figura 2C) en diversas concentraciones NaCI (pH 4.0, 200C) después de la excitación de triptofan en 280 nm. El incrementar la fuerza iónica originó que la máxima de fluorescencia cambiará a longitudes de onda inferiores, lo que indica que la estructura terciaria de 1.0 mg/ml GLP-1 es tanto generada como mejorada. Además, el análisis estructural terciario de 10 mg/ml GLP-1 en diversas fuerzas iónicas (pH 4.0, 20°C) utilizando espectros CD UV-cercano, demostró que la conformación auto-asociada de GLP-1 también se mejora con la fuerza iónica incrementada (figura 2D). Por consiguiente los datos sugieren que la fuerza iónica tiene un efecto dramático en la estructura de GLP-1, originando que la proteína tanto asuma una conformación a-helicoidal como se asocie en los oligómeros. Además, al incrementar la fuerza iónica en la solución se origina que incremente la oligomerización de GLP-1 hasta que se precipita en forma reversible. Este surgimiento es evidente en bajas concentraciones de péptido, en donde inicialmente no existe estructura terciaria, así como con altas concentraciones del péptido que ya muestran una estructura secundaria y terciaria sustancial. Por lo tanto, la fuerza iónica incrementada convierte fácilmente el GLP-1 no estructurado en las conformaciones a-helicoidales y auto-asociadas. Además, los resultados espectroscópicos observados con comparables con los efectos de la concentración de péptido incrementada mostrada previamente. Efecto de temperatura y pH de GLP-1 También se llevaron a cabo estudios para determinar si la conformación auto-asociada de GLP-1 es sensible a cambios en cualquier temperatura o pH. La figura 3A (CD UV-cercano) demuestra que la estructura terciaria de 10 mg/ml GLP-1 se disocia significativamente conforme incrementa la temperatura. Por otra parte, la temperatura no tiene efecto en bajas concentraciones (0.05 mg/ml) de GLP-1 a varias temperaturas y en un pH de 4.0; ver figura 3B y 3C (distante-U V-CD). El CD UV-distante ilustra que el péptido es insensible a la temperatura. Por consiguiente, el movimiento molecular incrementado obstaculiza en forma significativa la auto-asociación en GLP-1. De manera inversa, la figura 4A (CD UV-distante) demuestra que la solubilidad de la conformación GLP-1 a-helicoidal es sensible al pH. Aunque la estructura de 10 mg/mL GLP-1 es relativamente uniforme (por ejemplo GLP-1 permanece helicoidal) de un pH de 4.4 y menor, ocurre cierta precipitación cuando el pH se eleva cerca de o a neutral (entre pH 6.3 y 7.6) y se genera un espectro no ordenado. Las muestras cuando ocurrió la precipitación tiene menor intensidad como resultado de que está presente en la solución en GLP-1 menos soluble. Esta estructura no ordenada se determina a través de la mínima simple observada en 208 nm en la figura 4A (CD UV-distante), lo cual también se ilustra en forma adicional en la figura 4B (CD UV-cercano) y resultados similares de una disminución de GLP-1 en la solución después de la precipitación. Esta precipitación puede ocurrir cuando el pH se eleve arriba de pl de 5.5 para GLP-1. Sin embargo conforme se elevó el pH de casi neutral a 11.7, se volvió a disolver la mayor parte del precipitado, indicando que la precipitación es reversible. El precipitado no disuelto restante de GLP-1 en un pH de 11.7 puede originar que la cantidad de péptido en la solución disminuya y por lo tanto reduzca la intensidad del espectro (CD UV-distante) tal como se observa en la figura 4A. También se observó que GLP-1 es extremadamente insoluble cuando se mezcla polvo GLP-1 liofilizado con un amortiguador de pH 9 a una alta concentración de GLP-1. Estabilidad de GLP-1 La estabilidad del pH de GLP-1 se revisó determinando su resistencia a desamidación y oxidación además de los efectos de agitación y ciclos de congelación-descongelación. Se incubó GLP-1 (mg/mL) en pH 10.5, durante 5 días a una temperatura de 40°C después de lo cual se llevaron a cabo el HPLC de fase inversa y la espectroscopia de masa de electrorrocío (MS) para análisis de desamidación y oxidación. También se llevaron a cabo estudios de oxidación en muestras GLP-1 (1 mg/mL) incubada durante 2 horas en la presencia de 0.1 % H202 utilizando tanto HPLC como MS.
La figura 5 ilustra la estabilidad de GLP-1 bajo condiciones de desamidación y oxidación. Los cromatogramas GLP-1 ilustran que GLP-1 se eluye en el mismo tiempo de retención y que no resultan picos de degradación para las condiciones de desestabilización analizadas. Además, los análisis MS produjeron una masa similar para todas las muestras, 3297 g/mol lo que indica que la masa no se altera. Los datos también ilustran que el péptido permanece puro e intacto cuando se incuba bajo diversas condiciones. Por lo tanto, no se observó la desamidación de GLP-1. GLP-1 también se mostró como estable a tensión oxidativa tal como se observa en la presencia de 0.1% H202, en donde la pureza y masa de GLP-1 permaneció intacta, tal como se determina mediante GLP-1 y MS, respectivamente. En general, no hubo cambios en los tiempos de retención en los valores de masa y no resultaron picos de degradación, demostrando de esta forma que el péptido de GLP-1 es resistente tanto a desamidación y oxidación. Los efectos de aplicación y ciclos de congelación-descongelación consecutivos en varias concentraciones de GLP-1 fueron analizados con CD-UV-cercano y fluorescencia intrínseca. La agitación de 9.4 y 1.5 mg/mL GLP-1 no produjo alteraciones significativas en el péptido tal como se observa mediante CD-UV-cercano (figura 6A), y emisión de fluorescencia (figura 6B). Las muestras fueron agitadas durante y 90 minutos a temperatura ambiente y se recolectaron los espectros de emisión de fluorescencia después de la excitación de triptófano en 280 nm. En estudios independientes de congelación-descongelación, las soluciones que contienen GLP-1 (pH 4.0) en 1.6, 5.1 y 8.4 mg/ml fueron congeladas a una temperatura de -20°C y descongeladas a temperatura ambiente. El efecto de los 10 tipos de congelación-descongelación en GLP-1, fue llevado a cabo y analizado mediante CD-UV-cercano (figura 7A) y emisión de fluorescencia (figura 7B). Los espectros de emisión de fluorescencia se recolectaron después de la excitación de triptófano en 280 nm. Ambos análisis mostraron que la estructura terciaria del péptido no cambia notablemente debido a los múltiples ciclos de congelación-descongelación. En experimentos similares, el efecto de los 11 ciclos de congelación-descongelación en la estructura secundaria de 10 mg/mL GLP-1 (pH 4.0) fue analizado (figura 7C). El CD UV-distante ilustra que la estructura secundaria del péptido no cambia en forma significativa como un resultado de los múltiples ciclos de congelación-descongelación. En general, los análisis biofísicos obtenidos de los experimentos anteriores mostraron que la estructura del péptido GLP-1 está influenciada fuertemente por su concentración en solución. Conforme incrementó la concentración de GLP-1, se volvieron más prominente las estructuras a-helicoidales. Además, el incremento de la fuerza iónica mejoró, y en algunos casos generó, las estructuras GLP-1 terciarias. Ejemplo 2 Estudios de Absorción GLP-1/FDKP La interacción de GLP-1 con partículas dicetopiperazina (DKP) en la suspensión se evaluó llevando a cabo estudios de absorción. Las variables en estudios de absorción exploró los efectos de electrostáticas, enlace de hidrógeno, estructura de agua, flexibilidad de proteína e interacciones específicas de emparejamiento-sal en la interacción GLP-1/DKP. Además, se probaron estabilizadores de proteína común para interferencia con la absorción GLP-1 a superficies DKP. Utilizando las partículas de suspensión DKP formadas previamente (por ejemplo FDKP), se estudiaron las condiciones en donde GLP-1 absorbe a las superficies de las partículas DKP preformadas. Una suspensión de partícula FDKP en la cual se preformaron las partículas FDKP, se combinó con el amortiguador 3X pH y la solución 3X de un aditivo o excipiente. La solución final contenía una concentración de FDKP de 5 mg/ml y una concentración de GLP-1 de 0.25 mg/ml (5% p/p). El GLP-1 no enlazado en el sobrenadante fue filtrado de la suspensión. Las partículas FDKP con la proteína GLP-1 asociada fueron disueltas (reconstituidas) con 100 mM de bicarbonato de amonio y filtradas para separar cualquier proteína GLP-1 agregada. La cantidad de GLP-1 tanto en el sobrenadante como en las fracciones reconstituidas fue cuantificado mediante HPLC. Se llevaron a cabo una serie de experimentos en los cuales las condiciones empleadas incluyeron el uso de aditivos tales como sales, tensoactivos, iones, osmolitos, caotropos, orgánicos y varias concentraciones de GLP-1. Los resultados de estos estudios se describen más adelante. Estudios de sal - El efecto de la sal en el enlace de GLP-1 a partículas FDKP se observó mediante análisis HPLC. La carga de las partículas GLP-1/FDKP se llevó a cabo en 5 mg/mL FDKP y 0.25 mg/mL GLP-1 en la presencia de 0, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 y 1500 mM NaCI (figura 8A). La cantidad de GLP-1 detectada en las muestras de control libres de FDKP reconstituidas como una función de pH y concentración de NaCI también fue evaluada (figura 8B). El pH en ambos grupos de datos fue controlado con una mezcla de 20 mM fosfato/20 mM acetato . Tal como se observa en la figura 8A, el enlace óptimo (absorción) de GLP-1 a partículas FDKP fue influenciado fuertemente por el pH de la suspensión. En un pH de 4 y superior, se observaron aproximadamente del 3.2% al 4% de enlace de GLP-1 a partículas FDKP, en donde la proporción GLP-1/FDKP en la solución fue de 5% p/p. No fue evidente una absorción esencial de GLP-1 a partículas FDKP en un pH 2.0 en la presencia de 0 y 25 mM NaCI, aunque se observó cierta carga aparente con una fuerza iónica incrementada. Se observó la precipitación GLP-1 en los controles libres de FDKP con >1M NaCI, figura 8B. Esta carga aparente en =1M NaCI es el resultado de la precipitación reversible (extracción de sal) del péptido GLP-1 en una fuerza iónica superior. Los controles con alto nivel de sal de GLP-1 libre de partículas FDKP, también exhibieron altos niveles de GLP-1 en las muestras reconstituidas, lo que indica que GLP-1 ha quedado atrapado en los filtros cuando el sobrenadante ha sido recolectado. Debajo de 1 M NaCI, no hubo evidencia de precipitación GLP-1 en la ausencia de partículas FDKP. Estudios de tensoactivo - El efecto de los tensoactivos en el enlace de GLP-1 a partículas FDKP fue observado mediante análisis HPLC. La carga se llevó a cabo en 5 mg/ml FDKP y 0.25 mg/mL GLP-1 en la presencia de un tensoactivo (figura 9A). La cantidad de GLP-1 detectada en las muestras de control libres de FDKP reconstituido como una función de pH y la concentración de tensoactivo también fueron evaluados (figura 9B). El pH y las condiciones de la muestra de control fueron como se describe para el estudio de fuerza iónica anterior. Los tensoactivos empleados en este estudio incluyeron: Brij 78 en 0.09 mM, Tween 80 en 0.01 mM, Tritón X en 0.2 mM, Pluronic F68 en 0.12 mM, H(CH2)7S04Na en 0.9 mM, CHAPS en 0.9 mM, Cetrimide a 0.9 mM. Las curvas de carga para GLP-1 en la presencia de cada tensoactivo se muestran para GLP-1/FDKP como una función de pH.
Los datos muestran que las curvas de absorción-pH para partículas GLP-1/FDKP no fueron influenciadas por la presencia de tensoactivos cerca de su concentración de micelas críticas (CMC) - esto es, el rango pequeño de concentraciones que separan el límite debajo del cual virtualmente no se detectan agregados/micelas y el límite anterior en el cual virtualmente todas las moléculas de tensoactívo adicionales forman agregados. Por consiguiente, se sugiere además que cualquiera de estos tensoactivos pueda ser utilizado para optimizar la estabilidad y/o farmacocinéticas (PK) tal como se describe más adelante. Tal como se demuestra anteriormente para el estudio de sal, la interacción de GLP-1 con partículas FDKP fue influenciada por el pH de la suspensión. Estudios de ión. Por este experimento, se corrieron dos diferentes estudios de ión para determinar el efecto de los iones en el enlace de GLP-1 a partículas FDKP. En ambos estudios, CI" fue el contraión para los cationes y Na+ fue el contraión para los aniones. La carga de las partículas GLP-1/FDKP se llevó a cabo tal como se describe para los experimentos anteriores. El pH fue controlado como se describe supra. Las muestras se prepararon con amortiguador pH ya sea con pH de 3.0, 3.5, 4.0, o 5.0 en la presencia y ausencia de de NaCI (el cual se utilizó para evaluar de mejor manera los casos de fuerza iónica de alto nivel). Se incluyeron iones adicionales en muestras individuales tal como se indica a continuación: LiCi en 20 ó 250 nM, NaH4CI en 20 ó 250 mM, NaF en 20 ó 250 mM y NaCH3COO en 20 ó 250 mM. Los datos del primer estudio de iones, tal como se ilustra en la figura 10A, muestran las curvas de carga para GLP-1/FDKP, como una función del pH y iones. En la ausencia de NaCI, el fluoruro de una concentración ya sea de 20 ó 250 mM influenció fuertemente (mejoró) la absorción en un pH bajo con el NaF en una concentración de 250 mM que exhibe un máximo enlace sin importar el pH. Este patrón fue observado debido al fluoruro en la solución, no al sodio, debido a que el bicarbonato de sodio no tiene los mismos efectos en 20 y 250 mM. Además estos efectos no fueron un resultado de sodio en la muestra debido a que la sal en una concentración similar, tal como se muestra en la figura 8, no mostró este efecto. En la presencia de 1M NaCI, todos los iones produjeron una carga "aparente" de alto nivel. La carga "aparente" para las muestras 1M NaCI resultó de la extracción de sal del péptido GLP-1 de la solución en la presencia de una fuerza iónica de alto nivel. Esto se ilustra en forma adicional en la figura 10B, la cual muestra que GLP-1 está presente en las muestras de control libres de FDKP reconstituidas que contienen 1M NaCI. La cantidad de GLP-1 detectada para estas muestras de control incrementó para concentraciones de ión mayores, debido a que se agregaron a la fuerza iónica total en las muestras. En el segundo experimento de iones (figura 10C), las muestras GLP-1/FDKP fueron preparadas en la presencia de KCI en 20 ó 250 mM, imidazole en 20 ó 250 mM, Nal en 20 ó 250 mM, o NaP04 en 20 ó 250 mM. Los datos muestran que en 250 mM de imidazole se disminuyó la carga en la presencia de 1M NaCI y tanto 250 mM fosfato como 250 mM produjeron una carga "aparente" de alto nivel (figura 10C). Con base en la cantidad de GLP-1 detectada en las muestras de control libres de FDKP reconstituidas en concentraciones de 0M y 1M NaCI (figura 10D). Estos efectos resultaron de la influencia de los iones en el propio péptido GLP-1 y no en interacción del péptido con las partículas FDKP. El fosfato de sodio y el yoduro de sodio originaron cierta extracción de sal de GLP-1 en la ausencia de NaCI. Además, el imidazole ayudó a solubilizar el GLP-1 en las muestras 1M NaCI y de esta forma proporcionó una menor carga "aparente". También se observó precipitación en los controles 0M NaCI con 250 mM de fosfato y yoduro. Estudios de osmolito. El efecto de osmolitos en el enlace de GLP-1 a partículas FDKP también fue observado medíante análisis HPLC. La figura 11A muestra las curvas de carga para GLP-1/FDKP como una función del pH en la presencia de estabilizadores comunes (osmolitos). La carga de las partículas GLP-1/FDKP se llevó a cabo tal como se describe para el experimento previo. En forma similar, el pH fue controlado como se describe supra. Las muestras se prepararon en pH 3.0 y en la presencia de 20, 50, 100, 150, 200 ó 300 mM de osmolito (estabilizador). Los osmolitos fueron hexileno-glicol (Hex-Gly), trehalosa, glicina, PEG, TMAO, manitol o prolina; N/A indica que no hay osmolito. En un experimento similar, la concentración de osmolito (estabilizador) en las muestras se mantuvo constante en 100 mM y el pH varió de 2.0 a 4.0. Ninguno de los osmolitos (estabilizadores) estudiados tuvieron un impacto dramático en la absorción de GLP-1 a superficies FDKP, ya sea cuando el pH se mantuvo en pH 3.0 y las concentraciones de los osmolitos se variaron (figura 11A; curva de lado izquierdo) o cuando la concentración de osmolito se mantuvo constante en 100 mM y el pH fue variado (figura 11A; curvas de lado derecho). No se detectó precipitación de GLP-1 en las muestras de control libres de FDKP reconstituidas (figura 11B). Estos osmolitos se pueden utilizar para optimizar la estabilidad y/o farmacocinéticas. Estudios de caotropo y liotropo. Las especies iónicas que afectan la estructura del agua y proteínas (caotropos y liotropos) fueron oxidadas para determinar el papel que juegan estos factores en la absorción de GLP-1 a FDKP. La carga de las partículas GLP-1/FDKP se formó como se describe en los experimentos previos. En forma similar, el pH fue controlado como se describe supra. Las muestras se prepararon en un pH de 3.0 y en la presencia de 0, 20, 50, 100, 150, 200 ó 300 nM de los siguientes caotropos o liotropos: NaSCN, CsCI, Na2S04, (CH3)3N-HCI, Na2N03, Na citrato y NaCI04. En un experimento similar, la concentración del caotropo o liotropo en las muestras se mantuvo constante en 100 mM y el pH varió de 2.0 a 4.0. La figura 12A muestra las curvas de carga para GLP-1/FDKP como una función del pH y caotropo y/o liotropo. En un pH bajo (=3) ocurrieron variaciones significativas en la carga para los diferentes caotropos analizados, especialmente en mayores concentraciones de caotropo. Sin embargo en un pH de 4, esta variación no fue observada (figura 12C). Por lo tanto, estos agentes parecen promover el enlace de GLP-1 a las partículas FDKP en un pH inferior no favorable, aunque tienen poco impacto en condiciones de pH superiores que son favorables para enlace. Los datos de las muestras de control libres de FDKP reconstituidas, sugieren que las variaciones de carga observadas en pH 3.0 se deben en parte a que los caotropos específicos afectan la extracción de sal (precipitación) del péptido GLP-1 en diversos grados (figura 12B y 12D). Esto se observó para los caotropos fuertes tales como NaSCn y NaCI04. Estudios orgánicos. Los alcoholes conocidos por inducir la conformación helicoidal en péptidos no estructurados incrementando la fuerza de enlace-hidrógeno fueron evaluados para determinar el papel que juega la confirmación helicoidal en la absorción GLP-1 a FDKP. La carga de las partículas GLP-1/FDKP se llevó a cabo como se describe en los experimentos previos. En forma similar, el pH fue controlado como se describe supra. Los efectos de cada alcohol fueron observados en pH 2.0, 3.0, 4.0 y 5.0. Los alcoholes utilizados fueron: (MeOH), etanol (EtOH), trifluorometanol (TF E ) , o hexafluoroisopropanol (HFIP). Cada alcohol fue evaluado en una concentración de 5%, 10%, 15% y 20% v/v. La figura 13A muestra las curvas de carga para GLP-1/FDKP como una función de pH para cada alcohol en cada concentración. El pH 3.0, la baja concentración de HFIP (5%) dio como resultado una absorción mayor, tal como se demuestra a través de la proporción de masa de partículas GLP-1 a FDKP. Unicamente el alcohol con fuerza de enlace-H más fuerte (formación de hélice), HFIP, tuvo efecto en las suspensiones amortiguadas. En concentraciones superiores de HFIP (20%), se inhibió la absorción GLP-1/FDKP. La figura 13B muestra que la concentración de alcohol al 20%, no demostró una precipitación significativa de GLP-1 en las muestras de control libres de FDKP reconstituidas. Esto sugiere que la flexibilidad de conformación de un fármaco (por ejemplo, entropía y el número de contactos FDKP que se pueden formar) puede jugar un papel importante en la absorción. Los datos sugieren que el enlace-H puede jugar un papel importante en la interacción GLP-1 con superficies FDKP bajo las condiciones anteriores. Con base en los datos, se especula además que si el enlace-H sirvió como un dominante y una fuerza general en las interacciones FDKP-GLP-1, se pueden esperar más efectos y más fuertes. Estudios de concentración. - La absorción de las superficies de las partículas GLP-1 a FDKP en diversas concentraciones de GLP-1 fue investigada. La figura 14A muestra las curvas de carga de GLP-1 como una función de la concentración GLP-1 en varios pHs. Las concentraciones GLP-1 estuvieron en 0.15, 0.25, 0.4, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 5.0, o 10 mg/mL. El pH de las muestras estuvo en 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 ó 5.0. Se observó el incremento en la carga de GLP-1 en partículas FDKP cuando la concentración FDKP se mantuvo constante en 5 mg/mL y se incrementó la concentración GLP-1. Casi el 20% de la absorción GLP-1 en partículas FDKP fue observado cuando la concentración de GLP-1 fue de 10 mg/mL en pH 4. Sorprendentemente, no se observó saturación de absorción de la carga GLP-1 en partículas FDKP en concentraciones mayores de GLP-1. Esta observación es atribuible probablemente a la propia asociación de GLP-1 en una capa múltiple. El análisis de la morfología de las formulaciones GLP- 1/FDKP, mediante miscroscopía de exploración de electrones (SEM) muestra que las partículas GLP-1/FDKP están presentes como estructuras cristalinas o tipo placa que pueden formar agregados que comprenden más de una partícula GLP-1/FDKP (figura 14B). Estas formulaciones se prepararon utilizando una solución que contiene: (Panel A) 0.5 mg/mL GLP-1 y 2.5 mg/mL FDKP; (Panel B) 0.5 mg/mL GLP-1 y 10 mg/mL FDKP; (Panel C) 0.5 mg/mL GLP-1 y 10 mg/mL FDKP en 20 mM de cloruro de sodio, 20 mM de acetato de potasio 20 mM de fosfato de potasio; pH 4.0; y (Panel D) 10 mg/mL GLP-1 y 50 mg/mL FDKP en 20 mM de cloruro de sodio, 20 mM de acetato de potasio y 20 mM de fosfato de potasio en pH 4.0. Resumen de resultados En general, los estudios de absorción en la interacción de GLP-1 con partículas FDKP demostró que GLP-1 enlaza a las superficies de partícula DKP en la forma dependiente de pH con alta absorción en un pH de 4 o superior. La absorción de las superficies de partículas GLP-1 a DKP se descubrió como la más fuertemente afectada por el pH, esencialmente sin absorción en un pH de 2.0 e interacción substancial en un pH de > 4.0. Tal como se observa, los iones de sodio y fluoruro mejoraron la absorción en un pH bajo. Otros aditivos tales como tensoactivos, y estabilizadores comunes que tienen únicamente efecto ligero en la absorción de GLP-1 a superficies de partículas FDKP. Además, las propiedades de propio GLP-1 influenciado en los resultados de estos experimentos. Se encontró el comportamiento de GLP-1 como atípico y sorprendente en cuanto a que no hubo saturación de absorción observada, lo cual se atribuyó a la autoasociación de GLP-1 en altas concentraciones. La autoasociación de GLP-1 en altas concentraciones, permite el recubrimiento posible de partículas GLP-1 con múltiples capas de péptido GLP-1, promoviendo de esta forma una carga de porcentaje superior de péptido GLP-1. Esta calidad de autoasociación sorprendente prueba ser benéfica en la preparación de formas de administración GLP-1 estables. Además, la conformación autoasociada de GLP-1 puede tener la capacidad de hacer más lento o recargar su degradación en la sangre. Sin embargo, se observa que se debe tener cuidado cuando se trabaje con GLP-1 asociado, ya que es sensible a la temperatura y al pH alto. Ejemplo 3 Análisis de Integridad de Formulaciones GLP-1/FDKP Con base en los resultados de los experimentos en los ejemplos 1 y 2, se seleccionó una serie de formulaciones GLP-1 que tiene las características descritas en la tabla 1 para el ensayo de viabilidad celular que se describe en la presente invención. La mayoría de las formulaciones contuvieron excipientes GRAS ("generalmente reconocidos como seguros"), aunque algunos fueron seleccionados para permitir que se estudiara la relación entre estabilidad y absorción.
Tabla 1. Formulaciones GLP-1/FDKP seleccionadas Análisis de fase de Integridad Cantidad Sin Modificador pH 3.0 pH (mM) amortiguador 4.0 pH 5.0 Ninguna X X X X NaCI 1000 X X NaCI 20 X Tween 80 0.01% X HepSulf 0.90% X Brij 78 0.09% X F- 250 X F- 20 X X L¡+ 20 X X X Fosfato 250 X X Fosfato 20 X X X !midazol 250 X Manitol 20 X Glicina 20 X Me3N»HCI 50 X Citrato 50 X Am2S04 50 X CI04 50 X EtOH 20% X TFE 20% X Además, con base en los resultados obtenidos en los ejemplos 1 y 2, también se seleccionaron una serie de formulaciones para los estudios de integridad fase II de GLP- 1/FDKP. La tabla 2 que se encuentra más adelante muestra las seis formulaciones GLP-1 elegidas para la integridad de fase II. Después de que se prepararon los polvos, se combinaron con FDKP en blanco para producir masas similares tanto del péptido GLP-1 como de FDKP en cada formulación. Tabla 2. Formulaciones GLP-1/FDKP elegidas para la integridad de fase II. La formulación elaborada de 10 mg/mL GLP-1 en 20 mM NaCI y amortiguador pH 4.0, se describe como la formulación asociada por sal.
El efecto de la tensión en las formulaciones GLP-1/FDKP en la tabla 2 fue analizado mediante HPLC (figura 15). Las muestras que contienen 5%, 10% ó 20% GLP-1 /FDKP se cargaron en H20; o 5% o 10% GLP-1/FDKP se cargaron en NaCI + amortiguador pH 4.0 y se incubaron durante 10 días a una temperatura de 40°C. Los cromatogramas HPLC demuestran que el péptido GLP-1 se eluye en el mismo tiempo de retención y que no se encuentran tipos de degradación. Además, los análisis MS produjeron una masa similar para todas las muestras 3297 g/mol, indicando que la masa es uniforme para todas las muestras analizadas. Los datos muestran la proporción masa a masa de las partículas GLP-1 a FDKP y los otros componentes que estuvieron presentes en la solución, antes de la liofilización . En general, las formulaciones GLP- 1/FDKP mostraron ser estables a la tensión. Ejemplo 4 Estabilidad de GLP-1 Incubado en Fluido de Lavado de Pulmón La estabilidad de GLP-1 en fluidos biológicos tal como fluido y sangre de pulmón, se analizó determinando que la dipeptidil-peptidasa IV (DPP-IV), encontrada en fluidos biológicos, disocia y desactiva GLP-1.
La dipeptidil-peptidasa IV (DPP-IV) es una proteasa de serina enlazada por membrana extracelular expresada en la superficie de varios tipos celulares en células CD4+ T particulares. DPP-IV también se encuentra en sangre y fluidos de pulmón. DPP-IV está implicada en el control del metabolismo de glucosa debido a que sus substratos incluyen la hormona insulinotrópica GLP-1, la cual es desactivada por la eliminación de sus dos aminoácidos N-terminal; ver figura 16A. DPP-IV disocia el enlace de Ala-Glu de la forma de circulación mayor de GLP-1 humana (GLP-1 (7-36)) que libera los dos residuos N-terminales. DPP-IV ejerce una regulación negativa del desecho de glucosa, degradando GLP-1 que disminuye de esta forma el efecto de incretina en células ß de páncreas. Se llevaron a cabo estudios para determinar la inhibición de la degradación GLP-1 en sangre y fluido de pulmón de ratas en la presencia de aprotinina o inhibidor DPP-IV. La aprotinina, un inhibidor de proteasa de serina que ocurre naturalmente, la cual es conocida en la técnica por inhibir la degradación de proteína, se agregó a las muestras posteriormente a la recolección en 1, 2, 3, 4 y 5 TIU/ml. Posteriormente la actividad DPP-IV se midió detectando la disociación de un substrato luminiscente que contiene la secuencia Gly-Pro reconocida por DPP-IV. Se incubó fluido de la base de pulmón bronquial con substrato proluminiscente durante 30 minutos y el producto de disociación se detectó mediante luminiscencia.
Los datos mostraron un incremento en la inhibición de la actividad DPP-IV, tal como se detecta a través de inhibición de la degradación de péptido en varios fluidos biológicos (tal como se describe en la presente invención) con la concentración de aprotinina en incremento (figura 16B). Se observaron resultados similares con el inhibidor DPP-IV agregado a las muestras en forma posteriormente a la recolección 1.25, 2.5, 5, 10 y 20 pg/ml (figura 16C). La adición de inhibidores posterior a la recolección de muestras, permitió una evaluación más precisa de las mismas. La estabilidad de GLP-1 también fue revisada en el fluido de la base de pulmón utilizando una captura ELISA mAb que reconoce los aminoácidos GLP-1 7-9. GLP-1 se incubó en el fluido de lavado de pulmón (LLF) durante 2, 5, 20 y 30 minutos. Las condiciones de incubación fueron: 1 ó 10 pg /p/p) de LLF y 1 o 10 pg (p/p) como se ilustra en la figura 17. No se detectó GLP-1 en LLF solo. Con la combinación de LLF y GLP-1 en diversas concentraciones hubo una alta detección de GLP-1 en comparación con el GLP-1 solo, lo que indica que GLP-1 es estable, con el tiempo, en el fluido de lavado de pulmón (figura 17). La estabilidad de GLP-1 en fluido de lavado de pulmón no diluido se confirmó en estudios similares; en 20 minutos, se observó la integridad 70-72% (datos no mostrados). Además, la estabilidad de GLP-1 en plasma de rata fue revisado. El plasma se obtuvo de varias ratas (tal como se indica a través del plasma 1 y plasma 2 en la leyenda de las figuras) y se diluyó 1:2 ó 1:10 (v/v). Se agregó un microgramo de GLP-1 a 10 µ? de plasma o PBS. Las muestras se incubaron a una temperatura de 37°C durante 5, 10, 30 ó 40 minutos. La reacción se detuvo en hielo, y se agregó 0.1U de la aprotinina. Los datos muestran una alta concentración de GLP-1 en diluciones en plasma 1:2 y 1:10 en todos los puntos de tiempo probados (figuras 18A y 18B). En general, los datos indican que GLP-1 es sorprendentemente estable tanto en fluido de lavado de pulmón como en plasma, en donde se encuentra la proteasa de serina DPP-IV. Ejemplo 5 Efecto de las moléculas GLP-1 en Apoptosis y Proliferación Celular Para revisar si GLP-1 inhibe la apoptosis, se llevó a cabo un ensayo de clasificación para determinar el efecto de GLP-1 en la inhibición de muerte de célula-ß. Las células epiteliales pancreáticas de rata (ARIP) utilizadas como un modelo de célula-ß pancreática; compradas en ATCC, Manassas, VA) fueron tratadas previamente con GLP-1 en una concentración de 0, 2, 5, 10, 15 ó 20 nM durante 10 minutos. Posteriormente las células se dejaron sin tratar o se trataron con 5 µ? de estaurosporina (un inductor de apoptosis) durante 4.5 horas. Se evaluó la viabilidad celular utilizando Cell Titer-Glo™ (Promega, Madison, Wl). Una disminución en el porcentaje de muerte celular fue observada con un incremento en la concentración GLP-1 de hasta 10 nM en las células tratadas de estaurosporina (figuras 19A). La revisión adicional del efecto de GLP-1 en la apoptosis se determinó mediante análisis FACS utilizando manchado de anexina V. El manchado de anexina V es una herramienta útil para detectar células apoptóticas y es bien conocida para los expertos en la técnica. El enlace de anexina V a la membrana celular, permite el análisis de cambios en la asimetría de fosfolípidos (PS) antes de los cambios morfológicos asociados con la apoptosis ocurrida y antes de que se pierda la integridad de la membrana. Por lo tanto, el efecto de GLP-1 en la apoptosis fue determinado en células tratadas con 15 nM GLP-1, 1 µ? de estaurosporina durante 4 horas, 1 µ? de estaurosporina + 15 mM GLP-1 o ni estaurosporina ni GLP-1 (control experimental). Los datos muestran que GLP-1 inhibió la apoptosis inducida por estaurosporina en aproximadamente 40% (figura 19B). Se observaron resultados de inhibición de apoptosis similares utilizando un análogo GLP-1, exendina-4, que enlaza al receptor GLP-1 en una forma similar a GLP-1. Las células ARIP se trataron con estaurosporina 5 µ? en la presencia de 0, 10, 20 ó 40 nM de exendina durante 16, 24, o 48 horas respectivamente. Los datos (figura 20) muestran que en 10 nM, la exendina fue completamente inefectiva para inhibir la apoptosis, ya que hubo el 100% de muerte celular. En 20 y 40 nM la exendina inhibió la apoptosis hasta cierto grado con aproximadamente 50% de inhibición en 48 horas en la presencia de 40 nM de exendina-4. Ejemplo 6 Efecto de Formulaciones GLP-1/FDKP Candidatas en Muerte Celular Se llevaron a cabo ensayos a base de células para evaluar la capacidad de las formulaciones GLP-1/FDKP (tal como se describe en el ejemplo 3, tabla 1 anterior) para inhibir la muerte celular. Estas formulaciones de partículas GLP-1/FDKP estuvieron ya sea en una suspensión o fueron liofilizadas. Las formulaciones se analizaron con respecto a su capacidad para inhibir la muerte celular inducida por estaurosporina en células ARIP. Las células ARIP tratadas previamente por muestras GLP-1 se expusieron a 5 µ? de estaurosporina durante 4 horas y se analizaron con Cell Titer-Glo™ (Promega, Madison, Wl) para determinar la viabilidad celular. Las muestras de las diversas formulaciones GLP-1/FDKP se dejaron ya sea sin tensión o se tensionaron a una temperatura de 4o o 40°C durante 4 semanas. Cada muestra GLP-1/FDKP se utilizó en 45 nM en un ensayo a base de células para determinar su capacidad para inhibir muerte celular inducida por estaurosporina. Las muestras de control, mostradas en el lado derecho, ¡lustran la viabilidad de las células en el medio solo, con GLP-1 solo, con estaurosporina sola, o en la presencia tanto de GLP-1 como estaurosporina (nota: la leyenda de la gráfica no aplica a las muestras de control). Cada barra representa un triplicado separado). Todos los resultados mostrados son promedios de corridas por triplicado. Los datos muestran que todas las formulaciones liofilizadas GLP-1/FDKP tensionadas inhibieron la muerte celular inducida por estaurosporina (figura 21). Sin embargo, la muerte celular no fue inhibida a través de muchas de las formulaciones de suspensión GLP-1/FDKP. Ejemplo 7 Insuflación Pulmonar de Partículas GLP-1/FDKP Para revisar las farmacocinéticas de GLP-1/FDKP, se evaluaron concentraciones en plasma de GLP-1 en ratas Sprague Dawley hembra a las que se les administraron diversas formulaciones de GLP-1/FDKP mediante inyecciones intravenosas o insuflación pulmonar. En los estudios preliminares, GLP-1 en aproximadamente 4% y 16% (p/p) de las formulaciones de partículas GLP-1/FDKP, fueron los utilizados. Las ratas se aleatorizaron en 12 grupos con los grupos 1, 4, 7 y recibiendo una solución GLP-1 administrada mediante instilación líquida pulmonar o inyección IV. Los grupos 3, 5, 8 y 11 recibieron una formulación asociada con sal GLP-1/FDKP (tal como se describe en la tabla 2), administrada mediante insuflación pulmonar o inyección IV. Los grupos 3, 6, 9, 12 recibieron la formulación combinada asociada con sal GLP-1/FDKP administrada mediante insuflación pulmonar o inyección IV. La formulación GLP-1/FDKP fue una formulación asociada con sal en aproximadamente 16% de carga. Para lograr una carga aproximada del 4%, la formulación del 16% se combinó con partículas DKP en una mezcla 3:1. La insuflación pulmonar o inyección intravenosa fue de 0.5 ó 2.0 de partículas (16% o 4% de carga GLP-1, respectivamente) para una dosis GLP-1 total de 0.08 mg. En un grupo de animales separados (grupos 7 a 12) se repitió la administración el día 2. Los grupos 1, 4, 7 y 10 se les administraron 80 g de una solución GLP-1. A los grupos 2, 5, 8 y 11 se les administró una formulación asociada con sal GLP-1/FDKP (carga -16% GLP-1). Los grupos 3, 6, 9, 12 recibieron la formulación combinada asociada con sal GLP-1/FDKP (carga -4% GLP-1). El experimento se llevó a cabo dos veces utilizando las mismas formulaciones, con una dosificación y recolección de sangre en dos días consecutivos. Las muestras de sangre se tomaron en el día de la dosificación para cada grupo en una dosis previa (tiempo 0) y en los 2, 5, 10, 20, 30, 60 y 120 minutos posteriores a la dosis. En cada punto de tiempo, se recolectaron aproximadamente 150 pL de sangre total de la vena de la cola lateral en un tubo de crio-frasco que contiene aproximadamente 3 U/mL de aprotinina y 0.3% EDTA, se invirtió y almacenó en hielo. Las muestras de sangre se centrifugaron en 4000 rpm y se midieron en pipeta 40 µ? de plasma en placas de 96 depósitos las cuales se almacenaron a una temperatura de -80°C hasta que se analizaron con respecto a niveles GLP-1 mediante ELISA siguiendo las recomendaciones del fabricante (Lineo Research, St. Charles, MO). Se determinó que las condiciones óptimas eran cuando el amortiguador de ensayo fue GLP-1 en la presencia de suero (5% FBS) solo y sin matriz. Administración intravenosa: Los grupos 5, 6, 10, 11 y 12 recibieron varias formulaciones GLP-1/FDKP y solución GLP-1 en forma intravenosa (IV); (figura 22A). A los grupos 5 y 6 se les administró 15.% GLP-1/FDKP de los grupos 11 y 12 se les administró otra dosis de 15.8% GLP-1/FDKP en un día consecutivo; al grupo 10 se le administró una solución GLP-1 como un control. La concentración de GLP-1/FDKP fue detectada en los puntos de tiempo 0, 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 y 120 minutos. Todos los grupos mostraron un incremento detectable en niveles de plasma GLP-1 después de la administración intravenosa, con concentraciones máximas observadas a los 2 minutos posteriores al tratamiento. Los niveles de plasma de GLP-1 activo regresaron a niveles de fondo en 20 minutos posteriores al tratamiento para todos los grupos. No se observó una diferencia significativa en la cinéticas de estas diversas formulaciones de la solución GLP-1/FDKP y GLP-1 cuando se administró mediante inyección intravenosa. Se observó que los niveles de plasma de GLP-1 regresaron a los niveles de línea de base a los 10-20 minutos posteriores a las dosis en ratas tratadas mediante inyecciones intravenosa lo que sugiere las cinéticas fisiológicas (por ejemplo aproximadamente 95% de GLP-1 se eliminaron a los 10 minutos). Administración mediante insuflación simple: Los grupos 1, 2, 3, 7, 8 y 9 12 recibieron varias formulaciones GLP-1/FDKP o solución GLP-1 mediante insuflación pulmonar (figura 22B). Al grupo 1 se le administraron 80 pg de control GLP-1 mediante instilación líquida pulmonar (LIS); al grupo 2 se le administraron 15.8% GLP-1/FDKP mediante insuflación pulmonar (IS); al grupo 3 se le administraron 3.8% GLP-1/FDKP mediante insuflación pulmonar (IS); al grupo 7 se le administraron 80 pg de un control GLP-1 mediante instilación líquida pulmonar (LIS); al grupo 8 se le administraron 15.8% GLP-1/FDKP mediante insuflación pulmonar (IS); y al grupo 9 se le administraron 3.8% GLP-1/FDKP mediante insuflación pulmonar (IS). La concentración de GLP-1/FDKP se midió en los puntos de tiempo de 0, 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 y 120 minutos. Todos los grupos mostraron un incremento detectable en la concentración de GLP-1 en plasma después de la administración pulmonar. La concentración de plasma máxima de GLP-1 varió con la formulación/composición utilizada. Los grupos 2 y 8 mostraron niveles de plasma máximos de GLP-1 a los 10-20 minutos posteriores al tratamiento tal como se indica mediante el AUC, en tanto que los grupos 3 y 9 mostraron niveles significativos de GLP-1 activo a los 5 a 10 minutos, y los grupos 1 y 7 mostraron un incremento más rápido y temporal en niveles de plasma de GLP-1 activo. Los niveles de plasma de GLP-1 regresaron a los niveles de fondo a los 60 minutos posteriores al tratamiento en los grupos 2, 3, 7 y 8, en tanto que los grupos 1 y 7 alcanzaron los niveles de fondo a los 20 minutos posteriores al tratamiento. Ocho GLP-1 nanomolares parecen ser eficaces en un modelo de rata diabética; la dosis GLP-1 fue de 80 pg (3000 veces más que la dosis eficaz reportada); los niveles GLP-1 en plasma fueron 10 veces mayores con el suministro pulmonar de sus 3 horas de infusión (Chelikani y asociados, 2005) a los 30 minutos posteriores a la dosis; y la biodisponibilidad de GLP-1/FDKP suministrado mediante insuflación pulmonar fue de 71%. Estos resultados se reportan en forma adicional en la tabla 4 que se encuentra más adelante. Los niveles de plasma de GLP-1 regresaron a los niveles de línea de base a los 30 a 60 minutos posteriores a la dosis en la mayor parte de las ratas tratadas mediante suministro pulmonar. Todas las ratas mostraron un incremento en concentraciones en plasma de GLP-1 después de. la administración intravenosa o insuflación pulmonar en varias formulaciones GLP-1/FDKP, excepto una rata en el grupo 2. Conclusión: Se observó una diferencia en los perfiles farmacocinéticos de las formulaciones GLP-1/FDKP comparadas con solución GLP-1. Las concentraciones en plasma de GLP-1 fueron más sostenidas en ratas tratadas mediante insuflación pulmonar con formulaciones GLP-1/FDKP relativas a las tratadas con solución GLP-1. Todos los animales mostraron una disminución progresiva en concentraciones en plasma de GLP-1 entre 20 y 60 minutos posteriores a la dosis. Estos resultados mostraron una consistencia relativa en dos experimentos llevados a cabo en 2 días consecutivos. Tabla 4. Biodisponibilidad de Formulaciones GLP-1/FDKP *Combinados 3:1 con partículas FDKP Ejemplo 8 GLP-1/FDKP reduce la Ingesta de Alimentos en Ratas GLP-1 también es conocida en la técnica por trabajar en el cerebro para disparar una sensación de saciedad y reducir la ingesta de alimentos. Con base en el desempeño de GLP-1 en la saciedad y reducción de ingesta de alimentos, se llevaron a cabo experimentos para determinar si las formulaciones GLP- 1/FDKP de la presente invención fueron efectivas como agentes para reducir la alimentación y de esta forma tener un potencial para controlar la obesidad. Dos grupos de ratas hembra Sprague Dawley fueron dosificados ya sea con un control (aire) o una formulación 15.8% GLP-1/FDKP en una dosis de 2 mg/día (0.32 g GLP-1/dosis) mediante insuflación pulmonar. El grupo de control consistió en cinco ratas y el grupo de prueba consistió en diez ratas. A cada rata se le proporcionó una dosis simple durante 5 días consecutivos y la ingesta de alimentos se midió a las 2 y 6 horas después de cada dosis. El peso corporal de cada rata se recolectó diariamente. Los datos preliminares muestran que a las 2 y 6 horas posteriores a la dosis, hubo una disminución general en el consumo de alimentos acumulativo en las ratas dosificadas con formulaciones GLP-1/FDKP (figuras 23A y 23B). La disminución fue más pronunciada el día 4 a las 2 horas posteriores a la dosificación (p = 0.01). A las 6 horas la disminución fue más pronunciada en los días 1 y 2 (p<0.02). No hubo en el consumo de alimentos a las 24 horas posteriores a la dosis. Ejemplo 9 Estudios de Toxicidad Se repitieron los estudios de toxicidad de dosis para evaluar los efectos tóxicos potenciales y el perfil toxicocinético de GLP-1/DKP después de que se llevaron a cabo múltiples administraciones. Catorce días de estudio en las ratas y 28 días de estudio en monos se llevaron a cabo. GLP-1/FDKP se dosificó diariamente a través de la ruta de inhalación. En estudios en donde los animales fueron dosificados durante 28 días, una proporción de los animales fueron sacrificados inmediatamente después del régimen de dosificación, en tanto que otros animales se les dejó un periodo de recuperación de hasta un mes previo al sacrificio. Todos los animales fueron evaluados con respecto a signos clínicos, varios parámetros fisiológicos que incluyen GLP-1, glucosa, insulina, pesos de órganos e histopatología clínica de varios órganos. Se llevó a cabo una serie de estudios de mutagenicidad GLP para evaluar el potencial mutagénico de las partículas de dicetopiperazina. Estos estudios incluyeron los ensayos de aberración de Ames y Cromosomales in vitro, ambos de los cuales son conocidos para los expertos en la técnica. Además, también se llevó a cabo un ensayo de micronúcleo de ratón in vivo, tal como lo conocen los expertos en la técnica. Los datos de genotoxicidad mostraron que no hubo evidencia de potencial para mutagenicidad o toxicidad genética con partículas de dicetopiperazina. También se llevaron a cabo estudios para evaluar el efecto de las partículas de dicetopiperazina en la toxicidad reproductiva. Estos estudios incluyeron fertilidad, desarrollo embrio-fetal y estudios de desarrollo postnatal en ratas y conejos. Las partículas de dicetopiperazinas administradas mediante inyección subcutánea no desajustan la fertilidad o implante en ratas, y no hubo evidencia de teratogenicidad en ratas o conejos. Las partículas de dicetopiperazina no afectaron en forma adversa la fertilidad y desarrollo temprano del embrión, desarrollo embriofetal o desarrollo prenatal o postnatal. Debido a que se han eliminado del mercado clínico el número farmacéuticos debido a su propensión a originar síndrome de LQT (LQTS adquirido o síndrome Q-T largo es un trastorno hereditario, no frecuente del ritmo eléctrico del corazón que puede ocurrir en personas saludables) se empleó un ensayo hERG para revisar la farmacología de las partículas dicetopiperazina. Se utilizó el ensayo hERG debido a que la gran mayoría de los farmacéuticos que originan los LQTS adquiridos, realizan esto bloqueando el canal de potasio de gen relacionado con éter-a-go-go humano (hERG) que es responsable de la repolarización del potencial de acción cardiaca ventricular. Los resultados del ensayo hERG indicaron un IC50 > 100 µ? para las partículas de dicetopiperazina. Además, los resultados de estudios no clínicos con partículas de dicetopiperazina no mostraron efecto en el intervalo QTc (el intervalo QT corregido por la frecuencia cardiaca), ya que no se observó una prolongación en el perro (estudios cardiovasculares de 9 meses o farmacología segura). No hubo efectos de partículas de dicetopiperazina cuando se administraron en forma intravenosa en los sistemas CNS o cardiovasculares evaluados en batería de núcleo de farmacología segura. Ejem lo 10 Efecto de GLP-1 en Masa de célula-ß GLP-1 es conocido por promover todos los pasos en biosíntesis de insulina y estimular directamente el crecimiento de supervivencia de célula-ß así como la diferenciación de célula-ß. La combinación de estos efectos da como resultado una masa incrementada de células-ß. Además, la señalización del receptor GLP-1 da como resultado una reducción la apoptosis de célula-ß, lo cual contribuye a una masa incrementada de célula-ß. GLP-1 es conocida por modul-ar la masa de célula-ß a través de tres trayectorias potenciales: aumento de la proliferación de célula-ß; inhibición de apoptosis de células ß; y diferenciación de células madre putativas en el epitelio total. Para demostrar el efecto de GLP-1 en la masa de célula-ß, se trataron células los días 1, 3 y 5 con GLP-1/FDKP y se compararon con células no tratadas. La administración de GLP-1 incrementó la masa de célula-ß hasta dos veces tal como se sugiere en la literatura (Sturis y asociados, 2003). Además, la revisión del efecto de diversos agonistas de receptor GLP-1 (GLP-1R) en diabetes, demostró que los agonistas GLP-1R evitan o retrasan el surgimiento o progreso de diabetes. Los efectos de GLP-1/FDKP en proliferación de célula ß, la insulina y glucosa se evaluaron en ratas con grasa/obesas diabéticas Zucker macho (ZDF) (n = 8/grupo). Los animales recibieron ya sea control (aire) o 2 mg GLP-1/FDKP que contiene 15% (0.3 mg) GLP-1 diariamente durante 3 días. Se llevo a cabo una prueba de tolerancia de glucosa intraperitoneal (IP) y las muestras de sangre fueron recolectadas para GLP-1 en plasma y análisis de glucosa previo a la dosis y a los 15, 30, 45, 60 y 90 minutos posteriores de la dosis. Se recolectaron tejidos pancreáticos para secreción de insulina, masa de célula ß y análisis de apoptosis a través de inmunohistoquímica. Se llevó a cabo una prueba de tolerancia de glucosa (IPGTT, figura 24) el día 4 de la dosificación. Después del ayuno durante la noche, en el día 3, los animales recibieron un bolo de glucosa a través de inyección intraperitoneal seguido inmediatamente de control (aire) o administración GLP-1/FDKP mediante insuflación pulmonar. La sangre se recolectó antes del estímulo con glucosa y en varios puntos de tiempo hasta los 90 minutos posteriores a la dosis. A los 30 minutos posteriores a la dosis, el grupo 1 mostró un incremento del 47% en niveles de glucosa en comparación con la predosis, en tanto que el grupo 2 (GLP-1/FDKP) mostró un incremento del 17% en los niveles de glucosa en comparación con valores de predosis. Los niveles de glucosa fueron significativamente menores a través de todos los puntos de tiempo después de la prueba de tolerancia de glucosa en animales tratados versus control (p<0.05).
Los niveles de GLP-1 también se midieron en el día 3 de la dosificación (figura 25). La concentración máxima en plasma de los niveles GLP-1 en el grupo 2 fue de 10,643 pM a los 15 minutos posteriores a la dosis. Además, se midieron los niveles de insulina en varios puntos de tiempo el día 3 junto con medidas de glucosa después de la prueba de tolerancia de glucosa IP. Tanto el grupo 1 de control (aire) como el grupo 2 (GLP-1/DKP) demostró una disminución inicial en la concentración de insulina de los niveles previos a la dosis, 46% y 30%, respectivamente, los 15 minutos posteriores a la dosis (figuras 26). Sin embargo, a los 30 minutos posteriores a la dosis, los niveles de insulina en el grupo 2 regresaron a la línea de base en tanto que los niveles de insulina en el grupo 1 continuaron disminuyendo al 64% de los valores previos a la dosis. En animales tratados, los niveles de insulina a los 45 minutos, 60 minutos y 90 minutos fueron valores casi como previos a la dosis con desviaciones menores al 1.5%. Se prepararon rebanadas para inmunomanchado de insulina y evaluación microscópica de expresión de insulina. Con base en la evaluación cuantitativa de la expresión de insulina mediante microscopio de luz, hubo un incremento relacionado con el tratamiento en la expresión de insulina dentro de páncreas de ratas ZDF macho y estuvo relacionado con la dosis, aunque no se logró una significancia estadística (p = 0.067); tal como se determinar a través del porcentaje de células de islote ß que expresan insulina. El análisis de apoptosis tampoco se llevó a cabo en el tejido pancreático de ratas ZDF. Se evaluaron células de páncreas exocrinas y endocrinas a través del ensayo de TUNEL (Tornusciolo D.R. y asociados, 1995). Aproximadamente 10,000 células en el páncreas (exocrina y endocrina) fueron clasificadas. La mayor parte de las células positivas-TUNEL fueron exocrinas. No hubo diferencias en el índice de etiquetación de apoptosis en grupos tratados versus control. Además, se evaluó la proliferación de célula ß, en el páncreas de ratas obesas diabéticas Zucker dosificadas una vez al día durante 3 días con control (aire) o GLP-1/FDKP mediante insuflación pulmonar. Se prepararon rebanadas para co-localización de insulina y Ki67 (un marcador de proliferación) utilizando inmunohistoquímica. Se llevó a cabo la evaluación microscópica de proliferación celular de entre los islotes positivos-insulina y en el páncreas exógeno en un total de 17 ZDF ratas. Con base en la evaluación cuantitativa de proliferación celular, no hubo efectos relacionados con el tratamiento en la proliferación celular dentro de las células beta de islote o células exocrinas del páncreas en ratas ZDF macho.
En general, este estudio muestra que el GLP-1/FDKP administrado en 2 mg o 0.3 mg GLP-1 mediante insuflación pulmonar, disminuyó los niveles de glucosa en la sangre en ratas con grasa diabética (modelo para diabetes tipo 2) después de una prueba de tolerancia de glucosa y se incrementó el número de células de secreción de insulina por islote. Ejemplo 11 Preparación de formulaciones de partícula GLP-1/FDKP También se empleó una metodología alternativa para preparar formulaciones de partículas GLP-1/FDKP. Las formulaciones se prepararon como se muestra a continuación. Se preparó una solución de reserva de GLP-1 de 10% en peso agregando una parte GLP-1 (en peso) 9 partes de agua desionízada y agregar una pequeña cantidad de ácido acético glacial para obtener una solución clara. Una suspensión de reserva de partículas FDKP (aproximadamente partículas al 10% en peso) se dividió en tres partes. Una cantidad adecuada de una solución de reserva GLP-1 se agregó a cada suspensión para proporcionar composiciones objetivo de 5 y 15% en peso de GLP-1 en el polvo seco. Después de la adición de solución de proteínas, el pH de la suspensión fue de aproximadamente 3.5. Las suspensiones posteriormente se ajustaron a un pH de aproximadamente 4.4-4.5, después de lo cual las suspensiones fueron peletizadas en nitrógeno líquido y liofilizadas para eliminar el hielo. Las aerodinámicas de los polvos se caracteriza en términos de fracción respirable en el relleno (RF con base en relleno) es decir porcentaje (%) de polvo en el rango respirable normalizado mediante la cantidad de polvo en el cartucho, lo cual se determinó como se indica a continuación: se llenaron manualmente 5 cartuchos con 5 mg de polvo y se descargaron a través a través de un inhalador MannKind's MedTone® (descrito en la Solicitud de Patente Norteamericana Número 10/655,153).
Esta metodología produce una formulación con un buen RF en el relleno. El polvo con 5% en peso de GLP-1 se midió en 48.8% RF/relleno en tanto que el polvo que contiene aproximadamente 15% en peso de GLP-1 fue 32.2%RF/relleno. Ejemplo 12 Farmacocinéticas de GLP-1 /FDKP con Diversas Concentraciones de GLP-1 Para evaluar las propiedades farmacocinéticas de GLP-1/FDKP con varias concentraciones de GLP-1, se dividieron dieciocho ratas hembra Sprague Dawley que pesan entre 192.3 gramos y 211.5 gramos en cuatro grupos de tratamiento: Control GLP-1 (grupo 1, n = 3); formulaciones GLP-1/FDKP (grupos 2-4, n = 5/grupo). Los animales recibieron uno de los siguientes artículos de prueba: control (aire) mediante inspiración pulmonar; 2.42 mg GLP-1/FDKP que contiene 5% GLP-1 (0.12 mg GLP-1); 1.85 mg GLP-1 /FDKP que contiene 10% GLP-1 (0.19 mg GLP-1) o 2.46 mg GLP-1/FDKP que contiene 15% GLP-1 (0.37 mg, GLP-1) mediante insuflación pulmonar. Las muestras de sangre fueron recolectadas y ensayadas para FDKP de suero y los niveles de GLP-1 en plasma en la predosis y en diversos puntos de tiempo (2, 5, 10, 20, 30, 40 y 60 minutos) posteriores a la dosis. Las concentraciones GLP-1 en plasma máximas (Cmax) después de la administración de GLP-1/FDKP (formulación al 5%) fueron 2321 pM en un Tmax de 5 minutos posteriores a la dosis; 4,887 pM en una Tmax de 10 minutos posterior a la dosis (formulación al 10%); y 10,207 pM en una Tmax en 10 minutos posterior a la dosis (formulación al 15%). Tal como se ilustra en la figura 27, se observaron niveles de GLP-1 significativos a los 30 minutos posteriores a la dosis. Los niveles del área bajo la curva (AUC) de GLP-1 fueron 10622, 57101, 92606, 227873 pM*min para los Grupos 1-4, respectivamente. La vida media estimada de GLP-1 fue de 10 minutos para GLP-1/FDKP al 10% 0 15% de carga GLP-1. Tal como se ilustra en la figura 28, se determinaron las concentraciones FDKP máximas para ser de 8.5 pg/ml (Grupo 2), 4.8 pg/ml (Grupo 3) y 7.1 pg/ml (Grupo 4) para las formulaciones GLP-1 /FDKP en 5%, 10% y 15% GLP-1, respectivamente. El tiempo para las concentraciones máximas (Tmax) fue de 10 minutos. Estos datos muestra que FDKP y GLP- 1 exhibieron cinéticas de absorción similares y se absorbieron cantidades similares en FDKP en forma independiente de la carga GLP-1 en las partículas. En general, es estudio mostró que los niveles GLP-1 en plasma fueron detectados en niveles significativos después de la administración de una sola dosis de GLP-1/FDKP mediante insuflación pulmonar en ratas Sprague Dawley. Los incrementos relacionados con la dosis en los niveles GLP-1 en plasma fueron observados con las concentraciones máximas logradas en aproximadamente 10 minutos posteriores a la dosis y con niveles GLP-1 observables a los 40 minutos posteriores a la dosis. Todos los animales sobrevivieron hasta el término del estudio. Ejemplo 13 Propiedades Farmacodinámicas de GLP-1/FDKP se Administraron mediante Insuflación Pulmonar Para evaluar las propiedades farmacodinámicas de GLP-1/FDKP, se dividieron ratas hembra Sprague Dawley en 2 grupos de tratamiento. Los animales recibieron ya sea control (aire; n = 5) o 2 mg de GLP-1/FDKP que contiene 15% GLP-1 (0.3 mg GLP-1) a través de una sola insuflación pulmonar diaria (n = 10) durante 4 días consecutivos. El consumo de alimentos se midió durante el ciclo de oscuridad en la predosis, 1, 2, 4 y 6 horas posteriores a la dosis durante 4 días consecutivos (figura 29). Se disminuyó el consumo de alimentos de días 1, 2 y 3 después de la administración diaria de dosis simple de GLP-1/FDKP mediante insuflación pulmonar en los animales tratados en comparación con el grupo de control (aire) (p < 0.05). Hubieron disminuciones estadísticamente significativas en el consumo de alimentos en los animales en el grupo tratado versus control (aire) el Día 1 en el punto de tiempo de 1 hora y 6 horas y en el Día 2 a las 4 horas, 6 horas y en la dosis previa el Día 3. Se midieron diariamente los pesos corporales (figura 30) en la predosis durante 4 días significativos. Los pesos corporales al inicio de la dosificación fluctuaron de aproximadamente 180 a 209 gramos. Aunque no se logró una significancia estadística entre los animales tratados y de control (aire) los pesos corporales fueron inferiores en los animales tratados. Todos los animales sobrevivieron hasta el sacrificio programado. Ejemplos 14-16 Estudios Toxicocinéticos (TK) Los Ejemplos 14 a 16 que se encuentran más adelante describen estudios de toxicidad de dosis repetida realizados en ratas y monos para evaluar los efectos tóxicos potenciales y el perfil toxicocinético de polvo de inhalación GLP-1/FDKP. Los datos indicados sin toxicidad aparente con polvo de inhalación GLP-1/FDKP en varias dosis mayores que las propuestas por el uso clínico. Además, adicionalmente, existen diferencias entre los animales macho y hembra dentro de cada especie. Ejem lo 14 Toxicocinéticos de GLP-1/FDKP Administrados durante 5 días mediante Insuflación Pulmonar en Monos Se han conducido estudios para determinar la toxicidad y el perfil toxicocinético de GLP-1/FDKP mediante administración oronasal (los intentados en la administración de la ruta terapéutica humana) a los monos cinomolgus (Macaca fascicularis) , una ves al día (durante 30 minutos un día) durante 5 días consecutivos. Se ha encontrado en la administración oronasal de los monos sobre su boca y nariz y se ha realizado la prueba de formulación durante 30 minutos. Cuarenta días previos al inicio del tratamiento, los animales fueron aclimatados a los procedimientos de dosificación. En el inicio del tratamiento (Día 1), los animales macho fueron de entre 30 meses y 56 meses de edad y fluctuando en el peso de 2.3 a 4.0 kg; las hembras fueron de entre 31 meses y 64 meses y fluctuando en el peso de 1.6 a 3.4 kg. Diez monos naive cinomolgus (5 machos y 5 hembras) se asignaron a 5 grupos (2 animales por grupo) tal como se ha descrito en las Tablas 5 y 6 más adelante. Los monos no naive son colonia de animales a quienes han recibido previamente las formulaciones para ser probados. Sin embargo, estas formulaciones tienen vida corta y no son lo esperado para estar presentes o tener un efecto en los monos durante los experimentos de dosificación aquí descritos. Los animales que recibieron el control (aire), 2 mg/kg FDKP ó 0.3 (0.04 mg GLP-1), 1.0 (0.13 mg GLP-1), ó 2.0 (0.26 mg GLP-1) mg/kg GLP-1/FDKP.
Tabla 5: Objetivo y niveles de dosis promedio alcanzados estimados (determinados mediante análisis gravimétricos*): *Se realizó análisis gravimétrico a través del peso del papel filtro en la cámara de inhalación tanto antes, durante después de la dosificación para calcular la concentración de aerosol en la cámara y para determinar la duración de I dosificación. 1 Basado en un peso corporal alcanzado de 2.5 kg. 2 Basado en la medición de pesos corporales (promedio para macho y hembra). 3 El objetivo y niveles de dosis alcanzado resume que la proporción de GLP-1 en la atmósfera generada es de 13%. El estimado de la dosis inhalada total alcanza 100% de deposición dentro del tracto respiratorio.
Tabla 6: Objetivo y concentraciones de aerosol promedio alcanzadas (determinados mediante análisis gravimétrico*): *Se realizó análisis gravimétrico a través del peso del papel filtro en la cámara de inhalación tanto antes, durante y después de la dosificación para calcular la concentración de aerosol en la cámara y para determinar la duración de la dosificación. 1 El objetivo y concentraciones de aerosol alcanzados logra que la proporción de GLP-1 en la atmósfera generada es de 13%. El estimado y la dosis inhalada total resume el 100% de deposición dentro del tracto respiratorio.
Las muestras de sangre completa (muestra de 1.4 ml/sangre) se obtuvieron el Día 5 en los siguientes puntos de tiempo: Pre-dosis, 10, 30, 45, 60, 90, 120 minutos y 4 horas posterior a la dosis. Se recolectó la sangre mediante venopunción de la vena femoral. Las muestras de sangre se dividieron en 2 alícuotas. Una para análisis de GLP-1 en plasma (0.8 mi) y la otra (0.6 mi) para análisis FDKP en suero. Para el análisis de GLP-1 en plasma, en cada punto de tiempo, se recolectó sangre total (0.8 mi) en tubos 1.3 mi EDTA (0.1% EDTA). Se agregó un inhibidor DPP-IV (Millipore - Billerica, MA) (10 L/ml de sangre) a los tubos aproximadamente 5 a 10 segundos después de la recolección de sangre (produciendo una concentración de DPP-IV de 100 µ?). Los tubos se invirtieron varias veces y se colocaron inmediatamente sobre hielo húmedo. Se mantuvieron las muestras de sangre completa en el hielo húmedo hasta que se centrifugaron (2°-8°C) en 4000 rpm durante aproximadamente 10 minutos, para producir plasma. Las muestras de plasma se transfirieron en frascos adecuados y se mantuvieron en hielo seco antes del almacenamiento en un congelador a una temperatura de -70 (±10) °C. Se determinaron las concentraciones en plasma (Cmax), Tmax, AUC, y T1/2 para GLP-1. Después de la administración mediante inhalación de GLP-1/FDKP durante cuatro días consecutivos, se descubrieron niveles detectables de GLP-1 en todas las muestras pre-dosis el Día 5. El día 5, se lograron concentraciones pico en plasma (Cmax) de GLP-1 a los 10 minutos después de la administración de la dosis (figura 31 ). La dosis relacionada incrementa en GLP-1 Cmax y AUC|ast (área bajo la curva de tiempo - concentración del tiempo cero al tiempo de la última concentración cuantif ¡cable). Como una función de la dosis se observaron tanto en monos macho como en monos hembra el día 5. A través del rango de dosis estudiado, se observaron menos incrementos proporcionales de la dosis en GLP-1 AUC|ast en dosis en incremento en monos tanto en macho como hembra, excepto para machos en el nivel de dosis de 1 mg/kg/día. Un incremento de 6.7 veces en la dosis de 0.3 a 2.0 mg/kg/día fue el único que se obtuvo en un incremento de 2.9 veces en AUCiast en machos y un incremento de 1.1 veces en AUC|ast en hembras. La concentración pico de GLP-1 promedio 17.2, 93.1 y 214 pg/ml en machos y 19.3, 67.9 y 82.8 pg/ml en hembras cuando se administró GLP-1/FDKP en niveles de dosis de 0.3, 1.0 y 2.0 mg/kg/día respectivamente. Los niveles en plasma de GLP-1 disminuyeron rápidamente con una eliminación aparente de las vidas medias que fluctúa de 4 minutos a 24 minutos. Los valores AUC para GLP-1 fueron 21.6, 105 y 62.3 pg*h/ml en machos y 33.4 23.7 y 35.4 pg*h/ml en hembras cuando se administró GLP-1/FDKP en niveles de dosis de 0.3, 1.0 y 2.0 mg/kg/día respectivamente. No hubo diferencias de género aparentes TK en los parámetros de observado en el nivel de dosis más bajo GLP-1.
Sin embargo, los monos macho mostraron valores AUCiast consistentemente mayores que los monos hembra en los niveles de dosis media y alta investigados. Algunas muestras de los monos de control de vehículo y control (aire), mostraron niveles medibles de GLP-1. Esto puede haber sido originado por la contaminación del aire inhalado por los animales o puede haber sido una medida de GLP-1 endógena en dichos monos en particular. Se deberá observar que los animales de control fueron expuestos en diferentes habitaciones a las de los animales tratados con GLP-1/FDKP. Ya que la vida media biológica de GLP-1 es menor a 15 minutos, el GLP-1 de la administración de GLP-1/FDKP debe ser eliminado completamente a las 24 horas. Por consiguiente, los niveles endógenos de GLP-1 fueron la probable explicación de los niveles consistentemente cuantificables de GLP-1 en las muestras de tiempo o recolectadas el Día 5 y en todos los animales tratados con GLP-1/FDKP. Al sustraer los valores de tiempo cero de las concentraciones observadas de GLP-1 posteriores a las dosis, se debe reflejar el cambio en GLP-1 debido a la administración de GLP-1/FDKP. Para el análisis FDKP en suero, en cada punto de tiempo, se recolectó sangre total (0.6 mi) en tubos que no contienen anti-coagulante, dejándose coagular a temperatura ambiente durante un mínimo de 30 minutos y se separaron mediante centrifugación para obtener el suero. Se determinó el análisis FDKP y las concentraciones en suero (Cmax), Tmax, AUC, y T1/2). Después de la administración mediante inhalación de GLP-1/FDKP durante cuatro días consecutivos, se descubrieron niveles detectables de FDKP en todas las muestras posteriores a la dosis el Día 5. El Día 5, se lograron concentraciones pico en plasma (Cmax) deFDKP aproximadamente a los 10 a 30 minutos después de la administración de la dosis. Hubo un incremento relacionado con la dosis en FDKP AUC8 (área bajo la curva de tiempo-concentración de tiempo cero extrapolado al tiempo infinito), como una función de la dosis, observado en monos tanto hembra como macho el Día 5. Sin embargo, en hembras no hubo diferencia en el FDKP AUC», entre 0.3 y 1.0 mg/kg/día aunque no se observó un incremento relacionado con la dosis entre 1 y 2 mg/kg/día. En todos los casos cuando se observó un incremento, fue menor al proporcional de la dosis. Un incremento de 6.7 veces en la dosis de 0.3 a 2.0 mg/kg/día dio como resultado un incremento de 2.7 veces en AUCiast en machos y 3.0 veces de incremento en AUC» en hembras. La concentración pico (Cmax) de FDKP fue promediada 200, 451 y 339 ng/ml en machos y 134, 161 y 485 ng/ml en hembras a las que se les administró GLP-1F/DKP en niveles de dosis de 0.3, 1.0 y 2.0 mg/kg/día respectivamente. Los valores AUC» para FDKP fueron de 307, 578 y 817 ng.h/ml en machos y 268, 235 y 810 ng.h/ml en hembras a las que se les administró GLP-1/FDKP en niveles de dosis de 0.3, 1.0 y 2.0 mg/kg/día respectivamente. Los niveles de AUC8 y Cmax en animales a los que se les administró FDKP únicamente en una dosis de 2.1 mg/kg/día (Grupo 2) fueron del mismo orden de magnitud que los animales que recibieron GLP-1/FDKP en 2.13 mg/kg/día, con la excepción de que la Tmax fue ligeramente más larga en 30 a 45 minutos después de la administración de dosis.
En general, GLP-1/FDKP fue bien tolerado son signos o efectos clínicos en los pesos corporales, consumo de alimentos, parámetro de patología clínica, evaluaciones macroscópicas o microscópicas. También se observó que la administración mediante inhalación de GLP-1/FDKP a monos cinomolgus en las dosis logradas estimadas de hasta 2.13 mg/kg/día (que corresponden a una dosis de 0.26 mg/kg/día GLP-1) administradas durante 30 minutos un día durante 5 días no está asociada con cualquier toxicidad limitante). Ejemplo 15 Toxicocinéticas de GLP-1/FDKP Administrado durante 14 días mediante Insuflación Pulmonar en Ratas Este estudio evaluó la toxicidad potencial de GLP-1/FDKP después de la administración diaria mediante insuflación pulmonar durante 14 días consecutivos. Las ratas recibieron control (aire), partículas FDKP en 10 mg/kg, o 1 (0.15 mg GLP-1), 3 (0.45 mg GLP-1) o 10 (1.5 mg GLP-1) mg/kg GLP-1/FDKP como una insuflación pulmonar diaria durante 14 días consecutivos (n = 24/sexo/grupo). Los animales se observaron diariamente con respecto a signos clínicos de toxicidad; también se registraron el peso corporal y consumo de alimentos. En los días 1 y 14, se logró GLP-1 Cmax en aproximadamente 10 a 15 minutos después de la administración de la dosis en todos los grupos de dosis. Las concentraciones pico de GLP-1 en 10 mg/kg/día GLP-1/FDKP promedió 6714 y 6270 pg/ml el Día 1 y 2979 y 5834 pg/ml el Día 14 en machos y hembras, respectivamente. Los niveles en plasma de GLP-1 declinaron con una eliminación aparente de las vidas media fluctuando de 0.7 horas a 4.4 horas. Los niveles AUC promedio de GLP-1 fueron de 2187 pM*h en machos y 2703 pM*h en hembras en la dosis más alta de 10 mg/kg/día GLP-1/FDKP. No se observó acumulación mínima de GLP-1 y no hubo diferencias por género en Cma , vida media y Tmax. Los valores AUC de GLP-1 fueron ligeramente mayores en ratas hembra que en ratas macho en todas las dosis. El Nivel de Efecto Adverso no Observable (NOAEL) en ratas a las que se les administró GLP-1/FDKP durante 14 días consecutivos mediante insuflación pulmonar fue de 10 mg/kg/día GLP-1/FDKP (1.5 mg/kg/día GLP- 1). Aproximadamente 24 horas después de la dosis final, se sacrificaron los animales (12/sexo/grupo); se llevaron a cabo evaluaciones de patología clínica, macroscópicas y microscópicas. Se sacrificaron animales satélite toxicocinéticos (TK) (12/sexo/grupo) el Día 14 de la dosificación después de una recolección de sangre final. No hubo muertes u observaciones clínicas relacionadas con GLP-1/DKP. No hubo diferencias en los pesos corporales en el consumo de alimentos ente animales de control y tratados. En 10 mg/kg GLP-1/FDKP únicamente en hembras, los pesos de hígado y las proporciones de peso de hígado a peso corporal fueron significativamente menores en comparación con el grupo de control (aire). No hubo diferencias claras observadas a partir de los resultados de hematología, coagulación, química, urinoanálisis o química de orina entre ratas a las que se les administró controles de vehículo y aire. No hubo descubrimientos importantes o hístopatológicos en tejidos que fueran determinados por tener toxicidad potencial debido a la administración de GLP-1/FDKP. Ejem pío 16 Toxicocinéticas de GLP-1/FDKP Administrado durante 28 días mediante Insuflación Pulmonar en monos Este estudio evaluó la toxicidad y toxicocinéticas de GLP-1/FDKP administrado diariamente mediante inhalación durante al menos 4 semanas. Para evaluar la capacidad de reversión, persistencia o surgimiento retrasado de cualesquiera efectos, hubo un período de recuperación de 4 semanas. Los animales recibieron uno de los siguientes tratamientos: Grupo 1: control (aire); Grupo 2: 3.67 mg/kg/día de partículas FDKP; Grupo 3: 0.3 mg/kg/día GLP-1/FDKP (0.045 mg/kg/día GLP- 1); Grupo 4: 1 mg/kg/día GLP-1/FDKP (0.15 mg/kg/día GLP-1) o Grupo 5: 2.6 mg/kg/día GLP-1/FDKP (0.39 mg/kg/día GLP-1). Se dividieron cuarenta y dos mono cinomolgus en 2 grupos; estudio principal (n = 3/sexo/grupo) y de recuperación (n= 2/sexo/grupo) en grupos 1, 2, y 5. Grupo 1: control de aire Grupo 2: FDKP (~4 mg/kg/día); Grupo 3: 0.3 mg/kg/día GLP-1/FDKP (dosis baja); Grupo 4: .0 mg/kg/día GLP-1/FDKP (dosis media); Grupo 5: 2.6 mg/kg/día GLP-1 /FDKP (dosis altas). Tal como es normal, en estudios con monos únicamente se evaluaron controles y dosis altas en la recuperación. Los animales fueron observados dos veces al día con respecto a mortalidad y morbilidad y la me os una vez al día, 30 minutos posterior a la dosis, con respecto a anormalidades y signos de toxicidad. Los datos de peso corporal fueron recolectados semanalmente y se evaluó diariamente el consumo de alimentos cualitativo. La sangre fue recolectada para toxicocinéticas los Días 1, 28, y 56. Se anestesiaron, pesaron, se les extrajo la sangre y se necrotizaron el Día 29 tres animales/sexo/grupo. Los animales restantes en los Grupos 1, 2 y 5 (n = 2/sexo/grupo) fueron anestesiados, pesados, examinados y necrotizaron el Día 57. En la necropsia, se pesaron los órganos seleccionados y se recolectaron y conservaron los tejidos seleccionados. Todos los tejidos de cada animal fueron revisados en forma microscópica. Hubo fluctuaciones ocasionales en el peso corporal a través de todo el grupo; sin embargo, no hubo un efecto relacionado con el tratamiento en el peso corporal. Generalmente, todos los animales mantuvieron o ganaron cantidades menores de peso durante curso del estudio. Se observó en las dosis altas una mayor incidencia y frecuencia de heces sueltas y líquidas. No hubo cambios significativos observados en cualesquiera parámetro químicos clínicos que fueron considerados como relacionados con el tratamiento, con la excepción de un incremento moderado en deshidrogenasa de lactato (LDH) y aminotransferasa de aspartato (AST) en hembras con dosis alta el Día 29 (al final del tratamiento); ver tabla 7. Los niveles de LDH también fueron muy elevados en machos. Estos cambios se han resuelto al término del período de recuperación y no se correlacionaron con cualesquiera descubrimientos microscópicos en el hígado. El cambio en los niveles AST en el grupo de hembra con dosis alta se debió principalmente a uno de los cinco animales.
Tabla 7: Cambio en % promedio en ALT, AST y LDH No hubo evidencia de cualesquiera cambios macroscópicos o histológicos relacionados con el tratamiento en los niveles de dosis de hasta 2.6 mg/kg/día GLP-1 /FDKP. GLP-1 /FDKP fue bien tolerado sin signos clínicos o efectos significativos en los pesos corporales, consume de alimentos, hematología, urínoanálisis, análisis de insulina, oftalmoscopia, ECG, cambios microscópicos o microscópicos observados en dosis de hasta 2.6 mg/kg/día GLP-1 /FDKP (0.39 mg/kg/día GLP-1). La administración mediante inhalación de FDKP en una dosis lograda estimada de hasta 3.67 mg/kg/día durante 28 días durante hasta 30 minutos al día tampoco estuvo asociada con toxicidad alguna. Los incrementos relacionados con la dosis en GLP-1 y FDKP Cmax y AUCiast como una función de la dosis, fueron observados en monos tanto macho como hembra el Día 1. Durante el rango de dosis estudiado, se observaron menos incrementos proporcionales-dosis en GLP-1 Cmax aunque no en AUCiast con dosis en incremento en monos tanto macho como hembra el Día 28. Las concentraciones pico de GLP-1 en 2.6 mg/kg/día GLP-1/FDKP promediaron 259 pg/ml en machos y 164 pg/ml en hembras. Los niveles en plasma de GLP-1 disminuyeron con la eliminación de las vidas mediad variando de 0.6 a 2.5 horas. Los valores AUC promedio de GLP-1 fueron de 103 pg*hr/ml en machos y 104 pg*hr/ml en hembras la dosis alta. Los monos macho desplegaron valores AUC y Cma superiores en la dosis baja en comparación con los machos. Las concentraciones pico de FDKP en 2.6 mg/kg/día GLP-1/FDKP promediaron 1800 ng/ml en machos y 1900 pg/ml en hembras. En conclusión, la administración de inhalación de GLP-1/FDKP a monos cinomolgus en las dosis logradas estimadas de hasta 2.6 mg/kg/día GLP-1/FDKP o 0.39 mg/kg/día GLP-1 administradas durante 28 días durante hasta 30 minutos a día fue bien tolerada clínicamente. El NOAEL fue de 2.6 mg/kg/día GLP-1 /FDKP (0.39 mg/kg/día GLP-1). Tal como se describió en el Ejemplo 19 que se encuentra más adelante, la dosis máxima para humanos en el estudio de Fase I fue de 1.5 mg GLP-1/FDKP por día o -0.021 mg/kg GLP-1 (asumiendo un humano de 70 Kg). Estudios adicionales dosificarán 3.0 mg GLP-1/FDKP por día o -0.042 mg/kg GLP-1. Ejem pío 17 Preparación de Formulaciones de Exendina/FDKP Se prepare exendina-4/FDKP combinando una solución de péptido exendina-4 ácida (SEQ ID No. 3) con una suspensión de partículas FDKP. La solución de péptido ácido fue de 10% (p/p) del péptido disuelto en 2% de ácido acético. La suspensión FDKP contuvo aproximadamente 10% (p/p) de partículas FDKP. La solución de péptido de exendina-4 ácido se agregó a la suspensión de partículas FDKP mientras se mezcló suavemente. La mezcla exendina-4/FDKP fue triturada lentamente con una solución de amonia al 25% en un pH de 4.50. Posteriormente la mezcla fue pelitizada en nitrógeno líquido y fue liofilizada. El % de contenido de Fracción Respirable en el Relleno (% RF en Relleno) para un polvo de Exendina-4/FDKP al 15% fue de 36%, con un Porcentaje de Vaciamiento de Cartucho de 99%. Un polvo 15% GLP-1/FDKP produjo una escala similar mostrada en los contenidos %RF en Relleno de 34%, con un Porcentaje de Vaciamiento de Cartucho del 100%. Ejem pío 18 Farmacocinéticas de Exendina/FDKP Administrada mediante Insuflación Pulmonar Están en progresos estudios de toxicidad preliminar con dosis repetidas para revisar el perfil farmacodinámico y farmacocinética de exendina-4 (un análogo GLP-1) en una formulación exendina-4/FDKP en diversas concentraciones y después de múltiples administraciones mediante ruta pulmonar. Se llevaron a cabo estudios de veintiocho días en ratas y monos. Exendina/FDKP se dosifica en forma diaria mediante ruta de inhalación. En estudios en donde los animales son dosificados durante 28 días, se sacrifica inmediatamente una proporción de animales después del régimen de dosificación, en tanto que otros animales se dejan durante un período de hasta un mes de recuperación antes del sacrificio. Todos los animales se evalúan con respecto a signos clínicos de toxicidad; se registran varios parámetros fisiológicos incluyendo niveles en sangre de Exendina-4, glucosa, y insulina; pesos de órganos y patología clínica e histopatolog ía de varios órganos. Los grupos de estudio iniciales consistieron en cinco animales por grupo con dos grupos de control: aire y Exendina se administraron en forma intravenosa. Hubieron seis grupos de insuflación pulmonar que recibieron aproximadamente dosis de 2.0 mg de Exendina/FDKP en una carga de 5%, 10%, 15%, 20% y 25%, y 30% de Exendina (p/p). Se recolectó sangre completa para concentraciones de glucosa y Exendina en la sangre en un punto de tiempo de 8 horas. Se recolectaron los datos (Cmax, T½ y Tmax), demostrando que las formulaciones Exendina/FDKP tiene farmacocinéticas comparables o mejores a las de GLP-1/FDKP. Ejem pío 19 Farmacocinéticas de GLP-1/xDKP Administradas mediante Insuflación Pulmonar en Ratas Para determinar si diferentes DKPs pueden influenciar el perfil farmacocinética de las formulaciones GLP-1/FDKP, varias formulaciones GLP-1/xDKP tal como se describe en la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana titulada "Análogos FDKP Asimétricos para Utilizarse como Agentes de Suministro de Fármaco" presentada en una fecha coincidente con la presente solicitud e incorporada en su totalidad a la presente invención (Expediente Legal No. 51300-00041 ). Se llevaron a cabo estudios en rata divididas en 6 grupos de tratamiento que consisten en cinco animales por grupo. El grupo de control (n = 3) recibió GLP-1 mediante instilación de líquido. También se utilizó como un segundo control GLP-1/FDKP (0.3 mg GLP-1), administrada mediante insuflación pulmonar. Cada uno de los grupos tratados con GLP-1/xDKP recibió formulaciones GLP-1/xDKP mediante insuflación pulmonar en dosis de ~2.0 mg de xDKP cargado con GLP-1 en 10% y 15%. Los xDKPs utilizados fueron cargas de ácido (E)-3-(4-(3,6-dioxopiperazin-2-il)butilcarbamoil)-acrílico), (3,6-bis(4-carboxipropil)amidobutil-2,5-dicetop¡peraz¡na), y sal disódica de ((E)-3,6-bis(4-(Carboxi-2- propenil)amidobutil)-2,5-dicetopiperazina). Se recolectó sangre completa para evaluación de concentraciones a los 5, 10, 20, 30, 45, 60 y hasta 90 minutos posteriores a la dosis. Ejemplo 20 Prueba de Fase la, Dosis Simple, Etiqueta Abierta, Dosis Ascendente, Seguridad y Tolera bi I ¡dad Controlada de Polvo de Inhalación GLP-1/FDKP en sujetos Machos Adultos Saludables GLP-1 ha mostrado controlar la glucosa en sangre elevada en humanos cuando se administra mediante infusiones intravenosas (iv) o subcutáneas (se) mediante múltiples inyecciones subcutáneas. Debido a la vida media extremadamente corta de la hormona, se pueden requerir infusiones subcutáneas continuas o múltiples inyecciones subcutáneas diarias. Ninguna de estas rutas es práctica para un uso clínico prolongado. Los experimentos en animales mostraron que cuando GLP-1 se administró mediante inhalación, se puede lograr niveles terapéuticos. Varias de la acciones de GLP-1, incluyendo reducción en vaciamiento gástrico, saciedad incrementada y supresión de secreción de glucagón inadecuada parecieron estar relacionados con la ráfaga de GLP-1 liberada conforme comienzan los alimentos. Suplementando este aumento temprano en GLP-1 con el polvo de inhalación GLP-1/FDKP, se puede generar una respuesta farmacodinámica en animales diabéticos. Además, el aumento tardío en GLP-1 nativo relacionado con una secreción de insulina incrementada puede ser mimetizado mediante administración por pandrial del polvo de inhalación GLP-1 /FDKP. La prueba clínica fase la del polvo de inhalación GLP-1/FDKP está diseñada para probar la seguridad y capacidad de tolerancia de dosis seleccionada de un nuevo producto terapéutico de control glicémico inhalado para el primer tiempo en sujetos humanos. La administración hace usos de un aparato MedTone® Inhaler previamente probado. El intento principal de esta prueba clínica, es identificar un rango de dosis del polvo de inhalación GLP- 1/FDKP mediante inhalación pulmonar, que sean seguras, tolerables y se puedan utilizar en pruebas clínicas adicionales para establecer la evidencia de eficacia y seguridad. Las dosis seleccionadas para la prueba clínica fase la están basadas en la seguridad del animal que resulta de las pruebas no clínicas del polvo de inhalación GLP-1/FDKP descrito en los Ejemplos anteriores, en ratas y primates. Se inscribieron veintiséis (26) sujetos en 5 cohortes para lograr hasta 4 sujetos evaluables en cada uno de los cohortes 1 y 2 y hasta 6 sujetos evaluables en cada uno de los cohortes 3 a 5 quienes cumplieron con los criterios de elección y completaron la prueba clínica. Cada sujeto se dosificó una vez con péptido-1 tipo glucagón (GLP-1) como un Polvo de Inhalación GLP-1/FDKP en los siguientes niveles de dosis: cohorte 1: 0.05 mg; cohorte 2: 0.45 mg; cohorte 3: 0.75 mg; cohorte 4: 1.05 mg y cohorte 5: 1.5 mg de GLP-1. No se reemplazarán los desertores. Estas dosis asumen una masa corporal de 70 kg. Los expertos en la técnica pueden determinar niveles de dosis adicionales con base en los estudios descritos anteriormente. Los objetivos de esta prueba son determinar la seguridad y capacidad de tolerancia de dosis ascendentes de polvo de inhalación GLP-1/FDKP en sujetos machos adultos saludables. La capacidad de tolerancia de la dosis ascendente del polvo de inhalación GLP-1/FDKP tal como se determina mediante monitoreo farmacológico o efectos adversos en las variables,. Incluyendo eventos adversos reportados (AE), signos vitales, divisiones físicas, pruebas de laboratorio clínicas y electrocardiogramas (ECG) serán evaluados. Los objetivos secundarios son evaluar los parámetros de seguridad y farmacocinéticos adicionales. Estos parámetros de seguridad adicionales incluyen, tal como se expresa a través de la incidencia de cambios pulmonares y otros AEs y cambios en la función pulmonar entre la Visita 1 (Clasificación) y Visita 3 (Seguimiento); parámetros farmacocinéticos (PK) de plasma GLP-1 y d i ceto p i pe razi n a de fumarilo de suero (FDKP) después de la dosificación con el polvo de inhalación GLP-1 /FDKP, tal como se mide mediante GLP-1 en plasma AU C0-i 20(m¡n) y FDKP en suero de AU0-48o m¡n; parámetros PK adicionales de GLP-1 en plasma incluyen: GLP-1 en plasma Tmax; GLP-1 en plasma Cmax; y GLP-1 en plasma T½. Los parámetros PK adicionales de FDKP en suero incluyen: FDKP de suero Tmax; FDKP se suero Cmax; y FDKP en suero T½. Los puntos de extremo de las pruebas están basadas en una comparación de los siguientes parámetros farmacológicos y se seguridad determinados en la población de los sujetos de prueba. Los puntos de extremo primarios incluirán: puntos de extremo se seguridad serán evaluados con base en la incidencia y seguridad de AEs, reportados, incluyendo tos y dispnea, náusea y/o vómito, así como cambios de la clasificación en signos vitales, pruebas de laboratorio clínicas y revisiones físicas. Los puntos de extremo secundarios incluirán: disposición PK de GLP-1 en plasma y FDKP en suero (GLP-1 en plasma AUC0- 12o minutos y FDKP en suero AUC0-48o minutos); parámetros PK adicionales de GLP-1 en plasma (GLP-1 de plasma Tmax, GLP-1 de plasma Cmax y GLP-1 en plasma T½; parámetros PK adicionales de FDKP en suero (FDKP en suero max, FDKP en suero Cmax); y parámetros de seguridad adicionales (pruebas de función pulmonar (PFTs)) y ECG. La prueba de dosis simple, de fase la incorpora una estructura de dosis ascendente, de etiqueta abierta y una estrategia de diseño que es consistente con 21 CFR 312, Buena Práctica Clínica: Guía Consolidada (ICH-E6) y la Guía con Respecto a Consideraciones Generales para Pruebas Clínicas (ICH-E8) para determinar la seguridad y capacidad de tolerancia del producto medicinal en investigación (IMP). La prueba clínica consistirá en 3 visitas clínicas: 1) Una visita de clasificación (Visita 1); 2) Una visita de tratamiento (Visita 2); y 3) Una visita de seguimiento (Visita 3) 8 a 14 días después de la Visita 2. La administración de la dosis simple del polvo de inhalación GLP-1/FDKP ocurrirá en la Visita 2.
La prueba clínica evaluar los parámetros de seguridad en cada cohorte. El cohorte programado para recibir la siguiente concentración de dosis no será dosificado hasta que se realice una revisión con respecto a todos los datos de seguridad y capacidad de tolerancia para la primera dosis o dosis previas a través de la investigador principal (Pl). Se ¡mplementará un tiempo de retraso de dosis de media hora entre los sujetos en cada cohorte, para asegurar la seguridad del sujeto. La dosis puede ser interrumpida si 3 o más sujetos dentro de un cohorte, experimentan diversos síntomas de náusea y/o vómito o cuando se alcance la dosis máxima, o a juicio del Pl. Se evaluarán cinco dosis del polvo de inhalación GLP-1/FDKP (0.05, 0.45, 0.75, 1.05 y 1.5 mg de GLP-1). Para adaptar todas las dosis, se mezclará GLP-1/FDKP formulado con el polvo de inhalación FDKP. Se utilizará un cartucho de dosis simple que contienen 10 mg de polvo seco que consiste en polvo de inhalación GLP-1/FDKP (15% en peso a peso GLP-1/FDKP) como está o mezclado con la cantidad adecuada de polvo de inhalación FDKP, para obtener la dosis deseada de GLP-1 (0.05 mg, 0.45 mg, 0.75 mg, 1.05 mg y 1.5 mg): 1. Los primeros 2 niveles de dosis más bajas serán evaluados en 2 cohortes de 4 sujetos cada uno y en los 3 niveles de dosis superiores serán evaluados en 3 cohortes de 6 sujetos cada uno. Cada sujeto recibirá únicamente una dosis en 1 de los 5 niveles de dosis que serán evaluados. Además de las estaciones de sangre, para medidas GLP-1 (activo y total) y FDKP, se extraerán muestras para determinación de glucagón, glucosa, insulina y C-péptido. Se han hecho numerosas referencias a patentes y publicaciones impresas a lo largo de la presente especificación. Cada una de las referencias mencionadas anteriormente y publicaciones impresas están incorporadas en su totalidad en forma individual como referencia a la presente invención. A menos que indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como peso molécula, condición de reacción, etc., utilizados en la presente especificación y reivindicaciones adjuntas, serán entendidas como siendo modificadas en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la siguiente especificación y reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas observadas para ser obtenidas por la presente invención. Al menos, y no como un intento de limitar la aplicación de la doctrina de equivalente al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe ser construido al menos a la luz del número de dígitos significativos reportados y aplicando técnicas de redondeo ordinarios. Sin embargo, ya que los rangos numéricos y parámetros establecen que establecen el amplio alcance de la presente invención son aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se reportan en la forma más precisa. Sin embargo, cualquier valor numérico, contienen inherentemente ciertos errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus respectivas medidas de pruebas. Los expertos en la técnica podrán apreciar que se pueden realizar varias modalidades y modificaciones a la presente invención aquí descritas sin apartarse del alcance y espíritu de la misma. Tal como se utiliza en la presente invención, el uso de la palabra "un" o "una" cuando se utiliza junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la especificación, pueden significar "uno", aunque también es consistente con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno". Se contempla que se puede implementar cualquier método o composición aquí descrita con respecto a cualquier otro método o composición aquí descrito. El uso del término "o" en las reivindicaciones se utiliza para entender "y/o" a menos que se indique explícitamente para referirse a alternativas únicamente o las alternativas sean mutuamente exclusivas. A lo largo de la presente solicitud, el término "aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye una desviación estándar de error del aparato o método que está siendo empleado para determinar el valor. Podrán apreciarse otros objetos, características y ventajas de la presente invención a partir de la descripción y ejemplos anteriores, así como de las reivindicaciones. Sin embargo quedará entendido, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, auque indican modalidades específicas de la presente invención, se proporcionan únicamente a manera de ilustración, ya que varios cambios y modificaciones están dentro del espíritu y alcance de la presente invención y podrá ser apreciado por los expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada. REFERENCIAS Las referencias que se encuentran a continuación, hasta el punto en que puedan proporcionar procedimientos u otros detalles de ejemplo o suplementarios a los aquí establecidos, están incorporadas en forma específica a la presente invención como referencia. Chelikani PK y asociados, Intravenous infusión of glucagon-like peptide-1 potently inhibits food intake, sham feeding, y gastric emptying in rats (Infusión intravenosa de péptido-1 tipo glucagón inhibe potentemente la ingesta de alimentos, alimentación simulada y vaciamiento gástrico en ratas). Am J Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol, 288(6):R1695-706, 2005. D'Alessio, y asociados, J. Clin. Invest., 97:133-38, 1996.
Deacon CF: Therapeutic strategies based on glucagon-like peptide 1. (Estrategias terapéuticas con base en péptido-1 tipo glucagón) Diabetes. Sep; 53(9):2181 -9, 2004. Eissele, y asociados, Life ScL, 55:629-34, 1994. [00267] Goke, y asociados, J. Biol. Chem. 268:19650-55, 1993 Johnson JD y asociados: yR2 y calpain-10 delinéate a novel apoptosis pathway in pancreatic islets. (R1 y R2 y calpain-10 delinean una trayectoria de apoptosis novedosa en islotes pancreáticos). J Biol Chem., 279(23):24794-802, 2004. [00269] Malhotra, R., y asociados, Regulatory Peptides, 41: 149-56, 1992. [00270] Mentlein R, y asociados, Dipeptidil peptidase IV hidrolyses gastric inhibitory polipéptido, glucagon-like peptide-1 (7-36) amide, peptide histidine methionine y is responsible para their degradation in human serum. (La peptidasa de dipeptidilo IV hidroliza el polipéptido inhibidor gástrico, la amida de péptido-1 tipo glucagón (7-36), metionina de histidina de péptido y es responsable de su degradación en suero de humano). Eur J Biochem., 214:829 -835, 1993. Montrose-Raf izadeh , y asociados, Diabetes, 45(Suppl. 2):152A, 1996. Nauck MA, y asociados, Normalization of fasting hyperglycemia by exogenous GLP-1 (7-36 amide) in type 2 diabetic patients. (Normalización de hiperglucemia en ayuno mediante GLP-1 eógeno (amida 7-36) en pacientes diabéticos tipo 2). Diabetologia, 36:741 -744, 1993. Nauck MA, y asociados, Effects of subcutaneoss glucagon-like peptide 1 (GLP-1 [7-36 amide]) en pacientes con NIDDM. (Efectos de péptido-1 tipo glucagón subcutáneo (amida GLP-1 [7-36]) en pacientes con NIDDM). Diabetologia, 39:1546 -1553, 1996. Nauck MA, y asociados, Effects of glucagon-like peptide 1 on counterregulatory hormone responses, cognitive functions, y insulin secretion during hyperinsulinemic, stepped hypoglycemic clamp experiments in healthy volunteers. (Efecto de péptido-1 tipo glucagón en respuestas de hormona contra reguladoras, funciones cognitivas y secreción de insulina durante experimentos de sujeción hiper-insulinémicos e hipoglucémicos escalonados en voluntarios saludables). J Clin Endocrinol Metab., 87:1239 - 1246, 2002. Raufman, y asociados, J. Biol. Chem. 267:21432-37, 1992. Raufman, y asociados, J. Biol. Chem. 266:2897-902, 1991 Schepp, y asociados, Eur. J. Pharmacol, 69:183-91, 1994. Singh, y asociados, Regul. Pept. 53:47-59, 1994. Sturis J, y asociados, . British Journal of Pharmacology, 140,123 .132, 2003. Tornusciolo D.R. y asociados, Biotechniques 19(5):800-805, 1995. Simultaneous detection of TDT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TU N EL)-positive cells y múltiple immunohistochemical markers in single tissue sections.
(Detección simultánea de células positivas (TUNEL) de etiquetación de extremo de mella de biotina-dUTP transmitida por TDT y múltiples marcadores inmuno histoquímicos en secciones de tejido simple). Verdich C, y asociados, A meta-analysis of the effect of glucagon-like peptide-1 (7-36) amide on ad libitum energy intake in humans. (Un meta-análisis del efecto de la amida de péptido-1 tipo glucagón (7-36) amida en incesta de energía ad libitum en humanos). J Clin Endocrinol Metab., 86:4382 -4389, 2001. Wang Q, y asociados, Glucagon-like peptide-1 regulates proliferation y apoptosis via activation of protein kinase B in pancreatic INS-1 beta cells. (El péptido-1 tipo glucagón regula la proliferación de apoptosis mediante activación de cinasa de proteína B en células beta INS-1 pancreáticas) Diabetologia, 47:478 -487, 2004. Wang, y asociados, J. Clin. Invest, 95:417-21, 1995. Zander M, y asociados, Effect of 6-week course of glucagon-like peptide 1 on glycaemic control, insulin sensitivity, y beta-cell function in diabetes tipo 2: a parallel-grupo study. (Efecto del transcurso de 6 semanas de péptido 1 tipo glucagón en control glucémico, sensibilidad de insulina y función de célula beta en diabetes tipo 2: estudio de grupo paralelo). Lancet, 359:824 -830, 2002.

Claims (42)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una composición de polvo seco que comprende una micropartícula que comprende una molécula GLP-1 y una dicetopiperazina.
  2. 2. La composición de polvo seco tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula GLP-1 se selecciona del grupo que consiste en GLP-1 nativo, metabolitos de GLP-1, análogos de GLP-1, derivados de GLP-1, dipeptidil-peptidasa-l V (DPP-IV) protegidos por GLP-1, miméticos de GLP-1, análogos de péptido GLP-1, o análogos GLP-1 bosintéticos.
  3. 3. La composición de polvo seco tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la dicetopiperazina es una dicetopiperazina que tiene la fórmula 2,5-diceto-3,6-di(4-X-aminobutil)piperazina, en donde X es seleccionado del grupo que consiste en succinilo, glutarilo, maleilo, y fumarilo.
  4. 4. La composición de polvo seco tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque la dicetopiperazina es 2,5-diceto-3,6-di(4-fumaril-aminobutil)piperazina.
  5. 5. La composición de polvo seco tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula GLP-1 es GLP-1 nativo.
  6. 6. La composición de polvo seco tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula GLP-1 es una molécula GLP-1 amidada.
  7. 7. La composición de polvo seco tal como se describe en la reivindicación 6, caracterizada porque la molécula GLP-1 amidada es amida de GLP- 1(7-36).
  8. 8. Un proceso para formar una partícula que comprende una molécula GLP-1 y una dicetopiperazina que comprende los pasos de: proporcionar una molécula GLP-1; proporcionar una dicetopiperazina en una forma seleccionada de una dicetopiperazina que forma partículas, partículas de dicetopiperazina y combinaciones de los mismos; y combinar la molécula GLP-1 y la dicetopiperazina en la forma de una co-solución, en donde se forma la partícula que comprende la molécula GLP-1 y ladicetopiperazina.
  9. 9. El proceso tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque comprende además eliminar un solvente de la co-solución, mediante liofilización, filtración, o secado con rocío.
  10. 10. El proceso tal como se describe en la reivindicación 9, caracterizado porque la partícula comprende la molécula GLP-1 y la dicetopiperazina se forma mediante eliminación del solvente.
  11. 11. El proceso tal como se describe en la reivindicación 10, caracterizada porque la partícula que comprende la molécula GLP-1 y la dicetopiperazina se forman antes de la eliminación del solvente.
  12. 12. El proceso tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque la molécula GLP-1 se selecciona del grupo que consiste en GLP-1 nativo, un metabolito GLP-1, un análogo de GLP-1, un derivado de GLP-1, un GLP-1 protegido con dipeptidil-peptidasa-l V (DPP-IV), un mimético de GLP-1, un análogo de péptido GLP-1, o un análogo de GLP-1 biosintético.
  13. 13. El proceso tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque la molécula GLP-1 se proporciona en la forma de una solución que comprende una concentración GLP-1 de aproximadamente 1 g/ml -50 mg/ml.
  14. 14. El proceso tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque la molécula GLP-1 se proporciona en la forma de una solución que comprende una concentración GLP-1 de aproximadamente 0.1 mg/ml - 10 mg/ml.
  15. 15. El proceso tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque la molécula GLP-1 se proporciona en la forma de una solución que comprende una concentración GLP-1 de aproximadamente 0.25 mg/ml.
  16. 16. El proceso tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque la dicetopiperazina se proporciona en la forma de una suspensión de partículas de dicetopiperazina.
  17. 17. El proceso tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizada porque la dicetopiperazina se proporciona en la forma de una solución que comprende una dicetopiperazina que forma partículas, en donde proceso comprende además ajusfar el pH de la solución para formar partículas de dicetopiperazina.
  18. 18. El proceso tal como se describe en la reivindicación 16 o reivindicación 17, caracterizado porque además agregar un agente a la solución o suspensión, en donde el agente se selecciona del grupo que consiste en sales, tensoactivos, iones, osmolitos, caotropos y liotropos, solventes ácidos de base y orgánicos.
  19. 19. El proceso tal como se describe en la reivindicación 18, caracterizado porque el agente promueve la asociación entre la molécula GLP-1 y las partículas de dicetopiperazina o la dicetopiperazina que forma partículas.
  20. 20. El proceso tal como se describe en la reivindicación 18, caracterizado porque el agente mejora la estabilidad o farmacodinámicas de la molécula GLP-1.
  21. 21. El proceso tal como se describe en la reivindicación 18, caracterizado porque el agente es cloruro de sodio.
  22. 22. El proceso tal como se describe en la reivindicación 16 o reivindicación 17, caracterizado porque comprende además ajustar el pH de la suspensión o solución.
  23. 23. El proceso tal como se describe en la reivindicación 22, caracterizado porque el pH se ajusta a 4 o más.
  24. 24. El proceso tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque la molécula GLP-1 en la partícula tiene mayor estabilidad.
  25. 25. El proceso tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque la co-solución comprende una concentración GLP-1 de 1 µ9/??? -50 mg/ml.
  26. 26. El proceso tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque la co-solución comprende una concentración GLP-1 de 0.1 mg/ml - 10 mg/ml.
  27. 27. El proceso tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque la co-solución comprende una concentración GLP-1 de 0.25 mg/ml.
  28. 28. El proceso tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque comprende además agregar un agente a la co-solución, en donde el agente se selecciona del grupo que consiste en sales, tensoactivos, iones, osmolitos, caotropos y liotropos, solventes ácidos, bases u orgánicos.
  29. 29. El proceso tal como se describe en la reivindicación 28, caracterizado porque el agente promueve la asociación entre la molécula GLP-1 y las partículas de dicetopiperazina o la dicetopiperazina que forma partículas.
  30. 30. El proceso tal como se describe en la reivindicación 28, caracterizado porque el agente mejora la estabilidad o farmacodinámica de la molécula GLP-1.
  31. 31. El proceso tal como se describe en la reivindicación 28, caracterizado porque el agente es cloruro de sodio.
  32. 32. El proceso tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque comprende además ajustar el pH de la co-solución.
  33. 33. El proceso tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizado porque el pH se ajusta a aproximadamente 4 o más.
  34. 34. Un método para administrar una cantidad efectiva de una molécula GLP-1 a un sujeto que necesita de la misma, en donde el método comprende proporcionar un sujeto una partícula que comprende GLP-1 y dicetopiperazina.
  35. 35. El método tal como se describe en la reivindicación 34, caracterizado porque el suministro se lleva a cabo en forma intravenosa, subcutánea, oral, nasal, bucal, rectal o mediante administración pulmonar.
  36. 36. El método tal como se describe en la reivindicación 34, caracterizado porque el suministro se lleva a cabo mediante administración pulmonar.
  37. 37. El método tal como se describe en la reivindicación 34, caracterizado porque la necesidad comprende tratamiento de una condición o enfermedad seleccionada del grupo que consiste en diabetes, isquemia, lesión de tejido reperfusionado, dislipidemia, cardiomiopatía diabética, infarto al miocardio, síndrome coronario agudo, obesidad, cambios catabólicos después de cirugía, hiperglucemia, síndrome de intestino irritable, ataque, trastornos neurodegenerativos, trastornos de memoria y aprendizaje, trasplante de célula de islote y terapia regenerativa.
  38. 38. El método tal como se describe en la reivindicación 34, caracterizado porque el suministro de la partícula da como resultado una vida media farmacocinética y biodisponibilidad de GLP-1 mejoradas en comparación con GLP-1 nativo.
  39. 39. Un método para formar una composición en polvo con un perfil farmacocinético GLP-1 mejorado, que comprende los pasos de: proporcionar una molécula GLP-1; proporcionar a una dicetopiperazina que forma partículas en una solución; formar partículas de dicetopiperazina; combinar la molécula GLP-1 y la solución para formar una co-solución; y eliminar el solvente de la co-solucíón mediante secado con rocío para formar un polvo con un perfil farmacocinético de GLP-1 mejorado.
  40. 40. El método tal como se describe en la reivindicación 39, caracterizado porque el perfil farmacocinética de GLP-1 mejorado comprende una vida media de GLP-1 incrementada.
  41. 41. El método tal como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque la vida media de GLP-1 incrementada es mayor o igual a 7.5 minutos.
  42. 42. El método tal como se describe en la reivindicación 39, caracterizado porque el perfil farmacocinética de GLP-1 mejorado comprende una biodisponibilidad mejorada de GLP-1 en comparación con GLP-1 nativo.
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